ES2244417T3 - Inhibidor de tejido de metaloproteasa de matriz tipo-1 (timp-1) como un marcador de cancer. - Google Patents
Inhibidor de tejido de metaloproteasa de matriz tipo-1 (timp-1) como un marcador de cancer.Info
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Abstract
Un procedimiento para determinar si es probable que un individuo tenga un cáncer colorrectal, el procedimiento comprende determinar un primer parámetro que representa la concentración total de TIMP-1 en muestras de plasma, y que señala al individuo como que tiene una alta probabilidad de tener cáncer colorrectal si el parámetro está en o más allá de un valor que discrimina y que señala al individuo como improbable de tener cáncer colorrectal si el parámetro no está en o más allá del valor que discrimina, determinándose dicho valor que discrimina midiendo dicho al menos un primer parámetro tanto en una población control sana como en una población con cáncer colorrectal conocido, determinando de este modo el valor que discrimina el cual identifica la población con cáncer con una especificidad predeterminada o una sensibilidad predeterminada.
Description
Inhibidor de tejido de metaloproteasa de matriz
tipo-1 (TIMP-1) como un marcador de
cáncer.
La presente invención se refiere a una prueba
para usarse para rastrear poblaciones grandes en busca de la
aparición de cáncer colorrectal o cáncer de pulmón metastásico. El
procedimiento se basa en la medida de inhibidor de tejido de
metaloproteasas 1 (TIMP-1) en muestras de sangre. La
invención permite la identificación temprana de pacientes que tienen
cáncer colorrectal. El procedimiento es altamente específico, y los
pacientes con afecciones no malignas, tales como enfermedades del
intestino inflamatorias, no se detectan. La medida de otro
inhibidor similar, TIMP-2, no demuestra valor
clínico equivalente, indicando un nivel adicional de especificidad
de la invención.
La prueba se basa en la medida de inhibidor del
tejido de tipo metaloproteasas (TIMP-1), en el
plasma. Las concentraciones de TIMP-1 se pueden
determinar bien como la concentración de TMPI-1
total, la concentración del TIMP-1 libre, la
concentración de complejos entre TIMP-1 y MMP y/o
razones y fracciones de los mismos, referidas de ahora en adelante
como niveles TIMP-1. De acuerdo con la invención,
los individuos con una alta probabilidad de tener cáncer, por
ejemplo cáncer de colon, se pueden identificar mediante niveles
elevados de TIMP-1 en una muestra de plasma,
mientras individuos con bajos niveles de TIMP-1 es
improbable que sufran de cáncer, por ejemplo cáncer de colon. Así,
la invención se puede usar para identificar individuos con una alta
probabilidad de tener un cáncer en estado inicial, no sintomático,
por ejemplo cáncer de colon. Los individuos identificados se
examinarían adicionalmente y si el cáncer se encuentra, se
propondría a los pacientes cirugía, irradiación, y/o terapia
coadyuvante antineoplásica, incrementando de este modo la
posibilidad de curar el cáncer para el individuo.
El cáncer colorrectal es el cuarto cáncer más
frecuente en el mundo occidental, con aproximadamente 130.000 casos
nuevos anualmente en los Estados Unidos. Del cuarenta al 50% de
todos los pacientes de cáncer colorrectal se pueden diagnosticar
con la fase temprana de la enfermedad (fase de Duke A o B). La
mayoría de los pacientes con la fase temprana del cáncer colorrectal
se pueden curar sólo con cirugía. Así, el riesgo de recurrencia se
refiere estrechamente al estado de enfermedad en el tiempo de la
cirugía primaria, con aproximadamente un 10% de tasa de recaída en
la fase A de Duke y un 25-30% en la fase B de Duke.
Los pacientes con el cáncer colorrectal en la fase C de Duke tienen
una tasa de recaída a los cinco años del 70% después de la cirugía y
se les ofrece a menudo quimioterapia coadyuvante. Después de la
recaída, el riesgo de agonizar de la enfermedad es significativo.
Así, una forma de mejorar la supervivencia es incrementar el número
de pacientes que se diagnostican con un estado temprano de la
enfermedad. Rastrear en busca de cáncer colorrectal se ha mostrado
que mejora la supervivencia, sin embargo, los ensayos actuales
sufren de una falta de conformidad, de baja sensibilidad, y de la
necesidad de restricciones estrictas de la dieta. Así, se necesita
el desarrollo de ensayos nuevos y mejorados para la detección
temprana de cáncer colorrectal.
Debido a que la enfermedad metastásica es la
causa principal de la morbilidad y mortalidad del paciente de
cáncer, las moléculas implicadas en la regulación de la invasión de
tumores y metástasis son atractivas como dianas de
diagnóstico/pronóstico potenciales. Esta bien establecido que las
enzimas proteolíticas producidas por células cancerosas o por
células en el estroma del tumor están implicadas en degradación
extracelular de tejidos, conduciendo a invasión de células
cancerosas y metástasis. Un número de enzimas se ha asociado con
este procedimiento, siendo las más minuciosamente investigadas las
metaloproteasas, tales como las colagenasas y estromelisinas, y las
serina proteasas tales como plasmina. Recientemente, se han
publicado datos que indican que estas moléculas, libres o unidas en
complejos, se liberan del tejido tumoral y encuentran su camino en
la circulación.
Las metaloproteasas de la matriz (MMP) juegan un
papel crucial en el crecimiento y la dispersión del cáncer,
contribuyendo a la degradación enzimática de la matriz extracelular
(Liotta y col., 1991; Stetler-Stevenson y col.,
1993; MacDougall & Matrisian, 1995). Los inhibidores de MMP que
se dan en la naturaleza, los inhibidores de tejido de MMP (TIMP),
forman complejos estequiométricos 1:1 estrechos con las formas
activas de las MMP (Welgus y col., 1985; Kleiner y col., 1993),
inhibiendo de este modo la actividad catalítica de estas enzimas
(Stetler-Stevenson y col., 1996; Goldberg y col.,
1992; Birkedal-Hansen y col., 1993). Mientras el
balance entre las propiedades de degradación de la matriz de MMP y
el efecto inhibidor de TIMP se regula estrechamente bajo
condiciones fisiológicas normales (Matrisian, 1992; Thorgeirsson y
col., 1993; Bierkedal-Hansen y col., 1993), este
balance se puede desbaratar en tejido maligno.
Se ha descrito un número de inmunoensayos unidos
a enzima para la detección de TIMP-1 (Kodama y
col., 1989; Cooksley y col., 1990, Clark y col., 1991) y
TIMP-2 (Fujimoto y col., 1993). Estos ensayos se
han aplicado a fluidos corporales, por ejemplo suero, plasma,
líquido amniótico, fluido cerebroespinal, orina, pero el número de
muestras probadas no se ha validado suficientemente para establecer
intervalos normales para niveles TIMP en individuos sanos (Kodama y
col., Clark y col, 1991). Además, ninguno de estos ensayos se ha
validado suficientemente para la realización técnica o para el uso
clínico.
Se ha encontrado que TMP-1 y mRNA
están asociados con invasión incrementada y pronóstico pobre y
Guillem y col. (Proc. Annu. Meet Am. Assoc. Cancer Res.;
34:A466, 1993) sugieren un posible correlación entre niveles de RNA
de TIMP-1 y cánceres pobremente diferenciados,
colorrectales invasivos. Sin embargo, los niveles de proteína
TIMP-1 en sueros de pacientes de cáncer de próstata
y donantes sanos (Baker y col., 1994) mostraron un alto grado de
solapamiento. De forma similar, un estudio separado de plasma de
pacientes de cáncer de próstata y donantes sanos no mostró ninguna
diferencia en niveles de TIMP-1 entre los dos
grupos (Jung y col., 1997).
Además, Nauro y col. (J. Urol., vol. 1, nº. 3,
septiembre de 1994, páginas 228-231) encontró que
los niveles de TIMP-1 son significativamente mayores
en pacientes con cáncer de vejiga metastásico comparados con un
grupo control sano, mientras que ningún resultado se presentó acerca
de los niveles de TIMP-1 de cánceres de vejiga
premetastásicos. Las medidas de TPM-1 en orina se
han descrito también como que son útiles en la diagnosis de otros
cánceres no gastrointestinales tales como cáncer de vejiga, cáncer
de hígado y cáncer renal (solicitud de patente japonesa nº.
8-136548). En ninguno de estos estudios se ha
incluido una correlación entre el nivel de TIMP-1 de
pacientes con cánceres de vejiga en fase temprana y el nivel de
TIMP-1 de pacientes con cistitis. Esta evaluación
es importante aunque los niveles de TIMP-1 se
incrementan a un nivel similar al nivel de TIMP-1
de cánceres de vejiga en fase temprana.
Las medidas de los niveles de
TIMP-1 han mostrado también ser útiles en
diagnosticar enfermedades del sistema nervioso como se describe en
el documento US 5.324.634.
Los estudios de TIMP-1 formando
complejo con MMP-9 en el plasma de los pacientes con
cáncer gastrointestinal y ginecológico avanzado (Zucker y col.,
1995) demostraron niveles significativamente mayores en muestras de
sangre de pacientes de cáncer con enfermedad metastásica comparados
con individuos controles sanos, y que pacientes con altos niveles
de complejo TIMP-1:MMP-9 tuvieron
una supervivencia corta (Zucker y col., 1995 y documento US
5.324.634). Sin embargo, este estudio no incluye medidas de
TIMP-1 total o libre, sólo el complejo entre
TIMP-1 y uno de los hasta ahora aproximadamente 24
MMP identificados. Además, en este estudio, no se encontraron
diferencias entre los niveles de complejos de cáncer de mama y
donantes sanos. Además, en este estudio, no se encontraron
diferencias en niveles de complejos entre pacientes con cáncer de
mama y donantes sanos. Además, este estudio no incluye pacientes
con cáncer en fase temprana.
En un número de tipos de cáncer, hay una
necesidad crítica e incumplida de marcadores altamente sensibles y
específicos para someter a rastreo grandes poblaciones en busca de
la presencia de enfermedad maligna. Tales marcadores serían capaces
de identificar individuos con una alta probabilidad de cáncer en
fase temprana. Estos individuos se examinarían adicionalmente, y si
el cáncer se encuentra, se les ofrecería subsiguientemente cirugía,
radiación, o terapia coadyuvante antineoplásica.
Dado que las proteasas y sus receptores e
inhibidores parecen jugar un papel crucial en los mecanismos básicos
que conducen a la invasión del cáncer, estas moléculas se pueden
expresar en un punto temporal muy temprano en el proceso
carcinogénico. Como muchas de estas moléculas ejercen su acción
biológica extracelularmente, pueden estar presentes a niveles
elevados en fluidos corporales, incluso en pacientes con enfermedad
maligna invasiva en estado temprano. Además, dado que estas
moléculas están implicadas en las características más básicas de
progresión maligna, por ejemplo invasión y metástasis, se debería
investigar cuales formas de cáncer presentan un incremento en estas
moléculas.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para ayudar en el diagnóstico del cáncer colorrectal
en un paciente, dicho procedimiento comprende determinar la cantidad
de niveles de TIMP-1 total, formando un complejo o
libre y razones y fracciones de los mismos en muestras de
sangre.
Un aspecto de la presente invención se refiere a
un procedimiento para determinar si es probable que un individuo
tenga cáncer colorrectal o cáncer de mama metastásico, el
procedimiento comprende determinar un primer parámetro que
representa la concentración de TIMP-1 en muestras de
plasma, y que señala al individuo como que tiene una alta
probabilidad de tener cáncer si el parámetro está en o más allá de
un valor que discrimina y que señala al individuo como improbable
de tener cáncer si el parámetro no está en o más allá del valor que
discrimina.
El parámetro que representa la concentración de
TIMP-1 puede ser la concentración apropiada de
TIMP-1. TIMP-1 existe tanto en forma
libre como en forma de complejos con metaloproteasas, y se ha
encontrado que un parámetro importante es la concentración total de
TIMP-1, es decir, la suma de TIMP-1
en forma libre y el TIMP-1 en formas complejas. Se
entenderá que las expresiones diferentes de la concentración
apropiada pueden representar la concentración, tales como, por
ejemplo, la concentración multiplicada por un factor, etc., etc., y
tales representaciones distintas se pueden usar igualmente bien para
el propósito de la presente invención dado que se hacen los ajustes
correspondientes.
