NO329725B1

NO329725B1 - Fremgangsmate for bestemmelse av kolorektal kreft eller metastatisk brystkreft basert pa bestemmelse av konsentrasjonenTIMP-1 i plasmaprover

Info

Publication number: NO329725B1
Application number: NO20014869A
Authority: NO
Inventors: Mads Holten-Andersen; Ross W Stephens; Hans Jorgen Nielsen; Jarle Christensen Ib; Nils Bruenner
Original assignee: Hs Rigshospitalet
Priority date: 1999-04-09
Filing date: 2001-10-05
Publication date: 2010-12-06
Also published as: DE60021068D1; CA2652131A1; US20090035794A1; JP2002541481A; EP1171771B1; EP1619206A2; CA2366682C; US20110060529A1; NO20014869L; NO20014869D0; US7108983B1; ATE298890T1; AU771309B2; DE60021068T2; US7807379B2; AU3655600A; EP1619206A3; WO2000062070A3; US20080261246A1; JP2010266455A

Description

Foreliggende oppfinnelse omhandler en fremgangsmåte som kan benyttes for å screene store populasjoner for forekomsten av kolorektal kraft eller metastatisk brystkreft som angitt i henholdsvis krav 1 og krav 12. Fremgangsmåten er basert på målingen av vevsinhibitor av metallproteinaser 1 (TIMP-1) i plasmaprøver. Oppfinnelsen tillater tidlig identifikasjon av pasienter som har kolorektal kreft. Fremgangsmåten er svært spesifikk, og pasienter med godartede tilstander, så som inflammatoriske tarmsykdommer, blir ikke detektert. Måling av en annen tilsvarende inhibitor, TIMP-2, viser ikke ekvivalent klinisk verdi, noe som indikerer et ytterligere nivå av spesifisitet for oppfinnelsen.

Testen er basert på målingen av vevsinhibitor av metallproteinaser type 1 (TIMP-1) i plasma. TIMP-l-konsentrasjoner kan bli bestemt enten som den totale TIMP-l-konsentrasjonen, den frie TIMP-l-konsentrasjonen, konsentrasjonen av komplekser mellom TIMP-1 og MMP'er og/eller forhold og fraksjoner derav, heretter referert til som TIMP-1- nivåer. I henhold til oppfinnelsen kan individer med høy sannsynlighet for å ha kreft, for eksempel kolonkreft, bli identifisert ved forhøyede TIMP-l-nivåer i en plasmaprøve, mens individer med lave TIMP-1-nivåer sannsynligvis ikke lider av kreft, for eksempel kolonkreft. Således kan oppfinnelsen bli benyttet for å identifisere individer med en høy sannsynlighet for å ha tidlig fase, ikke-symptomatisk kreft, foreksempel kolonkreft. De identifiserte individene bør bli ytterligere studert, og dersom kreft blir funnet, bør pasientene bli tilbudt kirurgi, stråling og/eller adjuvans anti-neoplastisk terapi, for derved å øke sjansen for å kurere kreft hos individet.

Kolorektal kreft er den fjerde mest vanlige kreftformen i den vestlige verden, med omkring 130000 nye tilfeller årlig i USA. 40-50 % av alle pasienter med kolorektal kreft vil bli diagnostisert med tidlig fase sykdom (Dukes' fase A eller B). De fleste av disse pasientene med tidlig fase kolorektal kreft kan bli kurert ved kirurgi alene. Således er risikoen for tilbakekomst nært relatert til fasen på sykdommen ved tidspunktet for primær kirurgi, med omkring en 10 % tilbakefallsfrekvens i Dukes' fase A og 25-30 % i Dukes' fase B. Pasienter med Dukes' fase C kolorektal kreft har en fem års tilbakefallsfrekvens på 70 % etter kirurgi, og blir tilbudt adjuvanskjemoterapi. Etter tilbakefall er risikoen for å dø av sykdommen signifikant. Således er en måte å forbedre overlevelse på å øke antallet pasienter som blir diagnostisert med tidlig fase sykdom. Screening for kolorektal kreft har blitt vist å øke overlevelse, imidlertid lider nåværende tester av en mangel på overholdelse, av lav sensitivitet og av behovet for strenge diettrestriksjoner. Således er det et behov for utviklingen av nye og forbedrede tester for tidlig deteksjon av kolorektal kreft.

Fordi metastatisk sykdom er hovedårsaken til kreftpasientens sykelighet og dødelighet, er molekyler som er involvert i reguleringen av tumorinvasjon og metastaser attraktive som potensielle diagnostiske/prognostiske mål. Det er godt etablert at proteolytiske enzymer produsert av kreftceller eller av celler i tumorstroma, er involvert i ekstracellulær vevsdegradering, som fører til kreftcelleinvasjon og metastase. Et antall med enzymer har blitt assosiert med denne prosessen, der de mest nøye studerte er metallproteinaser, så som collagenaser og stromelysiner, og serinproteaser så som plasmin. Nylig har det blitt publisert data som indikerer at disse molekylene, frie eller bundet i komplekser, blir frigitt fra tumorvev og finner sin vei inn i sirkulasjonen.

Matriks metallproteinaser (MMP'er) spiller en avgjørende rolle i kreftvekst og spredning, og bidrar til den enzymatiske degraderingen av den ekstracellulære matriksen (Liotta et al., 1991; Stetler-Stevenson et al, 1993; MacDougall & Matrisian, 1995). De naturlig forekommende inhibitorene av MMP'er, vevsinhibitorer av MMP'er (TIMP'er), danner tette 1:1 støkiometriske komplekser med de aktiverte formene av MMP'ene (Velgus et al, 1985; Kleiner et al, 1993), og inhiberer derved den katalytiske aktiviteten til disse enzymene (Stetler-Stevenson et al, 1996; Goldberg et al, 1992; Birkedal-Hansen et al, 1993). Mens balansen mellom matriksdegraderingsegenskapene til MMP'er og den inhibitoriske effekten av TIMP'er er nøye regulert under normale fysiologiske betingelser (Matrisian, 1992; Thorgeirsson et al, 1993; Birkedal-Hansen et al, 1993), kan denne balansen bli forstyrret i ondartet vev.

Et antall av enzymkoblede immunoassayer for deteksjon av TIMP-1 (Kodama et al, 1989; Cooksley et al, 1990; Clark et al, 1991) og TIMP-2 (Fujimoto et al, 1993) har blitt beskrevet. Disse assayene har blitt anvendt på kroppsvæsker, for eksempel serum, plasma, amnionvæske, cerebrospinalvæske, urin, men antallet med prøver som er testet har ikke vært tilstrekkelig til å etablere normalområder for TIMP-nivåer i friske individer (Kodama et al, 1989; Clark et al, 1991). Videre har ingen av disse assayene blitt tilstrekkelig validert for teknisk utførelse eller for klinisk anvendelse.

I en studie av Mimori et al (Mimori et al, 1997), der tumorvevsnivåer av TIMP-1 mRNA ble studert i pasienter med gastrisk karsinom, ble høye tumor/normalvevs-forhold av TIMP-1 mRNA funnet å være assosiert med økt invasjon og dårlig prognose. Imidlertid viste TIMP-1 proteinnivåer i serum fra prostata kreftpasienter og friske donorer (Baker et al, 1994) en høy grad av overlapp. På samme måte viste en separat studie av plasma fra prostatakreftpasienter og friske donorer ingen forskjell i TIMP-l-nivåer mellom de to gruppene (Jung et al, 1997).

Narou et al. 1994 beskriver måling av TIMP-1 i serum hos pasienter med blærekreft. I artikkelen vises det at TIMP-l-nivået i serum er høyere i pasienter med blærekreft enn i friske individer og at TIMP-l-nivået i serum er signifikant høyere i pasienter med metastaser enn i pasienter uten metastaser.

WO 97/38314 beskriver diagnose, prediksjon av tilbakefall eller monitorering hos pasienter med bl.a. tumorer i nervesystemet ved å kvantifisere MMP-9 og/eller TIMP. TIMP kan i den forbindelse være TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3 eller TIMP-4.

