CN102296104A

CN102296104A - 癌症发生或转移的诊断试剂

Info

Publication number: CN102296104A
Application number: CN2010102083960A
Authority: CN
Inventors: 季红斌; 葛高翔
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Priority date: 2010-06-24
Filing date: 2010-06-24
Publication date: 2011-12-28

Abstract

本发明涉及癌症发生或转移的诊断试剂。提供了一种赖氨酸氧化酶(LOX)的用途，用于作为癌症的血清标志物；还提供了一种检测赖氨酸氧化酶活性的试剂组合及其在诊断癌症方面的用途；还提供了基于所述试剂组合的试剂盒。本发明第一次将检测LOX活性的方法应用于诊断癌症(如肺癌)，第一次将检测LOX活性的试剂应用于制备诊断癌症的试剂盒，从而为癌症的临床检测提供了更为简易的途径。

Description

癌症发生或转移的诊断试剂

技术领域

本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及癌症发生或转移的诊断试剂。

背景技术

肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其发病和致死率近年有明显上升趋势，由于肺癌的高转移性，绝大多数临床上确诊的肺癌患者通常已是晚期，往往出现了肿瘤转移以及扩散，手术治疗的可能性极低。因此早期发现、早期治疗至关重要。近年来，随着分子生物学、免疫学及生物化学等相关学科的飞速发展，血清中肿瘤标记物检测逐渐用于肿瘤早期诊断、评估预后及观察疗效、复发及转移等方面。与肺癌相关的肿瘤标志物的检测对肺癌的早期诊断具有重要的临床意义。

转移是目前导致癌症患者死亡的最主要原因，研究表明超过90％的癌症患者死于肿瘤的转移和扩散。癌症转移不是肿瘤细胞的独奏，而是一个涉及与肿瘤细胞和肿瘤间质包括细胞外基质(ECM)亲密互动的过程。细胞外基质的改造和重建，可以调节细胞与细胞以及细胞和胞外基质的相互作用，进而导致细胞所处的微环境改变和细胞自身行为变化，是肿瘤转移过程中的一个很重要的事件。因此参与细胞外基质重建的酶越来越受到广泛关注，它们在肺癌的发生发展过程中起着至关重要的作用，也极有可能为肺癌的转移治疗提供诊断标记和分子靶点。

赖氨酸氧化酶(LOX)是胶原纤维通过共价交联取得稳定性和发育成熟的关键酶，可以赋予细胞外基质适宜的强度和弹性，这对于维持结缔组织的韧性起到了至关重要的作用。

LOX作为一个胺基氧化酶，对胞外基质中的最重要的组分胶原蛋白和弹性蛋白进行交联，其前蛋白原(preproLOX)为48KD，在其N-端含有21个氨基酸的信号肽，经高尔基体糖基化修饰后被分泌到胞外，为50KD的前蛋白，再经过骨形态发生蛋白-1(BMP-1)的剪切产生32KD的具催化活性的酶和18KD的前肽(LOX-PP)，介导胶原和弹性蛋白的交联。此外，LOX还参与细胞运动、信号转导和基因表达调控等许多至关重要的生物学过程。

尽管以往本领域对于LOX与肿瘤相关性有一定的研究，然而前期均是针对于LOX在肿瘤中表达量的研究。例如，生物芯片分析的数据显示多种肿瘤细胞株以及人肿瘤组织包括肺癌和乳腺癌具有LOX的高表达(Kirschmann，D.A.，E.A.Seftor，et al.(2002).″A molecular role for lysyl oxidase in breast cancerinvasion.″Cancer Res 62(15)：4478-83；Kirschmann，D.A.，E.A.Seftor，et al.(1999).″Differentially expressed genes associated with the metastatic phenotype inbreast cancer.″Breast Cancer Res Treat 55(2)：127-36)。然而，也有研究指出在部分肿瘤如支气管肺癌、膀胱癌以及浆液性卵巢癌中LOX及其家族成员呈下调表达(Hough，C.D.，C.A.Sherman-Baust，et al.(2000).″Large-scale serial analysisof gene expression reveals genes differentially expressed in ovarian cancer.″Cancer Res 60(22)：6281-7；Woznick，A.R.，A.L.Braddock，et al.(2005).″Lysyloxidase expression in bronchogenic carcinoma.″Am J Surg 189(3)：297-301；Wu，G.，Z.Guo，et al.(2007).″LOXL1 and LOXL4 are epigenetically silenced and caninhibit ras/extracellular signal-regulated kinase signaling pathway in human bladdercancer.″Cancer Res 67(9)：4123-9)。可见，不同肿瘤的细胞起源不同、分化程度不同而导致了LOX的差异表达。因此，对于LOX的肿瘤相关性不可一概而论，还需要针对不同的肿瘤进行有针对性地区别研究。