El valor que discrimina es un valor el cual se ha
determinado midiendo el parámetro en el cual una población control
sana y una población con cáncer conocido determinan de este modo el
valor que discrimina el cual identifica la población con cáncer
bien con una especificidad predeterminada o bien con una
sensibilidad predeterminada basada en un análisis de la relación
entre los valores del parámetro y los datos clínicos conocidos de
la población control sana y la población de pacientes con cáncer,
tal como es patente a partir de la discusión detallada en los
ejemplos en el presente documento. El valor que discrimina
determinado de esta manera es válido para el mismo conjunto
experimental en futuros ensayos individuales.
La especificidad se define como la proporción de
positivos (es decir, individuos que tienen un parámetro que
representa la concentración de TIMP-1 en muestras de
plasma menores que un nivel de diagnóstico predefinido) que se
identifican correctamente mediante el procedimiento de la invención
descrito. La sensibilidad se define como la proporción de negativos
(es decir, individuos que tienen un parámetro que representa la
concentración de TIMP-1 en muestras de plasma menor
que un nivel de diagnóstico predefinido) que se identifican
correctamente mediante el procedimiento descrito.
La invención se puede usar tanto para un
individuo como para una población entera.
En los conjuntos experimentales específicos
descritos en el presente documento, el umbral de concentración de un
total de TIMP-1 útil como un valor que discrimina
se encontró que estaba en el intervalo de 50-160
microgramos/l de TIMP-1 total a una especificidad
del 90%. Otros conjuntos experimentales y otros parámetros darán
como resultado otros valores los cuales se pueden determinar de
acuerdo con las enseñanzas en el presente documento.
El procedimiento se puede aplicar a una población
no seleccionada, pero más apropiadamente a una población ya
identificada que tiene un riesgo incrementado de desarrollar
cáncer, por ejemplo, individuos con una disposición genética,
individuos quienes se han expuesto a sustancias carcinógenas, o
individuos con enfermedades no malignas que predisponen al cáncer.
En el caso del cáncer colorrectal, la población seleccionada para
la invención puede representar individuos con un pólipo previo,
individuos con enfermedad de Crohn o colitis ulcerativa, individuos
con uno o más miembros familiares con cáncer colorrectal o
individuos con una resección previa de un cáncer colorrectal
temprano.
Cuando un individuo se ha identificado como que
tiene altos niveles de TIMP-1 en su plasma el
individuo se referiría para examen adicional. Si se encuentra un
cáncer, se puede ofrecer al paciente cirugía, radiación o la terapia
antineoplásica coadyuvante que ayuda a curar al paciente de
cáncer.
El ejemplo 1 describe la preparación y validación
de un ensayo que mide el TIMP-1 total con alta
sensibilidad y especificidad analítica. Se describe que los
donantes de sangre sanos tienen un muy estrecho intervalo de
TIMP-1 total en plasma.
En el ejemplo 2, se describe el formateo de un
ELISA TIMP:MMP-9. El formato, ejecución, y
validación de este ensayo son similares a aquellos para el
TIMP-1 total, excepto que un anticuerpo policlonal
contra MMP-9 se usa en la etapa de captación.
Sustituyendo el anticuerpo MMP-9 con un anticuerpo
contra otro MMP, se pueden cuantificar los complejos entre
TIMP-1 y otros MPP.
En el ejemplo 3, se describe el formateo de un
ensayo TIMP-1 el cual mide exclusivamente
TIMP-1 libre. Este ensayo usa un anticuerpo
monoclonal anti-TIMP-1 (MAC 19) el
cual sólo reconoce TIMP-1 en su forma que no está
formando complejos. Así, este ensayo medirá la cantidad de
TIMP-1 libre en una muestra. La ejecución y
validación de este ensayo son similares al ensayo para el
TIMP-1 total.
Sustrayendo la concentración de
TIMP-1 libre de la concentración de
TIMP-1 total en una muestra biológica, se puede
determinar la concentración de todas las formas complejas de
TIMP-1. Debería enfatizarse que
TIMP-1 puede formar complejos con muchos de los MMP
y por lo tanto, sustraer un tipo de complejo de la cantidad total
de TIMP-1 sólo proporcionará información de la
fracción de TMIP-1 que no está formando complejos
con este MPP específico.
En el ejemplo 4, se muestra que los pacientes
sufren de cáncer colorrectal tienen los niveles de
TIMP-1 total significativamente elevados en sus
muestras de plasma preoperativas. Un trazado de percentil de los
niveles totales de TIMP-1 en plasma de todos los
pacientes de cáncer colorrectal y de donantes de sangre sanos
muestra que un total de concentración de TIMP-1 de
119,1 \mug/l es el centil nonagésimo de los donantes sanos.
Usando este corte, el 68% de los pacientes de cáncer colorrectal se
identificaron como que tienen niveles de TIMP-1
elevados en plasma. Cuando analizamos los pacientes de cáncer de
control por separado, se muestra que las medidas de
TIMP-1 total en plasma identificaron el 75% de los
pacientes de cáncer de colon (sensibilidad diagnóstica) con un 90%
de especificidad diagnóstica (el 10% de los donantes de sangre sanos
se clasificaron como que eran elevados). De forma similar, se
mostró solo para los pacientes de cáncer rectal, que las medidas
totales de TIMP-1 en plasma identificaron el 60% de
los pacientes de cáncer rectal con una especificidad de diagnóstico
del 90%. Si se desea una especificidad mayor o menor, el valor de
corte se puede cambiar. Esto se ilustra en la figura 13, mostrando
curvas de ROC de TIMP-1 total en plasma a partir de
pacientes de cáncer colorrectal. Además, las curvas de ROC se
incluyen para los grupos individuales de pacientes de cáncer de
colon y cáncer rectal. Cualquier otra información la cual se puede
derivar de estas curvas de ROC cae dentro del alcance de la presente
invención.
Un estudio prospectivo independiente, incluyendo
muestras preoperativas de plasma de 64 pacientes con cáncer de colon
(n = 43) o rectal (n = 21) confirmó los datos obtenidos del estudio
descrito anteriormente (figura 15). Un estudio adicional de 180
donantes de sangre sanos y 20 pacientes de cáncer colorrectal,
usando anticuerpos diferentes (anti TMP-1 11/E/C6,
anti TIMP-1 RRU-T6) en un ensayo
automatizado, corroboró adicionalmente los resultados clínicos
previos.
Además, los valores absolutos generados del
ensayo automatizado mostraron un alto grado de correlación con los
así obtenidos mediante el ensayo descrito en el ejemplo 1 (r =
0,9). El valor clínico de un marcador para rastreos de cáncer se
refiere a su capacidad para detectar fases tempranas de la
enfermedad, que influyendo potencialmente en la supervivencia. Se
ha mostrado que el TIMP-1 total fue eficiente como
un marcador de rastreo en cáncer colorrectal en fase temprana
(fases A y B de Duke) y estaba en la población total de pacientes de
cáncer colorrectal (figura 14). Así, rastrear con el
TIMP-1 total dará como resultado más pacientes con
cáncer en fase temprana diagnosticándose. De forma similar,
cualquier información que se puede derivar de la figura 14 cae
dentro del alcance de la presente invención.
Dividiendo los pacientes de cáncer de colon en
dos grupos, los pacientes con tumores situados en el lado derecho y
en el izquierdo respectivamente, es evidente que la medida del
TIMP-1 total fue especialmente útil en identificar
aquellos pacientes con lesiones en fase temprana, de cáncer de colon
situadas en el lado derecho (figura 14).
La especificidad de un ensayo de rastreo de
cáncer dado se basa en la eficiencia del ensayo para identificar
sólo aquellos pacientes que sufren de cáncer mientras pacientes que
sufren de enfermedades no malignas no se identificarían como
sujetos falsos positivos. En el caso del cáncer colorrectal, es
importante que el ensayo en cuestión pueda distinguir entre
enfermedades malignas y no malignas en el colon y rectales. Esto es
particularmente importante para enfermedades como enfermedad de
Crohn y colitis ulcerativa, dado que los pacientes con estas
enfermedades están en más alto riesgo de desarrollar cáncer.
En el ejemplo 5 se muestra que los niveles
totales de TIMP-1 son significativamente más altos
en pacientes con cáncer colorrectal que en pacientes con
enfermedades inflamatorias del intestino (IBD), mostrando que el
TIMP-1 total se puede usar para rastrear cáncer
colorrectal en una población de pacientes con IBD. Que
TIMP-1 no está incrementado en enfermedades no
malignas se sustenta por un artículo reciente (Keyser y col, 1999)
que demuestra que los pacientes con artritis reumatoide no tienen
incrementados los niveles de TIMP-1 en el plasma.
Además, comparando los niveles totales de TIMP-1
entre pacientes con IBD (excluyendo pacientes con enfermedad activa
aguda clínicamente evaluada, n = 4) y donantes de sangre sanos, no
se encontraron diferencias significativas en niveles de
TIMP-1 en plasma totales (p = 0,56), mostrando que
estas enfermedades no malignas no proporcionan resultados de ensayo
positivos falsos.
En el ejemplo 6, se describe el efecto aditivo de
la medida de un marcador de cáncer colorrectal adicional. Se midió
el antígeno carcinoembriónico (CEA) en todas las muestras de
pacientes de cáncer y donantes de sangre sanos. Combinando los
niveles de CEA y TIMP-1 medidos mediante el ensayo
descrito en el ejemplo 1, se pudo mostrar que mientras CEA solo
proporciona 35% de sensibilidad y un 98% de especificidad, la
sensibilidad de la combinación de CEA y el TIMP-1
total según se determina mediante análisis de regresión logística
se incrementa al 57% sin sacrificar especificidad.
En el ejemplo 7 se muestra que pacientes que
sufren de cáncer colorrectal tienen niveles de
TIMP-1 libres significativamente elevados en sus
muestras de plasma preoperativas. Un trazado de percentil que
incluye los niveles de TIMP-1 libre de los
pacientes de cáncer colorrectal como también los niveles de
TIMP-1 libre de donantes de sangre sanos, mostró
que los pacientes de cáncer colorrectal tienen significativamente
elevados los niveles de TIMP-1 comparados con los
donantes de sangre, p = 0,02. Se creó una curva de ROC (figura 18)
para estos pacientes y donantes y se vio que el
TIMP-1 libre proporcionó un área bajo la curva
(AUC) de 0,61.
En el ejemplo 8, se describe el uso del complejo
de ensayo TIMP-1:MMP-9 como una
ayuda para el diagnóstico colorrectal.
Se conoce TIMP-1 por existir bien
como la molécula libre o bien en complejo con MPP, preferiblemente
MPP-9. Medir el TIMP-1 total, el
TIMP-1 en complejos y el TIMP-1
libre, hará posible validar cada una de estas especies por su
potencial valor diagnóstico. Además, será posible calcular
relaciones o cualquier algoritmo derivado entre las diferentes
especies las cuales pudieron proporcionar valor diagnóstico
adicional.
En el ejemplo 9, se describe el valor diagnóstico
de la combinación de TIMP-1 total o libre.
Los datos muestran que combinando mediante
análisis de regresión logística las medidas de
TIMP-1 libres con las medidas totales de
TIMP-1, está demostrado un incremento significativo
en el AUC. Cualquier información que se puede derivar de la figura
18 cae dentro del alcance de la presente invención.
La especificidad de un ensayo de rastreo de
cáncer dado se basa en la eficacia del ensayo para identificar sólo
aquellos pacientes que sufren de cáncer mientras los pacientes que
sufren de enfermedades no malignas no se identificarían como falsos
positivos. Sin embargo, sería deseable que el ensayo fuese
específico para un tipo específico de cáncer, por ejemplo cáncer de
colon, en vez de se un marcador de todos los cánceres.