JP 8136548 beskriver måling av TIMP-1 i urin til bestemmelse av bl.a. blærekreft, leverkreft eller nyrekreft. Metoden benytter et immunoassay med monoklonale antistoffer til bestemmelsen av TIMP-1.

Studier av TIMP-1 i kompleks med MMP-9 i plasma hos pasienter med lang kommet gastrointestinal og gynekologisk kreft (Zucker et al, 1995) viste signifikant høyere nivåer i blodprøver fra kreftpasienter med metastatisk sykdom sammenlignet med friske kontrollindivider, og at pasienter med høye nivåer av TIMP-1 :MMP-9-kompleks hadde en kortere overlevelse (Zucker et al, 1995 og US 5 324 634). Imidlertid inkluderte denne studien ikke målinger av total eller fri TIMP-1, kun komplekset mellom TIMP-1 og en av de opp til nå omkring 24 identifiserte MMP'ene. Videre ble det i denne studien ikke funnet forskjeller i kompleksnivåer mellom pasienter med brystkreft og friske donorer. Dette studiet inkluderte heller ikke pasienter med kreft i tidlig fase.

I et antall av krefttyper er det et kritisk og umøtt behov for svært sensitive og spesifikke markører for å screene store populasjoner for nærværet av ondartet sykdom. Slike markører bør være i stand til å identifisere individer med en høy sannsynlighet fortidlig fase kreft. Disse individene bør bli ytterligere undersøkt, og dersom kreft blir funnet, deretter bli tilbudt kirurgi, stråling eller adjuvans anti-neoplastisk terapi.

Siden proteinaser og deres reseptorer og inhibitorer synes å spille en avgjørende rolle i balansemekanismene som fører til kreftinvasjon, kan disse molekylene bli uttrykt på et svært tidlig tidspunkt i den karsinogene prosessen. Ettersom mange av disse molekylene utøver sin biologiske virkning ekstracellulært, kan de være tilstede i forhøyede nivåer i kroppsvæsker, selv i pasienter med tidlig fase invasiv ondartet sykdom. Videre, siden disse molekylene er involvert i de mer grunn-leggende trekkene ved ondartet progresjon, for eksempel invasjon og metastase, bør det undersøkes hvorvidt hvilke former for kreft det er som viser en økning i disse molekylene.

Foreliggende oppfinnelse omhandler en fremgangsmåte for å hjelpe til i diagnostiseringen av kolorektal kreft i en pasient, nevnte fremgangsmåte omfatter å bestemme mengden av totale, kompleksbundede og/eller frie TIMP-1-nivåer og forhold og fraksjoner derav i plasmaprøver.

Et aspekt ved den foreliggende oppfinnelse omhandler en fremgangsmåte for å bestemme hvorvidt det er sannsynlig at et individ har kolorektal kreft eller metastatisk brystkreft, fremgangsmåten omfatter å bestemme en første parameter som representerer konsentrasjonen av TIMP-1 i plasmaprøver, og å indikere individet til å ha en høy sannsynlighet for å ha kreft dersom parameteren er ved eller over en diskriminerende verdi, og å indikere individet til lite sannsynlig å ha kreft dersom parameteren ikke er ved eller over den diskriminerende verdien.

Parameteren som representerer konsentrasjon av TIMP-1 kan være konsentrasjonen som er passende for TIMP-1. TIMP-1 eksisterer både i fri form og i form av komplekser med metallproteinaser, og det har blitt funnet at en viktig parameter er den totale konsentrasjonen av TIMP-1, det vil si summen av TIMP-1

i fri form og TIMP-1 i kompleksform. Det vil bli forstått at andre uttrykk enn den

passende konsentrasjonen kan representere konsentrasjonen, som for eksempel konsentrasjonen multiplisert med en faktor, osv. osv., og at slike andre representasjoner kan bli benyttet like godt for formålet med den foreliggende oppfinnelsen, gitt at de korresponderende justeringene blir gjort.

Den diskriminerende verdien er en verdi som er blitt bestemt ved å måle parameteren i både en frisk kontrollpopulasjon og en populasjon med kjent kreft, for derved å bestemme den diskriminerende verdien som identifiserer kreftpopulasjonen med enten en forutbestemt spesifisitet eller en forutbestemt sensitivitet, basert på en analyse av forholdet mellom parameterverdiene og de kjente kliniske dataene til den friske kontrollpopulasjonen og kreftpasient-populasjonen, slik som det er åpenbart fra den detaljerte beskrivelsen i eksemplene heri. Den diskriminerende verdien bestemt på denne måten er gyldig for det samme eksperimentoppsettet i fremtidige individtester.

Spesifisitet er definert som andelen av positiver (det vil si individer som har en parameter som representerer konsentrasjonen av TIMP-1 i plasmaprøver høyere enn et predefinert diagnostisk nivå) som blir korrekt identifisert ved den beskrevne fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen. Sensitivitet er definert som andelen med negativer (det vil si individer som har en parameter som representerer konsentrasjonen av TIMP-1 i plasmaprøver som er lavere enn et predefinert diagnostisk nivå) som blir korrekt identifisert ved den beskrevne fremgangsmåten.

Således vedrører foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for å bestemme hvorvidt et individ sannsynligvis har kolorektal kreft, kjennetegnet ved at fremgangsmåten omfatter å bestemme en første parameter som representerer enten

a) den totale konsentrasjonen av TIMP-1 i plasmaprøver, eller

b) kombinasjonen av konsentrasjonen av total TIMP-1 med

konsentrasjonen av fri TIMP-1 i plasmaprøver,

og som indikerer at det er stor sannsynlighet for at individet har kolorektal kreft dersom parameteren er ved eller over en diskriminerende verdi, og som indikerer at det er lite sannsynlig at individet har kolorektal kreft dersom parameteren ikke er ved eller over den diskriminerende verdien, nevnte diskriminerende verdi blir

bestemt ved å måle nevnte i det minste ene første parameter i både en frisk kontrollpopulasjon og en populasjon med kjent kolorektal kreft, og derved bestemme den diskriminerende verdien som identifiserer kreftpopulasjonen med en forutbestemt spesifisitet eller en forutbestemt sensitivitet.

I et annet aspekt vedrører foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for å bestemme hvorvidt det er sannsynlig at en pasient som har blitt behandlet for primær brystkreft har metastatisk brystkreft, kjennetegnet ved at den omfatter å bestemme en første parameter som representerer enten

a) den totale konsentrasjonen av TIMP-1 i plasmaprøver, eller

b) kombinasjonen av total TIMP-1 med konsentrasjonen av fri TIMP-1 i

plasmaprøver,

og som indikerer at det er stor sannsynlighet for at individet vil få metastatisk brystkreft dersom parameteren er ved eller over en diskriminerende verdi og som indikerer at det er lite sannsynlig at individet har metastatisk brystkreft dersom parameteren ikke er ved eller over den diskriminerende verdien, nevnte diskriminerende verdi blir bestemt ved å måle nevnte i det minste en første parameter i både en frisk kontrollpopulasjon og en populasjon med kjent metastatisk brystkreft og derved bestemme den diskriminerende verdien som identifiserer kreftpopulasjonen med en forutbestemt spesifisitet eller en forutbestemt sensitivitet.

Oppfinnelsen kan benyttes både for et individ og for en hel populasjon.

I de spesifikke eksperimentelle oppsettene beskrevet heri, ble konsentrasjons-terskelen av total TIMP-1 nyttig som en diskriminerende verdi funnet å være i området fra 50-160 mikrogram/l av total TIMP-1 ved en spesifisitet på 90 %. Andre eksperimentelle oppsett og andre parametere vil resultere i andre verdier som kan bli bestemt i overensstemmelse med det som fremsettes heri.