此外，本领域人员均了解，单单研究蛋白表达量的高低并不能代表其蛋白生物活性的高低。而目前现有技术的研究均限于蛋白的组织表达层面，依赖于组织标本或细胞系，临床应用具有一定限制；还没有针对LOX酶活性高低与肿瘤相关性进行研究。更没有针对LOX酶活性高低与肺癌及其临床分期进行相关性研究。

发明内容

本发明的另一目的在于提供肺癌发生或转移的诊断试剂。

在本发明的第一方面，提供一种赖氨酸氧化酶(LOX)用作检测癌症的血清标志物的用途。

在一个优选例中，所述的癌症是肺癌。

在另一优选例中，所述的赖氨酸氧化酶(LOX)用作肺癌临床分期的血清标志物。

在另一优选例中，所述的用作检测癌症的血清标志物是检测血清中赖氨酸氧化酶的活性。较佳地，检测血清中赖氨酸氧化酶的活性是否提高。

在本发明的另一方面，提供一种试剂组合，所述的组合含有：

安普莱红(Amplex red)，二氨基戊烷，过氧化氢酶，赖氨酸氧化酶专一性抑制剂。

在一个优选例中，所述的试剂组合还含有选自下组的一种或多种试剂：

尿素，四硼酸钠。

在另一优选例中，当所述试剂混合时，安普莱红、二氨基戊烷、尿素和四硼酸钠按照摩尔比是1∶(150-250)∶(20000-30000)∶(500-1500)；较佳地是1∶200∶24000∶1000。

在另一优选例中，当所述试剂混合时，尿素终浓度1.2±0.1M；四硼酸钠终浓度0.05±0.005M；安普莱红终浓度50±5μM；二氨基戊烷终浓度10±1mM。

在另一优选例中，当所述试剂混合时，过氧化氢酶终浓度0.1±0.01U/ml。

在另一优选例中，当所述试剂混合时，赖氨酸氧化酶专一性抑制剂终浓度500±50μM。

在另一优选例中，所述的二氨基戊烷是1，5-二氨基戊烷；或所述的过氧化氢酶是辣根过氧化物酶；或所述的赖氨酸氧化酶专一性抑制剂是β-氨基丙腈(BAPN)。

在本发明的另一方面，提供所述的试剂组合在制备诊断癌症的试剂盒中的用途。

在一个优选例中，所述的癌症是肺癌。

在本发明的另一方面，提供一种试剂盒，含有：所述的试剂组合。

在本发明的另一方面，提供一种(体外非诊断性地)测定赖氨酸氧化酶活性的方法，包括：

(1)将所述的试剂组合中安普莱红；二氨基戊烷，过氧化氢酶混合，形成混合液1；

(2)将所述的试剂组合中安普莱红；二氨基戊烷，过氧化氢酶，赖氨酸氧化酶专一性抑制剂混合，形成混合液2；

(3)分别检测混合液1和混合液2的混合液的酶活，混合液1的酶活减去混合液2的酶活的结果即是赖氨酸氧化酶的酶活。

在另一优选例中，通过激发波长560nm和发射波长590nm检测两种混合液的荧光值，从而确定酶活。

在本发明的另一方面，提供一种确定癌症或癌症易感性的方法，包括：

检测待测对象血清中的赖氨酸氧化酶的酶活；

若待测对象血清中的赖氨酸氧化酶的酶活显著高于(如高20％；较佳地高40％；更佳地高60％)正常人群血清中的赖氨酸氧化酶的酶活；则该待测对象是癌症患者或癌症易感性患者。