En el ejemplo 10, se describen los valores
TIMP-1 totales de plasma en muestras de sangre
preoperativas a partir de una cohorte de 322 pacientes con cáncer de
mama primario (fases I y II) comparados con los niveles de
TIMP-total en 108 donantes de sangre sanos. Se
muestra que los pacientes de mama tienen una mediana de nivel de
TIMP-1 total de 88,3 \mug/l, mientras que los
donantes sanos tienen una mediana de nivel de
TIMP-1 total de 88,9 \mug/l. La diferencia entre
estos valores no es clínicamente significativa, sustentando la
especificidad de los niveles de TIMP-1 para el
diagnóstico del cáncer colorrectal. Sin embargo, se estudiaría si
los niveles de TIMP-1 en plasma elevados se
encuentran en pacientes con cáncer no colorrectal en estado
temprano.
En el ejemplo 11, se describen los niveles
totales de TIMP-1 en pacientes con cáncer de mama
metastásico.
De importancia, el TIMP-1 total
en plasma de mujeres con cáncer de mama metastásico tienen un valor
de mediana de 236 \mug/l, significativamente más alto que niveles
en donantes de sangre sanos. Esto muestra el potencial de usar
niveles de TIMP-1 en plasma para el manejo de
pacientes de cáncer de pulmón.
En el ejemplo 12, se describen las
concentraciones de TIMP-2 en muestras preoperativas
de plasma de pacientes con cáncer colorrectal.
El TIMP-2 es otro inhibidor de
tejido de metaloproteasas con un alto grado de homología frente a
TIMP-1. Usando un inmunoensayo específico para
TIMP-2, las concentraciones de este inhibidor se
determinaron en muestras de plasma de pacientes de cáncer
colorrectal y en donantes de sangre sanos. No se encontraron
diferencias significativas en niveles de TIMP-2 en
plasma entre las dos poblaciones, sustentando el valor único de
TIMP-1 como una ayuda para el diagnóstico temprano
del cáncer colorrectal.
Figura 1: ensayo cinético para
TIMP-1. Curvas progresivas para el cambio en
absorbancia a 405 nm producidos mediante hidrólisis de
p-nitrofenilfosfato mediante inmunoconjugado de
fosfatasa alcalina unido a fase sólida. Los datos mostrados se
generan mediante 4 pocillos de ensayo individual tratados con 4
concentraciones diferentes de TIMP-1 purificado
recombinante; 10 \mug/l (\nabla-\nabla), 2,5
\mug/l (\Delta-\Delta) 0,63 \mug/l
(\Box-\Box) y 0,16 \mug/l
(\medcirc-\medcirc). Las líneas mostraron
haberse ajustado por simple regresión lineal.
Figura 2: curva estándar de
TIMP-1. Se recogieron automáticamente unidades de
absorbancia por estándares de TIMP-1 triplicados en
el intervalo de 0 a 5 \mug/l durante 60 minutos, con lecturas
tomadas a 405 nm cada 10 minutos. Las curvas de progreso se
introducen en el ordenador por cada pocillo y las velocidades
obtenidas se ajustan a una curva estándar usando una evaluación de
cuatro parámetros de la forma y = d + [(a-d)/(1 +
(x/c)^{b})]. En el ejemplo mostrado, los cuatro parámetros
derivados tienen los siguientes valores: a = 1,87, b = 1,11, c =
3,35, d = 73,5. El coeficiente de correlación para la curva
ajustada es >0,999.
Figura 3: recuperación de señal de
TIMP-1 estándar añadido en concentración
incrementada para el tampón de dilución de ensayo
(\Box-\Box), una dilución 1:100 de reserva de
plasma-EDTA (\Delta-\Delta), una
dilución 1:100 de reserva de plasma-citrato
(\nabla-\nabla) y una dilución 1:100 de reserva
de plasma-heparina
(\medcirc-\medcirc). Los valores mostrados son
las medias de triplicados. El coeficiente de correlación para cada
curva ajustada es mayor de 0,99.
Figura 4: realización de Western blot de muestra
de plasma del paciente inmunoabsorbida. Carril 1;
TIMP-1 estándar; carril 2: eluato de muestra de
plasma-citrato del paciente diluido 1:10 e
inmunoabsorbido con anti-TIMP-1
policlonal de oveja. Las bandas de TIMP-1 estándar
no reducido y TIMP-1 aislado a partir de la muestra
de plasma aparecen ambas justo debajo de 30 kDa.
Figura 5a: trazado de percentiles para el nivel
de TIMP-1 (\mug/l) medidos en
plasma-citrato (\medcirc) y
plasma-EDTA (\Delta) del mismo individuo en un
grupo de 100 donantes de sangre voluntarios.
Figura 5b: trazado de regresiones lineales para
el nivel de TIMP-1 en muestras de
plasma-citrato comparadas con muestras de
plasma-EDTA de los mismos 100 individuos. La
ecuación de la línea ajustada es y = 0,93x, con un coeficiente de
regresión de 0,99.
Figura 6: trazado de percentiles para los niveles
de TIMP-1 (\mug/l) medidos en dos grupos de
muestras de plasma-citrato obtenidas mediante el
mismo procedimiento a partir de donantes de sangre voluntarios a
tiempos diferentes. 100 muestras de mayo = 97 (\Delta) y 94
muestras de septiembre = 96 (\Box).
Figura 7: trazado de percentiles para los niveles
de TIMP-1 (\mug/l) medidos en 194 muestras de
plasma-citrato a partir de donantes de sangre
voluntarios y estratificados por sexo en 107 machos (\Delta) y 87
hembras (\medcirc).
Figura 8: ilustración gráfica del ELISA del
complejo TIMP-1:MMP-9.
Figura 9: ilustración gráfica del ELISA de
TIMP-1.
Figura 10: se recubrió una placa con el
anticuerpo policlonal anti-MMP-9. Se
añadieron diferentes concentraciones del complejo
TIMP-1:MPP-9, MMP-9
libre, TIMP-1 libre y un control blanco. Sólo se
unieron mediante el anticuerpo
anti-MMP-9 policlonal de captación
complejos TIMP-1:MMP-9 y
MMP-9 libre. Se añadió después MAC19 para detección
de antígenos. Ni el complejo
TIMP-1:MMP-9 ni el
MMP-9 libre se detectaron mediante MAC19, definiendo
la especificidad de este anticuerpo por TIMP-1
libre.
Figura 11: se recubrió una placa con el
anticuerpo policlonal anti-MMP-9. Se
añadieron diferentes concentraciones del complejo
TIMP-1:MPP-9, MMP-9
libre, TIMP-1 libre y un control blanco. Sólo se
unieron mediante el anticuerpo
anti-MMP-9 policlonal de captación
complejos TIMP-1:MMP-9 y
MMP-9 libre. Después se añadió MAC15 para detección
de antígeno. Sólo se detectó mediante MAC15 el complejo
TIMP-1:MMP-9 unido por el anticuerpo
anti-MMP-9 policlonal de captación.
El MMP-9 libre no se detectó mediante MAC15.
Figura 12: recuperación de señal en el ensayo de
TIMP-1 libre de TIMP-1 estándar
añadido en concentración creciente para ensayar tampón de dilución
(\Box-\Box), una dilución de reserva de
plasma-EDTA (\Delta-\Delta), una
dilución de reserva de plasma-citrato
(\medcirc-\medcirc) y una dilución de reserva
de plasma-heparina
(\medcirc-\medcirc). Los valores mostrados son
las medias de triplicados. El coeficiente de correlación para cada
curva ajustada es mayor de 0,99.
Figura 13: curvas de ROC para
TIMP-1 total en todos los pacientes de cáncer
colorrectal, en pacientes de cáncer rectal por separado y en
pacientes de cáncer de colon por separado. Como sujetos de control
sanos, se usó una cohorte de 108 donantes de sangre sanos (número
entre paréntesis = área bajo la curva).
Figura 14: curvas de ROC para
TIMP-1 total en todos los pacientes de cáncer
colorrectal con enfermedad de Duke A o B. Además, se incluyen las
curvas de ROC para pacientes de Duke A o B con cáncer de colon o con
cáncer de colon situado a la derecha (número entre paréntesis = área
bajo la curva).
Figura 15: se muestra curva de ROC para
TIMP-1 total a partir de un grupo independiente de
64 pacientes de cáncer colorrectal comparados con 108 donantes de
sangre sanos. (AUC = área bajo la curva).
Figura 16: conjunto de recuadros que muestran
concentraciones de TIMP-1 totales en plasma a partir
de donantes de sangre sanos, de pacientes con enfermedad de Crohn,
de pacientes con colitis ulcerativa y de pacientes con cáncer
colorrectal. Se muestran medianas, y centiles 10º, 25º, 75º y
90º.
Figura 17: curvas de ROC para
TIMP-1 total, CEA y para la combinación de
TIMP-1 total y CEA en pacientes con cáncer de colon
situado a la derecha y 108 donantes de sangre sanos. (Número entre
paréntesis = área bajo la curva).
Figura 18: curvas de ROC para
TIMP-1 libre en plasma, para TIMP-1
total en plasma y para la combinación de ellos en 64 pacientes de
CRC y 108 donantes. (Número entre paréntesis = área bajo la
curva).
Figura 19: curva de ROC para 322 pacientes de
cáncer de mama primarios y 108 donantes de sangre. (AUC = área bajo
la curva).
Figura 20: conjunto de percentiles para el nivel
del TIMP-1 total (\mug/l) medidos mediante ELISA
en 19 muestras de plasma-EDTA de pacientes femeninos
de cáncer de mama (\medcirc) y 87 donantes de sangre sanos
(\Delta).
Este ejemplo describe la preparación y validación
de un ELISA que mide los niveles totales de TIMP-1
en plasma. Además, este ejemplo proporciona información sobre
niveles TIMP-1 en diferentes preparaciones de plasma
también como en donantes de sangre sanos de ambos sexos.
Las muestras de sangre se obtuvieron inicialmente
a partir de 94 donantes de sangre voluntarios aparentemente sanos,
comprendiendo 51 machos de 19 a 59 años (mediana: 41 años) y 43
hembras de 20 a 64 años de edad (mediana: 36 años). En una recogida
subsiguiente, se obtuvieron 100 muestras de donantes, comprendiendo
56 machos de 19 a 59 años de edad (mediana: 42 años) y 44 hembras de
20 a 60 años de edad (mediana: 36,5 años). Se obtuvo el
consentimiento informado de todos los donantes, y el permiso de los
Comités Éticos locales.
Se sacó sangre periférica con estasis mínima (si
es necesario se aceptó un máximo de 2 minutos de estasis con un
torniquete a un máximo de +2 kPa) en citrato
pre-congelado, EDTA, o tubos de recogida de heparina
(Becton-Dickinson, Mountain View, CA), mezclado 5
veces mediante inversión, e inmediatamente congelado en hielo. Tan
pronto como fue posible (no más tarde de 1,5 horas después de
recogida) el plasma y las células sanguíneas se separaron mediante
centrifugación a 4ºC a 1.200 x g durante 30 minutos, y se
almacenaron congelados a -80ºC previamente al ensayo. Las reservas
de plasma se hicieron con muestras recogidas recientemente a partir
de al menos diez donantes, se alicuotaron y almacenaron en frío a
-80ºC. Para análisis, las muestras se descongelaron en baño de agua
a 37ºC y después se situaron en hielo hasta que se necesitó.
Se preparó un ELISA en sándwich sensible y
específico, usando anticuerpos de TIMP-1
desarrollados en los Strange-ways Laboratories
(Hembry y col., 1985). Un antisuero
anti-TIMP-1 policlonal de oveja
(Hembry y col., 1985; Murphy y col., 1991) se usó para captación de
antígeno, y una IgG1 anti-TIMP-1
monoclonal murina (MAC-15) (Cooksley y col., 1990)
se usó para detección de antígeno. Un conjugado de inmunoglobulina
antirratón de conejo/fosfatasa alcalina (número de catálogo D0314,
Dako, Glostrup, Dinamarca) fue el reactivo secundario de detección.
El último conjugado se suministró preadsorbido con IgG humana,
eliminando así reactividad cruzada en IgG en las muestras de plasma.
Como el anticuerpo de detección monoclonal MAC-15
reconoce tanto TIMP-1 libre como
TIMP-1 en complejo con MMP (Cooksley y col., 1990),
el contenido en TIMP-1 total mediante el antisuero
anti-TIMP-1 policlonal de oveja se
cuantificó mediante el ELISA.