Fremgangsmåten kan bli anvendt på en ikke-selektert populasjon, men mer passende på en populasjon som allerede er identifisert til å ha en økt risiko for å utvikle kreft, for eksempel individer med en genetisk disposisjon, individer som har vært eksponert for karsinogene substanser eller individer med kreft-predisponerende ikke-ondartede sykdommer. I tilfellet med kolorektal kreft kan populasjonen valgt for oppfinnelsen representere individer med en tidligere polypp, individer med Crohns sykdom eller ulcerøs kolitt, individer med en eller flere familiemedlemmer med kolorektal kreft eller individer med en tidligere reseksjon av tidlig kolorektal kreft.

Når et individ er blitt identifisert til å ha høye TIMP-l-nivåer i hans eller hennes plasma, bør individet bli foreskrevet for ytterligere undersøkelse. Dersom kreft blir funnet, kan pasienten bli tilbudt kirurgi, stråling eller adjuvans anti-neoplastisk terapi til hjelp for å kurere pasientens kreft.

Eksempel 1 beskriver fremstillingen og valideringen av et assay som måler total TIMP-1 med høy analytisk sensitivitet og spesifisitet. Det er beskrevet at friske bloddonorer har et svært smalt område med plasma total TIMP-1.

I eksempel 2 er dannelsen av et TIMP-l:MMP-9 ELISA beskrevet. Formatet, utførelsen og valideringen av dette assayet er lignende de for total TIMP-1, bortsett fra at et polyklonalt antistoff mot MMP-9 blir benyttet i fangingstrinnet. Ved å substituere MMP-9-antistoffet med et antistoff mot en annen MMP, kan komplekser mellom TIMP-1 og andre MMP'er bli kvantitert.

I eksempel 3 blir dannelsen av et TIMP-l-assay som kun måler fri TIMP-1 beskrevet. Dette assayet utnytter et monoklonalt anti-TIMP-l-antistoff (MAC 19) som bare gjenkjenner TIMP-1 i sin ikke-kompleksbundede form. Således vil dette assayet måle mengden av fri TIMP-1 i en prøve. Utføringen og valideringen av dette assayet er lignende til assayet for total TIMP-1.

Ved å subtrahere den frie TIMP-l-konsentrasjonen fra den totale TIMP-l-konsentrasjonen i en biologisk prøve, kan konsentrasjonen av alle komplekse former av TIMP-1 bli bestemt. Det bør understrekes at TIMP-1 kan danne komplekser med mange av MMP'ene, og derfor vil det å subtrahere en type av kompleks fra den totale mengden med TIMP-1 bare tilveiebringe informasjon om den fraksjonen av TIMP-1 som ikke er i kompleks med denne spesifikke MMP'en.

I eksempel 4 er det vist at pasienter som lider av kolorektal kreft har signifikant forhøyede TIMP-l-nivåer i sine preoperative plasmaprøver. Et persentilplott av de totale TIMP-l-nivåene i plasma fra alle pasienter med kolorektal kreft og fra de friske bloddonorene, viste at en total TIMP-l-konsentrasjon på 119,1 ug/l er 90-centilen til de friske donorene. Ved å benytte denne avkuttingen ble 68 % av pasientene med kolorektal kreft identifisert til å ha forhøyede plasma-TIMP-1-nivåer. Da kolon kreftpasientene ble analysert separat, ble det vist at de totale TIMP-l-målingene i plasma identifiserte 75 % av kolonkreftpasientene (diagnostisk sensitivitet) med en 90 % diagnostisk spesifisitet (10 % av de friske bloddonorene ble klassifisert til å være høye). På samme måte ble det vist for de rektale kreftpasientene alene at totale TIMP-l-målinger i plasma identifiserte 60 % av de rektale kreftpasientene med en 90 % diagnostisk spesifisitet. Dersom en høyere eller lavere sensitivitet eller spesifisitet er ønsket, kan avkuttingsverdien bli endret. Dette er illustrert i figur 13 som viser ROC-kurver for total TIMP-1 i plasma fra pasienter med kolorektal kreft. I tillegg er det inkludert ROC-kurver for de individuelle gruppene av pasienter med kolon- og rektalkreft. Enhver annen informasjon som kan bli avledet fra disse ROC-kurvene faller innenfor omfanget til den foreliggende oppfinnelsen.

En uavhengig prospektiv studie som inkluderer preoperative plasmaprøver fra 64 pasienter med kolonkreft (n = 43) eller rektalkreft (n = 21) bekreftet dataene som ble oppnådd i den ovennevnte beskrevne studien (figur 15). En ytterligere studie av 180 friske bloddonorer og 20 pasienter med kolorektal kreft, som benyttet forskjellige antistoffer (anti TIMP-1 11 E/C6, anti-TIMP-1 RRU-T6) i et automatisert immunoassay, understøttet ytterligere de tidligere kliniske resultatene. Videre viste de absolutte verdiene generert fra det automatiserte assayet en høy grad av korrelasjon til de som ble oppnådd ved assayet beskrevet i eksempel 1 (r = 0,9).

Den kliniske verdien av en markør for kreftscreening er relatert til dens evne til å detektere tidlige faser av sykdom, som muligens impliserer overlevelse. Det ble vist at total TIMP-1 var en like effektiv screeningsmarkør i tidlig fase kolorektal kreft (Dukes faser A og B) som den var i den totale populasjonen av pasienter med kolorektal kreft (figur 14). Således vil screening med total TIMP-1 resultere i at flere pasienter blir diagnostisert med tidlig fase kreft. På en lignende måte vil enhver informasjon som kan bli avledet fra figur 14 falle innenfor omfanget til den foreliggende oppfinnelsen.

Ved å dele pasientene med kolorektal kreft i to grupper, pasienter med henholdsvis venstresidige og høyresidige tumorer, ble det åpenbart at måling av total TIMP-1 var spesielt nyttig for å identifisere de pasientene med tidlig fase, høyre-sidig kolonkreftskader (figur 14).

Spesifisiteten av en gitt kreftscreeningstest er basert på effektiviteten av testen til å identifisere kun de pasientene som lider av kreft, mens pasienter som lider av godartede sykdommer ikke bør bli identifisert som falske positive subjekter. I tilfellet med kolorektal kreft er det viktig at testen det er snakk om kan skille mellom ondartede og godartede sykdommer i kolon og rektalt. Dette er spesielt viktig for sykdommer som Crohns sykdom og ulcerøs kolitt, siden pasienter med disse sykdommene har høyere risiko for å utvikle kreft.

I eksempel 5 er det vist at totale TIMP-l-nivåer er signifikant høyere i pasienter med kolorektal kreft enn i pasienter med inflammatoriske tarmsykdommer (IBD), noe som viser at total TIMP-1 kan bli benyttet for å screene for kolorektal kreft i en populasjon av pasienter med IBD. At TIMP-1 ikke er økt i godartede sykdommer blir støttet av en nylig artikkel (Keyser et al, 1999), som viser at pasienter med revmatoid artritt ikke har økte plasma TIMP-l-nivåer. Videre, ved å sammenligne totale TIMP-l-nivåer blant pasienter med IBD (bortsett fra pasienter med klinisk vurdert akutt aktiv sykdom, n = 4) og friske bloddonorer, ble ingen signifikante forskjeller i totale plasma TIMP-l-nivåer funnet (p = 0,56), noe som viser at disse godartede sykdommene ikke gir falske positive testresultater.

I eksempel 6 blir den additive effekten av målingen av en ytterligere kolorektal kreftmarkør beskrevet. Carcino Embryonic Antigen (CEA) ble målt i alle kreftpasienter og friske bloddonorprøver. Ved å kombinere CEA og TIMP-l-nivåene målt ved assayet beskrevet i eksempel 1, ble det vist at mens CEA alene gir en 35 % sensitivitet ved en 98 % spesifisitet, økte sensitiviteten av kombinasjonen av CEA og total TIMP-1 bestemt ved logistikkregresjonsanalyse til 57 %, uten å ofre spesifisitet.

