DE60021068T2 - Gewebeinhibitor der matrix-metalproteinase typ 1 (timp-1) als krebsmarker - Google Patents

Gewebeinhibitor der matrix-metalproteinase typ 1 (timp-1) als krebsmarker Download PDF

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Description

  • KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft einen Test, der verwendet werden soll, um eine umfangreiche Population auf das Vorkommen von Kolorektalkrebs oder metastasierenden Brustkrebs zu durchmustern. Das Verfahren basiert auf der Messung des Gewebeinhibitors der Metallproteinasen 1 (TIMP-1) in Plasmaproben. Die Erfindung erlaubt die frühe Erkennung von Patienten, die Kolonrektalkrebs haben. Das Verfahren ist hoch spezifisch und Patienten mit nicht-malignen Erkrankungen wie zum Beispiel entzündlichen Darmerkrankungen werden nicht nachgewiesen. Die Messung eines anderen ähnlichen Inhibitors, TIMP-2, zeigt keinen vergleichbaren klinischen Wert, was auf einen zusätzlichen Spezifitätsgrad der Erfindung hindeutet.
  • Der Test basiert auf der Messung des Gewebeinhibitors der Metallproteinasen Typ1 (TIMP-1) im Plasma. TIMP-1-Konzentrationen können entweder als Gesamt-TIMP-1-Konzentration, freie TIMP-1-Konzentration, Konzentration von Komplexen zwischen TIMP-1 und MMPs und/oder Verhältnisse und Anteile davon bestimmt werden, hierin nachstehend als TIMP-1-Mengen bezeichnet. Gemäß der Erfindung können Individuen mit einer hohen Wahrscheinlichkeit Krebs zu haben, z.B. Kolonkrebs, durch erhöhte TIMP-1-Mengen in einer Plasmaprobe identifiziert werden, während es unwahrscheinlich ist, dass Individuen mit niedrigen TIMP-1-Mengen an Krebs, z.B. Kolonkrebs, leiden. Die Erfindung kann daher verwendet werden, um Individuen zu identifizieren, die eine hohe Wahrscheinlichkeit eines nicht-symptomatischen Krebses im Frühstadium, z.B. Kolonkrebs, aufweisen. Die identifizierten Individuen sollten weiter untersucht werden und, falls Krebs gefunden wird, sollte den Patienten ein operativer Eingriff, Bestrahlung und/oder adjuvante anti-neoplastische Therapie angeboten werden, um dadurch für das Individuum die Wahrscheinlichkeit einer Heilung des Krebses zu erhöhen.
  • HINTERGRUND
  • Kolorektalkrebs ist der vierhäufigste Krebs in der westlichen Welt mit jährlich etwa 130.000 neuen Fällen in den Vereinigten Staaten. 40 bis 50% aller Patienten mit Kolorektalkrebs werden im Frühstadium der Krankheit diagnostiziert (Dukes' Stadium A oder B). Die meisten dieser Patienten mit Kolorektalkrebs im Frühstadium können durch den operativen Eingriff alleine geheilt werden. Somit steht das Risiko eines erneuten Auftretens eng mit dem Stadium der Krankheit zur Zeit der ersten Operation in Zusammenhang, mit etwa einer 10% Rezidivrate im Dukes' Stadium A und 25–30% in Dukes' Stadium B. Patienten mit Kolorektalkrebs im Dukes' Stadium C haben eine fünfjährige Rezidivrate von 70% nach einem operativen Eingriff und ihnen wird adjuvante Chemotherapie angeboten. Nach einem Rezidiv ist das Risiko an der Krankheit zu sterben signifikant. Ein Weg das Überleben der Patienten zu verbessern ist daher, die Zahl der Patienten zu erhöhen, die mit der Krankheit im Frühstadium diagnostiziert werden. Durchmusterung auf Kolorektalkrebs hat eine Verbesserung des Überlebens gezeigt, vant Chemotherapie. Nach einem Rezidiv ist das Risiko an der Krankheit zu sterben signifikant. Ein Weg das Überleben der Patienten zu verbessern ist daher, die Zahl der Patienten zu erhöhen, die mit der Krankheit im Frühstadium diagnostiziert werden. Es konnte gezeigt werden, dass Durchmusterung auf Kolorektalkrebs zu einer Verbesserung des Überlebens führte, gegenwärtige Test leiden jedoch unter einem Mangel an Befolgung, an niedriger Sensitivität und an der Notwendigkeit für strenge Ernährungseinschränkungen. Die Entwicklung von neuen und verbesserten Untersuchungen für den frühen Nachweis von Kolorektalkrebs wird daher benötigt.
  • Da die metastasierende Krankheit die Hauptursache für Erkrankung und Mortalität der Krebspatienten ist, sind Moleküle, die an der Regulation der Tumorinvasion und Metastasierung beteiligt sind, als mögliche diagnostische/prognostische Ziele attraktiv. Es ist wohl bekannt, dass proteolytische Enzyme, die von Krebszellen oder von Zellen im Stroma des Tumors hergestellt werden, am extrazellulären Gewebeabbau beteiligt sind und zur Invasion der Krebszellen und Metastasierung führen. Etliche Enzyme sind mit diesem Vorgang in Zusammenhang gebracht worden, die am gründlichsten untersuchten sind die Metallproteinasen wie zum Beispiel die Kollagenasen und Stromelysine und die Serinproteasen wie zum Beispiel Plasmin. Vor kurzem sind Daten veröffentlicht worden, die darauf hinweisen, dass diese Moleküle, frei oder gebunden in Komplexen, vom Tumorgewebe freigesetzt werden und ihren Weg in den Blutkreislauf finden.
  • Matrix-Metallproteinasen (MMPs) spielen eine entscheidende Rolle in Krebswachstum und -Ausbreitung, wobei sie am enzymatischen Abbau der extrazellulären Matrix mitwirken (Liotta et al, 1991; Stetler-Stevenson et al, 1993; MacDougall & Matrisian, 1995). Die natürlich vorkommenden Inhibitoren der MMPs, Gewebeinhibitoren der MMPs (TIMPs), bilden enge, stöchiometrische 1:1-Komplexe mit den aktivierten Formen der MMPs (Welgus et al, 1985; Kleiner et al, 1993) und inhibieren dadurch die katalytische Aktivität dieser Enzyme (Stetler-Stevenson et al, 1996; Goldberg et al, 1992; Birkedal-Hansen et al, 1993). Während das Gleichgewicht zwischen den Matrix-abbauenden Eigenschaften der MMPs und dem hemmenden Effekt der TIMPs unter normalen physiologischen Bedingungen genau reguliert ist (Matrisian, 1992; Thorgeirsson et al, 1993; Birkedal-Hansen et al, 1993), kann dieses Gleichgewicht in malignem Gewebe gestört sein.
  • Es wurden etliche enzymverbundene Immuntests für den Nachweis von TIMP-1 (Kodama et al, 1989; Cooksley et al, 1990; Clark et al, 1991) und TIMP-2 (Fujimoto et al, 1993) beschrieben. Diese Tests sind auf Körperflüssigkeiten, z.B. Serum, Plasma, Fruchtwasser, Gehirn-Rückenmarksflüssigkeit und Harn, angewandt worden, aber die Anzahl der untersuchten Proben war nicht ausreichend, um normale Bereiche für TIMP-Mengen in gesunden Individuen zu ermitteln (Kodama et al, 1989; Clark et al, 1991). Darüber hinaus wurde keiner dieser Tests ausreichend auf technische Ausführung und medizinische Verwendung hin bewertet.
  • Es wurde festgestellt, dass TIMP-1-mRNA mit der zunehmenden Invasion und der schlechten Prognose assoziiert ist und Guillem et al. (Proc Annu Meet Am Assoc Cancer Res; 34:A466, 1993) weisen auf eine mögliche Korrelation zwischen TIMP-1-RNA-Mengen und schlecht differenziertem, invasivem Kolorektalkrebs hin. Die TIMP-1-Proteinmengen in Seren von Prostatakrebs-Patienten und gesunden Spendern (Baker et al, 1994) zeigten jedoch einen hohen Grad an Überschneidung. In ähnlicher Weise zeigte eine gesonderte Studie von Plasma von Prostatakrebs-Patienten und gesunden Spendern keinen Unterschied in TIMP-1-Mengen zwischen den beiden Gruppen (Jung et al, 1997).
  • Darüber hinaus hat Nauro et al. (J. Urol, Bd. 1, Nr. 3, September 1994, Seiten 228–231) festgestellt, dass TIMP-1-Mengen im Serum, verglichen zu einer gesunden Kontrollgruppe, in metastasierenden Blasenkrebs-Patienten erheblich höher sind, wohingegen keine Ergebnisse über die TIMP-1-Mengen von prä-metastasierenden Blasenkrebsen gezeigt wurden. TIMP-1-Messungen im Harn sind auch für die Diagnose von anderen nicht-gastrointestinalen Krebsen als nützlich beschrieben worden, wie zum Beispiel Blasenkrebs, Leberkrebs und Nierenkrebs (Japanische Patentanmeldung Nr. 8-136548). In keiner dieser Studien ist eine Korrelation zwischen den TIMP-1-Mengen von Patienten mit Blasenkrebs im Frühstadium und den TIMP-1-Mengen von Patienten mit Zystitis erfasst worden. Diese Evaluierung ist wichtig, da TIMP-1-Mengen bei Zystitis auf ein ähnliches Niveau erhöht sind wie TIMP-1-Mengen im Frühstadium von Blasenkrebs.
  • Messungen der TIMP-1-Mengen haben sich auch als nützlich in der Diagnose von Erkrankungen des Nervensystems herausgestellt, wie sie in US 5.324.634 beschrieben werden.
  • Studien von in Komplexen mit MMP-9 vorliegenden TIMP-1 im Plasma von Patienten mit fortgeschrittenem gastrointestinalem und gynäkologischem Krebs (Zucker et al, 1995) zeigten signifikant höhere Mengen in Blutproben von Krebspatienten mit metastasierender Krankheit im Vergleich zu gesunden Kontrollindividuen und, dass Patienten mit hohen Mengen an TIMP-1:MMP-9-Komplex eine kürzere Überlebensdauer hatten (Zucker et al, 1995 und US 5.324.634 ). Diese Studie bezog jedoch keine Messungen von Gesamt- oder freiem TIMP-1 ein, nur des Komplexes zwischen TIMP-1 und einem der bis jetzt ungefähr 24 identifizierten MMPs. Darüber hinaus wurde in dieser Studie kein Unterschied in den Komplexmengen zwischen Patienten mit Brustkrebs und gesunden Spendern gefunden. Außerdem schloss diese Studie keine Patienten mit Krebs im Frühstadium ein.
  • GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • In etlichen Krebstypen gibt es ein entscheidendes und nicht erfülltes Erfordernis für hochsensitive und spezifische Marker zur Durchmusterung von großen Populationen auf die Anwesenheit von malignen Erkrankungen. Solche Marker sollten in der Lage sein Individuen mit einer hohen Wahrscheinlichkeit an Krebs im Frühstadium zu identifizieren. Diese Individuen sollten weiter untersucht werden und, falls Krebs gefunden wird, sollte ihnen im Anschluss daran ein chirurgischer Eingriff, Bestrahlung oder adjuvante anti-neoplastische-Therapie angeboten werden.
  • Nachdem Proteinasen und ihre Rezeptoren und Inhibitoren in den grundlegenden Mechanismen, die zur Krebsinvasion führen, eine entscheidende Rolle spielen, können diese Moleküle an einem sehr frühen Zeitpunkt im kanzerogenen Verlauf exprimiert werden. Da viele dieser Moleküle ihre biologische Wirkung extrazellulär ausüben, können sie sogar in Patienten mit invasiver maligner Erkrankung im Frühstadium in erhöhten Mengen in Körperflüssigkeiten vorhanden sein. Nachdem diese Moleküle an den eher grundlegenderen Merkmalen der malignen Progression beteiligt sind, z.B. Invasion und Metastasierung, sollte ferner untersucht werden, ob und welche Formen von Krebs eine Zunahme dieser Moleküle zeigen.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Unterstützung in der Diagnose von Kolorektalkrebs in Patienten, wobei dieses Verfahren die Bestimmung der Menge von Gesamt-, als Komplex vorliegenden und/oder freien TIMP-1-Mengen und Verhältnissen und Anteilen davon in Plasmaproben umfasst.
  • Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung, ob ein Individuum möglicherweise einen Kolorektalkrebs oder metastasierenden Brustkrebs hat, wobei das Verfahren umfasst: Bestimmen eines ersten Parameters, der die Konzentration von TIMP-1 in Plasmaproben repräsentiert, und falls der Parameter bei oder jenseits eines Unterscheidungswertes gelegen ist, anzeigt, dass das Individuum mit hoher Wahrscheinlichkeit einen Kolorektalkrebs hat, und falls der Parameter nicht bei oder jenseits des Unterscheidungswertes gelegen ist, anzeigt, dass es unwahrscheinlich ist, dass das Individuum einen Kolorektalkrebs hat.
  • Der Parameter, der die Konzentration von TIMP-1 repräsentiert, kann die korrekte Konzentration sein die für TIMP-1 korrekt ist. TIMP-1 liegt sowohl in freier Form als auch in der Form von Komplexen mit Metallproteinasen vor und es konnte gezeigt werden, dass ein wichtiger Parameter die Gesamtkonzentration von TIMP-1 ist, das heißt, die Summe von TIMP-1 in freier Form und TIMP-1 in Komplexformen. Es versteht sich, dass die anderen Ausdrücke als die korrekte Konzentration die Konzentration wie zum Beispiel die Konzentration, vervielfacht durch einen Faktor, usw. usw. repräsentieren können und dass solche anderen Repräsentationen genauso gut für den Zweck der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, vorausgesetzt, dass die entsprechenden Anpassungen durchgeführt werden.
  • Der Unterscheidungswert ist ein Wert, der durch Messung des Parameters in sowohl einer gesunden Kontrollpopulation als auch in einer Population mit bekanntem Krebs bestimmt worden ist, wodurch der Unterscheidungswert bestimmt wird, der die Krebspopulation mit entweder einer vorbestimmten Spezifität oder einer vorbestimmten Sensitivität identifiziert, basierend auf einer Analyse des Verhältnisses zwischen den Parameterwerten und den bekannten klinischen Daten der gesunden Kontrollpopulation und der Krebspatienten-Population, so wie es von der genauen Diskussion in den Beispielen hierin offensichtlich ist. Der auf diese Art bestimmte Unterscheidungswert ist für die gleiche Versuchsanordnung in zukünftigen Tests von Individuen gültig.