Se recubrieron placas de microvaloración de 96
pocillos (Maxisorp, Nunc, Roskilde, Dinamarca) durante 1 hora a 37ºC
con 100 \mul/pocillo de
anti-TIMP-1 de oveja policlonal (4
mg/l) en tampón carbonato de 0,1 moles/l, pH 9,5. Los pocillos se
aclararon dos veces con 200 \mul/pocillo de disolución de
SuperBlockJ (Pierce Chemicals, Rockford, IL) diluida 1:1 con
disolución salina tamponada con fosfato (PBS). Las placas de
microtitulación se almacenaron durante hasta 14 días a -20ºC. En el
día del análisis, las placas se descongelaron a temperatura
ambiente y se lavaron 5 veces en PBS que contiene 1 g/l de
Tween.
Se usó una serie de estándares de
TIMP-1 purificado humano recombinante para calibrar
cada placa. Los estándares se prepararon diluyendo en serie una
disolución de reserva de TIMP-1 purificado. Las
concentraciones estándar fueron 10, 5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,313 y
0,156 \mug/l. Se incluyó en cada placa un blanco que contenía
sólo tampón de dilución de muestras, y 2 controles hechos de una
dilución 1:100 de una reserva de plasma-citrato. Se
añadió un control como la primera muestra en la placa y se añadió
el segundo control como la última. Todas las muestras de plasma se
diluyeron 1:100 en tampón de muestra constituido por 50 moles/litro
de fosfato, pH 7,2, 0,1 moles/l de NaCl, 10 g/l de seroalbúmina
bovina (fracción V, Boehringer-Mannheim, Penzberg,
Alemania), y 1 g/l de Tween 20. Se incubaron en la placa un total
de 100 \mul/pocillo de cada estándar, blanco, control, y muestra
de paciente durante 1 hora a 30ºC. Todos los estándares, blancos,
controles, y muestras se corrieron por triplicado en cada placa para
cada ensayo. Después de la incubación primaria, los pocillos se
lavaron 5 veces, después se trataron durante 1 hora a 30ºC con 100
\mul/pocillo de anticuerpo monoclonal MAC-15
purificado (0,5 mg/ml) en tampón de muestra de dilución. Después de
otros cinco lavados los pocillos se incubaron durante 1 hora a 30ºC
con 100 \mul/pocillo de conjugado de inmunoglobulinas (Ig)
antirratón de conejo/fosfatasa alcalina diluido 1:2000 en tampón de
dilución de muestras. Después de 5 lavados con disolución de lavado
y 3 lavados con agua destilada, se añadieron a cada pocillo 100
\mul de disolución sustrato (1,7 g/l en 0,1 moles/l de
Tris\cdotHCl, pH 9,5, 0,1 moles/l de NaCl, 5 mmoles/l de
MgCl_{2}) p-nitrofenilfosfato (Sigma, San Luís,
MO) recién preparada. La placa se situó en un lector de placas Ceres
900J (Bio-Tek Instruments, Winooski, VT) a 23ºC con
la formación del color amarillo controlada automáticamente. Las
lecturas se tomaron a 405 nm frente a un blanco de aire cada 10
minutos durante una hora. El software KinetiCalc II se usó para
analizar los datos calculando la velocidad de formación de color
para cada pocillo (análisis de regresión lineal), generando una
curva estándar ajustada según 4 parámetros, y calculando la
concentración de TIMP-1 de cada muestra de
plasma.
La recuperación de señal de
TIMP-1 se midió siguiendo adición de diluciones
1:100 de reservas de plasma-citrato,
plasma-EDTA o plasma-heparina. Se
añadió TIMP-1 purificado a las reservas de plasma
para dar concentraciones finales en el intervalo de 0 a 10
\mug/l. La recuperación se calculó en cada caso a partir de la
pendiente de la línea que representa la señal de
TIMP-1 como una función de la concentración, donde
se definió el 100% de la recuperación como la pendiente obtenida
cuando TIMP-1 se diluyó en tampón de dilución de
muestra.
El plasma-citrato de un paciente
con un alto nivel de TIMP-1 en sangre (634
\mug/l, determinado por ELISA), se diluyó 1:10 y se añadió a una
columna de proteína A-sefarosa preincubada con
anti-TIMP-1 de oveja policlonal.
Después de 5 ciclos, las proteínas unidas se eluyeron a partir de
la columna y 50 \mul del eluato resultante se corrieron en gel de
electroforesis de SDS al 12% (Ready GelJ, Bio-Rad).
Una mezcla de marcadores de bajo peso molecular (Pharmacia) y de
alto peso molecular (Bio-Rad) y 50 \mul de
TIMP-1 estándar (100 \mug/l) en tampón de muestra
de Laemmli se corrieron también en el gel. Las proteínas se
transfirieron electroforéticamente desde el gel sobre una membrana
de difluoruro de polivinilideno (PVDF) (Millipore). La membrana se
incubó durante 1 hora a temperatura ambiente con 20 ml de
MAC-15 (5 mg/l). La membrana se lavó e incubó
después durante una hora adicional a temperatura ambiente con 20 ml
de conjugado de inmunoglobulina antirratón de conejo/fosfatasa
alcalina diluido 1:1000. Finalmente la membrana se lavó y el color
se formó mediante la adición de una disolución sustrato de fosfato
(NBT/BCIP).
La formación de color en cada pocillo progresó
como una función lineal del tiempo para todas las concentraciones de
TIMP-1 total en estos experimentos (figura 1), con
coeficientes de correlación para las líneas ajustadas típicamente
mayores de 0,99. La curva estándar para las velocidades trazada
frente a la concentración de TIMP-1 estaba
constituida por las regiones lineales y curvadas superiores (por
encima del intervalo de 0 a 5 \mug/l) de una curva sigmoidal, y
el coeficiente de correlación para el ajuste del parámetro 4 fue
típicamente mejor que 0,999 (figura 2). La velocidad con nada de
TIMP-1 (leer un blanco de aire) fue 1,21 \pm 0,15
(media \pm SD), unidades de miliabsorbancia/minuto (n = 29),
mientras la velocidad con 10 \mug/l de TIMP-1
estándar fue de 50,3 \pm 6,01 unidades de miliabsorbancia/minuto
(n = 29). El límite de detección para el ensayo, definido como la
concentración de TIMP-1 correspondiente a una señal
3 SD por encima de la media para el blanco TIMP-1,
fue 0,089 \mug/l. Este valor fue el 13% de la media de las
concentraciones medidas de TIMP-1 en muestras de
plasma-citrato sanas. El coeficiente de variación
intraensayo (CV) para 16 repeticiones de una reserva de
plasma-citrato de control fue 5,3%, y el CV
intraensayo durante 29 análisis sucesivos de la reserva del plasma
(llevados a cabo diferentes días) fue 6,2%. Esta reserva de plasma
tiene una concentración de TIMP-1 de 57,8 \mug/l,
que corresponde al centil 22º de los individuos normales.
Recuperación del TIMP-1
recombinante después de dilución en plasma. La recuperación
específica se determinó mediante adición de concentraciones
crecientes de TIMP-1 purificado a un panel de
replicados de reserva de plasma, seguidos por la medida de señal
subsiguiente. La recuperación fue 104% en
plasma-citrato, 101% en plasma-EDTA
diluido, y 87% en plasma-heparina diluido (figura
3). Así la recuperación de la señal de TIMP-1 a
partir de un estándar interno fue aceptable para todas las
preparaciones de plasma.
Se hicieron diluciones en serie de reservas de
plasma-citrato, plasma-EDTA y
plasma-heparina para someter a ensayo la reducción
lineal en la señal de TIMP-1. Los plasmas -citrato,
-EDTA y -heparina proporcionaron todos buena linealidad de señal
como una función de dilución. La dilución del plasma al 1% la cual
se escogió para las determinaciones subsiguientes se presentó bien
dentro del intervalo de esta curva de dilución lineal.
Un ensayo de bandas de Western de una muestra de
plasma de paciente inmunoabsorbida mostró una banda clara de 28 kDa
(figura 4, carril 2), correspondiente a TIMP-1
libre, que no forma complejo (figura 4, carril 1). No se encuentra
ninguna banda a los pesos moleculares mayores esperados
correspondientes a complejos entre MMP y TIMP-1, por
ejemplo MMP-2:TIMP-1, 100 kDa. Esto
indica bien que la mayor parte de TIMP-1 estuvo
presente en el plasma como forma libre, o bien que los complejos se
disociaron durante SDS- PAGE. Aunque la muestra se dejó tanto no
reducida como no calentada con el fin de preservar cualesquiera
complejos presentes en la muestra de plasma, se ha comunicado que
los complejos MMP:TIMP pueden ser inestables en
SDS-PAGE (Wilhelm y col., 1989;
Stetler-Stevenson y col., 1989; Moll y col., 1990),
incluso bajo condiciones no reductoras (Moutsiakis y col.,
1992).
Una colección de muestras de
plasma-citrato y plasma-EDTA tomadas
simultáneamente de 100 donantes sanos estuvo disponible para este
estudio. Estas muestras no se recogieron específicamente como plasma
pobre en plaquetas. Sin embargo, un número de muestras pequeño,
representativo, preparadas en forma de plasma pobre en plaquetas, no
se diferencian significativamente en valores de
TIMP-1 totales. Los trazados de percentiles para
niveles de TIMP-1 totales en estas muestras se
muestran en la figura 5a. Los valores en cada grupo se aproximaron
a una distribución normal. Los niveles de TIMP-1 de
plasma-citrato variaron entre 0,55 y 90,3 \mug/l
(del percentil 10º al 90º) con una media de 69 \pm 13,1 \mug/l.
De forma similar, los niveles de TIMP-1 en
plasma-EDTA variaron de 58,0 a 91,8 \mug/l con
una media de 73,5 \pm 14,2 \mug/l. Tanto para
plasma-citrato como para
plasma-EDTA, los niveles medios de
TIMP-1 estuvieron en proximidad cercana a los
niveles de la mediana (tabla 1). Una comparación de dos en dos
mostró que el nivel de TIMP-1 en
plasma-citrato fue significativamente menor que
4,34 \mug/l (95% CI: 2,43-6,33; (p < 0,0001))
que el nivel de plasma-EDTA del mismo individuo.
Sin embargo, es probable que esta diferencia se pueda deber a la
variabilidad en el procedimiento de toma de muestras durante la
recogida de plasma. Los tubos de plasma-EDTA
contuvieron material anticoagulante seco, mientras los tubos de
plasma-citrato contuvieron una pequeña cantidad de
tampón de citrato líquido el cual proporcionó un error de dilución
sistemático pequeño y variable (x 9/10). El nivel de
TIMP-1 en plasma-citrato estaba
correlacionado con el de plasma-EDTA de los mismos
individuos. El ordenamiento de regresión lineal en la figura 5b
muestra un coeficiente de regresión de 0,99 con una pendiente de la
línea ajustada de 0,93, quizás ilustrando este pequeño error de
dilución. Un ensayo de rango de Spearman no paramétrico para el
grupo de datos proporcionó un valor de rho de 0,62 y p <
0,0001.