I eksempel 7 er det vist at pasienter som lider av kolorektal kreft har signifikant forhøyede frie TIMP-l-nivåer i sine preoperative plasmaprøver. Et persentilplott som inkluderer de frie TIMP-l-nivåene fra pasientene med kolorektal kreft, så vel som frie TIMP-l-nivåer fra friske bloddonorer, viste at pasienter med kolorektal kreft hadde signifikant forhøyede frie TIMP-l-nivåer sammenlignet med bloddonorer p = 0,02. En ROC-kurve ble laget (figur 18) for disse pasientene og donorer, og det ble sett at fri TIMP-1 ga et areal under kurven (AUC) på 0,61.

I eksempel 8 blir anvendelsen av TIMP-1 :MMP-9-kompleksassayet som en hjelp for diagnostiseringen av kolorektal kreft beskrevet.

TIMP-1 er kjent for å eksistere enten som det frie molekylet, eller i kompleks med MMP'er, fortrinnsvis MMP-9. Å måle totalt TIMP-1, kompleksbundet TIMP-1 og fri TIMP-1 vil gjøre det mulig å validere hver av disse spesiene for sin potensielle diagnostiske verdi. I tillegg vil det være mulig å beregne forhold eller en hvilken som helst avledet algoritme mellom de ulike slagene som kan tilveiebringe ytterligere diagnostisk verdi.

I eksempel 9 er den diagnostiske verdien av kombinasjonen av total og fri TIMP-1 beskrevet.

Dataene viser at ved å kombinere med logistikkregresjonsanalyse de frie TIMP-1-målingene med de totale TIMP-l-målingene, ble det demonstrert en signifikant økning i AUC. Enhver informasjon som kan bli avledet fra figur 18 faller innenfor omfanget til den foreliggende oppfinnelsen.

Spesifisiteten til en gitt kreftscreeningstest er basert på testens effektivitet til å identifisere kun de pasientene som lider av kreft, mens pasienter som lider av godartede sykdommer ikke bør identifiseres som falske positive. Imidlertid vil det være ønskelig at testen var spesifikk for en spesifikk krefttype, for eksempel kolonkreft, i stedet for å være en all-kreftmarkør.

I eksempel 10 er de totale TIMP-l-verdiene i preoperative blodprøver fra en kohort gruppe på 322 pasienter med primær brystkreft (fase I og II) sammenlignet med de totale TIMP-l-nivåer i 108 friske bloddonorer, beskrevet. Det ble vist at brystpasientene hadde et midlere totalt TIMP-l-nivå på 88,3 ug/l, mens de friske donorene hadde en midlere plasma konsentrasjon av total TIMP-1 på 88,9 ug/l. Forskjellene mellom disse verdiene er ikke klinisk signifikant, noe som støtter spesifisiteten av TIMP-l-nivåer for diagnostiseringen av kolorektal kreft. Imidlertid bør det studeres hvorvidt forhøyede plasma TIMP-l-nivåer blir funnet i pasienter med tidlig fase ikke-kolorektal kreft.

I eksempel 11 er totale TIMP-l-nivåer i pasienter med metastatisk brystkreft beskrevet.

Det er verdt å merke seg at total TIMP-1 i plasma fra kvinner med metastatisk brystkreft hadde en midlere verdi på 236 ug/l, signifikant høyere enn nivåer i friske bloddonorer. Dette viser potensialet for å benytte plasma TIMP-l-nivåer i behandlingen av brystkreftpasienter.

I eksempel 12 er konsentrasjonene av TIMP-2 i preoperative plasmaprøver fra pasienter med kolorektal kreft beskrevet.

TIMP-2 er en annen vevsinhibitor av metallproteinase med en høy grad av homologi til TIMP-1. Ved å benytte et spesifikt immunoassay for TIMP-2 ble konsentrasjoner av denne inhibitoren bestemt i plasmaprøver fra pasienter med kolorektal kreft og i friske bloddonorer. Ingen signifikante forskjeller i plasma TIMP-2-nivåer ble funnet mellom de to populasjonene, noe som støtter den unike verdien av TIMP-1 som en hjelp for den tidlige diagnostiseringen av kolorektal kreft.

FIGURTEKSTER

Figur 1: Kinetikkassay for TIMP-1. Utviklingskurver for endringen i absorbans ved 405 nm produsert ved hydrolyse av p-nitrofenylfosfat ved fast-fasebundet alkalin-fosfatase immunkonjugat. Dataene som er vist er generert ved 4 individuelle assaybrønner behandlet med 4 forskjellige konsentrasjoner av renset rekombinant TIMP-1; 10 ug/l (v-v), 2,5 ug/l (A-A), 0,63 ug/l ( - ) og 0,16 ug/l (O-O). Linjene som er vist har blitt tilpasset ved enkel lineær regresjon. Figur 2: TIMP-1 standardkurve. Absorbansenheter for triplikat TIMP-1-standarder i området fra 0 til 5 ug/l er samlet automatisk i løpet av 60 minutter, med avlesninger gjort ved 405 nm hvert 10. minutt. Utviklingskurver er beregnet for hver brønn, og hastighetene oppnådd er tilpasset til en standardkurve ved å benytte en fireparameterlikning av formen y = d + [(a-d)/(l+(x/c)<b>)]. I eksempelet som er vist hadde de fire avledede parametrene følgende verdier: a = 1,87, b = 1,11, c = 3,35, d = 73,5. Korrelasjonskoeffisienten for den tilpassede kurven er > 0,999. Figur 3: Gjenvinning av signal fra standard TIMP-1 tilsatt i økende konsentrasjon til assayfortynningsbuffer ( - ), en 1:100 fortynning av EDTA plasmasammenslåing (A-A), en 1:100 fortynning av citrat plasmasammenslåing (V-V) og en 1:100 fortynning av heparin plasmasammenslåing (O-O). Verdiene som er vist er gjennomsnitt av triplikater. Korrelasjonskoeffisienten for hver tilpassede kurve er > 0,99. Figur 4: Western blotting av immunabsorbert pasientplasmaprøve. Rad 1: Standard TIMP-1; rad 2: Eluat av pasient citratplasmaprøve fortynnet 1:100 og immunabsorbert med sau polyklonalt anti-TIMP-1. Bånd av ikke-reduserte standard TIMP-1 og TIMP-1 isolert fra plasmaprøve åpenbares begge rett under 30 kDa. Figur 5a: Persentilplott for nivået av TIMP-1 (ug/l) målt i citratplasma (O) og EDTA-plasma (A) fra det samme individet i et sett med 100 frivillige bloddonorer. Figur 5b: Lineært regresjonsplott for nivået av TIMP-1 i citratplasma prøver sammenlignet med EDTA-plasmaprøver fra de samme 100 individene. Likningen til den tilpassede linjen er y = 0,93x, med en regresjonskoeffisient på 0,99. Figur 6: Persentilplott for nivåene av TIMP-1 (ug/l) målt i to sett med citrat-plasmaprøver oppnådd ved den samme fremgangsmåten fra frivillige bloddonorer ved ulike tidspunkter. 100 prøver fra mai = 97 (A) og 94 prøver fra sept = 96

(

Figur 7: Persentilplott for nivåene av TIMP-1 (ug/l) målt i 194 citratplasmaprøver fra frivillige bloddonorer og lagdelt ved kjønn til 107 mannlige (A) og 87 kvinnelige

(O).

Figur 8: Grafisk illustrasjon av TIMp-l:MMP-9-kompleks ELISA.

Figur 9: Grafisk illustrasjon av fri TIMP-1 ELISA.