  • Die Spezifität wird als ein Anteil von Positiven definiert (d.h. Individuen, die einen Parameter aufweisen, der die Konzentration von TIMP-1 in Plasmaproben, höher als ein vorher festgelegtes diagnostisches Niveau, repräsentiert), welche durch das beschriebene Verfahren der Erfindung korrekt definiert werden. Sensitivität wird als ein Anteil von Negativen definiert (d.h. Individuen, die einen Parameter aufweisen, der die niedrigere Konzentration von TIMP-1 in Plasmaproben als ein vorher festgelegtes diagnostisches Niveau repräsentiert), welche durch das beschrieben Verfahren korrekt definiert werden.
  • Die Erfindung kann sowohl für ein einzelnes Individuum als auch für eine Gesamtpopulation verwendet werden.
  • In den hierin beschriebenen spezifischen Versuchsanordnungen wurde herausgefunden, dass der als ein Unterscheidungswert nützliche Konzentrationsgrenzwert von Gesamt-TIMP-1 in einem Bereich von 50–160 Mikrogramm/l des Gesamt-TIMP-1 liegt, bei einer Spezifität von 90%. Andere Versuchsanordnungen und andere Parameter werden in anderen Werten resultieren, welche in Übereinstimmung mit den Lehren hierin bestimmt werden können.
  • Das Verfahren kann an einer nicht vorher ausgewählten Populationsgruppe angewandt werden, aber besser geeignet an einer Population, bei der schon festgestellt wurde, dass sie ein erhöhtes Risiko hat Krebs zu entwickeln, z.B. Individuen mit einer genetischen Disposition, Individuen, die karzinogen Substanzen ausgesetzt waren, oder Individuen mit nicht-malignen Erkrankungen, die für Krebs prädisponieren. Im Fall von Kolorektalkrebs könnte die Population, die für die Erfindung ausgewählt wird, Individuen repräsentieren, die einen früheren Polypen hatten, Individuen mit Crohn-Krankheit oder mit ulzerativer Kolitis, Individuen mit einem oder mehreren Familienmitgliedern mit Kolorektalkrebs oder Individuen mit einer früheren Resektion eines Kolorektalkrebs im Frühstadium.
  • Wenn bei einem Individuum hohe TIMP-1-Mengen in seinem oder ihrem Plasma festgestellt wurden, sollte das Individuum zu weiteren Untersuchungen zugeteilt werden. Wenn Krebs festgestellt wird, könnte dem Patienten eine Operation, Bestrahlung oder adjuvante neoplastische Therapie mit dem Ziel angeboten werden, den Patienten von Krebs zu heilen.
  • Beispiel 1 beschreibt die Herstellung und Bewertung eines Tests, der Gesamt-TIMP-1 mit hoher analytischer Sensitivität und Spezifität misst. Es wird beschrieben, dass gesunde Blutspender einen sehr engen Bereich an Gesamt-TIMP-1 im Plasma aufweisen.
  • In Beispiel 2 wird der Aufbau eines TIMP-1:MMP-9-ELISA beschrieben. Der Aufbau, die Ausführung und die Bewertung dieses Tests sind ähnlich zu jenen für Gesamt-TIMP-1, außer dass ein polyclonaler Antikörper gegen MMP-9 im Einfangschritt verwendet wird. Durch Ersetzen des MMP-9-Antikörpers durch einen Antikörper gegen eine andere MMP können Komplexe zwischen TIMP-1 und anderen MMPs quantifiziert werden.
  • In Beispiel 3 wird der Aufbau eines TIMP-1-Tests beschrieben, der ausschließlich freies TIMP-1 misst. Dieser Test nutzt einen monoclonalen anti-TIMP-1-Antikörper (MAC-19), der nur TIMP-1 in seiner nicht in Komplexen vorliegenden Form erkennt. Dieser Test wird daher die Menge an freiem TIMP-1 in einer Probe messen. Die Ausführung und Bewertung dieses Tests sind ähnlich zu dem Test für Gesamt-TIMP-1.
  • Durch Subtraktion der freien TIMP-1-Konzentration von der Gesamt-TIMP-1-Konzentration in einer biologischen Probe kann die Konzentration von allen Formen an TIMP, die in Komplexen vorliegen, bestimmt werden. Es sollte betont werden, dass TIMP-1 mit vielen der MMPs Komplexe bilden kann und daher wird die Subtraktion von einem Komplextyp von der Gesamtmenge an TIMP-1 nur Information über den Anteil von TIMP-1 liefern, der nicht mit dieser spezifischen MMP komplexiert ist.
  • In Beispiel 4 wird gezeigt, dass Patienten, die an Kolorektalkrebs leiden, wesentlich erhöhte Mengen an Gesamt-TIMP-1 in ihren präoperativen Plasmaproben aufweisen. Ein Perzentilen-Plot der Mengen des Gesamt-TIMP-1 im Plasma von allen Kolorektalkrebs-Patienten und von gesunden Blutspendern zeigt, dass eine Gesamt-TIMP-1-Konzentration von 119,1 μg/l das neunzigste Perzentil von gesunden Spendern darstellt. Bei 68% der Kolorektalkrebs-Patienten wurde unter Verwendung dieses Trennwertes festgestellt, dass sie erhöhte TIMP-1-Mengen im Plasma aufwiesen. Wenn die Kolonkrebs-Patienten gesondert analysiert wurden, wurde gezeigt, dass Gesamt-TIMP-1-Messungen im Plasma 75% der Kolonkrebs-Patienten identifizierten (diagnostische Sensitivität), mit einer 90% diagnostischen Spezifität (10% der gesunden Blutspender wurden als hoch eingestuft). Auf ähnliche Weise wurde allein für die Patienten mit Rektalkrebs gezeigt, dass die Gesamt-TIMP-1-Messungen im Plasma 60% der Rektalkrebs-Patienten identifizierten, mit einer 90% diagnostischen Spezifität. Falls eine höhere oder niedrigere Sensitivität oder Spezifität erwünscht ist, kann der Trennwert verändert werden. Das ist in 13 veranschaulicht; sie zeigt ROC-Kurven von Gesamt-TIMP-1 im Plasma von Kolorektalkrebs-Patienten. Außerdem sind ROC-Kurven für die einzelnen Gruppen von Kolon- und Rektalkrebs-Patienten enthalten. Jegliche zusätzliche Information, die aus diesen ROC-Kurven erhalten werden kann, fällt in den Geltungsbereich der vorliegenden Erfindung.
  • Eine unabhängige vorausschauende Studie, die präoperative Plasmaproben von 64 Patienten mit Kolon(n = 43)- oder Rektal(n = 21)-Krebs einschloss, bestätigte die von der vorstehend beschriebenen Studie (15) erhaltenen Daten. Eine zusätzliche Studie von 180 gesunden Blutspendern und 20 Kolorektalkrebs-Patienten unter Verwendung von unterschiedlichen Antikörpern (anti-TIMP-1 11E/C6, anti-TIMP-1 RRU-T6) in einem automatisierten Immuntest bestätigte die vorherigen klinischen Ergebnisse weiter.
  • Die absoluten Werte, die durch den automatisierten Test erzeugt wurden, zeigten ferner ein hohes Maß an Übereinstimmung zu jenen, die in dem in Beispiel 1 beschriebenen Test erhalten wurden. (r = 0,9). Der klinische Wert eines Markers zur Durchmusterung auf Krebs steht in Beziehung mit seiner Fähigkeit die frühen Stadien der Krankheit zu detektieren und dadurch möglicherweise das Überleben zu beeinflussen. Es wurde gezeigt, dass Gesamt-TIMP-1 im Frühstadium von Kolorektalkrebs (Dukes' Stadien A und B) ein ebenso effizienter Durchmusterungsmarker war, wie sie in der Gesamtpopulation von Kolorektalkrebs-Patienten (14) war. Die Durchmusterung von Gesamt-TIMP-1 wird daher darin resultieren, dass mehr Patienten mit Krebs im Frühstadium diagnostiziert werden. In ähnlicher Weise fällt jegliche Information, die von 14 erhalten werden kann, in den Geltungsbereich der vorliegenden Erfindung.
  • Durch Aufteilung der Kolonkrebs-Patienten in zwei Gruppen, in Patienten mit Tumoren auf der linken Seite beziehungsweise auf der rechten Seite, wurde klar, dass die Messung von Gesamt-TIMP-1 besonders für die Identifizierung jener Patienten mit rechtsseitigen Kolonkrebs-Läsionen im Frühstadium nützlich war (14).
  • Die Spezifität eines bestimmten Krebs-Durchmusterungstests basiert auf der Effizienz des Tests nur jene Patient zu identifizieren, die an Krebs leiden, während Patienten, die an nicht-malignen Erkrankungen leiden, nicht als falsch-positive Individuen identifiziert werden sollten. Im Fall von Kolorektalkrebs ist es wichtig, dass der fragliche Test zwischen malignen und nicht malignen Erkrankungen des Kolons und des Rektums unterscheiden kann. Dies ist besonders für Erkrankungen wie Crohn-Krankheit und ulzerativer Kolitis von Bedeutung, da Patienten mit jenen Erkrankungen ein höheres Risiko haben Krebs zu entwickeln.
  • In Beispiel 5 wird gezeigt, dass Gesamt-TIMP-1-Mengen in Patienten mit Kolorektalkrebs erheblich höher sind als in Patienten mit entzündlichen Darmerkrankungen (IBD), was zeigt, dass Gesamt-TIMP-1 verwendet werden kann, um in einer Population von Patienten mit IBD auf Kolorektalkrebs zu durchmustern. Die Tatsache, dass TIMP-1 in nicht-malignen Erkrankungen nicht erhöht ist, wird durch eine neue Veröffentlichung (Keyser et al. 1999) unterstützt, was zeigt, dass Patienten mit rheumatoider Arthritis keine erhöhten TIMP-1-Mengen im Plasma aufweisen. Außerdem wurden beim Vergleich der Gesamt-TIMP-1-Mengen unter Patienten mit IBD (mit Ausnahme der Patienten mit klinisch beurteilter, akuter aktiver Erkrankung, n = 4) und gesunden Blutspendern keine erheblichen Unterschiede in den Gesamt-TIMP-1-Mengen festgestellt (p = 0,56), was zeigt, dass diese nicht-malignen Erkrankungen keine falsch-positiven Testergebnisse liefern.
  • In Beispiel 6 wird der Additiveffekt der Messung eines zusätzlichen Kolorektalkrebs-Markers beschrieben. Carcinoembryonales Antigen (CEA) wurde in allen Krebspatienten- und gesunden Blutspender-Proben gemessen. Es konnte durch Vereinigung der mittels des in Beispiel 1 beschriebenen Tests gemessenen CEA- und TIMP-1-Mengen gezeigt werden, dass, während CEA alleine eine 35% Sensitivität bei einer 98% Spezifität ergibt, die Sensitivität der Kombination von CEA und Gesamt-TIMP-1, wie sie durch logistische Regressionsanalyse bestimmt wurde, auf 57% gesteigert war, ohne die Spezifität zu opfern.
  • In Beispiel 7 wird gezeigt, dass Patienten, die an Kolorektalkrebs leiden, signifikant erhöhte freie TIMP-1-Mengen in ihren präoperativen Plasmaproben aufweisen. Ein Perzentiles-Plot, der freie TIMP-1-Mengen von Kolorektalkrebs-Patienten sowie die freien TIMP-1-Mengen von gesunden Blutspendern einschließt, zeigte, dass Kolorektalkrebs-Patienten, verglichen mit den Blutspendern, signifikant erhöhte freie TIMP-1-Mengen aufwiesen, mit p = 0,02. Eine ROC-Kurve wurde für diese Patienten und Spender erstellt (18) und es wurde festgestellt, dass freier TIMP-1 einen Bereich unter der Kurve (BUK) von 0,61 ergab.
  • In Beispiel 8 wird die Verwendung des TIMP-1:MMP-9-Komplextests als ein Hilfsmittel zur Diagnose von Kolorektalkrebs beschrieben.
  • Es ist bekannt, dass TIMP-1 entweder als freies Molekül oder in einem Komplex mit MMPs, vorzugsweise MMP-9, vorliegt. Messung von Gesamt-TIMP-1, von in Komplexen vorliegendem TIMP-1 und freiem TIMP-1 wird es ermöglichen jede dieser Spezies auf ihren möglichen diagnostischen Wert hin einzustufen. Außerdem wird es möglich sein, das Verhältnis oder jeden abgeleiten Algorithmus zwischen verschiedenen Spezies zu berechnen, welche einen zusätzlichen diagnostischen Wert liefern könnten.
  • In Beispiel 9 wird der diagnostische Wert von der Kombination von gesamtem und freiem TIMP-1 beschrieben.
  • Die Daten zeigen, dass durch Vereinigung der freien TIMP-1-Messungen mit den Gesamt-TIMP-1-Messungen mittels logistischer Regressionsanalyse eine signifikante Erhöhung des BUKs gezeigt wurde. Jegliche Information, die von 18 erhalten werden kann, fällt in den Geltungsbereich der vorliegenden Erfindung.
  • Die Spezifität eines gegebenen Krebs-Durchmusterungstests basiert auf der Wirksamkeit des Tests nur jene Patienten zu identifizieren, die an Krebs leiden, während Patienten, die an nicht-malignen Erkrankungen leiden, nicht als falsch-positiv identifiziert werden sollten. Es wäre jedoch wünschenswert, dass der Test spezifisch für einen bestimmten Krebstyp, z.B. Kolonkrebs, wäre, anstatt ein universeller Krebsmarker zu sein.
  • In Beispiel 10 werden Gesamtplasma-TIMP-1-Werte in präoperativen Proben von einer Gruppe von 322 Patienten mit primärem Brustkrebs (Stadien I und II) im Vergleich mit Gesamt-TIMP-1-Mengen in 108 gesunden Blutspendern beschrieben. Es wurde gezeigt, dass die Brustkrebs-Patienten eine mittlere Gesamt-TIMP-1-Menge von 88,3 μg/l aufwiesen, während die gesunden Spender eine mittlere Plasmakonzentration an Gesamt-TIMP-1 von 88,9 μg/l aufwiesen. Der Unterschied zwischen diesen beiden Werten ist klinisch nicht signifikant, was die Spezifität von TIMP-1-Mengen für die Diagnose von Kolorektalkrebs unterstreicht. Es sollte dennoch untersucht werden, ob erhöhte Plasma-TIMP-1-Mengen in Patienten mit nicht-Kolorektalkrebs im Frühstadium festgestellt werden können.