Se ensayaron un total de 194 muestras de
plasma-citrato de donantes de sangre sanos,
comprendiendo 94 muestras tomadas durante una recogida y 100
muestras tomadas 9 meses más tarde de un grupo de donantes
diferente. La figura 6 muestra los trazados de percentil para los
niveles de TIMP-1 medidos en estos dos grupos
independientes. El intervalo de referencia para niveles
TIMP-1 en plasma-citrato de la
primera recogida fue de 53,3 a 77,7 \mug/l (del percentil 10º al
90º) con una media de 65,4 \pm 10,1 \mug/l el cual fue
indistinguible de la mediana (tabla 1) y aproximadamente una
distribución normal. El nivel medio TIMP-1 para la
segunda recogida fue 69,2 \pm 13,1 \mug/l (intervalo de
referencia de 55,0 a 90,3 \mug/l). Una comparación no de dos en
dos mostró que los niveles de TIMP-1 en los dos
grupos de muestras tomados durante dos periodos diferentes
diferenciados sólo por 3,82 \mug/l (95% CI:
0,50-7,14 \mug/l; p < 0,024). Además, no es
patente ninguna diferencia significativa entre los controles (n =
8) incluidos en cada grupo de ensayos (diferencia media 0,36
\mug/l; 95% CI: 1,71-2,44 \mug/l; p = 0,69). El
nivel medio TIMP-1 para todas las 194 muestras de
plasma-citrato fue 67,3 \pm 11,8 \mug/l, cerca
de la mediana de 66,1 \mug/l, con niveles que se aproximan de
nuevo a una distribución normal (intervalo de referencia de 54,0 a
82,7 \mug/l).
| Sumario de niveles de TIMP-1 total determinados en sangre de donantes sanos | |||||
| Fracción | Fecha de | Número de | Media \pm | Mediana | Intervalo de |
| sanguínea | recogida de | muestras | SD (\mug/l) | (\mug/l) | referencia* |
| muestras | (\mug/l) | ||||
| Plasma-citrato | Septiembre 96 | 94 | 65,4 \pm 10,1 | 65,6 | 53,3-77,7 |
| Plasma-citrato | Mayo 97 | 100** | 69,2 \pm 13,1 | 67,0 | 55,0-90.3 |
| Plasma-citrato | 96 + 97 | 194 | 67,3 \pm 11,8 | 66,1 | 54,0-82,7 |
| Plasma-EDTA | Mayo 97 | 100** | 73,5 \pm 14,2 | 71,2 | 58,0-91,8 |
| *El intervalo de referencia se define como el percentil del 10º al 90º. | |||||
| **Estas muestras se recogieron de los mismos donantes. |
En estos estudios, los valores control medidos en
cada ensayo tienen un CV del 2,7%. En la figura 7 se muestran los
percentiles de los niveles de TMPI-1 en 194
muestras de plasma-citrato calculados de acuerdo al
género. El valor medio TIMP-1 para 107 donantes
masculinos fue de 70,4 \pm 12,0 \mug/l (mediana 69,4 \mug/l)
con un intervalo de referencia de 56,2 a 86,6 \mug/l, mientras el
valor medio de TIMP-1 para 87 donantes femeninos en
este grupo fue 63,5 \pm 10,5 \mug/l (mediana: 62,0 \mug/l)
con un intervalo de referencia de 51,8 a 77,0 \mug/l. Hubo una
diferencia significativa (p < 0,0001) en los niveles medios de
TMPI-1 entre los dos grupos, con los machos teniendo
niveles de TMPI-1 más altos que las hembras. Hubo
una tendencia hacia un incremento en el TMPI-1 del
plasma con el incremento de la edad (rho de Spearman = 0,33, P =
0,0011), pero esta no se incrementa con el género (hembras: rho de
Spearman = 0,29, P = 0,006; machos: rho de Spearman = 0,35, P =
0,0003). En el plasma-EDTA, el valor medio de
TIMP-1 para 56 machos fue 76,9 \pm 15,0 \mug/l
(mediana: 75,1 \mug/l) con un intervalo de referencia de 58,8 a
96,9 \mug/l, mientras 44 donantes femeninas tuvieron un nivel
medio de TIMP-1 de 69,3 \pm 11,8 \mug/l
(mediana: 67,9) con un intervalo de referencia de 56,1 a 85,5
\mug/l. De nuevo, una aparece diferencia significativa entre
machos y hembras (p = 0,0076, comparación media no de dos en
dos).
El ensayo descrito anteriormente permite asegurar
la determinación del TIMP-1 total en muestras de
plasma humano. Los ensayos de velocidad cinética del antígeno
ligado se llevaron a cabo fácilmente, permitiendo el ajuste
automático de las curvas de velocidad, las cuales han demostrado
ser más fiables que las medidas de resultados individuales. El uso
de un agente de bloqueo rápido y un tampón de dilución con alta
capacidad de tamponamiento también contribuye a ensayos
reproducibles. Incorporar todos estos elementos en el ensayo final
cumple los requerimientos de sensibilidad, especificidad,
estabilidad, y buena recuperación de un estándar interno.
Los estudios cuantitativos en sangre a partir de
donantes sanos mostraron que tanto muestras de
plasma-citrato como muestras de pasma EDTA son
adecuadas para la determinación de TIMP-1.
Comparados con otros estudios publicados de TIMP-1 i
de donantes sanos (Jung y col., 1996; Jung y col., 1996), los
niveles en el presente estudio caen dentro de un intervalo muy
estrecho. Algunos estudios han comunicado resultados en suero, pero
el plasma se seleccionó para el presente estudio para evitar la
contribución variable de la activación plaquetaria a los valores
medidos de TIMP-1 (Cooper y col., 1985). Mientras
las muestras de plasma usadas en este estudio no se prepararon
específicamente como plasma pobre en plaquetas, se mostró, tomando
como base los ensayos llevados a cabo en el laboratorio, que éste
no cambia los valores. El material del donante fue lo bastante
grande para demostrar que los niveles de TMPI-1 en
individuos sanos (tanto en plasma-EDTA como en
plasma-citrato) se aproximaron a una distribución
normal, en hembras como también en machos. Los niveles medios de
TIMP-1 fueron aproximadamente un 10% más altos en
machos que en hembras tanto para EDTA como para
plasma-citrato. Una explicación para esto es una
velocidad de liberación más alta de TIMP-1 en
sangre de plaquetas activadas, reflejando una tendencia a una
incidencia más alta de enfermedad tromboembólica en la población
masculina. Cuando los machos y las hembras se consideraron por
separado, hubo una correlación débil entre TIMP-1 y
edad como se ve en la población total (véase anteriormente).
El ejemplo siguiente describe un ensayo para
determinar la concentración de complejos
TIMP-1:MMP-9 en fluidos corporales.
El ensayo se usó con muestras de plasma de donantes de sangre sanos
con el fin de establecer intervalos normales de este complejo
(Holten Andersen y col., 1999).
Se preparó un ELISA en sándwich sensible y
específico usando el anticuerpo TIMP-1 anteriormente
descrito, MAC-15, y un anticuerpo policlonal
MMP-9 de conejo desarrollado en el Departamento
Hematológico, Rigshospitalet, Dinamarca (Kjeldsen y col., 1992). El
anticuerpo MMP-9 se usó para captación de antígenos
y MAC-15 se usó para detección de antígenos. Un
conjugado de Ig antirratón de conejo/fosfatasa alcalina (Dako,
Glostrup, Dinamarca) permite un ensayo de velocidad cinético
(figura 8). El último conjugado se suministró preadsorbido frente a
IgG humana, eliminando así reactividad cruzada con IgG en las
muestras de plasma. El anticuerpo MMP-9 captó tanto
MMP-9 libre como MPP-9 formando
complejos con TIMP-1, mientras que
MAC-15 reconoce sólo TIMP-1. Por lo
tanto sólo los complejos
TIMP-1:MMP-9 se cuantificaron
mediante este par de reactivos.
Para prevenir la formación de complejos
TIMP-1:MMP-9 espontánea, ex
vivo durante los procedimientos de toma de muestras y ensayo, se
añadió un inhibidor de proteasas (es decir Galardin, Batimastat,
Marimastat) a la muestra de plasma después de la descongelación. La
adición del inhibidor de proteasas bloqueó la formación de complejos
in vitro mediante inhibición de la actividad catalítica de
las metaloproteasas.
El ensayo de
TIMP-1:MMP-9 se preparó y validó
mediante un procedimiento similar a aquel descrito anteriormente
para el ensayo de TIMP-1 total. El estándar
TIMP-1:MMP-9 se preparó incubando
cantidades equimolares de TIMP-1 y
MMP-9 purificados recombinantes (activados añadiendo
APMA) en PBS durante 1 hora a 37 grados Celsius.
Brevemente, placas de microtitulación de 96
pocillos se recubrieron durante toda una noche a 4ºC con 100
\mul/pocillo de antisuero
anti-MMP-9 policlonal de conejo en
0,1 moles/l de tampón carbonato, pH 9,5. Previamente a su uso, los
pocillos de ensayo se aclararon dos veces con 200 \mul/pocillo de
disolución SuperBlok diluida 1:1 con disolución salina tamponada
con fosfato (PBS), y después se lavaron 5 veces en PBS que contenía
1 g/l de Tween 20. Los pocillos se incubaron después durante 1 hora
a 30ºC con 100 \mul/pocillo de plasma diluido en tampón de
muestra. Una serie de estándares de
TIMP-1:MMP-9 se usaron para
calibrar cada placa. Los estándares se prepararon diluyendo en serie
una disolución de reserva de complejo
TIMP-1:MMP-9 purificado. Se incluyó
en cada placa un blanco que contenía sólo tampón de dilución de la
muestra, y dos controles hechos a partir de una reserva de
plasma-citrato. Un control de reserva de plasma se
añadió como la primera muestra en la placa y el segundo control se
añadió como la última. Todos los estándares, blancos, controles, y
muestras se realizaron por triplicado en cada placa para cada
ensayo. Después de la incubación de las muestras en el complejo de
unión TIMP-1:MMP-9, los pocillos se
lavaron 5 veces, seguido por tratamiento durante 1 hora a 30ºC con
100 \mul/pocillo de MAC-15 en tampón de dilución
de muestra. Después de otros 5 lavados, los pocillos se incubaron
durante 1 hora a 30ºC con 100 \mul/pocillo de conjugado
inmunoglobulina antirratón de conejo/fosfatasa alcalina diluido en
tampón de dilución de la muestra. Tras 5 lavados con disolución de
lavado y 3 lavados adicionales con agua destilada, se añadieron a
cada pocillo 100 \mul de disolución sustrato de nitrofenilfosfato
recién preparada. La placa se situó en un lector de placa Ceres
900J a 23ºC con la formación del color amarillo automáticamente
controlado. Las lecturas se tomaron a 405 nm frente a un blanco de
aire cada 10 minutos durante 1 hora. El software KinetiCalc II se
usó para analizar los datos calculando la velocidad de formación de
color para cada pocillo (análisis de regresión lineal), generando
una curva estándar ajustada según 4 parámetros, y calculando la
concentración TIMP:MMP-9 de cada muestra de
plasma.
La recuperación específica se determinó mediante
adición del complejo TIMP-1:MMP-9 a
una serie de reservas de plasma-citrato,
plasma-EDTA o plasma-heparina. La
recuperación en cada caso se calculó a partir de la pendiente de la
línea que representa señal del complejo
TIMP-1:MMP-9 como una función de
concentración, donde la recuperación del 100% se definió como la
pendiente obtenida cuando el complejo
TIMP-1:MMP-9 se diluyó en el tampón
de dilución de la muestra.
La formación de color en cada pocillo fue una
función lineal del tiempo para todas las concentraciones de
complejos TIMP-1:MMP-9 medidos en
estos experimentos, con coeficientes de correlación para las líneas
ajustadas automáticamente típicamente mayores de 0,9. El coeficiente
de correlación para el ajuste de 4 parámetros fue típicamente mayor
de 0,999.
La recuperación específica se determinó mediante
adición de concentraciones crecientes de
TIMP-1:MMP-9 a una reserva de plasma
y medida subsiguiente de la señal específica.
Se hicieron diluciones seriadas de las reservas
plasma-citrato y plasma-EDTA y los
niveles de complejo se cuantificaron para determinar la linealidad
del ensayo. Los plasmas -citrato y -EDTA proporcionaron todos buena
linealidad de señal como una función de la dilución.
El siguiente ejemplo describe un ensayo que
determina la concentración de niveles de TIMP-1
libres en fluidos corporales. El ensayo se aplicó a muestras de
plasma de donantes de sangre sanos con el fin de establecer
intervalos normales de TIMP-1 libre.
Se preparó un inmunoensayo de sándwich sensible y
específico, usando un anticuerpo IgG1 monoclonal
(MAC-19) desarrollado en los Strangeways
Laboratories, Inglaterra (Cooksley y col., 1990) y un anticuerpo
anti-TIMP-1 policlonal de oveja. El
anticuerpo anti-TIMP-1 policlonal de
oveja se usó para captación de antígenos y el
MAC-19 monoclonal murino se usó para detección de
antígenos. Un conjugado de inmunoglobulina antirratón de
conejo/fosfatasa alcalina se usó como el reactivo de detección
secundario (figura 9). El último conjugado se suministró
preadsorbido contra IgG humana, eliminando así reactividad cruzada
con IgG en las muestras de plasma. El anticuerpo monoclonal
MAC-19 es completamente específico para
TIMP-1 libre, el cual por lo tanto es la única
forma cuantificada en este ensayo.