Figur 10: En plate ble belagt med det polyklonale anti-MMP-9-antistoffet. Forskjellige konsentrasjoner av TIMP-1 :MMP-9-kompleks, fri MMP-9, fri TIMP-1 og en blank kontroll ble tilsatt. Bare TIMP-1 :MMP-9-komplekser og fri MMP-9 ble bundet av det erobringspolyklonale (capture polyclonal) anti-MMP-9-antistoffet. MAC19 ble deretter tilsatt for antigendeteksjon. Hverken TIMP-l:MMP-9-kompleks eller fri MMP-9 ble detektert ved MAC19, noe som definerer spesifisiteten til dette antistoffet for fri TIMP-1. Figur 11: En plate ble belagt med det polyklonale anti-MMP-9-antistoffet. Forskjellige konsentrasjoner av TIMP-1 :MMP-9-kompleks, fri MMP-9, fri TIMP-1 og en blank kontroll ble tilsatt. Bare TIMP-1 :MMP-9-komplekser og fri MMP-9 ble bundet av det erobringspolyklonale anti-MMP-9-antistoffet. MAC15 ble deretter tilsatt for antigendeteksjon. Bare TIMP-1 :MMP-9-kompleks bundet av det erobringspolyklonale anti-MMP-9-antistoffet ble detektert ved MAC15. Fri MMP-9 ble ikke detektert ved MAC15. Figur 12: Gjenvinning av signal i det frie TIMP-l-assayet fra standard TIMP-1 tilsatt i økende konsentrasjon til assayfortynningsbuffer ( - ), en fortynning av EDTA plasmasammenslåing (A-A), en fortynning av citratplasmasammenslåing (V-V) og en fortynning av heparinplasmasammenslåing (0-0). Verdiene som er vist er gjennomsnittene av triplikater. Korrelasjonskoeffisienten for hver tilpassede kurve er større enn 0,99. Figur 13: ROC-kurver for total TIMP-1 i alle pasienter med kolorektal kreft, i pasienter med rektal kreft separat og i pasienter med kolonkreft separat. Som friske kontrollsubjekter ble en gruppe på 108 friske bloddonorer benyttet. (Tall i parentes = Areal under kurven). Figur 14: ROC-kurver for total TIMP-1 i alle kreftpasienter med kolorektal kreft med Dukes A eller B-sykdom. I tillegg er kurver for Dukes A eller B-pasienter med kolonkreft eller med høyresidig kolonkreft inkludert. (Tall i parentes = Areal under kurven). Figur 15: ROC-kurve for total TIMP-1 fra et uavhengig sett av 64 pasienter med kolorektal kreft sammenlignet med 108 friske bloddonorer er vist. (AUC = Areal under kurven). Figur 16: Boksplott som viser totale TIMP-l-konsentrasjoner i plasma fra friske bloddonorer, fra pasienter med Crohns sykdom, fra pasienter med ulkerativ kolitt og fra pasienter med kolorektal kreft. Medianverdier, 10., 25., 75. og 90. centiller er vist. Figur 17: ROC-kurver for total TIMP-1, CEA og for kombinasjonen av total TIMP-1 og CEA i pasienter med høyre kolonkreft og 108 friske bloddonorer. (Tall i parentes = Areal under kurve). Figur 18: ROC-kurver for plasmafri TIMP-1, for plasma total TIMP-1 og for kombinasjonen herav i 64 CRC-pasienter og 108 donorer. (Tall i parentes = Areal under kurve). Figur 19: ROC-kurve for 322 primære brystkreftpasienter og 108 bloddonorer.

(AUC = Areal under kurve).

Figur 20: Persentilplott for nivået av total TIMP-1 (ug/l) målt ved ELISA i 19 EDTA plasmaprøver fra kvinnelige pasienter med brystkreft (O) og 87 friske bloddonorer

(A).

EKSEMPLER

Eksempel 1

Fremstilling av et ELISA for å kvantifisere totale TIMP-l-konsentrasjoner i human plasma.

Dette eksempelet beskriver fremstillingen og valideringen av et ELISA som måler totale TIMP-l-nivåer i plasma. I tillegg tilveiebringer dette eksempelet informasjon om TIMP-l-nivåer i ulike plasmaprepareringer, så vel som i friske bloddonorer av begge kjønn.

Blodprøver ble initielt oppnådd fra 94 tilsynelatende friske frivillige bloddonorer, og omfattet 51 menn i alderen 19 til 59 år (middelverdi: 41 år) og 43 kvinner i alderen 20 til 64 år (middelverdi: 36 år). I en påfølgende innsamling, ble 100 blodprøver oppnådd, som omfattet 56 menn i alderen 19 til 59 år (middelverdi: 42 år) og 44 kvinner i aldere 20 til 60 år (middelverdi: 46,5 år). Informert samtykke ble oppnådd fra alle donorer og tillatelse ble oppnådd fra de lokale etiske komiteer.

Perifert blod ble hentet med minimumsstaser (dersom nødvendig var et maksimum på 2 min staser med en årepresse på maksimum +2 kPa akseptabelt)

i forkjølt citrat-, EDTA- eller heparinsamlingsrør (Becton-Dickinson, Mountain View, CA), blandet 5 ganger ved inversjon og umiddelbart kjølt ned på is. Så snart som mulig (ikke senere enn 1,5 timer etter innsamling) ble plasma og blodceller separert ved sentrifugering ved 4 °C ved 1200 x g i 30 minutter, og lagret frosset ved -80°C før assay. Plasmasammenslåinger ble gjort med nylig innsamlede prøver fra minst 10 donorer, porsjonert og lagret frosset ved -80 °C. For analyse ble prøvene raskt tint i et 37 °C vannbad og deretter plassert på is inntil behov.

Et sensitivt og spesifikt sandwich ELISA ble fremstilt ved å benytte TIMP-1-antistoffer utviklet ved Strangeways Laboratories (Hembry et al, 1985). Et sau polyklonalt anti-TIMP-l-antiserum (Hembry et al, 1985; Murphy et al, 1991) ble benyttet for antigenerobring, og et murint monoklonalt anti-TIMP-1 IgGl (MAC-15) (Cooksley et al, 1990) for antigendeteksjon. Et kanin anti-mus immunglobulin/alkalisk fosfatasekonjugat (katalog nummer D0314, Dako, Glostrup, Danmark) var det sekundære deteksjonsreagenset. Dette sistnevnte konjugatet ble levert preabsorbert mot humant IgG, og eliminerte således kryssreaktivitet med IgG i plasmaprøvene. Ettersom det monoklonale deteksjonsantistoffet MAC-15 gjenkjenner både fri TIMP-1 og TIMP-1 i kompleks med MMP'er (Cooksley et al, 1990), ble det totale TIMP-l-innholdet erobret av sau polyklonalt anti-TIMP-l-antiserum kvantifisert ved ELISA. 96 brønners mikrotiterplater (Maxisorp, Nunc, Roskilde, Danmark) ble belagt i 1 time ved 37 °C med 100 ul/brønn med polyklonalt sau anti-TIMP-1 (4 mg/l) i 0,1 mol/l karbonatbuffer, pH 9,5. Brønnene ble deretter renset to ganger med 200 pl/brønn med SuperBlockJ-løsning (Pierce Chemicals, Rockford, IL) fortynnet 1:1 med fosfatbufret saltløsning (PBS). Mikrotiterplatene ble lagret i opp til 14 dager ved -20 °C. På analysedagen ble platene tint ved romtemperatur og vasket 5 ganger i PBS som inneholdt 1 g/l Tween.