  • In Beispiel 11 werden Gesamt-TIMP-1-Mengen in Patienten mit metastasierendem Brustkrebs beschrieben.
  • Es ist anzumerken, dass der Gesamt-TIMP-1 im Plasma von Frauen mit metastasierendem Brustkrebs einen Mittelwert von 236 μg/l aufwies, das ist erheblich höher als die Mengen in gesunden Blutspendern. Das zeigt das Potential der Verwendung von Plasma-TIMP-1-Mengen für die Handhabung von Brustkrebspatienten.
  • In Beispiel 12 werden die Konzentrationen von TIMP-2 in präoperativen Plasmaproben von Patienten mit Kolorektalkrebs beschrieben.
  • TIMP-2 ist ein anderer Gewebeinhibitor von Metallproteinasen mit einem hohen Homologiegrad zu TIMP-1. Unter Verwendung eines spezifischen Immuntests für TIMP-2 wurden die Konzentrationen dieses Inhibitors in Plasmaproben von Kolorektalkrebs-Patienten und in gesunden Blutspendern bestimmt. Zwischen den beiden Populationen wurden keine erheblichen Unterschiede in Plasma-TIMP-2-Mengen gefunden, was den einmaligen Wert von TIMP-1 als ein Hilfsmittel für die frühe Diagnose von Kolorektalkrebs unterstützt.
  • FIGURLEGENDEN
  • 1: Kinetischer Test für TIMP-1. Ablaufkurven für die Änderung im Absorptionsvermögen bei 405 nm, erzeugt durch die Hydrolyse von p-Nitrophenylphosphat durch an feste Phase gebundenes alkalische Phosphatase-Immunkonjugat. Die gezeigten Daten werden durch 4 einzelne Testvertiefungen erzeugt, die mit 4 verschiedenen Konzentration des gereinigten rekombinanten TIMP-1 behandelt wurden; 10 μg/l (∇-∇), 2,5 μg/l (Δ-Δ), 0,63 μg/l (⎕-⎕) und 0,16 μg/l (O-O). Die gezeigten Linien sind durch einfache lineare Regression angepasst worden.
  • 2: TIMP-1-Standardkurve. Absorptionseinheiten für TIMP-1-Standards in dreifacher Ausführung im Bereich von 0 bis 5 μg/l werden automatisch über 60 Minuten gesammelt, Messungen werden alle 10 Minuten bei 405 nm vorgenommen. Ablaufkurven werden für jede Vertiefung errechnet und die erhaltenen Raten werden unter Verwendung einer Vierparametergleichung der Formel y = d + [(a – d)/(1 + (x/c)b)] an eine Standardkurve angepasst. In dem gezeigten Beispiel hatten die vier abgeleiteten Parameter die folgenden Werte: a = 1,87, b = 1,11, c = 3,35, d = 73,5. Der Korrelationskoeffizient für die angepasste Kurve beträgt > 0,999.
  • 3: Wiederfindung ("unrecovery") eines Signals von Standard-TIMP-1, welches in zunehmender Konzentration zum Testverdünnungpuffer (⎕-⎕) hinzugefügt wurde, eine 1:100 Verdünnung vom EDTA-Plasmapool (Δ-Δ), eine 1:100 Verdünnung vom Citrat-Plasmapool (∇-∇) und eine 1:100 Verdünnung vom Heparin-Plasmapool (O-O). Die gezeigten Werte sind die Mittel von dreifachen Ausführungen. Der Korrelationskoeffizient für jede angepasste Kurve ist größer als 0,99.
  • 4: Westernblott-Verfahren von immunabsorbierten Plasmaproben von Patienten. Spur 1: Standard TIMP-1; Spur 2: Eluat einer 1:10 verdünnten Patienten-Citrat-Plasmaprobe und mit polyclonalem Schaf-anti-TIMP-1 immunabsorbiert. Banden von nicht-reduziertem Standard-TIMP-1 und aus Plasmaproben isoliertem TIMP-1 scheinen gerade unterhalb von 30 kDa auf.
  • 5a: Perzentilen-Plot für die Mengen an TIMP-1 (μg/l), gemessen in Citrat-Plasma (O) und EDTA-Plasma (Δ) von dem selben Individuum in einer Gruppe aus 100 freiwilligen Blutspendern.
  • 5b: Graphische Darstellung der linearen Regression für die Mengen an TIMP-1 in Citrat-Plasmaproben verglichen mit EDTA-Plasmaproben von denselben 100 Individuen. Die Gleichung der angepassten Linie ist y = 0,93x mit einem Regressionskoeffizienten von 0,99.
  • 6: Perzentilen-Plot für die Mengen an TIMP-1 (μg/l), gemessen in zwei Gruppen von Citrat-Plasmaproben, die durch das gleiche Verfahren von freiwilligen Blutspendern zu unterschiedlichen Zeiten erhalten wurden. 100 Proben von Mai = 97 (Δ) und 94 Proben von September = 96 (⎕).
  • 7: Perzentilen-Plot für die Mengen an TIMP-1 (μg/l), gemessen in 194 Citrat-Plasmaproben von freiwilligen Blutspendern und nach Geschlecht in 107 männliche (Δ) und 87 weibliche (O) aufgeschichtet.
  • 8: Graphische Darstellung des TIMP-1:MMP-9-Komplex-ELISAs.
  • 9: Graphische Darstellung des freien TIMP-1-ELISAs.
  • 10: Eine Platte wurde mit dem polyclonalen anti-MMP-9-Antikörper beschichtet. Unterschiedliche Konzentrationen an TIMP-1:MMP-9-Komplex, freiem MMP-9, freiem TIMP-1 und einer leeren Kontrolle wurden hinzugefügt. Nur TIMP-1:MMP-9-Komplexe und freie MMP-9 wurden durch den polyclonalen anti-MMP-9-Einfangantikörper gebunden. MAC-19 wurde dann für den Antigennachweis hinzugefügt. Weder TIMP-1:MMP-9-Komplex noch freie MMP-9 wurden durch MAC-19 nachgewiesen, was die Spezifität dieses Antikörpers für freien TIMP-1 definiert.
  • 11: Eine Platte wurde mit dem polyclonalen anti-MMP-9-Antikörper beschichtet. Unterschiedliche Konzentrationen von TIMP-1:MMP-9-Komplex, freiem TIMP-1 und eine leeren Kontrolle wurden hinzugefügt. Nur TIMP-1:MMP-9-Komplexe und freie MMP-9 wurden durch den polyclonalen anti-MMP-9-Einfangantikörper gebunden. MAC-15 wurde dann für den Antigennachweis hinzugefügt. Nur durch den polyclonalen anti-MMP-9-Einfangantikörper gebundener TIMP-1:MMP-9-Komplex wurde durch MAC-15 nachgewiesen. Freie MMP-9 wurde durch MAC-15 nicht nachgewiesen.
  • 12: Wiederfindung eines Signals im freien TIMP-1-Test von Standard-TIMP-1, welches in zunehmender Konzentration zum Testverdünnungpuffer (⎕-⎕) hinzugefügt wurde, eine Verdünnung vom EDTA-Plasmapool (Δ-Δ), eine Verdünnung vom Citrat-Plasmapool (∇-∇) und eine Verdünnung vom Heparin-Plasmapool (O-O). Die gezeigten Werte sind die Mittel von dreifachen Ausführungen. Der Korrelationskoeffizient für jede angepasste Kurve ist größer als 0,99.
  • 13: Die ROC-Kurven für Gesamt-TIMP-1 in allen Kolorektalkrebs-Patienten, in Rektalkrebs-Patienten gesondert und in Kolonkrebs-Patienten gesondert. Als gesunde Kontrollpersonen wurde eine Gruppe von 108 gesunden Blutspendern verwendet. (Zahl in den Klammern = Bereich unter der Kurve).
  • 14: Die ROC-Kurven für Gesamt-TIMP-1 in allen Kolorektalkrebs-Patienten mit Dukes' A- oder B-Syndrom. Außerdem sind ROC-Kurven für Dukes' A- oder B-Patienten mit Kolonkrebs oder mit rechtseitigem Kolonkrebs einbezogen (Nummer in den Klammern = Bereich unter der Kurve).
  • 15: ROC-Kurve für Gesamt-TIMP-1 von einer unabhängigen Gruppe von 64 Kolorektalkrebs-Patienten verglichen mit 108 gesunden Blutspendern wird gezeigt. (BUK = Bereich unter der Kurve)
  • 16: Kästchen-Plot, der die Gesamt-TIMP-1-Konzentrationen im Plasma von gesunden Blutspendern, von Patienten mit Crohn-Krankheit, von Patienten mit ulzerativer Kolitis und von Patienten mit Kolorektalkrebs zeigt. Mittelwerte, 10., 25., 75. und 90. Perzentile werden gezeigt.
  • 17: ROC-Kurven von Gesamt-TIMP-1, CEA und für die Kombination aus Gesamt-TIMP-1 und CEA in Patienten mit rechtsseitigem Kolonkrebs und 108 gesunden Blutspendern. (Zahl in Klammern = Bereich unter der Kurve).
  • 18: ROC-Kurven für freies TIMP-1 aus Plasma, für Gesamt-TIMP-1 aus Plasma und für die Kombination hiervon in 64 CRCL („colorectal cancer"-Kolorektalkrebs)-Patienten und 108 Spendern (Zahl in Klammern = Bereich unter der Kurve).
  • 19: ROC-Kurve für 322 Patienten mit primärem Brustkrebs und 108 Blutspendern. (BUK = Bereich unter der Kurve)
  • 20: Perzentil-Plot für die Mengen an Gesamt-TIMP-1 (μg/l) gemessen durch ELISA in 19 EDTA-Plasmaproben von weiblichen Brustkrebspatienten (O) und 87 gesunden Blutspendern (Δ).
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1
  • Erzeugung eines ELISAs zur Quantifizierung von Gesamt-TIMP-1-Konzentrationen in menschlichem Plasma.
  • Dieses Beispiel beschreibt die Erzeugung und Bewertung eines ELISAs, der Gesamt-TIMP-1-Mengen im Plasma misst. Außerdem stellt dieses Beispiel Information über TIMP-1-Mengen in verschiedenen Plasma-Präparaten sowie auch in gesunden Blutspendern beiderlei Geschlechts bereit.
  • Material und Methoden:
  • Blutspender
  • Blutproben wurden zunächst von 94 anscheinend gesunden freiwilligen Blutspendern erhalten, welche 51 Männer im Alter von 19 bis 59 Jahren (Mittel: 41 Jahre) und 43 Frauen im Alter von 20 bis 64 Jahren (Mittel: 36 Jahre) umfassten. In einer anschließenden Entnahme wurden 100 Proben von Spendern erhalten, die 56 Männer im Alter von 19 bis 59 Jahren (Mittel: 42 Jahre) und 44 Frauen im Alter von 20 bis 60 Jahren (Mittel: 36,5 Jahre) umfassten. Eine Einverständniserklärung wurde von allen Spendern erhalten und von den örtlichen ethischen Ausschüssen wurde Genehmigung erhalten.
  • Blutentnahmen und Plasmatrennungen
  • Peripheres Blut wurde mit minimaler Stasis (falls nötig war ein Maximum von 2-minütiger Stasis mit einem Tourniquet bei einem Maximum von +2 kPa akzeptabel) entnommen und in vorgekühlte Citrat-, EDTA- oder Heparin-Entnahmeröhrchen (Becton-Dickinson, Mountain View, CA) gegeben, fünfmal durch Umdrehen gemischt und sofort auf Eis gekühlt. Sobald als möglich (nicht später als 1,5 Stunden nach der Entnahme) wurden Plasma und Blutzellen durch Zentrifugation bei 4°C bei 1.200 × g für 30 min getrennt und bei –80°C vor dem Test eingefroren. Die Plasmapools wurden mit frisch entnommenen Proben von mindestens zehn Spendern hergestellt, aliquotiert und eingefroren bei –80°C aufbewahrt. Für die Untersuchung wurden die Proben in einem 37°C Wasserbad schnell aufgetaut und dann bis zum Gebrauch auf Eis gestellt.
  • Gesamt TIMP-1-ELISA
  • Ein sensitiver und spezifischer Sandwich-ELISA wurde unter Verwendung von TIMP-1-Antikörpern, die in den Strangeways Laboratories (Hembry et al, 1985) entwickelt wurden, erzeugt. Ein polyclonales Schaf-anti-TIMP-1-Antiserum (Hembry et al, 1985; Murphy et al, 1991) wurde für das Einfangen des Antigens verwendet und monoclonales Maus-anti-TIMP-1-IgG1 (MAC-15) (Cooksley et al, 1990) für den Antigennachweis. Ein Kaninchen-anti-Maus-Immunglobulin/alkalische Phosphatase-Konjugat (Katalognummer D0314, Dako, Glostrup, Dänemark) war das zweite Nachweis-Reagens. Das letztere Konjugat wurde prä-absorbiert an menschliches IgG bereitgestellt, auf diese Weise wurde eine Kreuzreaktivität mit IgG in den Plasmaproben ausgeschlossen. Als der monoclonale Nachweisantikörper erkennt MAC-15 sowohl freies TIMP-1 als auch TIMP-1 im Komplex mit MMPs (Cooksley et al, 1990). Der Gesamt-TIMP-1-Gehalt, der durch das polyclonale Schaf-anti-TIMP-1-Antiserum eingefangen wurde, wurde durch den ELISA quantifiziert.
  • Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (Maxisorp, Nunc, Roskilde, Dänemark) wurden für 1 Stunde bei 37°C mit 100 μl/Vertiefung an polyclonalem Schaf-anti-TIMP-1 (4 mg/l) in 0,1 Mol/l Carbonatpuffer, pH-Wert 9,5 beschichtet. Die Vertiefungen wurden dann zweimal mit 200 μl/Vertiefung an SuperBlockJ-Lösung (Pierce Chemicals, Rockford, IL) gewaschen, die 1:1 mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) verdünnt war. Die Mikrotiterplatten wurden für bis zu 14 Tage bei –20°C gelagert. Am Tag der Untersuchung wurden die Platten bei Raumtemperatur aufgetaut und fünfmal in PBS gewaschen, die 1 g/l Tween enthielt.