Con el fin de ensayar que MAC19 no reacciona con
complejos entre TIMP-1 y MMP-9, el
anticuerpo policlonal anti-MMP-9 de
conejo descrito en el ejemplo 2 se usó para la captación de
antígeno y el anticuerpo monoclonal de ratón MAC19 se usó para la
detección de antígeno. Un conjugado de inmunoglobulina antirratón
de conejo/fosfatasa alcalina se usó como el reactivo de detección
secundario. Se sometieron a ensayo el complejo estándar
TIMP-1:MMP-9, MMP-9
libre, TIMP-1 libre, y un control blanco. La figura
10 muestra que los complejos
TIMP-1:MMP-9 unidos mediante el
anticuerpo policlonal anti-MMP-9 no
se detectan mediante MAC19. Se llevó a cabo un experimento
equivalente, donde MAC19 se sustituyó con MAC15. La figura 11
muestra los resultados de este experimento. Se vio que MAC15
detecta el complejo TIMP-1:MMP-9
unido por el anticuerpo policlonal
anti-MMP-9.
Para prevenir la formación ex vivo de
complejos TIMP-1:MMP durante los procedimientos de
toma de muestras y ensayo, se añadió un inhibidor de proteasas (es
decir Galardin, Batimastat, Marimastat) a la muestra de plasma
después de la descongelación. La adición del inhibidor de proteasas
bloqueó la formación de complejos in vitro mediante
inhibición de la actividad catalítica de las metaloproteasas.
Las placas de microtitulación de 96 pocillos se
recubrieron durante 1 hora a 37ºC con 100 \mul/pocillo de
anti-TIMP-1 policlonal de oveja (4
mg/l) en 0,1 moles/l de tampón carbonato, pH 9,5. Los pocillos de
ensayo se aclararon después dos veces con 200 \mul/pocillo de
disolución SuperBlock diluida 1:1 con disolución salina tamponada
con fosfato (PBS). Las placas de microtitulación se almacenaron
durante hasta 14 días a -20ºC. En el día de uso, las placas se
descongelaron a temperatura ambiente y se lavaron 5 veces en PBS que
contenía 1 g/l de Tween 20. Los pocillos se incubaron después
durante 1 hora a 30ºC con 100 \mul/pocillo de diluciones 1:25 de
plasma por triplicado preparadas en un tampón de muestra
constituido por 50 moles/litro de fosfato, pH 7,2, 0,1 moles/l de
NaCl, 10 g/l de seroalbúmina bovina (Fracción V,
Boehringer-Mannheim, Penzberg, Alemania) y 1 g/l de
Tween 20. Los estándares se prepararon diluyendo en serie una
disolución de reserva de TIMP-1 libre purificado
para producir concentraciones de 10, 5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,313 y
0,156 \mug/l. En cada placa estaba incluido un blanco que
contenía sólo tampón de dilución de muestra, y dos controles hechos
a partir de una reserva de plasma-citrato diluida
1:25. Se añadió una reserva de plasma-citrato como
la primera muestra en la placa y el segundo control se añadió al
final. Todos los estándares, blancos, controles, y muestras se
corrieron por triplicado en cada placa para cada ensayo. Después de
unión al TIMP-1, los pocillos se lavaron 5 veces,
después se trataron durante 1 hora a 30ºC con 100 \mul/pocillo del
anti-TIMP MAC-19 monoclonal murino
purificado (0,5 mg/ml) en tampón de dilución de muestras. Después
de otros 5 lavados los pocillos se incubaron durante 1 hora a 30ºC
con 100 \mul/pocillo de conjugado de inmunoglobulina antirratón de
conejo/fosfatasa alcalina diluido 1:2.000 en tampón de dilución de
muestra. Tras 5 lavados con disolución de lavado y 3 lavados con
agua destilada, se añadieron a cada pocillo 100 \mul de
disolución sustrato de nitrofenil fosfato (Sigma, San Luís, MO)
recién preparada (1,7 g/l en 0,1 moles/l de Tris\cdotHCl, pH 9,5,
0,1 mol/l de NaCl, 5 mmol/l de MgCl_{2}), y la placa se situó en
un lector de placas Ceres 900J (Bio-Tek Instruments,
Winooski, VT) a 23ºC. La formación del color amarillo se controló
automáticamente, con lecturas tomadas a 405 nm frente a un blanco de
aire cada 10 minutos durante 1 hora. El software KinetiCalc II se
usó para analizar los datos, para calcular la velocidad del cambio
de color para cada pocillo (análisis de regresión lineal), y para
introducir en el ordenador una curva estándar ajustada según 4
parámetros, de la cual se calculó la concentración de
TIMP-1 libre de cada muestra de plasma.
Estos experimentos se llevaron a cabo
esencialmente como se describen en el ejemplo 1, pero usando MAC19
en lugar de MAC15 para detección de TIMP-1 libre
(como se describe anteriormente).
Se obtuvieron las muestras de 108 donantes sanos.
Los donantes dieron sangre en una base de voluntarios y estaban
todos aparentemente sanos. Se obtuvo el consentimiento informado de
todos los donantes de sangre, y se obtuvo permiso de los comités
éticos locales. La recogida de muestras de sangre y la manipulación
de la sangre se llevó a cabo como se describe en el ejemplo 1.
La aparición del color en cada pocillo fue una
función lineal del tiempo para todas las concentraciones de
TIMP-1 medidas en estos experimentos, con
coeficientes de correlación para las líneas automáticamente
ajustadas típicamente mejor que 0,999. La variación intraensayo
para 24 medidas por triplicado de la reserva de plasma control fue
del 9,6%.
La recuperación de señal específica se determinó
por adición de concentraciones incrementantes de
TIMP-1 estándar purificado a una reserva deplasma y
medida subsiguiente de la señal de ELISA. En la reserva de
plasma-citrato diluida se obtuvo una recuperación
del 105%, mientras que se obtuvo una recuperación del 96% en la
reserva de plasma-EDTA diluida. (figura 12).
Se hicieron las diluciones seriadas de reservas
de plasma-citrato y plasma-EDTA y
se sometieron a ensayo niveles de TIMP-1 libres para
ensayar la reducción lineal en la señal de ELISA. Los plasmas
citrato y EDTA proporcionaron todos buena linealidad de señal como
función de la dilución.
Se midió el TIMP-1 libre en todas
las muestras de plasma. La concentración mediana libre
TIMP-1 fue de 70,9 \mul/l (intervalo:
32,3-169,7 \mul/l).
Este ensayo mide directamente los niveles de
TIMP-1 libres en plasma. Cuando se comparan los
niveles de TIMP-1 libres con niveles totales de
TIMP-1 (los últimos medidos con el ensayo descrito
en el ejemplo 1) en los 108 donantes de sangre sanos, se obtuvo un
coeficiente de correlación de 0,46 (rho, rango de Spearman, p <
0,0001).
Los niveles totales de TIMP-1 en
plasma de 591 pacientes de cáncer colorrectal (338 de colon y 235
rectales) y en plasma de 108 individuos sanos de igual edad y
género se midieron con el ensayo de TIMP-1 descrito
en el ejemplo 1. Los valores de TIMP-1 se
analizaron y compararon usando parámetros bioestadísticos
estándar.
Se incluyeron en el estudio 591 pacientes que
sufrieron cirugía elegida para cáncer colorrectal patológicamente
confirmado. Las muestras de sangre se obtuvieron preoperativamente
con consentimiento informado de todos los pacientes de acuerdo con
la declaración de Helsinki, y se garantizó el permiso por el comité
ético del Hvidovre Hospital, Dinamarca. Todos los pacientes tenían
adenocarcinoma verificado patológicamente del colon o el recto. Se
encontró que 59 (10%) pacientes se pudieron clasificar como que
tenían la enfermedad de Duke en su fase A, 219 (35%) como pacientes
de la enfermedad de Duke en su fase B, 170 (29%) como pacientes de
la enfermedad de Duke en su fase C y 143 (24%) como pacientes de la
enfermedad de Duke en su fase D. 338 tumores fueron cánceres de
colon y 253 fueron cánceres rectales. Se recogieron datos clínicos
tales como edad, sexo y supervivencia después de la cirugía. La
edad mediana de los pacientes fue de 69 años (intervalo de
33-90 años) con 237 hembras y 354 machos
representados en la cohorte de pacientes.
Una segunda cohorte de pacientes se recogió
prospectivamente. Esta cohorte consta de 21 pacientes de cáncer
rectal y 43 pacientes de cáncer de colon. Hubo 11 pacientes con
enfermedad de Duke en su fase A, 27 con enfermedad de Duke en su
fase B, 14 con enfermedad de Duke en su fase C, y 13 con enfermedad
de Duke en su fase D.
La misma población donante descrita en el ejemplo
3.
Se recogieron preparativamente muestras de sangre
(5 ml) de todos los paciente en el día 3 de su cirugía. Para
asegurar medidas válidas de TIMP-1, se tomó sangre
periférica con estasis mínima y se recogió en tubos anticoagulantes
de EDTA (Becton-Dickinson, Mountain View, CA) de
acuerdo con un protocolo previamente descrito (ejemplo 1).
Los niveles de TIMP-1 se midieron
en muestras de plasma de EDTA usando el ensayo descrito en el
ejemplo 1.
Usando un ensayo de velocidad cinética, los
niveles totales de TIMP-1 se determinaron en todos
los pacientes y donantes sanos de muestras de plasma. Cada muestra
de plasma tiene niveles medibles de TIMP-1, con un
valor de TIMP-1 total de mediana para los 591
pacientes de cáncer colorrectal de 141,1 \mug/l (intervalo
53,7-788,7 \mug/l). Cuando se estratifican en
cáncer rectal y cáncer de colon, los valores medianas fueron de
158,6 \mug/l (intervalo 53,7-788,7 \mug/l) para
el cáncer de colon y 126,3 (intervalo: 64,1-640,1
\mug/l) para el cáncer rectal. Hubo una diferencia
estadísticamente significativa en niveles de TIMP-1
cuando el material de pacientes se estratificó de acuerdo con la
fase de la enfermedad de Duke, con fase A de Duke siendo la más
baja y fase D de Duke siendo la más alta (ensayo
Kruskal-Wallis, P < 0,0001). Sin embargo, los
niveles de TIMP-1 más altos no se restringieron a
enfermedad avanzada, y no se vio ninguna diferencia significativa
en niveles de TIMP-1 en plasma total entre los
pacientes de enfermedad de Duke en las fases de la A a la C. Se
encontró una correlación relativamente débil entre
TIMP-1 en plasma y edad (r = 0,35; p < 0,0001).
No hubo diferencia significativa en niveles de
TIMP-1 entre machos y hembras (p = 0,97).
El nivel de mediana de TIMP-1 en
plasma de donantes sanos fue 88,6 \mug/l con un intervalo de
51,0-0,156,2 \mug/l. Hubo una diferencia
estadística alta en los valores de TIMP-1 totales
en plasma entre los pacientes de cáncer colorrectal y los donantes
de sangre sanos.
El valor de TIMP-1 total mediana
para los 64 pacientes de cáncer colorrectal fue 138,2 \mug/l
(intervalo: 80,7-790,6 \mug/l). Estratificando los
pacientes en los de cáncer de colon y los de cáncer rectal, los
valores, de mediana, de TIMP-1 total fueron 152,2
\mug/l (intervalo: 80,7-626,2 \mug/l) para el
colon y 133,6 (intervalo: 84,3-790,6) para el cáncer
rectal. Hubo una diferencia estadística alta en los valores de
TIMP-1 totales en plasma entre los pacientes de
cáncer de colon y cáncer rectal comparados cada uno con los
donantes de sangre sanos.