在一个优选例中，所述的癌症是肺癌。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1显示了正常对照和肿瘤患者血清中LOX的活性比较。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，首次将赖氨酸氧化酶(LOX)的活性情况与癌症(特别是肺癌)的发生、发展、转移、分期相关联。从而第一次将检测LOX活性的试剂应用于制备诊断癌症的试剂盒；第一次将检测LOX活性的方法应用于诊断癌症。

LOX活性与癌症相关

本领域人员均了解，尽管蛋白在组织中的表达量检测可以反映疾病的发生或发展状况，然而要获得组织切片或细胞样本，必需要获得受试者的身体组织，这在临床上并非上一个简单的过程；并且，获得的身体组织样品后，还需要通过Western Blot、免疫组化等方法进行检测，操作复杂不易控制，从而一定程度限制了这方面的临床应用。而如果可以通过检测体液样本，如血清、唾液等来实现检测，则取样过程的复杂程度大大降低。此外，单单研究蛋白表达量的高低并不能代表其蛋白生物活性的高低，而从研究蛋白的生物活性高低来判断疾病的严重程度或易感性则更加准确和直观。

本发明首次在肺癌患者中对血清LOX水平进行了检测，取材方便、操作简单、便于复查，患者易于接受，并可以通过动态观察指标变化判断疗效，评估预后，指导治疗。

通过检测肺癌患者血清中的LOX活性，本发明人发现，与正常人相比肺癌患者血清中的LOX活性显著增高，说明LOX是肺癌发生的早期事件。而且，与早期的肺癌患者相比，晚期转移的病人血清中LOX的活性也显著增高。同样，有淋巴结转移组高于无淋巴结转移组。以上均说明血清中LOX的活性与TNM分期、转移正相关。提示LOX可以作为临床上肺癌诊断和预后的重要生物学标记物之一。这些发现为肺癌在临床上的诊断或治疗提供了理论基础和新的药靶和策略。血清LOX活性对肺癌的诊断、转移复发的监测有比较重要的临床意义。

因此，基于本发明人的新发现，提供了一种LOX的用途，用于作为癌症的血清标志物。较佳地，所述的癌症是肺癌。更佳地，所述的LOX用于作为肺癌临床分期的血清标志物。

也即：可以利用LOX蛋白：(i)进行癌症的分型、鉴别诊断、和/或易感性分析；(ii)评估相关人群的癌症治疗药物、药物疗效、预后，以及选择合适的治疗方法；(iii)早期评估相关人群癌症患病风险，早期监测早期预防。

通过收集人肺癌临床样本进行血清中LOX活性的检测，还可以分析LOX的活性与肺癌发生发展以及转移的相关性，并为肺癌的转移治疗提供新的诊断标记和分子靶点。

LOX活性检测

关于LOX活性检测，主要原理是对LOX在催化胶原共价交联过程中会产生的H₂O₂进行测定来间接反映LOX的活性。

早期的研究主要应用了氚标记法和高香草酸荧光检测法两种检测方法。前者用氚标记前胶原蛋白底物中的赖氨酸，经赖氨酸氧化酶LOX催化胶原共价交联，在此过程中释放氚标记的H₂O₂，然后采用专门设计的真空蒸馏装置收集氚标记的H₂O₂，再用液体闪烁光谱定量。这种方法的优点为敏感性和特异性高，但需要特制的装备，还涉及到放射性元素带来的安全问题(Bedell-Hogan，D.，P.Trackman，et al.(1993).″Oxidation，cross-linking，and insolubilization ofrecombinant tropoelastin by purified lysyl oxidase.″J Biol Chem 268(14)：10345-50)。而高香草酸荧光检测法基于H₂O₂和高香草酸能在辣根过氧化物酶的催化下按1∶1的摩尔数之比发生氧化反应，产生的荧光物质在317nm激发光作用下产生荧光，通过测定在421nm处的荧光强度间接测定H₂O₂的含量。该方法相对简单易行，但由于该荧光物质的光谱学特性决定了在检测生物样本的过程中很难避免自体荧光干扰，导致其敏感性较低(Trackman，P.C.，C.G.Zoski，et al.(1981).″Development of a peroxidase-coupled fluorometric assay forlysyl oxidase.″Anal Biochem 113(2)：336-42)。