  • Eine Reihe an gereinigten rekombinanten menschlichen TIMP-1-Standards wurde verwendet, um jede Platte zu kalibrieren. Die Standards wurden erzeugt, um eine Stammlösung von gereinigtem TIMP-1 seriell zu verdünnen. Die Standard-Konzentrationen waren 10, 5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,313 und 0,156 μg/l. Auch auf jeder Platte enthalten war ein Leerwert, der nur Proben-Verdünnungspuffer enthielt, und 2 Kontrollen, die von einer 1:100-Verdünnung eines Citrat-Plasmapools hergestellt waren. Eine Kontrolle wurde als die erste Probe auf der Platte hinzugefügt und die zweite Kontrolle wurde als die Letzte hinzugefügt. Alle Plasmaproben wurden 1:100 in Probenpuffer verdünnt, der 50 Mol/l Phosphat, pH-Wert 7,2, 0,1 Mol/l NaCl, 10 g/l Rinderserumalbumin (Fraktion V, Boehringer-Mannheim, Penzberg, Germany) und 1 g/l Tween 20 enthielt. Jeweils eine Gesamtmenge von 100 μl/Vertiefung an Standard, Leerwert, Kontrolle und Patientenprobe wurde auf der Platte für 1 Stunde bei 30°C inkubiert. Alle Standards, Leerwerte, Kontrollen und Proben wurden auf jeder Platte für jeden Test in dreifacher Ausführung ausgeführt. Nach der Erstinkubation wurden die Vertiefungen fünfmal gewaschen, dann für 1 Stunde bei 30°C mit 100 μl/Vertiefung an gereinigtem monoclonalem MAC-15-Antikörper (0,5 mg/l) in Proben-Verdünnungspuffer behandelt. Nach weiteren 5 Waschvorgängen wurden die Vertiefungen für 1 h bei 30°C mit 100 μl/Vertiefung an Kaninchen-anti-Maus-Immunglobulin (Ig)/alkalische Phosphatase-Konjugat inkubiert, das 1:2000 in Proben-Verdünnungspuffer verdünnt war. 100 μl frisch hergestelltes p-Nitrophenyl-phosphat (Sigma, St. Louis, MO)-Substratlösung (1,7 g/l in 0,1 Mol/l Tris-HCl, pH-Wert 9,5, 0,1 Mol/l NaCl, 5 mMol/l MgCl2) wurden nach 5 Waschvorgängen mit Waschlösung und 3 Waschvorgängen mit destilliertem Wasser zu jeder Vertiefung hinzugefügt. Die Platte wurde in einen Ceres 900J-Plattenleser (Bio-Tek Instruments, Winooski, VT) bei 23°C gegeben, wobei die gelbe Farbentwicklung automatisch überwacht wurde. Messungen wurden bei 405 nm gegen einen Luftleerwert alle 10 Minuten eine Stunde lang genommen. KinetiCalc-II-Software wurde verwendet, um die Daten durch Berechnung der Farbentwicklungsrate für jede Vertiefung (lineare Regressionsanalyse) zu untersuchen, was eine angepasste 4-Parameter-Standardkurve erzeugte und die TIMP-1-Konzentration jeder Plasmaprobe errechnete.
  • Wiederfindungsexperimente
  • Die Wiederfindung des TIMP-1-Signals wurde nach der Zugabe zu 1:100-Verdünnungen von Citrat, EDTA oder Heparin-Plasmapools gemessen. Gereinigter TIMP-1 wurde zu Plasmapools hinzugefügt, um eine Endkonzentration im Bereich von 0 bis 10 μg/l zu ergeben. Die Wiederfindung wurde in jedem Fall von der Neigung der Linie berechnet, die das TIMP-1-Signal als eine Funktion der Konzentration darstellt, wobei 100% Wiederfindung als die Neigung definiert wurde, die erhalten wurde, wenn TIMP-1 in Proben-Verdünnungspuffer verdünnt wurde.
  • Immunblott-Verfahren
  • Citrat-Plasma von einem Patienten mit einer hohen Menge an TIMP-1 im Blut (634 μg/l, bestimmt durch ELISA) wurde 1:10 verdünnt und zu einer Protein-A-Sepharosesäule hinzugefügt, die mit polyclonalem Schaf-anti-TIMP-1 vorinkubiert worden war. Nach 5 Zyklen wurden die gebundenen Proteine von der Säule eluiert und 50 μl des daraus resultierenden Eluats einer 12% SDS-Gelelektrophorese (Ready GelJ, Bio-Rad) unterzogen. Ein Gemisch von Niedrigmolekulargewichts- (Pharmacia) und Hochmolekulargewichtsmarkern (Bio-Rad) und 50 μl an TIMP-1-Standard (100 μl/l) in Lämmli-Probenpuffer ließ man auch auf dem Gel laufen. Die Proteine wurden elektrophoretisch vom Gel auf eine Polyvinyliden-Difluorid(PVDF)-Membran (Millipore) übertragen. Die Membran wurde für 1 h bei Raumtemperatur mit 1% Magermilchpulver in TBS inkubiert. Nach dem Waschen wurde die Membran für 1 h bei Raumtemperatur mit 20 ml MAC-15 (5 mg/l) inkubiert. Die Membran wurde dann gewaschen und für eine weitere Stunde bei Raumtemperatur mit 20 ml Kaninchen-anti-Maus-Ig/alkalische Phosphatase-Konjugat inkubiert, das 1:1000 verdünnt war. Schließlich wurde die Membran gewaschen und die Farbe durch Zugabe einer Phosphat-Substratlösung (NBT/BCIP) entwickelt.
  • Ergebnisse:
  • ELISA-Durchführung
  • Die Farbentwicklung in jeder Vertiefung schritt in diesen Experimenten (1) für alle Konzentrationen des Gesamt-TIMP-1 als eine lineare Zeitfunktion voran, mit Korrelationskoeffizienten, die für die angepassten Linien üblicher Weise größer als 0,99 waren. Die Standardkurve für die gegen die TIMP-1-Konzentration aufgetragenen Raten bestanden aus den linearen und oberen gekrümmten Bereichen (über einem Bereich von 0 bis 5 μg/l) einer sigmoidalen Kurve und der Korrelationskoeffizient für die 4-Parameter-Anpassung war üblicher Weise besser als 0,999 (2). Die Rate ohne TIMP-1 (gemessen gegen einen Luft-Leerwert) war 1,21 ± 0,15 (Mittel ± SD "standard derivation"-Standardabweichung) Milliabsorptionseinheiten/Minute (n = 29), während die Rate mit 10 μg/l Standard-TIMP-1 50,3 ± 6,01 Milliabsorptionseinheiten/Minute (n = 29) war. Die Nachweisgrenze für den Test, die als die Konzentration von TIMP-1 definiert wurde, die sich mit einem Signal 3 SD über dem Mittel für den TIMP-1 Leerwert deckt, war 0,089 μg/l. Dieser Wert betrug 13% des Mittels für die gemessenen Konzentrationen von TIMP-1 in gesunden Citrat-Plasmaproben. Die testinterne Variationskoeffizent (VK) für 16 Wiederholungen eines Kontroll-Citrat-Plasmapools war 5,3% und der VK zwischen den Tests für 29 sukzessive Tests des Plasmapools (durchgeführt an unterschiedlichen Tagen) war 6,2%. Dieser Plasmapool hatte eine TIMP-1-Konzentration von 57,8 μg/l, was der 22. Perzentile eines normalen Individuums entspricht.
  • Wiederfindung von rekombinantem TIMP-1 nach Verdünnung in Plasma. Spezifische Wiederfindung wurde durch die Zugabe von steigenden Konzentrationen an gereinigtem TIMP-1 zu einer Reihe von Plasmapool-Replikas bestimmt, gefolgt von anschließender Messung des Signals. Die Wiederfindung war in Citrat-Plasma 104%, in verdünntem EDTA-Plasma 101% und in verdünntem Heparin-Plasma 87% (3). Die Wiederfindung an TIMP-1-Signal von einem internen Standard war daher für alle Erzeugungen von Plasmapräparate annehmbar.
  • Verdünnungskurven für Gesamt-TIMP-1-Signal des Plasmas
  • Serielle Verdünnungen von Citrat-, EDTA- und Heparin-Plasmapools wurden durchgeführt, um auf lineare Reduktion im TIMP-1-Signal zu prüfen. Citrat-, EDTA- und Heparin-Plasmen ergaben alle eine gute Linearität des Signals als eine Funktion der Verdünnung. Die 1% Plasmaverdünnung, welche für anschließende Bestimmungen ausgewählt wurde, lag völlig innerhalb des Bereichs dieser linearen Verdünnungskurve.
  • Immunblott-Verfahren für Gesamt-TIMP-1 des Plasmas
  • Ein Western-Blot einer immunabsorbierten Plasmaprobe eines Patienten zeigte ein deutliches Band von 28 kDa (4, Spur 2), was freiem nicht in Komplexen vorliegendem TIMP-1 entspricht (4, Spur 1). Bei den erwarteten höheren Molekulargewichten, die Komplexen zwischen MMPs und TIMP-1 entsprechen, z.B. MMP-2:TIMP-1, 100 kDa, wurden keine Banden festgestellt. Das deutet darauf hin, dass der Hauptteil an TIMP-1 im Plasma als freie Form vorliegt oder dass Komplexe während der SDS-PAGE zerfallen sind. Obwohl die Probe sowohl nicht reduziert als auch nicht erhitzt wurde, um jegliche in der Plasmaprobe vorhandenen Komplexe zu erhalten, wurde berichtet, dass MMP:TIMP-Komplexe in SDS-Page, sogar unter nicht-reduzierenden Bedingungen (Moutsiakis et al, 1992), instabil sein können (Wilhelm et al, 1989; Stetler-Stevenson et al, 1989; Moll et al, 1990).
  • Gesamt-TIMP-1 in Citrat- und EDTA-Plasma von dem selben gesunden Spender
  • Eine Sammlung an Citrat- und EDTA-Plasmaproben, die gleichzeitig von 100 gesunden Spendern entnommen wurden, war für diese Studie verfügbar. Diese Proben wurden nicht speziell als Blutplättchen-armes Plasma gesammelt. Eine kleine repräsentative Zahl an Proben, hergestellt aus Blutplättchen-armen Plasma, unterschied sich jedoch in den Gesamt-TIMP-1-Werten nicht erheblich. Die Perzentil-Plots für Gesamt-TIMP-1-Mengen in diesen Proben werden in 5a gezeigt. Die Werte in jeder Gruppe glichen annähernd einer normalen Verteilung. Citrat-Plasma-TIMP-1-Mengen bewegten sich zwischen 55,0 und 90,3 μg/l (10. bis 90. Perzentil) mit einem Mittel von 69,2 ± 13,1 μg/l. In ähnlicher Weise bewegten sich EDTA-Plasma-TIMP-1-Mengen von 58,0 bis zu 91,8 μg/l mit einem Mittel von 73,5 ± 14,2 μg/l. Sowohl für Citrat- als auch für EDTA-Plasma befanden sich die Mittel-TIMP-1-Werte nahe den Medianmengen (Tabelle 1). Ein gepaarter Mittelwertvergleich zeigte, dass die Mengen an TIMP-1 in Citrat-Plasma um 4,34 μg/l (95% Cl 2,34–6,33; (p < 0,0001) signifikant niedriger waren als die EDTA-Plasmamengen desselben Individuums. Es ist jedoch wahrscheinlich, dass dieser Unterschied auf der Variabilität der Probenentnahme während der Plasmaentnahme beruht. EDTA-Plasmaröhrchen enthielten ein trockenes gerinnungshemmendes Mittel, während Citrat-Plasmaröhrchen eine geringe Menge an flüssigem Citratpuffer enthielten, die einen kleinen und variablen systematischen Verdünnungsfehler ergab (× 9/10). Die Menge an TIMP-1 in Citrat-Plasma korrelierte mit jener in EDTA-Plasma von den gleichen Individuen. Der lineare Regressions-Plot in 5b zeigt einen Regressionskoeffizienten von 0,99 mit einer Neigung der angepassten Linie von 0,93, was vielleicht einen geringen Verdünnungsfehler darstellt. Ein nicht-parametrischer Spearman-Rangtest für die Datengruppe ergab einen Rho-Wert von 0,62 und p < 0,0001.
  • Gesamt-TIMP-1-Mengen in Citrat-Plasma
  • Eine Gesamtmenge von 194 Citrat-Plasmaproben von gesunden Blutspendern wurde getestet, umfassend 94 Proben, die während einer Sammlung entnommen wurden, sowie 100 Proben, die 9 Monate später von einer anderen Spendergruppe entnommen wurden. 6 zeigt die Perzentil-Plots für TIMP-1-Mengen, die in diesen beiden unabhängigen Gruppen gemessen wurden. Der Referenzbereich für TIMP-1-Mengen in Citrat-Plasma von der ersten Sammlung war 53,3 bis 77,7 μg/l (10. bis 90. Perzentil) mit einem Mittel von 65,4 ± 10,1 μg/l, welches vom Medienwert nicht zu unterscheiden war (Tabelle 1) und annähernd einer normalen Verteilung entsprach. Die mittlere TIMP-1-Menge für die zweite Sammlung war 69,2 ± 13,1 μg/l (Referenzbereich 55,0 bis 90,3 μg/l). Ein ungepaarter Mittelwertvergleich zeigte, dass sich die beiden Probengruppen, die während der verschiedenen Zeiträume entnommen wurden, nur um 3,82 μg/l (95% Cl: 0,50–7,14 μg/l; p = 0,024) unterschieden. Darüber hinaus war kein signifikanter Unterschied zwischen den Kontrollen (n = 8) offensichtlich, die in jeder Gruppe der Tests enthalten waren (Unterschied des Mittels 0,36 μg/l; 95% Cl: 1,71–2,44 μg/l; p = 0,69). Die TIMP-1-Medianmenge für alle 194 Citrat-Plasmaproben war mit 67,3 ± 11,8 μg/l nahe dem Medianwert von 66,1 μg/l mit Mengen, die wieder annähernd einer normalen Verteilung glichen (Referenzbereich 54,0 bis 82,7 μg/l). TABELLE 1
    Figure 00230001
    Figure 00240001
    • * Der Referenzbereich ist als das 10. bis 90. Perzentil definiert.
    • ** Diese Proben werden von den gleichen Spendern entnommen.