Usando los niveles de TIMP-1
total medidos en plasma de donantes sanos y los 591 pacientes de
cáncer colorrectal, se generaron curvas de Características
Operativas del Receptor (ROC) para evaluar el valor diagnóstico del
TIMP-1 total. Como se ve en la figura 13, la curva
ROC estuvo inicialmente empinada, indicando una sensibilidad y
especificidad altas de TIMP-1 total como un
marcador de cáncer colorrectal. Parece que el AUC es mayor para el
cáncer de colon que para el cáncer rectal. La figura 14 muestra una
curva de ROC similar que incluye ahora sólo pacientes con cáncer
colorrectal en fase temprana, es decir, enfermedad de Duke en fase
A o B. También se muestra la curva ROC para el cáncer de colon
situado a la derecha en fase temprana (enfermedad de Duke en fase A
o B).
Usando los niveles de TIMP-1
total medidos en plasma de donantes sanos y en la segunda cohorte de
64 pacientes de cáncer colorrectal, las curvas de ROC se
construyeron de nuevo para confirmar el valor diagnóstico de
TIMP-1. Como se ve en la figura 15, la curva fue de
nuevo inicialmente empinada, indicando una alta sensibilidad y
especificidad de TIMP-1 total como un marcador para
cáncer colorrectal.
Un estudio adicional de 180 donantes de sangre
sanos y 20 pacientes de cáncer colorrectal, que usan diferentes
anticuerpos (anti-TIMP-1 11E/C6,
anti-TIMP-1 RRU-T6)
(estos dos clones que produjeron los anticuerpos se depositaron el
10 de abril de 2000 con ATTC) en un inmunoensayo automatizado,
corroboró adicionalmente los resultados clínicos previos. Además,
los valores absolutos generados a partir del ensayo automatizado
mostraron un alto grado de correlación con aquellos obtenidos
mediante el ensayo descrito en el ejemplo 1 (r = 0,9).
Estos datos sugieren que las medidas de
TIMP-1 totales en plasma se pueden usar como un
procedimiento de rastreo para ayudar en la identificación de
pacientes con un alto riesgo de tener cáncer colorrectal. En
particular, el TIMP-1 total fue igual de efectivo
en identificar pacientes con cáncer temprano (fases A + B de Duke)
que en identificar pacientes con enfermedad más avanzada. Además,
el TIMP-1 total fue incluso más efectivo en
identificar pacientes con cáncer de colon en fase temprana, situado
en el lado derecho, un diagnóstico que es difícil con
procedimientos de diagnóstico convencionales. El cáncer de colon
situado en el lado derecho no se puede visualizar mediante
sigmoidoscopía flexible, una metodología de rastreo de cáncer de
colon estándar. Tiene una aparición más insidiosa que la de las
lesiones situadas a la izquierda, y los síntomas clínicos se
desarrollan sólo en una fase más tardía de la enfermedad. El
diagnóstico temprano del cáncer de colon situado a la derecha tiene
el potencial de reducir la mortalidad de esta enfermedad.
Además, el ensayo menor, prospectivo, corroboró
los resultados de un estudio mayor retrospectivo, confirmando
adicionalmente el valor diagnóstico del total de
TIMP-1 en pacientes que sufren de cáncer
colorrectal.
Se incluyeron en el estudio 46 pacientes con IBD
(enfermedad inflamatoria del intestino) en el estudio. 22 pacientes
tenían colitis ulcerativa y 24 pacientes tenían enfermedad de
Crohn. Se incluyeron para comparación los niveles totales de
TIMP-1 en plasma-EDTA de donantes de
sangre sanos y pacientes de cáncer colorrectal (ejemplos 3 y
4).
4).
Valores totales de TIMP-1 se
midieron en muestras de plasma-EDTA usando el ensayo
de sándwich descrito en el ejemplo 1.
Los valores medidos de TIMP-1 se
muestran en la tabla 2.
| Colitis | Enfermedad | Total de | Donantes | Cáncer | |
| ulcerativa | de Crohn | IBD | sanos | colorrectal | |
| n = 22 | n = 24 | n = 46 | n = 108 | n = 591 | |
| Mediana de | 79,5 | 78,3 | 84,8 | 89,1 | 141 |
| TIMP-1 total | |||||
| (\mug/l) | |||||
| Intervalo de | 54,9-189,9 | 49,0-156,2 | 38,7-154,5 | 51,0-156,2 | 53,7-789 |
| TIMP-1 total | |||||
| (\mug/l) |
No hubo diferencia significativa cuando se
compararon los valores de TIMP-1 totales de
pacientes con IBD y donantes de sangre sanos
(Mann-Whitney; p = 0,45). Hubo una diferencia
altamente significativa entre los niveles totales de plasma de
TIMP-1 entre pacientes con IBD y los 591 pacientes
de cáncer colorrectal (Mann-Whitney; p <
0,0001). Una representación gráfica de estos resultados se
representa en la figura 16.
Estos resultados demuestran que pacientes con
cáncer colorrectal tienen niveles en plasma de
TIMP-1 significativamente mayores que pacientes con
IBD. Además, los pacientes con IBD tienen niveles de
TIMP-1 total equivalentes a aquellos encontrados en
donantes de sangre sanos, mostrando que se puede usar el
TIMP-1 total en plasma como un marcador altamente
sensible y específico para distinguir entre enfermedades no
malignas y malignas del tracto gastrointestinal.
\newpage
El TIMP-1 total en plasma de 591
pacientes de cáncer colorrectal (338 de cáncer de colon y 253 de
cáncer rectal) y en plasma de 108 individuos sanos de igual edad y
género se midieron usando el ensayo de TIMP-1
descrito en el ejemplo 1. Además, CEA se midió en las muestras de
suero del paciente y las muestras de suero del donante
correspondientes usando un kit EIA CEA comercialmente disponible,
quimioluminiscente (Immulite CEA, DPC©, Los Ángeles, California,
USA). Los valores de TIMP-1 y CEA de donantes sanos
y pacientes de cáncer se combinaron mediante análisis de regresión
logística y se generaron curvas de ROC.
Calcular la sensibilidad y especificidad de CEA
en los 591 pacientes de cáncer colorrectal cuando incluyen los 108
donantes sanos un corte que proporciona un 98% de especificidad
dando una sensibilidad del 35%. Cuando los pacientes se
estratifican en cáncer de colon o rectal, la sensibilidad fue del
37% y el 33% respectivamente al mismo nivel de especificidad.
Incluyendo sólo pacientes con cáncer de colon situado a la derecha,
se demuestra en la figura 17 que la sensibilidad aumenta al
45%.
Cuando los valores totales de
TIMP-1 del ejemplo 4 se incluyen conjuntamente con
CEA, la sensibilidad de la combinación del marcador se encontró por
análisis de regresión logística y es 52%. La sensibilidad
diagnóstica adicional obtenida mediante la adición de medidas de
CEA en suero es altamente significativa (p < 0,0001). Cuando
estratificamos la cohorte de pacientes en cáncer rectal y cáncer de
colon, la sensibilidad fue del 61% y el 38%, respectivamente en el
nivel de especificidad del 98%. Incluyendo sólo pacientes con cáncer
de colon situado a la derecha, la sensibilidad fue del 74%. Una
ilustración gráfica de estos resultados aparece en la figura
17.
Estos datos mostraron que añadiendo un marcador
adicional, se puede obtener una mejora en la sensibilidad
diagnóstica del TIMP-1 total, manteniendo mientras
una especificidad alta del 98%. Así, la combinación de CEA y
TIMP-1 pudo ser útil como un procedimiento de
rastreo para identificar pacientes con un alto riesgo de tener
cáncer colorrectal. En particular, esta combinación fue eficiente
en identificar pacientes con cáncer en fase temprana (fases A+B de
la enfermedad de Duke). Además, esta combinación fue altamente
efectiva en identificar pacientes con cáncer de colon en fase
temprana, situado en el lado derecho.
Los niveles de TIMP-1 libre en
plasma de 64 pacientes de cáncer colorrectal (43 de cáncer de colon
y 21 de cáncer rectal) y en plasma de 108 individuos de igual edad,
sanos se midieron usando los ensayos de TIMP-1
descritos en el ejemplo 3. Los valores de TIMP-1
libres se analizaron y compararon usando parámetros bioestadísticos
estándar.
Usando la velocidad cinética de ELISA descrita en
el ejemplo 3, los niveles de TIMP-1 libres se
midieron en todos los pacientes y muestras de plasma de donantes
sanos. Todas las muestras tenían niveles medibles de
TIMP-1 libre, con un valor mediana de
TIMP-1 de 0,82 \mug/l (intervalo:
44,7-424,0 \mug/l) para los pacientes de cáncer
colorrectal. El nivel de TIMP-1 libre mediana en
plasma de donantes sanos fue 70,9 \mug/l, con un intervalo de
32,3-169,7 \mug/l. Mientras que no se encuentra
diferencia significativa en niveles de TIMP-1 libre
entre pacientes con enfermedad de Duke en fases A-C,
los pacientes con enfermedad de Duke en fase D tienen niveles de
TIMP-1 en plasma significativamente elevados
comparados con los pacientes con enfermedad de Duke en fases A y B.
Cuando comparamos valores totales de TIMP-1 con
valores de TIMP-1 libres en plasma de estos 64
pacientes de cáncer colorrectal se encontró un coeficiente de
correlación de 0,91 (Rho, rango de Spearman, p < 0,0001).
La figura 18 muestra las curvas de ROC generadas
de las medidas en plasma de TIMP-1 libre. El AUC es
0,61 cuando se determina la realización diagnóstica de
TIMP-1 libre.
Estos datos muestran que el
TIMP-1 solo no es probable que sea útil como un
marcador de rastreo para identificar pacientes con un alto riesgo de
tener cáncer colorrectal.
Los niveles complejos de
TIMP-1:MPP-9 en plasma de pacientes
de cáncer colorrectal y en plasma de individuos sanos de igual edad
y género se puede medir usando el ensayo
TIMP-1:MMP-9 descrito en el ejemplo
2. Se pueden comparar los valores de complejo
TIMP-1:MMP-9 de donantes sanos y
pacientes de cáncer y se puede determinar el valor diagnóstico.
Usando los valores medidos de niveles
TIMP-1 libre, total, y de complejo
TIMP-1:MMP-9, se puede calcular el
valor diagnóstico de las razones o fracciones. Además se pueden
añadir otras moléculas por ejemplo CEA de suero a estos cálculos
para generar algoritmos matemáticos para incrementar el valor
diagnóstico general.
Los niveles totales de TIMP-1 en
plasma de 64 pacientes de cáncer colorrectal y en plasma de 108
individuos de igual edad y género se midió con el ensayo de
TIMP-1 descrito en el ejemplo 1. Usando el ensayo
descrito en el ejemplo 3, los niveles de TIMP-1
libre en plasma se midieron en los mismos individuos como se
describe anteriormente. Los valores de TIMP-1 total
y libre se analizaron y compararon usando análisis de regresión
logística.
Se incluyeron en el estudio 64 pacientes que
sufren cirugía electiva para cáncer colorrectal patológicamente
confirmado. Hubo 11 pacientes con enfermedad de Duke en fase A, 27
con enfermedad de Duke en fase B, 14 con enfermedad de Duke en fase
C, y 13 con enfermedad de Duke en fase D. Las muestras de sangre se
obtuvieron preoperativamente con consentimiento informado de todos
los pacientes de acuerdo con la declaración de Helsinki, y se
garantizó el permiso por el comité ético local del Hvidovre
Hospital, Dinamarca. Todos los pacientes tuvieron adenocarcinoma
patológicamente verificado del colon o el recto. Se recogieron los
datos clínicos tales como edad, sexo y supervivencia después de la
cirugía.
La misma población donante como se describe en el
ejemplo 3.
Las muestras de sangre (5 ml) se recogieron
preoperativamente de todos los pacientes en el día de su cirugía.
Para asegurar las medidas válidas de TIMP-1, se
sacó sangre periférica con estasis mínima y se recogió en tubos
anticoagulantes de EDTA (Becton-Dickinson, Mountain
View, CA) de acuerdo con un protocolo previamente descrito (ejemplo
1).
Los niveles de TIMP-1 se midieron
en muestras de plasma-EDTA usando los ensayos
descritos en el ejemplo 1 y el ejemplo 3.
Los niveles de TIMP-1 total en
estos 64 pacientes con cáncer colorrectal se describen en el ejemplo
4, y los niveles libres de TIMP-1 en estos pacientes
se describen en el ejemplo 7.