En serie med rensede rekombinante humane TIMP-l-standarder ble benyttet for å kalibrere hver plate. Standarder ble fremstilt ved serielt å fortynne en stam løsning med renset TIMP-1. Standard konsentrasjoner var 10, 5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,313 og 0,156 ug/l. Inkludert på hver plate var en blank som inneholdt kun prøve-fortynningsbuffer, og to kontroller laget av en 1:100 fortynning av citratplasmasammenslåing. En kontroll ble tilsatt som den første prøven på platen og den andre kontrollen ble tilsatt som den siste. Alle plasmaprøvene ble fortynnet 1:100 i prøvebuffer som besto av 50 mol/l fosfat, pH 7,2, 0,1 mol/l NaCI, 10 g/l bovint serum albumin (Fraction V, Boehringer-Mannheim, Penzberg, Tyskland) og 1 g/l Tween 20. Et totalvolum på 100 pl/brønn av hver standard, blank, kontroll og pasientprøve ble innkubert på platen i 1 time ved 30 °C. Alle standarder, blanker, kontroller og prøver ble kjørt i triplikat på hver plate for hvert assay. Etter primær innkubering ble brønnene vasket 5 ganger, deretter behandlet i 1 time ved 30°C med 100 pl/brønn med renset MAC-15 monoklonalt antistoff (0,5 mg/l) i prøve-fortynningsbuffer. Etter ytterligere 5 vaskinger ble brønnene innkubert i 1 time ved 30°C med 100 pl/brønn av kanin anti-muse immunglobuliner (Ig)/alkalisk fosfatasekonjugat fortynnet 1:2000 i prøvefortynningsbuffer. Etter 5 vaskinger med vaskeløsning og 3 vaskinger med destillert vann, ble 100 ul med frisk laget p-nitrofenylfosfat (Sigma, St. Louis, MO) substratløsning (1,7 g/l i 0,1 mol/l Tris.HCl, pH 9,5, 0,1 mol/l NaCI, 5 mmol/l MgCI2) tilsatt til hver brønn. Platen ble plassert i en Ceres 900J plateleser (Bio-Tek Instruments, Winnoski, VT) ved 23 °C med den gule fargeutviklingen automatisk monitorert. Avlesninger ble tatt ved 405 nm mot en luftblank hvert 10. minutt i 1 time. KinetiCalc II programvare ble benyttet for å analysere dataene ved å beregne hastigheten på fargedannelse for hver brønn (lineær regresjonsanalyse), som ga en 4-parameters tilpasset standardkurve og å beregne TIMP-l-konsentrasjonen for hver plasmaprøve. Gjenvinning av TIMP-l-signal ble målt etter tilsetting av 1:100 fortynninger av citrat-, EDTA- eller heparinplasmasammenslåinger. Renset TIMP-1 ble tilsatt til plasmasammenslåinger for å gi sluttkonsentrasjoner i området fra 0 til 10 ug/l. Gjenvinningen i hvert tilfelle ble beregnet fra stigningen på linjen som representerer TIMP-l-signal som en funksjon av konsentrasjon, der 100 % gjenvinning ble definert som stigningen oppnådd når TIMP-1 ble fortynnet i prøvefortynningsbuffer.

Citratplasma fra en pasient med et høyt nivå av TIMP-1 i blodet (634 ug/l, bestemt ved ELISA), ble fortynnet 1:10 og tilsatt en protein A-Sepharose-kolonne preinnkubert med polyklonalt sau anti-TIMP-1. Etter 5 sykluser ble bundet protein eluert fra kolonnen og 50 ul av det resulterende eluatet kjørt på 12 % SDS gel-elektroforese (Ready GelJ, Bio-Rad). En blanding av lavmolekylvekt-(Pharmacia) og høymolekylvektmarkører (Bio-Rad) og 50 ul med TIMP-l-standard (100 ug/l) i Laemmli prøvebuffer ble også kjørt på gelen. Proteiner ble overført elektroforetisk fra gelen på en polyvinylidendifluorid (PVDF) membran (Millipore). Membranen ble innkubert i 1 time ved romtemperatur med 1 % skummet melkepulver i TBS. Etter vasking ble membranen innkubert i 1 time ved romtemperatur med 20 ml MAC-15 (5 mg/l). Membranen ble deretter vasket og innkubert for en ytterligere time ved romtemperatur med 20 ml kanin anti-mus lg/alkalisk fosfatasekonjugat fortynnet 1:1000. Til slutt ble membranen vasket og farge utviklet ved tilsetning av en fosfatsubstratløsning (NBT/BCIP).

Resultater:

Utvikling av farge i hver brønn utviklet seg som en lineær funksjon av tid for alle konsentrasjoner av total TIMP-1 i disse eksperimentene (figur 1), med korrelasjonskoeffisienter for de tilpassede linjene typisk større enn 0,99. Standard kurven for hastighetene plottet mot TIMP-l-konsentrasjonen besto av de lineære og øvre kurvede regionene (over området fra 0 til 5 ug/l) av en sigmoid kurve, og korrelasjonskoeffisienten for 4-parametertilpasningen var typisk bedre enn 0,999 (figur 2). Hastigheten uten TIMP-1 (lest mot en luftblank) var 1,21 ± 0,15 (gjennomsnitt ± SD) milliabsorbansenheter/min (n = 29), mens hastigheten med 10 ug/l standard TIMP-1 var 50,3 ± 6,01 milliabsorbansenheter/min (n = 29). Deteksjonsgrensen for assayet, definert som konsentrasjonen av TIMP-1 som korresponderer til et signal 3 SD over gjennomsnittet for TIMP-l-blanken, var 0,089 ug/l. Denne verdien var 13 % av gjennomsnittet av de målte konsentrasjonene av TIMP-1 i friske citratplasma prøver. Intraassaykoefflsienten for variasjon (CV) for 16 replikater av en kontroll citratplasmasammenslåing var 5,3 %, og interassay CV for 29 suksessive assay av plasmasammenslåingen (kjørt på forskjellige dager) var 6,2 %. Denne plasmasammenslåingen hadde en TIMP-1-konsentrasjon på 57,8 ug/l, som korresponderer til den 22. centilen til normale individer.

Gjenvinning av rekombinant TIMP-1 etter fortynning i plasma. Spesifikk gjenvinning ble bestemt ved tilsetning av økende konsentrasjoner av renset TIMP-1 til et panel med plasmasammenslåingsreplikater, etterfulgt av påfølgende målinger av signal. Gjenvinning var 104 % i citratplasma, 101 % i fortynnet EDTA-plasma og 87 % i fortynnet heparinplasma (figur 3). Således var gjenvinning av TIMP-l-signal fra en intern standard akseptabel for alle plasmaprepareringene.

Serielle fortynninger av citrat-, EDTA- og heparinplasmasammenslåinger ble utført for å teste for lineær reduksjon i TIMP-l-signal. Citrat-, EDTA- og heparinplasma ga alle god linearitet av signal som en funksjon av fortynning. Den 1 % plasma-fortynningen som var valgt for påfølgende bestemmelser lå godt innenfor området for denne lineære fortynningskurven.

Et Western blot av en immunabsorbert pasientplasmaprøve viste et klart bånd på 28 kDa (figur 4, rad 2), som korresponderer til fri, ikke-kompleksbundet TIMP-1 (figur 4, rad 1). Ingen bånd ble funnet ved de antatte høyere molekylvektene som korresponderer til komplekser mellom MMP'er og TIMP-1, for eksempel MMP-2:TIMP-1, 100 kDa. Dette indikerer enten at hoveddelen av TIMP-1 var tilstede i plasmaet i den frie formen, eller at komplekser var dissosiert i løpet av SDS-PAGE. Selv om prøvene ble etterlatt både uredusert og uoppvarmet for å bevare eventuelle komplekser som var tilstede i plasmaprøven, har det vært rapportert at MMP:TIMP-komplekser kan være ustabile i SDS-PAGE (Wilhelm et al, 1989; Stetler-Stevensen et al, 1989; Moll et al, 1990), selv under ikke-reduserende betingelser (Moutsiakis et al, 1992).

En samling av citrat- og EDTA-plasmaprøver tatt samtidig fra 100 friske donorer var tilgjengelige for dette studiet. Disse prøvene var ikke spesifikt samlet som plasma med lite blodplater. Et lite, representativt antall med prøver, fremstilt som plasma med lite blodplater, skilte seg imidlertid ikke signifikant i totale TIMP-1-verdier. Persentilplottene for totale TIMP-l-nivåer i disse prøvene er vist i figur 5a. Verdiene i hvert sett var tilnærmet en normal distribusjon. Citratplasma TIMP-l-nivåer varierte mellom 55,0 og 90,3 ug/ (10. til 90. persentil) med et gjennomsnitt på 69,2 ± 13,1 ug/l. På samme måte varierte EDTA-plasma TIMP-l-nivåer fra 58,0 til 91,8 ug/l, med et gjennomsnitt på 73,5 ± 14,2 ug/l. For både citrat-og EDTA-plasma var gjennomsnittlige TIMP-l-nivåer svært nær middelverdiene (tabell 1). En parret gjennomsnittssammenligning viste at nivået av TIMP-1 i citratplasma var signifikant lavere ved 4,34 ug/l (95 % Cl 2,34-6,33; (p

<0,0001)) enn EDTA-plasmanivået for det samme individet. Imidlertid er det sannsynlig at denne forskjellen kan skyldes variabiliteten i prøvesamlings-prosedyren i løpet av plasmainnsamling. EDTA-plasmarør inneholdt tørt anti-koagulerende materiale mens citratplasmarør inneholdt en liten mengde av flytende citratbuffer som ga en liten og variabel systematisk fortynningsfeil (x 9/10). Nivået av TIMP-1 i citratplasma korrelerte med det i EDTA-plasma for de samme individene. Det lineære regresjonsplottet i figur 5b viser en regresjonskoeffisient på 0,99 med en stigning på den tilpassede linjen på 0,93, som muligens illustrerer denne lille fortynningsfeilen. En ikke-parametrisk Spearmans rank-test for datasettet ga en rho-verdi på 0,62 og p < 0,0001.