  • Untersuchungen auf Korrelationen mit Geschlecht und Alter des Spenders
  • In diesen Untersuchungen hatten die in jedem Test gemessenen Kontrollwerte einen VK von 2,7%. Perzentile für TIMP-1-Mengen in 194 Citrat-Plasmaproben, die gemäß dem Geschlecht berechnet wurden, werden in 7 gezeigt. Der mittlere TIMP-1-Wert für 107 männliche Spender war 70,4 ± 12,0 μg/l (Medianwert: 69,4 μg/l) mit einem Referenzbereich von 56,2 bis 86,6 μl/l, während der mittlere TIMP-1-Wert für weibliche Spender in dieser Gruppe 63,5 ± 10,5 μg/l (Medianwert: 62,0 μg/l) war, mit einem Referenzbereich von 51,8 bis 77,0 μg/l. Es gab zwischen den beiden Gruppen einen signifikanten Unterschied (p < 0,0001) an mittleren TIMP-1-Mengen; Männer wiesen höhere TIMP-1-Mengen auf als Frauen. Es gab mit zunehmendem Alter (Spearman-Rho-Wert = 0,33, P = 0,0011) eine Tendenz in Richtung einer Erhöhung an Plasma-TIMP-1, aber diese Tendenz stieg nicht mit dem Geschlecht an (Frauen: Spearman-Rho = 0,29, P = 0,006; Männer: Spearman-Rho = 0,35, P = 0,0003). Der mittlere TIMP-1-Wert im EDTA-Plasma war für 56 Männer 76,9 ± 15,0 μg/l (Medianwert: 75,1 μg/l) mit einem Bereich von 58,8 bis 96,9 μg/l, während 44 weibliche Spender eine mittlere TIMP-1-Menge von 69,3 ± 11,8 (Medianwert: 67,9) mit einem Referenzbereich von 56,1 bis 85,5 μg/l aufwiesen. Es trat erneut ein signifikanter Unterschied zwischen Männern und Frauen auf (p = 0,0076, ungepaarter Mittelwertvergleich).
  • Diskussion:
  • Der vorstehend beschriebene Test ermöglicht die genaue Bestimmung des Gesamt-TIMP-1 in menschlichen Plasmaproben. Tests der kinetischen Rate des gebundenen Antigens wurden leicht bewerkstelligt, was ein automatisches Anpassen der Ratenkurven erlaubten; das hat sich als erheblich zuverlässiger als einzelne Endpunktmessungen erwiesen. Die Verwendung eines schnellen Blockierungsmittels und eines Verdünnungspuffers mit hoher Pufferkapazität trug auch zu reproduzierbaren Tests bei. Das Einbeziehen all dieser Elemente in den endgültigen Test erfüllte die Erfordernisse von Sensitivität, Spezifität, Stabilität und guter Wiederfindung eines internen Standards.
  • Die quantitativen Studien im Blut von gesunden Spendern zeigten, dass sowohl Citrat- als auch EDTA-Plasmaproben für die TIMP-1-Bestimmung geeignet sind. Verglichen mit anderen veröffentlichten Studien von TIMP-1 von gesunden Spendern (Jung et al, 1996; Jung et al, 1996) fielen die Mengen in der vorliegenden Studie in einen sehr engen Bereich. Manche Studien haben von Ergebnissen im Serum berichtet, aber für die vorliegende Studie wurde Plasma gewählt, um die variable Verteilung der Blutplättchen-Aktivierung zu den gemessenen TIMP-1-Werten zu vermeiden (Cooper et al, 1985). Während die Plasmaproben, die in dieser Studie verwendet wurden, nicht speziell als Blutplättchen-armes Plasma erzeugt wurden, ist basierend auf im Labor durchgeführten Untersuchungen gezeigt worden, dass diese Tatsache die Werte nicht verändert. Das Spendermaterial war umfangreich genug, um zu zeigen, dass TIMP-1-Mengen in gesunden Individuen (sowohl EDTA als auch Citrat) für Frauen sowie auch für Männer annähernd einer normalen Verteilung glichen. Mittlere TIMP-1-Werte waren in Männern ungefähr 10% höher als in Frauen, sowohl für EDTA- als auch für Citrat-Plasma. Eine Erklärung dafür ist eine höhere Freisetzungsrate von TIMP-1 ins Blut von aktivierten Blutplättchen, was eine Tendenz in Richtung eines häufigeren Vorkommen von thrombo-embolischer Erkrankung in der männlichen Bevölkerung hinweist. Wenn Männer und Frauen getrennt betrachtet wurden, gab es wie bei der Gesamtpopulation eine schwache Korrelation zwischen TIMP-1 und dem Alter (siehe vorstehend).
  • Beispiel 2
  • Erzeugung eines ELISAs, um TIMP-1:MMP-9-Komplexe im Plasma zu quantifizieren.
  • Die folgenden Beispiele beschreiben einen Test zur Bestimmung der Konzentration von TIMP-1:MMP-9-Komplexen in Körperflüssigkeiten. Der Test wird mit Plasmaproben von gesunden Blutspendern durchgeführt, um normale Bereiche dieses Komplexes zu ermitteln (Holten Andersen et al, 1999).
  • Material und Methoden:
  • TIMP-1:MMP-9-Komplex-ELISA
  • Ein sensitiver und spezifischer Sandwich-ELISA wurde unter Verwendung des vorstehend beschriebenen TIMP-1-Antikörpers, MAC-15, und eines polyclonalen Kaninchen-MMP-9-Antikörper, in der hämatologischen Abteilung, Rigshospitalet, Dänemark (Kjeldsen et al, 1992) entwickelt, erzeugt. Der MMP-9-Antikörper wurde zum Antigen-Einfangen verwendet und MAC-15 wurde zum Antigennachweis verwendet. Ein Kaninchen-anti-Maus-Ig/alkalisches Phosphatase-Konjugat (Dako, Glostrup, Dänemark) ermöglichte einen Test der kinetischen Rate (8). Das letztere Konjugat wurde prä-absorbiert an menschliches IgG geliefert und schloss auf diese Weise Kreuz-Reaktivität mit IgG in den Plasmaproben aus. Der MMP-9-Antikörper fing sowohl freies MMP-9 als auch im Komplex mit TIMP-1 vorliegendes MMP-9 ein, während MAC-15 nur TIMP-1 erkannte. Daher wurden durch dieses Reagenspaar nur TIMP-1:MMP-9-Komplexe quantifiziert.
  • Um spontane ex vivo-TIMP-1:MMP-Komplexbildung während der Probenentnahme und den Testvorgängen zu verhindern, wurde ein Proteaseinhibitor (d.h. Galardin, Batimastat, Marimastat) nach dem Auftauen zu der Plasmaprobe hinzugefügt. Die Zugabe des Proteinaseinhibitors blockierte in vitro-Komplexbildung durch die Hemmung der katalytischen Aktivität der Metallproteinasen.
  • Der TIMP-1:MMP-9-Test wurde durchgeführt und durch ein ähnliches Verfahren zu jenem, das vorstehend beschrieben wurde für den Gesamt-TIMP-1-Test bewertet. Der TIMP-1:MMP-9-Standard wurde durch Inkubation von äquimolaren Mengen an gereinigtem rekombinanten TIMP-1 und MMP-9 (aktiviert durch Zugabe von APMA) in PBS für eine Stunde bei 37 Grad Celsius erzeugt.
  • Kurz gesagt wurden Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen über Nacht bei 4°C mit 100 μl/Vertiefung an polyclonalem Kaninchen-anti-MMP-9-Antiserum in 0,1 Mol/l Carbonatpuffer, pH-Wert 9,5, beschichtet. Vor der Verwendung wurden die Vertiefungen zweimal mit 200 μl/Vertiefung an SuperBlock-Lösung gespült, die 1:1 mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) verdünnt war, und dann fünfmal in PBS gewaschen, die 1 g/l Tween 20 enthielt. Die Vertiefungen wurden dann für 1 Stunde bei 30°C mit 100 μl/Vertiefung an Plasma inkubiert, das in Probenpuffer verdünnt war. Eine Reihe von gereinigten TIMP-1:MMP-9-Standards wurde verwendet, um jede Platte zu kalibrieren. Die Standards wurden durch serielle Verdünnung einer Stammlösung von gereinigtem TIMP-1:MMP-9-Komplex erzeugt. Auf jeder Platte war ein Leerwert enthalten, der nur Proben-Verdünnugspuffer enthielt und 2 Kontrollen, die aus einem Citrat-Plasmapool hergestellt wurden. Ein Kontroll-Plasmapool wurde als die erste Probe auf der Platte hinzugefügt und die zweite Kontrolle als die Letzte. Alle Standards, Leerwerte, Kontrollen und Proben wurden in dreifacher Ausführung auf jeder Platte für jeden Test ausgeführt. Nach Inkubation der Proben und TIMP-1:MMP-9-Komplexbindung wurden die Vertiefungen fünfmal gewaschen, gefolgt von der Behandlung, für 1 Stunde bei 30°C, mit 100 μl/Vertiefung an MAC-15 in Proben-Verdünnungspuffer. Nach 5 weiteren Waschvorgängen wurden die Vertiefungen für 1 Stunde bei 30°C mit 100 μl/Vertiefung an Kaninchen-anti-Maus-Ig/alkalische Phosphatase-Konjugat inkubiert, das mit Proben-Verdünnungspuffer verdünnt war. Nach 5 Waschvorgängen mit Waschlösung und 3 zusätzlichen Waschvorgängen mit destilliertem Wasser wurden 100 μl frisch hergestellte p-Nitrophenylphosphat-Substratlösung zu jeder Vertiefung hinzugefügt. Die Platte wurde in ein Ceres 900J-Plattenlesegerät gestellt und die gelbe Farbentwicklung bei 23°C automatisch überwacht. Die Messungen wurden alle 10 Minuten für eine Stunde bei 405 nm gegen einen Luft-Leerwert durchgeführt. KinetiCalc II-Software wurde verwendet, um die Daten durch Berechnung der Farbentwicklungsrate für jede Vertiefung (lineare Regressionsanalyse), was eine angepasste 4-Parameter-Standardkurve erzeugte, und durch Berechnung der TIMP-1-MMP9-Konzentration jeder Plasmaprobe zu untersuchen.
  • Wiederfindungsexperimente
  • Die spezifische Wiederfindung wurde durch Zugabe von TIMP-1:MMP-9-Komplexen zu einer Reihe von Citrat-, EDTA- oder Heparin-Plasmapools bestimmt. Die Wiederfindung in jedem Fall wurde von der Neigung der Linie berechnet, die das TIMP-1:MMP-9-Komplexsignal als eine Funktion der Konzentration darstellt, wobei 100% Wiederfindung als die Neigung definiert wurde, die erhalten wird, wenn der TIMP-1:MMP-9-Komplex im Proben-Verdünnungspuffer verdünnt wurde.
  • Ergebnisse
  • ELISA-Durchführung
  • Die Farbentwicklung in jeder Vertiefung war für alle Konzentrationen der TIMP-1:MMP-9-Komplexe, die in diesen Experimenten gemessen wurden, eine lineare Zeitfunktion, mit Korrelationskoeffizienten, die für die automatisch angepassten Linien typischer Weise größer als 0,999 waren.
  • Wiederfindung des TIMP-1:MMP-9-Komplexes nach der Verdünnung in Plasma
  • Die spezifische Wiederfindung wurde durch Zugabe von zunehmenden Konzentrationen an TIMP-1:MMP-9 zu einem Plasmapool und anschließender Messung des spezifischen Signals bestimmt.
  • Verdünnungskurven für Plasma-TIMP-1:MMP-9
  • Serielle Verdünnungen von Citrat- und EDTA-Plasmapools wurden hergestellt und die Komplexmengen quantifiziert, um die Linearität des Tests zu bestimmen. Sämtliche Citrat- und EDTA-Plasmen ergaben als eine Verdünnungsfunktion eine gute Linearität des Signals.
  • Beispiel 3
  • Erzeugung eines ELISAs zur Quantifizierung freier TIMP-1-Mengen im Plasma
  • Die folgenden Beispiele beschreiben einen Test, der die Konzentration von freien TIMP-1-Mengen in Körperflüssigkeiten bestimmt. Der Test wird auf Plasmaproben von gesunden Blutspendern angewandt, um normale Bereiche an freiem TIMP-1 zu erstellen.
  • Material und Methoden:
  • FREIER-TIMP-1-ELISA
  • Ein sensitiver und spezifischer Sandwich-Immuntest wurde unter Verwendung eines monoclonalen TIMP-1-IgG1-Antikörpers (MAC-19), der in den Strangeways Laboratories, England (Cooksley et al, 1990) entwickelt wurde, und eines polyclonalen Schaf-anti-TIMP-1-Antikörpers erzeugt. Der polyclonale Schaf-anti-TIMP-1-Antikörper wurde zum Antigeneinfangen verwendet und der monoclonale Maus-MAC-19 wurde für den Antigennachweis verwendet. Ein Kaninchen-anti-Maus-Ig/alkalische Phosphatase-Konjugat stellte das sekundäre Nachweisreagens dar (9). Das letztere Konjugat wurde prä-absorbiert an menschliches IgG geliefert und schloss auf diese Weise Kreuz-Reaktivität mit IgG in den Plasmaproben aus. Der monoclonale MAC-19-Antikörper ist für freien TIMP-1 völlig spezifisch, welcher daher in diesem Test die einzige quantifizierte Form ist.
  • Um zu überprüfen, dass MAC-19 nicht mit Komplexen zwischen TIMP-1 und MMP-9 reagiert, wurde der in Beispiel 2 beschriebene polyclonale Kaninchen-anti-MMP-9-Antikörper zum Antigeneinfangen verwendet und der monoclonale Maus-Antikörper MAC19 für den Antigennachweis. Ein Kaninchen anti-Maus-Ig/alkalische Phosphatase-Konjugat wurde als das sekundäre markierte Reagens verwendet. Standard TIMP-1:MMP-9-Komplex, freie MMP-9, freier TIMP-1 und ein Leerwert wurden getestet. 10 zeigt, dass vom polyclonalen anti-MMP-9-Antikörper gebundene TIMP-1:MMP-9-Komplexe nicht durch MAC-19 nachgewiesen werden. Ein äquivalentes Experiment wurde durchgeführt, in dem MAC-19 durch MAC-15 ersetzt wurde. 11 zeigt die Ergebnisse dieses Experiments. Es wird gezeigt, dass MAC-15 den TIMP-1:MMP:9-Komplex, der durch den polyclonalen anti-MMP-9-Antikörper gebunden wird, nachweist.
  • Um die Bildung von TIMP-1:MMP-Komplexen ex vivo während der Probenabnahme und Testvorgänge zu verhindern, wurde ein Proteaseinhibitor (d.h. Galardin, Batimastat, Marimastat) zu der Plasmaprobe nach dem Auftauen hinzugefügt. Die Zugabe des Proteaseinhibitors verhinderte die Komplexbildung in vitro durch Hemmung der katalytischen Aktivität der Metallproteinasen.
  • Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen wurden für 1 Stunde bei 37°C mit 100 μl/Vertiefung an polyclonalem Schaf-anti-TIMP-1 (4 mg/l) in 0,1 Mol/l Carbonatpuffer, pH-Wert 9,5, beschichtet. Die Testvertiefungen wurden dann zweimal mit 200 μl/Vertiefung an SuperBlock-Lösung gespült, die 1:1 mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) verdünnt war. Die Mikrotiterplatten wurden bis zu 14 Tage bei –20°C gelagert. Am Verwendungstag wurden die Platten bei Raumtemperatur aufgetaut und fünfmal mit PBS gewaschen, das 1 g/l Tween 20 enthielt. Die Vertiefungen wurden dann 1 Stunde bei 30°C mit 100 μl/Vertiefung an in dreifacher Ausführung durchgeführten 1:25 Verdünnungen von Plasma in Probenpuffer inkubiert, der aus 50 Mol/l Phosphat, pH-Wert 7,2, 0,1 Mol/l NaCl, 10 g/l Rinderserumalbumin (Fraktion V, Boehringer-Mannheim, Penzberg, Deutschland) und 1 g/l Tween 20 bestand. Die Standards wurden durch serielle Verdünnungen einer Stammlösung von gereinigtem freiem TIMP-1 erzeugt, um Konzentrationen von 10, 5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,313 und 0,156 μg/l zu ergeben. Auf jeder Platte war auch ein Leerwert enthalten, der nur Probenverdünnungspuffer enthielt, und 2 Kontrollen, hergestellt aus einem Citrat-Plasmapool, der 1:25 verdünnt war. Ein Kontroll-Plasmapool wurde als die erste Probe auf der Platte hinzugefügt und die zweite Kontrolle wurde als die Letzte hinzugefügt. Alle Standards, Leerwerte, Kontrollen und Proben wurden in dreifacher Ausführung auf jeder Platte für jeden Test ausgeführt. Nach der TIMP-1-Bindung wurden die Vertiefungen fünfmal gewaschen und für 1 Stunde bei 30°C mit 100 μl/Vertiefung des gereinigten monoclonalen Maus-anti-TIMP-MAC-19 (0,5 mg/l) in Probenverdünnungspuffer behandelt. Nach weiteren 5 Waschvorgängen wurden die Vertiefungen für 1 he bei 30°C mit 100 μl/Vertiefung des Kaninchen-anti-Maus-Immunglobin/alkalische Phosphatase-Konjugats inkubiert, das 1:2000 in Proben-Verdünnungspuffer verdünnt war. Nach 5 Waschvorgängen mit Waschlösung und 3 Waschvorgängen mit destilliertem Wasser wurden 100 μl der frisch hergestellten p-Nitrophenylphosphats (Sigma, St. Louis, MO)-Substrat-Lösung (1,7 g/l in 0,1 Mol/l Tris-HCl, pH-Wert 9,5, 0,1 Mol/l NaCl, 5 mMol/l MgCl2) zu jeder Vertiefung hinzugefügt und die Platte wurde bei 23°C in ein Ceres 900J-Plattenlesegerät (Bio-Tek Instruments, Winooski, VT) gestellt. Die gelbe Farbentwicklung wurde automatisch überprüft, mit Messungen, die bei 405 nm alle 10 Minuten für eine Stunde gegen einen Luftleerwert genommen wurden. KinetiCalc II-Software wurde zur Analyse der Daten verwendet, um die Farbentwicklungsrate für jede Vertiefung (lineare Regressionsanalyse) zu berechnen und um eine angepasste 4-Parameter-Standardkurve zu errechnen, von welcher die freie TIMP-1-Konzentration von jeder Plasmaprobe berechnet wurde.
  • Verdünnungskurven und Wiederfindungsexperimente
  • Diese Experimente wurden, im Wesentlichen wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt, aber unter Verwendung von MAC-19 statt MAC-15 für den Nachweis von freiem TIMP-1 (wie vorstehend beschrieben).
  • Gesunde Spender
  • 108 Spender-Plasmaproben wurden erhalten. Die Spender spendeten Blut auf einer freiwilligen Basis und waren anscheinend alle gesund. Eine Einverständniserklärung wurde von allen Blutspendern nach deren Aufklärung erhalten und von den örtlichen ethischen Ausschüssen wurde eine Genehmigung erhalten. Die Blutprobenentnahme und Verarbeitung wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt.
  • Ergebnisse
  • ELISA-Durchführung
  • Die Farbentwicklung in jeder Vertiefung war für alle freien TIMP-1-Konzentrationen, die in diesen Experimenten gemessen wurden, eine lineare Zeitfunktion mit Korrelationskoeffizienten für die automatisch angepassten Linen, die typischer Weise besser als 0,9 waren. Der Korrelationskoeffizient für die 4-Parameter-Anpassung war typischer Weise besser als 0,999. Die testinterne Variation für 24 Messungen des Kontroll-Plasmapools, die in dreifacher Ausführung durchgeführt wurde, war 9,6%.
  • Wiederfindung von rekombinantem TIMP-1 nach der Verdünnung in Plasma
  • Spezifische Singnalwiederfindung wurde durch die Zugabe von steigenden Konzentrationen an gereinigtem TIMP-1-Standard zu einem Plasmapool und anschließender Messung des ELISA-Signals bestimmt. In dem verdünnten Citrat-Plasmapool wurde 105% Wiederfindung erhalten, während in dem verdünnten EDTA-Plasmapool eine Wiederfindung von 96% erreicht wurde (12).
  • Verdünnungskurven von freiem Plasma-TIMP-1-Signal
  • Serielle Verdünnungen von Citrat- und EDTA-Plasmapools wurden hergestellt und freie TIMP-1-Mengen untersucht, um auf lineare Reduktion in den ELISA-Signalen zu testen. Sämtliche Citrat- und EDTA-Plasmen ergaben eine gute Linearität des Signals als eine Verdünnungsfunktion.
  • Gesunde Blutspender
  • Freier TIMP-1 wurde in allen Plasmaproben gemessen. Die freie TIMP-1-Mediankonzentration war 70,9 μg/l (Bereich: 32,3–169,7 μg/l).
  • Diskussion
  • Dieser Test misst freie Plasma-TIMP-1-Mengen direkt. Wenn man in den 108 gesunden Blutspendern freie TIMP-1-Mengen mit Gesamt-TIMP-1-Mengen vergleicht (die letzteren werden mit dem in Beispiel 1 beschriebenen Test gemessen), wird ein Korrelationskoeffizient von 0,46 (Rho, Spearman-Rangtest, p < 0,0001) erhalten.
  • Beispiel 4
  • Der diagnostische Wert von Gesamt-TIMP-1 in Patienten mit Kolorektalkrebs.
  • Die Gesamt-TIMP-1-Mengen im Plasma von 591 Kolorektalkrebs-Patienten (338 Kolon und 253 Rektum) und in Plasmen von 108 in Alter und Geschlecht übereinstimmenden gesunden Individuen wurden mit dem in Beispiel 1 beschriebenen TIMP-1-Test gemessen. Die TIMP-1-Werte wurden unter Verwendung von biostatistischen Standard-Parametern analysiert und verglichen.
  • Material und Methoden:
  • Patienten
  • 591 Patienten, die einem elektiven operativen Eingriff für pathologisch bestätigten Kolorektalkrebs unterzogen wurden, sind in die Studie einbezogen worden. Blutproben wurden vor der Operation mit einer Einverständniserklärung von allen Patienten gemäß der Helksinki-Deklaration nach deren Aufklärung erhalten und vom örtlichen ethischen Ausschuss des Hvidovre Hospital, Dänemark, wurde eine Genehmigung bewilligt. Alle Patienten wiesen ein pathologisch verifiziertes Adenokarzinom des Kolons oder Rektums auf. Es wurde festgestellt, dass 59 (10%) Patienten mit Dukes' Syndrom im Stadium A klassifiziert werden konnten, 219 (37%) Patienten mit Dukes' Stadium B, 170 (29%) Patienten mit Dukes' Stadium C und 143 (24%) Patienten mit Dukes' Stadium D. 338 Tumore waren Kolonkrebs und 253 waren Rektalkrebs. Klinische Daten wie Alter, Geschlecht und Überleben nach dem operativen Eingriff wurden gesammelt. Das mittlere Alter der Patienten war 69 Jahre (Bereich: 33–90 Jahre) mit 237 in der Patientengruppe vertretenen Frauen und 354 Männern.
  • Eine zweite Patientengruppe wurde vorausschauend zusammengestellt. Diese Gruppe bestand aus 21 Rektalkrebs- und 43 Kolonkrebspatienten. Es gab 11 Patienten mit Dukes' Stadium A-, 27 mit Dukes' Stadium B-, 14 mit Dukes' Stadium C- und 13 mit Dukes' Stadium D-Syndrom.
  • Gesunde Spender
  • Die gleiche Spenderpopulation, wie sie in Beispiel 3 beschrieben wurde.
  • Blutproben
  • Blutproben (5 ml) wurden vor der Operation von allen Patienten am Tag der Operation entnommen. Um gültige TIMP-1-Messungen sicherzustellen wurde peripheres Blut mit minimaler Stasis gemäß dem vorher beschrieben Protokoll (Beispiel 1) entnommen und in gerinnungshemmenden EDTA-Röhrchen (Becton-Dickinson, Mountain View, CA) gesammelt.
  • TIMP-1-ELISA
  • TIMP-1-Mengen wurden in EDTA-Plasmaproben unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Tests gemessen.
  • Ergebnisse:
  • Gesamt-TIMP-1-Mengen im Plasma
  • Unter Verwendung eines Tests für die kinetische Rate wurden die Gesamt-TIMP-1-Mengen in allen Plasmaproben der Patienten und der gesunden Spender bestimmt. Jede Plasmaprobe wies messbare Mengen an TIMP-1 mit einem Gesamt-TIMP-1-Medianwert für die 591 Kolorektalkrebs-Patienten von 141,1 μg/l (Bereich 53,7–788,7 μg/l), auf. Wenn sie in Kolon- und Rektalkrebs aufgeschichtet wurden, waren die Medianwerte 158,6 μg/l (Bereich 53,7–788,7 μg/l) für Kolon- und 126,3 (Bereich 64,1–640,1 μg/l) für Rektalkrebs. Es gab einen statistisch signifikanten Unterschied in TIMP-1-Mengen, wenn das Patientenmaterial gemäß den Dukes' Stadien aufgeschichtet wurde, mit Dukes' A als niedrigste und Dukes' D als höchste (Kruskal-Wallis-Test, P < 0,0001). Die höchsten TIMP-1-Mengen waren jedoch nicht auf Krankheiten im fortgeschrittenen Stadium beschränkt und es konnte kein signifikanter Unterschied in Gesamt-TIMP-1-Mengen des Plasmas unter Patienten mit Dukes' A-C-Syndrom erkannt werden. Eine relativ schwache Korrelation zwischen Plasma-TIMP-1 und Alter wurde festgestellt (r = 0,35; p < 0,0001). Es gab keinen signifikanten Unterschied in TIMP-1-Mengen zwischen Männern und Frauen (p = 0,97).
  • Die TIMP-1-Medianmenge im Plasma von gesunden Spendern war 88,6 μg/l mit einem Bereich von 51,0 – 156,2 μg/l. Es gab eine hohe statistische Differenz in den Gesamt-TIMP-1-Werten des Plasmas zwischen den Kolorektalkrebs-Patienten und den gesunden Blutspendern.
  • Der Gesamt-TIMP-1-Medianwert für die 64 Kolorektalkrebs-Patienten war 138,2 μg/l (Bereich: 80,7–790,6 μg/l). Nach Aufschichtung der Patienten in Kolon- und Rektalkrebs waren die Gesamt-TIMP-1-Medianwerte 152,2 μg/l (Bereich: 80,7–626,2 μg/l) für Kolon- und 133,6 (Bereich: 84,3–790,6) für Rektalkrebs. Es gab eine hohe statistische Differenz in den Gesamt- TIMP-1-Werten des Plasmas zwischen den Kolon- und Rektalkrebs-Patienten, jeweils verglichen mit den gesunden Blutspendern.
  • Diagnostischer Wert des Gesamt-TIMP-1
  • Unter Verwendung der gemessenen Gesamt-TIMP-1-Mengen im Plasma von gesunden Spendern und der 591 Kolorektalkrebs-Patienten, wurden Receiver Operating Characteristics(ROC)-Kurven erstellt, um den diagnostischen Wert des Gesamt-TIMP-1 zu berechnen. Wie man in 13 sieht, war die ROC-Kurve anfangs steil, was auf eine hohe Sensitivität und Spezifität des Gesamt-TIMP-1 als einen Marker für Kolorektalkrebs hinweist. Es sieht so aus, als ob der BUK für Kolonkrebs größer ist als für Rektalkrebs. 14 zeigt eine ähnliche ROC-Kurve, die nun nur Patienten mit Kolorektalkrebs im Frühstadium enthält, d.h. Dukes-Stadium A oder B-Syndrom. Die ROC-Kurve für rechtsseitigen Kolonkrebs im Frühstadium (Dukes' Stadium A und B) wird auch gezeigt.
  • Unter Verwendung der Gesamt-TIMP-1-Mengen im Plasma von gesunden Spendern und in der zweiten Gruppe von 64 Kolorektalkrebs-Patienten wurden die ROC-Kurven wieder erstellt, um den diagnostischen Wert von TIMP-1 zu bestätigen. Wie aus 15 entnommen werden kann, war die Kurve anfangs wieder steil, was auf eine hohe Sensitivität und Spezifität des Gesamt-TIMP-1 als einen Marker für Kolorektalkrebs hinweist.
  • Eine zusätzliche Studie von 180 gesunden Blutspendern und 20 Kolorektalkrebs-Patienten unter Verwendung unterschiedlicher Antikörper (anti-TIMP-1 11E/C6, anti-TIMP-1 RRU-T6) (diese beiden Clone, welche die Antikörper erzeugten, wurden am 10. April 2000 bei der ATTC hinterlegt) in einem automatisierten Immuntest bestätigte die vorherigen klinischen Ergebnisse weiter. Darüber hinaus zeigten die absoluten Werte, die von dem automatisierten Test erzeugt wurden, einen hohen Korrelationsgrad zu jenen, die durch den in Beispiel 1 beschriebenen Test erzeugt wurden (r = 0,9).