本发明采用安普莱红(Amplex red)荧光法检测LOX的浓度。利用Amplexred和H₂O₂在辣根过氧化物酶的催化下按1∶1的摩尔数之比发生氧化反应，产生荧光物质试卤灵。试卤灵在560nm激发光作用下产生荧光，通过检测发射波长590nm的荧光值对H₂O₂进行定量，间接反映培养基中LOX的浓度。试卤灵的光学特性很好地避免了生物学样本譬如细胞培养上清中自发荧光所带来的干扰，灵敏度较高香草酸荧光检测法高。β-氨基丙腈(BAPN)作为LOX的特异性抑制剂，在体系中加入适量的BAPN可以完全抑制其中LOX的活性，此时用荧光分光光度仪记录到的荧光值就是体系中除LOX以外其它物质产生的荧光值。扣除这部分荧光值就是样品中LOX的荧光值。

试剂组合

本发明还提供了一种试剂组合，所述的试剂组合含有：安普莱红；二氨基戊烷，过氧化氢酶，赖氨酸氧化酶专一性抑制剂(优选BAPN)。

所述的二氨基戊烷可以与LOX发生反应，被LOX氧化生成过氧化氢；所述的过氧化氢在过氧化氢酶催化的条件下可以与Amplex red发生反应生成荧光信号物质(试卤灵)，从而可通过检测荧光信号物质来定性或定量地确定LOX的酶活。

由于二氨基戊烷与LOX的反应是非特异性的，也可能与其它种类的酶发生反应。因此，较佳地，设置另一组试验，其中加入LOX活性抑制剂来抑制LOX的活性。从而，通过将不加入LOX活性抑制剂的试验组的酶活测定结果减去加入LOX活性抑制剂组的酶活测定结果来得到准确的LOX活性测定结果。

在进行反应时，还可加入一些使LOX酶稳定的物质。较佳地，所述的试剂组合还含有选自下组的一种或多种试剂：尿素，四硼酸钠。所述试剂的加入可以使得LOX更稳定，而使得LOX以外的其它酶不稳定；并且，还提供了一个良好的化学环境，使得LOX蛋白保持较为松散的结构，从而更有利于化学反应的进行。

较佳地，当所述试剂混合用于反应时，Amplex red、二氨基戊烷、尿素和四硼酸钠按照摩尔比是1∶(150-250)∶(20000-30000)∶(500-1500)；较佳地是1∶200∶24000∶1000。

较佳地，当所述试剂混合时，尿素终浓度1.2±0.1M；四硼酸钠终浓度0.05±0.005M.；Amplex red终浓度50±5μM；二氨基戊烷终浓度10±1mM。

较佳地，当所述试剂混合时，过氧化氢酶终浓度0.1±0.01U/ml。

较佳地，当所述试剂混合时，赖氨酸氧化酶专一性抑制剂终浓度500±50μM。

本发明还提供了所述试剂组合的应用，用于制备诊断癌症(特别是肺癌)的试剂盒。

以上的试剂组合可以分别置于容器中，或按照适当配比混合后，置于容器中，从而制成一种试剂盒。所述的试剂盒用于诊断癌症，特别是肺癌。

较佳地，所述的试剂盒中还包含有使用说明书。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

I.材料和方法

血清样本的收集

在获得了当地伦理委员会的批准和患者知情同意的前提下，本发明人在2007年7月至2009年3月间从上海复旦大学附属肿瘤医院收集了128例肺癌患者的血清，对照组28例由该院健康查体中心提供，其性别、年龄与肺癌组差异无统计学意义。将血液样本收集在促凝管中，室温下2小时内凝血，4000转5分钟取上清分装冻存在-80℃待测。所有参与这项研究的患者均为初步诊断为肺癌，前期没有接受任何化疗或放疗。本发明人还收集到了患者的一些临床基本资料，包括性别，吸烟史，既往病史和临床病理学分型和病理分期。