Totalt ble 194 citratplasmaprøver fra friske bloddonorer studert, som omfattet 94 prøver tatt i løpet av en innsamling og 100 prøver tatt 9 måneder senere fra et annet sett med donorer. Figur 6 viser persentilplottene for TIMP-l-nivåer målt i disse to uavhengige gruppene. Referanseområdet for TIMP-l-nivåer i citratplasma fra den første innsamlingen var 53,3 til 77,7 ug/l (10. til 90. persentil) med et gjennomsnitt på 65,4 ± 10,1 ug/l/ som ikke var mulig å skille fra gjennomsnittet (tabell 1), og som nærmet seg en normal distribusjon. Gjennomsnittlig TIMP-1-nivå for den andre innsamlingen var 69,2 ± 13,1 ug/l (referanseområde 55,0 til 90,3 Mg/I). En uparret gjennomsnittssammenligning viste at TIMP-l-nivåer i de to settene med prøver tatt i løpet av to forskjellige perioder var forskjellige kun med 3,82 M9/I (95 % Cl: 0,50-7,14 ug/l; p = 0,024). Videre var ingen signifikant forskjell åpenbar mellom kontrollene (n = 8) inkludert i hvert sett med assay

(gjennomsnittlig differanse 0,36 ug/l; 95 % Cl: 1,71-2,44 ug/l; p = 0,69). Det gjennomsnittlige TIMP-l-nivået for alle de 194 citratplasmaprøvene var 67,3 ± 11,8 ug/l, nær middelverdien på 66,1 ug/l, med nivåer som igjen nærmet seg en normal distribusjon (referanseområde 54,0 til 82,7 ug/l).

I disse studiene (tester for korrelasjoner til kjønn og alder hos donor) hadde kontrollverdiene som ble målt i hvert assay en CV på 2,7 %. Persentiler for TIMP-l-nivåer i 194 citratplasmaprøver beregnet i henhold til kjønn er vist i figur 7. Gjennomsnitts TIMP-l-verdien for 107 mannlige donorer var 70,4 ± 12,0 ug/l (middelverdi 69,4 ug/l) med et referanseområde fra 56,2 til 86,6 ug/l, mens den gjennomsnittlige TIMP-l-verdien for 87 kvinnelige donorer i dette settet var 65,5 ± 10,5 Mg/I (middelverdi: 62,0 ug/l) med referanseområdet fra 51,8 til 77,0 ug/l. Det var en signifikant forskjell (p < 0,0001) i TIMP-l-gjennomsnittsnivåer mellom de to gruppene, der menn hadde høyere TIMP-l-nivåer enn kvinner. Det var en trend mot en økning i plasma TIMP-1 ved økende alder (Spearmans rho = 0,33, P = 0,0011), men dette økte ikke med kjønn (kvinner: Spearmans rho = 0,20, P = 0,0006; menn: Spearmans rho = 0,35, P = 0,0003). I EDTA-plasma varden gjennomsnittlige TIMP-l-verdien for 56 menn 76,9 ± 15,0 ug/l (middelverdi: 75,1 Mg/I) med et område fra 58,8 til 96,9 \ xq/\, mens 44 kvinnelige donorer hadde et gjennomsnittlig TIMP-l-nivå på 69,3 ± 11,8 \ xq/\ (middelverdi: 67,9 pg/l) med et referanseområde fra 56,1 til 85,5 \ ig/\. Igjen ble det åpenbart en signifikant forskjell mellom menn og kvinner (p = 0,0076, uparret gjennomsnittssammenligning).

Assayet beskrevet over muliggjør nøyaktig bestemmelse av total TIMP-1 i humane plasmaprøver. Kinetiske hastighetsassay av det bundede antigenet ble enkelt oppnådd, og tillot automatiser tilpasning av hastighetskurver, som hadde vist seg vesentlig mer pålitelige enn enkle endepunktsmålinger. Anvendelsen av et raskt blokkerende agens og en fortynningsbuffer med høy bufringskapasitet bidro også til reproduserbare assayer. Inkorporering av alle disse elementene i det endelige assayet fullbyrdet kravene til sensitivitet, spesifisitet, stabilitet og god gjenvinning av en intern standard.

De kvantitative studiene i blod fra friske donorer viste at både citrat- og EDTA-plasmaprøver er egnede for TIMP-l-bestemmelse. Sammenlignet med andre publiserte studier av TIMP-1 fra friske donorer Pung et al, 1996; Jung et al, 1996), falt nivåene i det foreliggende studiet innenfor et svært lite område. Noen studier har rapportert resultater i serum, men plasma var valgt for det foreliggende studiet for å unngå det variable bidraget til blodplateaktivering og de målte TIMP-l-verdiene (Cooper et al, 1985). Mens plasmaprøvene som ble benyttet i dette studiet ikke var spesifikt fremstilt som blodplatefattig plasma, ble det vist, basert på tester utført i laboratoriet, at dette ikke endrer verdiene. Donormaterialet var stort nok til å vise at TIMP-l-nivåer i friske individer (både EDTA og citrat) nærmet seg en normal distribusjon, for kvinner så vel som for menn. Gjennomsnittlige TIMP-l-nivåer var omkring 10 % høyere i menn enn i kvinner for både EDTA- og citratplasma. En forklaring for dette er en høyere frigivelseshastighet for TIMP-1 inn i blodet fra aktiverte blodplater, noe som reflekterer en tendens mot høyere forekomst av trombo-embolisk sykdom i den mannlige populasjonen. Når menn og kvinner ble vurdert separat, var det en svak korrelasjon mellom TIMP-1 og alder sett for hele populasjonen (se over).

Eksempel 2

Fremstilling av et ELISA for å kvantitere TIMP-l:MMP-9-komplekser i plasma.

Det følgende eksempelet beskriver et assay for å bestemme konsentrasjonen av TIMP-1 :MMP-9-komplekser i kroppsvæsker. Assayet blir benyttet med plasmaprøver fra friske bloddonorer for å etablere normale områder for dette komplekset (Holten Andersen et al., 1999).

Et sensitivt og spesifikt sandwich ELISA ble fremstilt ved å benytte det

ovennevnte beskrevne TIMP-l-antistoffet, MAC-15, og et kanin MMP-9 polyklonalt antistoff utviklet i Hematologisk Avdeling, Rigshospitalet, Danmark (Kjeldsen et al, 1992). MMP-9-antistoffet ble benyttet for antigenerobring og MAC-15 ble benyttet for antigendeteksjon. Et kanin anti-mus-Ig/alkalisk fosfatasekonjugat (Dako,

Glostrup, Danmark) muliggjorde et kinetisk hastighetsassay (figur 8). Det sistnevnte konjugatet ble levert preabsorbert mot human IgG, og eliminerte således kryssreaktivitet med IgG i plasmaprøvene. MMP-9-antistoffet erobret både fri MMP-9 og MMP-9 i kompleks med TIMP-1, mens MAC-15 bare gjenkjente TIMP-1. Derfor ble bare TIMP-l:MMP-9-kompleksene kvantifisert ved dette reagensparet.