Usando los niveles de TIMP-1
total y libre en plasma de donantes sanos y de 64 pacientes de
cáncer colorrectal, las curvas ROC se construyen para cada una de
estas formas TIMP-1. Los valores de
TIMP-1 total obtenidos confirman el valor
diagnóstico de las medidas de TIMP-1 total en
pacientes con cáncer colorrectal. Como se ve en la figura 15, la
curva fue de nuevo empinada inicialmente, indicando una alta
sensibilidad y especificidad de TIMP-1 total como un
marcador para cáncer colorrectal. La curva ROC para
TIMP-1 libre se discute en el ejemplo 7.
Los datos correspondientes para el
TIMP-1 total en esta población de pacientes
proporcionaron un AUC de 0,88. Sin embargo, se obtuvo un incremento
en valor diagnóstico cuando combinamos TIMP-1 libre
y total (AUC = 0,94). Este incremento es altamente significativo
estadísticamente, p < 0,0001 y muestra el valor de la importante
realización de usar tanto TIMP-1 libre como total en
el mismo análisis.
Estos datos sugieren que la combinación de
medidas de TIMP-1 total y TIMP-1
libre en plasma se pueden usar como un procedimiento de rastreo para
ayudar en identificar pacientes con un alto riesgo de tener cáncer
colorrectal.
De forma similar a como se describe en el
presente ejemplo, se pueden calcular y usar otras razones y/o
combinaciones o permutaciones matemáticas entre valores de
TIMP-1 libre y total para propósitos
diagnósticos.
Los cálculos de relaciones entre todas las
diversas formas de TIMP-1, incluyendo
TIMP-1 total y libre, la concentración de complejos
total (TIMP-1 total - TIMP-1 libre)
y/o la concentración de
TIMP-1:MMP-9, puede ser
extremadamente útil en el manejo, y especialmente el diagnóstico
diferencial de pacientes con enfermedades no malignas y pacientes
con cáncer.
Usando el ensayo de TIMP-1 total
descrito en el ejemplo 1, se analizaron las muestras de plasma
preoperativo de 322 pacientes con cáncer de mama primario para el
contenido de TIMP-1 total. Además, se evaluaron 108
muestras de plasma de donantes de sangre sanos. El
TIMP-1 total mediana para los pacientes de cáncer
de mama fue 88,3 \mug/l (intervalo: 45,5-289,3
\mug/l), mientras el nivel de TIMP-1 total
mediana para los donantes de sangre sanos fue 88,9 \mug/l
(intervalo: 51,0-156,2 \mug/l). No hubo ninguna
diferencia significativa estadística en niveles en plasma de
TIMP-1 total entre los dos grupos
(Mann-Whitney, p = 0,87). La figura 19 muestra una
curva ROC que incluye los datos anteriormente mencionados.
Estos datos demuestran que pacientes con cáncer
de mama primario tienen valores de TIMP-1 total que
no son significativamente diferentes de aquellos de donantes de
sangre sanos. Así, estos datos sustentan la especificidad de las
medidas de TIMP-1 en el diagnóstico de pacientes con
cáncer colorrectal.
Este ejemplo describe determinaciones de
TIMP-1 total para pacientes con cáncer de mama en
fase IV.
La sangre se recogió de 19 pacientes de cáncer de
mama en fase IV (de 45 a 70 años de edad) en el Departamento de
Oncología, Herlev University Hospital, Copenhague, Dinamarca, y de
87 donantes de sangre femeninos sanos (ejemplo 1).
Los niveles de TIMP-1 totales se
midieron en todas las muestras de plasma-EDTA
usando el ensayo descrito en el ejemplo 1.
El TIMP-1 total se midió en
muestras de plasma-EDTA de 19 pacientes de cáncer de
mama con enfermedad en fase IV. Estos niveles se compararon con los
niveles de TIMP-1 total en 87 donantes femeninos
sanos. El nivel de TIMP-1 total, promedio, medido
en los 19 pacientes de cáncer fue 292 \pm 331 \mug/l (mediana:
236 \mug/l) comparado con un nivel de TIMP-1
total, promedio, de 63,5 \pm 10,5 \mug/l (mediana: 62,0
\mug/l) en 87 donantes femeninos sanos. Un ensayo en
funcionamiento de Wald-Wolfowitz indica una
diferencia altamente significativa (p < 0,0001) entre niveles de
TIMP-1 total de pacientes y aquellos de donantes
sanos. La figura 20 muestra un trazado de percentiles de los
niveles de TIMP-1 total de los 19 pacientes de
cáncer de pulmón y los niveles de TIMP-1
encontrados en plasma de los 87 donantes femeninos sanos.
Estos datos muestran que las medidas de
TIMP-1 en plasma se pueden usar para controlar
pacientes con cáncer de pulmón para la recurrencia de la
enfermedad.
Se midieron niveles de TIMP-2 con
un ensayo de TIMP-2 interno en plasma de 64
pacientes colorrectales (43 de colon y 21 rectales) y en plasma de
108 individuos sanos de edad igual. Se compararon los valores
medidos de TIMP-2 de donantes sanos y pacientes de
cáncer.
TIMP-2 fue medible en todas las
muestras. No se encontraron diferencias significativas en niveles de
TIMP-2 entre donantes de sangre sanos y pacientes
de cáncer colorrectal.
Estos datos sustentan la especificidad de las
medidas de TIMP-1 en el diagnóstico de pacientes con
cáncer colorrectal, sustentando el valor único de
TIMP-1 como una ayuda en el diagnóstico temprano de
cáncer colorrectal.
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Claims (27)
1. Un procedimiento para determinar si es
probable que un individuo tenga un cáncer colorrectal, el
procedimiento comprende determinar un primer parámetro que
representa la concentración total de TIMP-1 en
muestras de plasma, y que señala al individuo como que tiene una
alta probabilidad de tener cáncer colorrectal si el parámetro está
en o más allá de un valor que discrimina y que señala al individuo
como improbable de tener cáncer colorrectal si el parámetro no está
en o más allá del valor que discrimina, determinándose dicho valor
que discrimina midiendo dicho al menos un primer parámetro tanto en
una población control sana como en una población con cáncer
colorrectal conocido, determinando de este modo el valor que
discrimina el cual identifica la población con cáncer con una
especificidad predeterminada o una sensibilidad predeterminada.
2. Un procedimiento para determinar si es
probable que un individuo tenga un cáncer colorrectal, el
procedimiento comprende determinar un primer parámetro que
representa la combinación de la concentración de
TIMP-1 total con la concentración de
TIMP-1 libre en muestras de plasma, y que señala al
individuo como que tiene una alta probabilidad de tener cáncer
colorrectal si el parámetro está en o más allá de un valor que
discrimina y que señala al individuo como improbable de tener cáncer
colorrectal si el parámetro no está en o más allá del valor que
discrimina, determinándose dicho valor que discrimina midiendo dicho
al menos un primer parámetro tanto en una población control sana
como en una población con cáncer colorrectal conocido, determinando
de este modo el valor que discrimina el cual identifica la población
con cáncer con una especificidad predeterminada o una sensibilidad
predeterminada.
3. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2, en el que la combinación se lleva a cabo
mediante análisis de regresión logística.
4. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, el cual comprende adicionalmente
determinar al menos un segundo parámetro, representando el segundo
parámetro la concentración de un marcador adicional diferente a
partir de cualquier forma de TIMP-1, en una muestra
de fluido corporal del individuo.
5. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 4, en el que el primer parámetro que representa la
concentración de TIMP-1 en muestras de plasma y el
al menos un segundo parámetro diferente de cualquier forma de
TIMP-1 se combinan para dar como resultado un
parámetro combinado y que señala al individuo como que tiene una
alta probabilidad de tener cáncer colorrectal si el parámetro
combinado está en o más allá de un valor que discrimina y que señala
al individuo como improbable de tener cáncer colorrectal si el
parámetro combinado no está en o más allá del valor que
discrimina.
6. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 5, en el que la combinación se lleva a cabo mediante
análisis de regresión logística.
7. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 5 ó 6, en la que el valor que discrimina del
parámetro combinado es un valor el cual se ha determinado
determinando dicho parámetro combinado tanto en un control de
población sana como en una población con cáncer colorrectal
conocido, determinando de este modo el valor que discrimina el cual
identifica la población de cáncer con una especificidad
predeterminada o una sensibilidad predeterminada.
8. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 6-9, en el que al menos un
segundo parámetro determinado es un parámetro que representa la
concentración de un marcador de tumores.
9. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 8, en el que el marcador de tumores se selecciona del
grupo constituido por CEA, u-PAR soluble, catepsina
B, HER2-neu, CA15-3 y
YKL-40.
10. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 9, en el que al menos un segundo parámetro
determinado es la concentración de CEA.
11. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, en el que el individuo es un
miembro de una población no seleccionada.
12. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, en el que el individuo es un
miembro de una población ya identificada como que tiene un riesgo
incrementado de desarrollar cáncer gastrointestinal.
13. Un procedimiento para determinar si un
paciente que ha sido tratado de cáncer de mama primario es probable
que tenga cáncer de mama metastásico, que comprende determinar un
primer parámetro que representa la concentración total de
TIMP-1 en muestras de plasma, y que señala al
individuo como que tiene una alta probabilidad de tener cáncer
metastásico si el parámetro combinado está en o más allá de un
valor que discrimina y que señala al individuo como improbable de
tener cáncer metastásico si el parámetro combinado no está en o más
allá del valor que discrimina, determinándose dicho valor que
discrimina midiendo dicho al menos un primer parámetro tanto en una
población control sana como en una población con cáncer metastásico
conocido, determinando de este modo el valor que discrimina el cual
identifica la población de cáncer metastásico con una especificidad
predeterminada o una sensibilidad predeterminada.
14. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 13, en el que la combinación se lleva a cabo con
análisis de regresión logística.
15. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 13, el cual comprende determinar adicionalmente al
menos un segundo parámetro, representando el segundo parámetro la
concentración de un marcador adicional diferente de cualquier forma
de TIMP-1, en una muestra de fluido corporal del
individuo.
16. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 15, en la que el primer parámetro representa la
concentración de TIMP-1 en muestras de plasma y el
al menos un segundo parámetro diferente de cualquier forma de
TIMP-1 se combinan para dar como resultado un
parámetro combinado y que señala al individuo como que tiene una
alta probabilidad de tener cáncer colorrectal si el parámetro
combinado está en o más allá de un valor que discrimina y que señala
al individuo como improbable de tener cáncer colorrectal si el
parámetro combinado no está en o más allá del valor que
discrimina.
17. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 16, en el que la combinación se lleva a cabo mediante
análisis de regresión logística.
18. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 15 ó 16, en el que el valor que discrimina del
parámetro combinado es un valor el cual se ha determinado
determinando dicho parámetro combinado tanto en un control de
población sana como en una población con cáncer metastásico
conocido, determinando de este modo el valor que discrimina el cual
identifica la población de cáncer metastásico con una especificidad
predeterminada o una sensibilidad predeterminada.
19. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 15-18, en el que el al menos
segundo parámetro determinado es un parámetro que representa la
concentración de un marcador de tumores.
20. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 19, en el que el marcador de tumor se selecciona del
grupo constituido por CEA, u-PAR soluble, catepsina
B, HER2-neu, CA15-3 y
YKL-40.
21. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 20, en el que el al menos un segundo parámetro
determinado es la concentración de CEA.
22. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 13-21, en el que la
determinación se lleva a cabo en varios puntos temporales a
intervalos como parte de un control de un paciente de cáncer después
del tratamiento del cáncer primario.
23. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1-12, usado para detectar
cáncer colorrectal en fase temprana.
24. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 23, en el que el cáncer colorrectal en estado
temprano se selecciona del grupo constituido por la fase A de Duke
del cáncer de colon, fase B de Duke del cáncer de colon, fase C de
Duke del cáncer de colon, fase A de Duke del cáncer rectal, fase B
de Duke del cáncer rectal y fase C de Duke del cáncer rectal.
25. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, en el que la determinación de la
concentración se lleva a cabo por medio de un inmunoensayo o un
ensayo de actividad.
26. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 25, en el que el inmunoensayo es un ELISA.
27. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 25, en el que el ensayo de actividad es
zimografía.
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