  • Diskussion:
  • Diese Daten weisen darauf hin, dass Gesamt-TIMP-1-Messungen im Plasma als ein Durchmusterungsverfahren zur Unterstützung der Identifizierung von Patienten mit einem hohen Risiko Kolorektalkrebs zu haben verwendet werden können. Im Besonderen war TIMP-1 bei der Identifizierung von Patienten mit Krebs im Frühstadium (Dukes' Stadium A + B) genauso wirkungsvoll wie bei der Identifizierung von Patienten mit fortgeschritteneren Krankheiten. Außerdem war TIMP-1 sogar noch effektiver in der Identifizierung von Patienten mit rechtsseitigem Kolonkrebs im Frühstadium, eine Diagnose, die mit herkömmlichen diagnostischen Verfahren schwierig ist. Rechtsseitiger Kolonkrebs kann mit der flexiblen Sigmoidoskopie, einem Standardverfahren zur Durchmusterung auf Kolonkrebs, nicht sichtbar gemacht werden. Er hat einen heimtückischeren Beginn als linksseitige Läsionen und klinische Symptome entwickeln sich erst in den späten Krankheitsstadien. Frühe Diagnose von rechtsseitigem Kolonkrebs hat das Potential die Mortalität dieser Krankheit zu reduzieren.
  • Darüber hinaus bestätigte der kleinere, vorausschauende Test die Ergebnisse der größeren rückblickenden Studie, was den diagnostischen Wert des Gesamt-TIMP-1 in Patienten, die an Kolorektalkrebs leiden, weiter bestätigt.
  • Beispiel 5
  • Quantifizierung des Gesamt-TIMP-1 im Plasma von Patienten mit entzündlichen Darmerkrankungen.
  • Patienten
  • 46 Patienten mit IBD (entzündliche Darmerkrankungen) wurden in die Studie miteinbezogen. 22 Patienten hatten ulzerative Kolitis und 24 Patienten hatten Crohn-Krankheit. Gesamt-TIMP-1-Mengen im EDTA-Plasma von gesunden Blutspendern und Kolorektalkrebs-Patienten (Beispiele 3 und 4) wurden als Vergleich einbezogen.
  • GESAMT-TIMP-1-WERTE
  • Gesamt-TIMP-1-Mengen wurden in den EDTA-Plasmaproben unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Sandwich-Tests gemessen.
  • Ergebnisse:
  • Die gemessenen Gesamt-TIMP-1-Werte werden in Tabelle 2 gezeigt.
  • Tabelle 2
    Figure 00380001
  • Es gab keinen signifikanten Unterschied wenn Gesamt-TIMP-1-Werte von Patienten mit IBD und gesunden Blutspendern verglichen wurden (Mann-Whitney; p = 0,45). Es gab einen sehr signifikanten Unterschied zwischen Gesamt-TIMP-1-Mengen des Plasmas zwischen Patienten mit IBD und den 591 Kolorektalkrebs-Patienten (Mann-Whitney; p < 0,0001). Eine graphische Darstellung dieser Ergebnisse wird in 16 veranschaulicht.
  • Diskussion:
  • Die Ergebnisse zeigen, dass Patienten mit Kolorektalkrebs signifikant höhere Gesamt-TIMP-1-Plasmamengen aufweisen als Patienten mit IBD. Darüber hinaus wiesen Patienten mit IBD Gesamt-TIMP-1-Mengen auf, die jenen entsprachen, die in gesunden Blutspendern festgestellt wurden, was zeigt, dass Gesamt-TIMP-1 des Plasmas als ein hoch sensitiver und spezifischer Marker zur Unterscheidung zwischen nicht-malignen und malignen Erkrankungen des Magen-Darm-Trakts verwendet werden kann.
  • Beispiel 6
  • Der diagnostische Wert des Gesamt-TIMP-1 in Kombination mit CEA in Patienten mit Kolorektalkrebs.
  • Gesamt-TIMP-1 in Plasma von 591 Kolorektalkrebs-Patienten (338 Kolon und 253 Rektum) und in Plasma von 108 im Alter und Geschlecht übereinstimmenden gesunden Individuen wurde unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen TIMP-1-Tests gemessen. Außerdem wurde CEA in den entsprechenden Serumproben von Patienten und Spendern unter Verwendung eines im Handel erhältlichen, chemolumineszenten CEA EIA-Kits (Immulite CEA, DPC®, Los Angeles, California, USA) gemessen. Die TIMP-1- und CEA-Werte von gesunden Spendern und Krebspatienten wurden durch logistische Regressionsanalyse vereinigt und ROC-Kurven wurden erstellt.
  • Ergebnisse:
  • Diagnostischer Wert von Gesamt-TIMP-1 und CEA
  • Bei Berechnung der Sensitivität und Spezifität von CEA in 591 Kolorektalkrebs-Patienten ergab ein Trennwert, der eine 98% Spezifität bereitstellte, bei Einbeziehung von 108 gesunden Spendern eine Sensitivität von 35%. Wenn Patienten in Kolon- oder Rektalkrebs aufgeschichtet wurden, war die Sensitivität 37% bzw. 33% bei der gleich bleibenden Spezifitätshöhe. Es wird in 17 gezeigt, dass wenn nur Patienten mit rechtsseitigem Kolonkrebs einbezogen wurden, die Sensitivität auf 45% gesteigert wurde.
  • Wenn die Gesamt-TIMP-1-Werte von Beispiel 4 zusammen mit CEA einbezogen wurden, wurde durch logistische Regressionsanalyse festgestellt, dass die Sensitivität der Markerkombination 52% war. Die zusätzliche diagnostische Sensitivität, die durch Hinzufügen der CEA-Messungen im Serum erreicht wurde, ist sehr signifikant (p < 0,0001). Wenn die Patientengruppe in Kolon- und Rektalkrebs aufgeschichtet wurde, war die Sensitivität 61% bzw. 39% bei 98% Spezifitätshöhe. Wenn nur Patienten mit rechtsseitigem Kolonkrebs einbezogen wurden, war die Sensitivität 74%. Eine graphische Darstellung dieser Ergebnissen erscheint in 17.
  • Diskussion:
  • Diese Daten zeigen, dass durch Zugabe eines zusätzlichen Markers eine Verbesserung der diagnostischen Sensitivität von Gesamt-TIMP-1 erreicht werden kann, während eine hohe Spezifität von 98% erhalten bleibt. Die Kombination von CEA und TIMP-1 könnte daher als ein Durchmusterungsverfahren zur Identifizierung von Patienten nützlich sein, die ein hohes Risiko aufweisen Kolorektalkrebs zu haben. Im Besonderen war diese Kombination bei der Identifizierung von Patienten mit frühen Krebsstadien (Dukes' Stadium A + B) effizient. Außerdem war diese Kombination in der Identifizierung von Patienten mit rechtsseitigem Kolonkrebs im Frühstadium sehr effizient.
  • Beispiel 7
  • Mangel an diagnostischem Wert von freien TIMP-1-Mengen des Plasmas in Patienten mit Kolorektalkrebs.
  • Material und Methoden
  • Mengen an freiem TIMP-1 im Plasma von 64 Kolorektalkrebs-Patienten (43 Kolon und 21 Rektum) und im Plasma von 108 im Alter übereinstimmenden gesunden Individuen wurden unter Verwendung des in Beispiel 3 beschriebenen TIMP-1-Tests gemessen. Die freien TIMP-1-Werte wurden unter Verwendung von biostatistischen Standard-Parametern analysiert und verglichen.
  • Ergebnisse:
  • Mengen an freiem TIMP-1 im Plasma
  • Unter Verwendung des in Beispiel 3 beschriebenen ELISAs für die kinetischen Rate wurden die freien TIMP-1-Mengen in allen Patienten und Plasmaproben von gesunden Spendern gemessen. Alle Proben wiesen messbare Mengen an freiem TIMP-1 auf, mit einem freien TIMP-1-Medianwert von 82,0 μg/l (Bereich 44,7–424,0 μg/l) für die Kolorektalkrebs-Patienten. Die freie TIMP-1-Medianmenge im Plasma von gesunden Spendern war 70,9 μg/l, mit einem Bereich von 32,3–169,7 μg/l. Während kein signifikanter Unterschied in den freien TIMP-1-Mengen unter Patienten mit Dukes' Stadium A-C-Syndrom gefunden wurde, wiesen Patienten mit Dukes' Stadium D, verglichen mit Patienten mit Dukes' Stadium A- und B-Syndrom, signifikant erhöhte freie TIMP-1-Mengen im Plasma auf. Wenn die Gesamt-TIMP-1-Werte mit freien TIMP-1-Werten im Plasma dieser 64 Kolorektalkrebs-Patienten verglichen wurden, wurde ein Korrelationskoeffizient von 0,91 (Rho, Spearman-Rangtest, p < 0,0001) festgestellt.
  • Fehlen eines diagnostischen Wertes von freiem TIMP-1
  • 18 zeigt die ROC-Kurven, die von den Plasma-Messungen des freien TIMP-1 erlangt wurden. Der BUK ist 0,61 wenn die diagnostische Leistung des freien TIMP-1 bestimmt wird.
  • Diskussion:
  • Diese Daten zeigen, dass freier TIMP-1 alleine voraussichtlich nicht als Durchmusterungsmarker nützlich ist, um Patienten zu identifizieren, die ein hohes Risiko aufweisen Kolorektalkrebs zu haben.
  • Beispiel 8
  • Diagnostischer Wert der TIMP-1:MMP-9-Komplex-Messungen in Patienten mit Kolorektalkrebs.
  • TIMP-1:MMP-9-Komplexmengen im Plasma von Kolorektalkrebs-Patienten und im Plasma von in Alter und Geschlecht übereinstimmenden Individuen können unter Verwendung des in Beispiel 2 beschriebenen TIMP-1:MMP-9-Test gemessen werden. TIMP-1:MMP-9-Komplexwerte von gesunden Spendern und Krebspatienten können verglichen und der diagnostische Wert kann bestimmt werden.
  • Unter Verwendung der gemessenen Werte von freien, gesamten und TIMP-1:MMP-9-Komplex-Mengen können die diagnostischen Werte von Verhältnissen oder Fraktionen berechnet werden. Außerdem können andere Moleküle, z.B. Serum-CEA, zu diesen Berechnungen hinzugefügt werden, um mathematische Algorithmen zur Erhöhung des diagnostischen Gesamtwertes zu erzeugen.
  • Beispiel 9
  • Diagnostischer Wert der Kombination von Gesamt-TIMP-1 des Plasmas und freiem TIMP-1 des Plasmas in Patienten mit Kolorektalkrebs.
  • Gesamt-TIMP-1-Werte im Plasma von 64 Kolorektalkrebs-Patienten und im Plasma von 108 in Alter und Geschlecht übereinstimmenden gesunden Individuen wurden mit dem in Beispiel 1 beschriebenen TIMP-1- Test gemessen. Unter Verwendung des in Beispiel 3 beschriebenen Tests wurden freie TIMP-1-Mengen des Plasmas in den gleichen Individuen, wie vorstehend beschreiben, gemessen. Die gesamten und freien TIMP-1-Werte wurden unter Verwendung von logistischer Regressionsanalyse analysiert und verglichen.
  • Material und Methoden:
  • Patienten
  • 64 Patienten wurden in diese Studie einbezogen, die einem selektiven operativen Eingriff für pathologisch bestätigten Kolorektalkrebs unterzogen wurden. Diese Gruppe bestand aus 21 Rektalkrebs- und 43 Kolonkrebs-Patienten. Es gab 11 Patienten mit Dukes' Stadium A-, 27 mit Dukes' Stadium B-, 14 mit Dukes' Stadium C- und 13 mit Dukes' Stadium D-Syndrom. Blutproben wurden vor der Operation mit Einverständniserklärungen aller Patienten gemäß der Helsinki-Deklaration nach deren Aufklärung erhalten und vom örtlichen ethischen Ausschuss des Hvidovre Hospital, Dänemark, wurde eine Genehmigung bewilligt. Alle Patienten wiesen pathologisch verifizierte Adenokarzinome des Kolons oder Rektums auf. Klinische Daten wie Alter, Geschlecht und Überleben nach der Operation wurden gesammelt.
  • Gesunde Spender
  • Die gleiche Spenderpopulation, wie sie in Beispiel 3 beschrieben ist.
  • Blutproben
  • Blutproben (5 ml) wurden vor der Operation von allen Patienten am Tag ihrer Operation gesammelt. Um gültige TIMP-1-Messungen sicherzustellen, wurde peripheres Blut mit minimaler Stasis gemäß dem vorher beschrieben Protokoll (Beispiel 1) entnommen und in gerinnungshemmenden EDTA-Röhrchen (Becton-Dickinson, Mountain View, CA) gesammelt.
  • Plasmamessungen von Gesamt- und freiem TIMP-1
  • TIMP-1 Mengen wurden in EDTA-Plasmaproben unter Verwendung der in Beispiel 1 und Beispiel 3 beschriebenen Tests gemessen.
  • Ergebnisse:
  • TIMP-1-Mengen im Plasma
  • Die Gesamt-TIMP-1-Werte in diesen 64 Patienten mit Kolorektalkrebs werden in Beispiel 4 beschrieben und die freien TIMP-1-Mengen in diesen Patienten werden in Beispiel 7 beschrieben.
  • Unter Verwendung der gesamten und freien TIMP-1-Mengen im Plasma von gesunden Spendern und von den 64 Kolorektalkrebs-Patienten wurden ROC-Kurven für jede dieser TIMP-1-Formen erstellt. Die erhaltenen Gesamt-TIMP-1-Werte bestätigen den diagnostischen Wert von Gesamt-TIMP-1-Messungen in Patienten mit Kolorektalkrebs. Wie aus 15 zu entnehmen ist, war die Kurve anfänglich wieder steil, was auf eine hohe Sensitivität und Spezifität von Gesamt-TIMP-1 als Marker für Kolorektalkrebs hinweist. Die ROC-Kurve für freien TIMP-1 wurde in Beispiel 7 besprochen.
  • Die entsprechenden Daten für Gesamt-TIMP-1 in dieser Patientenpopulation ergab einen BUK von 0,88. Eine Steigerung des diagnostischen Wertes wurde jedoch erhalten, wenn freier und Gesamt-TIMP-1 (BUK = 0,94) vereinigt wurden. Diese Steigerung ist statistisch sehr signifikant, p < 0,0001, und zeigt den Nutzen der wichtigen Ausführungsform sowohl freien als auch Gesamt-TIMP-1 in derselben Analyse zu verwenden.
  • Diskussion:
  • Diese Daten weisen darauf hin, dass die Kombination von Messungen des Gesamt-TIMP-1 und des freien TIMP-1 im Plasma als ein Durchmusterungsverfahren zur Unterstützung bei der Identifizierung von Patienten, die ein hohes Risiko aufweisen, Kolorektalkrebs zu haben, verwendet werden kann.