Amplex red荧光法检测LOX的浓度

本发明人将收集到的肺癌病人血清取出20μl，加入荧光试剂(1.2M尿素，0.05M四硼酸钠(pH 8.2)，0.1U/ml辣根过氧化物酶，50μM Amplex red和10mM 1，5-二氨基戊烷(diaminopentane))，组成总体积为2ml的溶液，分为各1ml的2等份。其中1等份为A组，即LOX样本组溶液；对应的另一等份为B组，并在其中加入500μM BAPN，然后将A、B两组溶液均放入37℃金属浴中孵育30min后置于冰上，立即用荧光分光光度仪以激发波长560nm和发射波长590nm检测其荧光值。用A组溶液的荧光值分别减去对应的B组溶液的荧光值，即为血清样品中中LOX的荧光值。

统计学分析

本发明人利用SPSS软件对收集的临床资料和对应血清中LOX的荧光值进行了统计分析。所有数据采用均数±标准差表示，组间比较采用t检验和单因素方差分析，确定P＜0.05为差异有显著性。

II.实施例

自2007年7月至2009年3月，本发明人对128位临床上初次诊断为非小细胞肺癌病人的血清样本中LOX的活性进行了检测，并与28名正常健康人作比较(见图1)，发现肺癌患者血清中LOX的活性显著地高于正常人组(P＝0.0067)，提示LOX活性检测可以作为肺癌的早期发现和早期诊断的一种方法，LOX可以作为血清学标记。

通过T检验和单因素方差分析不同临床病理特征的肺癌患者血清中LOX的活性，发现LOX的活性与肿瘤的转移密切相关(P＝0.015)。晚期或是已经发现转移的病人血清中LOX的活性普遍升高(P＝0.014)。而在具有不同临床分期、组织学分型、性别以及吸烟史的病人中LOX的活性没有显著的统计学差异，见表1。

表1.肺癌患者血清中LOX的活性

以上的统计分析说明，LOX除了可以作为肿瘤转移治疗的靶点，还能为肺癌患者病情的诊断提供血清标记。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种赖氨酸氧化酶用作检测癌症的血清标志物的用途。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的癌症是肺癌。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，用作肺癌临床分期的血清标志物。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的用作检测癌症的血清标志物是检测血清中赖氨酸氧化酶的活性。

5.一种试剂组合，所述的组合含有：

安普莱红，二氨基戊烷，过氧化氢酶，赖氨酸氧化酶专一性抑制剂。

6.如权利要求5所述的试剂组合，其特征在于，还含有选自下组的一种或多种试剂：

尿素，四硼酸钠。

7.如权利要求5或6所述的试剂组合，其特征在于，所述的二氨基戊烷是1，5-二氨基戊烷；或所述的过氧化氢酶是辣根过氧化物酶；或所述的赖氨酸氧化酶专一性抑制剂是β-氨基丙腈。

8.权利要求5-7任一所述的试剂组合在制备诊断癌症的试剂盒中的用途。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的癌症是肺癌。

10.一种试剂盒，含有：权利要求5-7任一所述的试剂组合。

11.一种测定赖氨酸氧化酶活性的方法，包括：

(1)将权利要求5的试剂组合中安普莱红；二氨基戊烷，过氧化氢酶混合，形成混合液1；

(2)将权利要求5的试剂组合中安普莱红；二氨基戊烷，过氧化氢酶，赖氨酸氧化酶专一性抑制剂混合，形成混合液2；

12.一种确定癌症或癌症易感性的方法，包括：

检测待测对象血清中的赖氨酸氧化酶的酶活；

若待测对象血清中的赖氨酸氧化酶的酶活显著高正常人群血清中的赖氨酸氧化酶的酶活；则该待测对象是癌症患者或癌症易感性患者。