  • In ähnlicher Weise, wie in dem vorliegenden Beispiel beschrieben, können andere Verhältnisse und/oder Kombinationen oder mathematische Permutationen zwischen freiem und Gesamt-TIMP-1-Wert errechnet und für diagnostische Zwecke verwendet werden.
  • Berechnungen von Beziehungen zwischen all den verschiedenen Formen von TIMP-1, einschließlich gesamtem und freiem TIMP-1, Gesamt-Konzentrationen von Komplexen (Gesamt-TIMP-1 – freier TIMP-1) und/oder der Konzentration von TIMP-1:MMP-9, könnte in der Behandlung und besonders in der differenziellen Diagnose von Patienten mit nicht-malignen Erkrankungen und Patienten mit Krebs sehr nützlich sein.
  • Beispiel 10
  • Mangel an diagnostischem Wert von Gesamt-TIMP-1-Messungen in Patienten mit primärem (Stadium I und II) Brustkrebs.
  • Material und Methoden
  • Unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Gesamt-TIMP-1-Tests wurden vor der Operation entnommene Plasmaproben von 322 Patienten mit primärem Brustkrebs auf den Gesamt-TIMP-1-Gehalt untersucht. Außerdem wurden 108 Plasmaproben von gesunden Blutspendern ausgewertet. Der mittlere Gesamt-TIMP-1-Medianwert für Brustkrebs-Patienten war 88,3 μg/l (Bereich: 45,5–289,3 μg/l), während die Gesamt-TIMP-1-Medianmenge für gesunde Blutspender 88,9 μg/l war (Bereich: 51,0–156,2 μg/l). Es gab keinen statistisch signifikanten Unterschied in Gesamt-TIMP-1-Plasmamengen zwischen den beiden Gruppen (Mann-Whitney, p = 0,87). 19 zeigt eine ROC-Kurve, welche die vorstehend erwähnten Daten beinhaltet.
  • Diskussion
  • Diese Daten demonstrieren, dass Patienten mit primärem Brustkrebs Gesamt-TIMP-1-Werte aufweisen, die sich von jenen von gesunden Blutspendern nicht signifikant unterscheiden. Daher unterstützen diese Daten die Spezifität der TIMP-1-Messungen in der Diagnose von Patienten mit Kolorektalkrebs.
  • Beispiel 11
  • Der diagnostische Wert von Gesamt-TIMP-1 des Plasmas in Patienten mit metastasierendem Brustkrebs (Stadium IV).
  • Dieses Beispiel beschreibt Bestimmungen des Gesamt-TIMP-1 von Patienten mit Brustkrebs in Stadium IV.
  • Material und Methoden:
  • Patienten und Blutspender
  • Blut wurde auf der Onkologieabteilung des Herlev University Hospital, Kopenhagen, Dänemark von 19 Brustkrebs-Patienten mit Stadium IV (Alter: 45 bis 70 Jahre) und von 87 gesunden weiblichen Spendern (Beispiel 1) abgenommen.
  • Gesamt-TIMP-1-Werte
  • Gesamt-TIMP-1-Werte wurden in allen EDTA-Plasmaproben unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Tests gemessen.
  • Ergebnisse:
  • Gesamt-TIMP-1-Mengen im Plasma von Patienten mit fortgeschrittenem Brustkrebs
  • Gesamt-TIMP-1 wurde in EDTA-Plasmaproben von 19 Brustkrebspatienten mit der Krankheit in Stadium IV gemessen. Diese Mengen wurden mit Gesamt-TIMP-1-Mengen in 87 gesunden weiblichen Spendern verglichen. Die Gesamt-TIMP-1-Medianmenge, die in den 19 Brustkrebspatienten gemessen wurde, war 292 ± 331 μg/l (Medianwert: 236 μg/l) verglichen mit einer Gesamt-TIMP-1-Medianmenge von 63,5 ± 10,5 μg/l (Medianwert: 62,0 μg/l) in 87 gesunden weiblichen Spendern. Ein Wald-Wolfowitz-Runs-Test deutete einen sehr signifikanten Unterschied (p < 0,0001) zwischen den Gesamt-TIMP-1-Mengen von Patienten und jenen von gesunden Spendern an. 20 zeigt einen Perzentil-Plot der Gesamt-TIMP-1-Mengen von den 19 Brustkrebs-Patienten und der TIMP-1-Mengen, die im Plasma der 87 gesunden weiblichen Spender festgestellt wurden.
  • Diskussion:
  • Diese Daten zeigen, dass Plasma-TIMP-1-Messungen verwendet werden können, um Brustkrebs-Patienten auf ein erneutes Auftreten der Krankheit zu überprüfen.
  • Beispiel 12
  • Diagnostischer Wert von TIMP-2-Messungen in Patienten mit Kolorektalkrebs
  • Material und Methoden
  • TIMP-2-Mengen wurden mit einem internen TIMP-2-Test im Plasma von 64 Kolorektalkrebs-Patienten (43 Kolon und 21 Rektum) und im Plasma von 108 im Alter übereinstimmenden gesunden Individuen gemessen. Die gemessenen TIMP-2-Werte von gesunden Spendern und Krebspatienten wurden verglichen.
  • Ergebnisse:
  • TIMP-2 konnte in allen Proben nachgewiesen werden. Es wurden keine signifikant unterschiedlichen TIMP-2-Mengen zwischen gesunden Blutspendern und Kolorektalkrebs-Patienten festgestellt.
  • Diskussion
  • Diese Daten unterstützen die Spezifität von TIMP-1-Messungen in der Diagnose von Patienten mit Kolorektalkrebs, was den einmaligen Wert von TIMP-1 als ein Hilfsmittel in der frühen Diagnose von Kolorektalkrebs unterstützt.
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Claims (27)

  1. Verfahren zur Bestimmung, ob ein Individuum möglicherweise einen Kolorektalkrebs hat, wobei das Verfahren umfasst: Bestimmen eines ersten Parameters, der die Gesamtkonzentration von TIMP-1 in Plasmaproben repräsentiert, und wenn der Parameter bei oder jenseits eines Unterscheidungswertes gelegen ist, anzeigt, dass das Individuum mit hoher Wahrscheinlichkeit einen Kolorektalkrebs hat, und wenn der Parameter nicht bei oder jenseits des Unterscheidungswertes gelegen ist, anzeigt, dass es unwahrscheinlich ist, dass das Individuum einen Kolorektalkrebs hat, wobei der Unterscheidungswert dadurch bestimmt wird, dass der zumindest eine erste Parameter sowohl in einer gesunden Kontrollpopulation als auch in einer Population, von der bekannt ist, dass sie Kolorektalkrebs hat, gemessen wird, wodurch der Unterscheidungswert bestimmt wird, der die Krebspopulation mit einer vorbestimmten Spezifität oder einer vorbestimmten Sensitivität identifiziert.
  2. Verfahren zur Bestimmung, ob ein Individuum möglicherweise einen Kolorektalkrebs hat, wobei das Verfahren umfasst: Bestimmen eines ersten Parameters, der die Kombination der Konzentration von Gesamt-TIMP-1 mit der Konzentration von freiem TIMP-1 in Plasmaproben repräsentiert, und wenn der Parameter bei oder jenseits eines Unterscheidungswertes gelegen ist, anzeigt, dass das Individuum mit hoher Wahrscheinlichkeit einen Kolorektalkrebs hat, und wenn der Parameter nicht bei oder jenseits des Unterscheidungswertes gelegen ist, anzeigt, dass es unwahrscheinlich ist, dass das Individuum einen Kolorektalkrebs hat, wobei der Unterscheidungswert dadurch bestimmt wird, dass der zumindest eine erste Parameter sowohl in einer gesunden Kontrollpopulation als auch in einer Population, von der bekannt ist, dass sie Kolorektalkrebs hat, gemessen wird, wodurch der Unterscheidungswert bestimmt wird, der die Krebspopulation mit einer vorbestimmten Spezifität oder einer vorbestimmten Sensitivität identifiziert.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Kombinieren durch logistische Regressionsanalyse durchgeführt wird.
  4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, zusätzlich umfassend das Bestimmen von zumindest einem zweiten Parameter, in einer Körperflüssigkeitsprobe des Individuums, wobei der zweite Parameter die Konzentration eines weiteren, von jeder Form von TIMP-1 unterschiedlichen Markers repräsentiert.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei der erste Parameter, der die Konzentration von TIMP-1 in Plasmaproben repräsentiert und der zumindest eine zweite Parameter, der von jeder Form von TIMP-1 unterschiedlich ist, kombiniert werden, um in einem kombinierten Parameter zu resultieren, und wenn der kombinierte Parameter bei oder jenseits eines Unterscheidungswertes gelegen ist, anzeigt, dass das Individuum mit hoher Wahrscheinlichkeit einen Kolorektalkrebs hat, und wenn der kombinierte Parameter nicht bei oder jenseits des Unterscheidungswertes gelegen ist, anzeigt, dass es unwahrscheinlich ist, dass das Individuum einen Kolorektalkrebs hat.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Kombinieren durch logistische Regressionsanalyse durchgeführt wird.
  7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, wobei der Unterscheidungswert des kombinierten Parameters ein Wert ist, der durch Bestimmung des kombinierten Parameters sowohl in einer gesunden Kontrollpopulation als auch in einer Population, von der bekannt ist, dass sie Kolorektalkrebs hat, bestimmt wurde, wodurch der Unterscheidungswert bestimmt wird, der die Krebspopulation mit einer vorbestimmten Spezifität oder einer vorbestimmten Sensitivität identifiziert.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 9, wobei der zumindest eine zweite bestimmte Parameter ein Parameter ist, der die Konzentration eines Tumormarkers repräsentiert.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Tumormarker ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus CEA, lösliches u-PAR, Kathepsin B, HER2-neu, CA15-3 und YKL-40.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei der zumindest eine zweite bestimmte Parameter die Konzentration von CEA ist.
  11. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Individuum ein Mitglied einer unselektierten Population ist.
  12. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Individuum ein Mitglied einer Population ist, die bereits dahingehend identifiziert wurde, dass sie ein erhöhtes Risiko zur Entwicklung eines gastrointestinalen Krebses aufweist.
  13. Verfahren zur Bestimmung, ob ein Patient, der gegen einen primären Brustkrebs behandelt wurde, möglicherweise metastatischen Brustkrebs hat, umfassend Bestimmen eines ersten Parameters, der die Gesamtkonzentration von TIMP-1 in Plasmaproben repräsentiert, und wenn der Parameter bei oder jenseits eines Unterscheidungswertes gelegen ist, anzeigt, dass das Individuum mit hoher Wahrscheinlichkeit metastatischen Krebs hat, und wenn der Parameter nicht bei oder jenseits des Unterscheidungswertes gelegen ist, anzeigt, dass es unwahrscheinlich ist, dass das Individuum metastatischen Krebs hat, wobei der Unterscheidungswert dadurch bestimmt wird, dass der zumindest eine erste Parameter sowohl in einer gesunden Kontrollpopulation als auch in einer Population, von der bekannt ist, dass sie metastatischen Krebs hat, gemessen wird, wodurch der Unterscheidungswert bestimmt wird, der die metastatische Krebspopulation mit einer vorbestimmten Spezifität oder einer vorbestimmten Sensitivität identifiziert.
  14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Kombinieren durch logistische Regressionsanalyse durchgeführt wird.
  15. Verfahren nach Anspruch 13, zusätzlich umfassend die Bestimmung von zumindest einem zweiten Parameter, wobei der zweite Parameter die Konzentration eines weiteren Markers, der sich von jeder Form von TIMP-1 unterscheidet, in einer Körperflüssigkeitsprobe des Individuums repräsentiert.
  16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei der erste Parameter, der die Konzentration von TIMP-1 in Plasmaproben repräsentiert, und der zumindest eine zweite Parameter, der unterschiedlich von jeder Form von TIMP-1 ist, kombiniert werden, so dass sie einen kombinierten Parameter ergeben und, wenn der kombinierte Parameter bei oder jenseits eines Unterscheidungswertes gelegen ist, anzeigt, dass das Individuum mit hoher Wahrscheinlichkeit metastatischen Krebs hat, und wenn der kombinierte Parameter nicht bei oder jenseits des Unterscheidungswertes gelegen ist, anzeigt, dass es unwahrscheinlich ist, dass das Individuum metastatischen Krebs hat.
  17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei das Kombinieren durch logistische Regressionsanalyse durchgeführt wird.
  18. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, wobei der Unterscheidungswert des kombinierten Parameters ein Wert ist, der durch Bestimmung des kombinierten Parameters sowohl in einer gesunden Kontrollpopulation als auch in einer Population, von der bekannt ist, dass sie metastatischen Krebs hat, bestimmt wurde, wodurch der Unterscheidungswert bestimmt wird, der die metastatische Krebspopulation mit einer vorbestimmten Spezifität oder einer vorbestimmten Sensitivität identifiziert.
  19. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 18, wobei der zumindest eine zweite bestimmte Parameter ein Parameter ist, der die Konzentration eines Tumormarkers repräsentiert.
  20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei der Tumormarker ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus CEA, lösliches u-PAR, Kathepsin B, HER2-neu, CA15-3 und YKL-40.
  21. Verfahren nach Anspruch 20, wobei der zumindest eine zweite bestimmte Parameter die Konzentration von CEA ist.
  22. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 21, wobei die Bestimmung zu mehreren Zeitpunkten in Intervallen durchgeführt wird, als Teil einer Überwachung eines Krebspatienten nach der Behandlung des Primärkrebses.
  23. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, verwendet zum Nachweis eines frühen Kolorektalkrebsstadiums.
  24. Verfahren nach Anspruch 23, wobei das frühe Kolorektalkrebsstadium aus der Gruppe ausgewählt wird bestehend aus Dickdarmkrebs-Dukes' Stadium A, Dickdarmkrebs-Dukes' Stadium B, Dickdarmkrebs-Dukes' Stadium C, Rektalkrebs-Dukes' Stadium A, Rektalkrebs-Dukes' Stadium B und Rektalkrebs-Dukes' Stadium C.
  25. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Konzentrationsbestimmung mittels eines Immuntests oder eines Aktivitätstests durchgeführt wird.
  26. Verfahren nach Anspruch 25, wobei der Immuntest ein ELISA ist.
  27. Verfahren nach Anspruch 25, wobei der Aktivitätstest eine Zymographie ist.
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