For å hindre spontan, ex vivo TIMP-l:MMP-kompleksdannelse i løpet av prøve-samlingen og assayprosedyrer, ble en proteaseinhibitor (det vil si galardin, batimastat, marimastat) tilsatt til plasmaprøven etter tining. Tilsettingen av proteaseinhibitoren blokkerte in vitro kompleksdannelse ved inhibisjon av den katalytiske aktiviteten til metallproteinasene.

TIMP-1 :MMP-9-assayet ble fremstilt og validert ved en metode lignende til den som er beskrevet over for det totale TIMP-l-assayet. TIMP-1: MMP-9-standarder ble fremstilt ved å innkubere ekvimolare mengder med renset rekombinant TIMP-1 og MMP-9 (aktivert ved å tilsette APMA) i PBS i 1 time ved 37 °C.

I korthet ble 96 brønners mikrotiterplater belagt over natt ved 4 °C ved 100 ul/brønn av kanin polyklonalt anti-MMP-9 antiserum i 0,1 mol/l karbonatbuffer, pH 9,5. Før anvendelse ble assaybrønnene godt renset to ganger med 200 ul/brønn med SuperBlock-løsning fortynnet 1:1 med fosfatbufret saltløsning (PBS), og deretter vasket 5 ganger i PBS som inneholdt 1 g/l Tween 20. Brønner ble deretter innkubert i 1 time ved 30 °C med 100 pl/brønn med plasma fortynnet i prøvebuffer A serier med renset TIMP-1: MMP-9-standarder ble benyttet for å kalibrere hver plate. Standarder ble fremstilt ved serielt å fortynne en stam løsning med renset TIMP-l:MMP-9-kompleks. Inkludert på hver plate var en blank som inneholdt kun prøvefortynningsbuffer og 2 kontroller laget av en citratplasmasammenslåing. En kontrollplasmasammenslåing ble tilsatt som den første på platen og den andre kontrollen ble tilsatt som den siste. Alle standarder, blanker, kontroller og prøver ble kjørt i triplikat på hver plate for hvert assay. Etter prøveinnkubering og TIMP-l:MMP-9 kompleksbinding, ble brønnene vasket 5 ganger, etterfulgt av behandling i 1 time ved 30 °C med 100 pl/brønn med MAC-15 i prøvefortynningsbuffer. Etter ytterligere 5 vasker ble brønnene innkubert i 1 time ved 30 °C med 100 pl/brønn med kanin anti-mus lg/alkalisk fosfatasekonjugat fortynnet i prøvefortynningsbuffer. Etter 5 vaskinger med vaskeløsning og 3 ytterligere vaskinger med destillert vann, ble 100 ul med nylig laget p-nitrofenylfosfatsubstratløsning tilsatt i hver brønn. Platene ble plassert i en Ceres 900J plateleser ved 23°C med den gule fargeutviklingen monitorert automatisk avlesninger ble utført ved 405 nm mot en luftblank hvert 10. minutt i 1 time. KinetiCalc II programvare ble benyttet for å analysere dataene ved å beregne hastigheten til fargedannelse for hver brønn (lineær regresjonsanalyse), å generere en 4-parameters tilpasset stand ard kurve, og å beregne TIMP-l:MMP-9-konsentrasjonen for hver plasmaprøve.

Spesifikk gjenvinning ble bestemt ved tilsetning av TIMP-1 :MMP-9-kompleks til en serie av citrat-, EDTA- eller heparinplasmasammenslåinger. Gjenvinningen i hvert tilfelle ble beregnet fra stigningen på linjen som representerer TIMP-1 :MMP-9-komplekssignalet som en funksjon av konsentrasjon, der 100 % gjenvinning ble definert som stigningen oppnådd når TIMP-1: MMP-9-komplekset var fortynnet i prøvefortynningsbufferen.

Utviklingen av farge i hver brønn var en lineær funksjon av tid for alle konsentrasjonene av TIMP-1:MMP-9-komplekser målt i disse eksperimentene, med korrelasjonskoeffisienter for de automatisk tilpassede linjene typisk større enn 0,9. Korrelasjonskoeffisienten for 4-parameter-tilpasningen var typisk større enn 0,999.

Spesifikk gjenvinning ble bestemt gjennom tilsetting av økende konsentrasjoner av TIMP-l:MMP-9 til en plasmasammenslåing, og påfølgende måling av det spesifikke signalet.

Seriefortynninger med citrat- og EDTA-plasmasammenslåinger ble utført og kompleksnivåer kvantifisert for å bestemme lineariteten til assayet. Citrat- og EDTA-plasmaer ga alle god linearitet av signaler som en funksjon av fortynning.

Eksempel 3

Fremstilling av et ELISA for å kvantifisere frie TIMP-l-nivåer i plasma.

Det følgende eksempelet beskriver et assay som bestemmer konsentrasjonen av frie TIMP-l-nivåer i kroppsvæsker. Assayet blir anvendt på plasmaprøver fra friske bloddonorer for å etablere normale områder for fri TIMP-1.

Et sensitivt og spesifikt sandwich immunoassay ble bremstilt ved å benytte et TIMP-1 monoklonalt IgGl antistoff (MAC-19) utviklet ved Strangeways Laboratories, England (Cooksley et al, 1990) og et sauepolyklonalt anti-TIMP-1-antistoff. Det sauepolyklonale anti-TIMP-l-antistoffet ble benyttet for antigenerobring, og det murine monoklonale MAC-19 ble benyttet for antigendeteksjon. Et kanin anti-mus-Ig/alkalisk fosfatasekonjugat var det sekundære deteksjonsreagenset (figur 9). Det siste konjugatet ble levert preabsorbert mot humant IgG, og eliminerte dermed kryssreaktivitet med IgG i plasmaprøvene. Det MAC-19 monoklonale antistoffet er fullstendig spesifikt for fri TIMP-1 som derfor er den eneste formen som blir kvantifisert i dette assayet.

For å teste at MAC19 ikke reagerer med komplekser mellom TIMP-1 og MMP-9, ble kaninpolyklonalt anti-MMP-9-antistoff beskrevet i eksempel 2 benyttet for antigenerobring, og det musemonoklonale antistoffet MAC19 for antigendeteksjon. Et kanin anti-mus-Ig/alkalisk fosfatasekonjugat ble benyttet som det sekundære merkede reagenset. Standard TIMP-l:MMP-9-kompleks, fri MMP-9, fri TIMP-1 og en blank kontroll ble studert. Figur 10 viser at TIMP-l:MMP-9-komplekser bundet av det polyklonale anti-MMP-9-antistoffet ikke blir detektert av MAC19. Et tilsvarende eksperiment ble utført der MAC19 ble substituert med MAC15. Figur 11 viser resultatene av dette eksperimentet. Det kan ses at MAC15 detekterer TIMP-1:MMP-9 kompleksbundet av det polyklonale anti-MMP-9-antistoffet.

For å hindre ex vivo-dannelse av TIMP-1 :MMP-komplekser i løpet av prøve-samlingen og assayprosedyrene, ble en proteaseinhibitor (det vil si galardin, baltimastat, marimastat) tilsatt til plasmaprøven etter tining. Tilsetningen av proteaseinhibitoren hindret in vitro kompleksdannelse ved inhibisjon av den katalytiske aktiviteten av metallproteinasene.

96 brønners mikrotiterplater ble belagt i 1 time ved 37 °C med 100 pl/brønn av polyklonalt sau anti-TIMP-1 (5 mg/l) i 0,1 mol/l karbonatbuffer, pH 9,5. Assaybrønnene ble deretter renset to ganger med 200 ul/brønn med SuperBlock-løsning fortynnet 1:1 med fosfatbufret saltløsning (PBS). Mikrotiterplatene ble lagret i opp til 14 dager ved -20 °C. På dagen de skulle brukes ble platene tint ved romtemperatur og vasket 5 ganger i PBS som inneholdt 1 g/l Tween 20. Brønnene ble deretter innkubert i 1 time ved 30 °C med 100 pl/brønn med triplikat 1:25 fortynninger av plasma laget i en prøvebuffer som besto av 50 mol/l fosfat, pH 7,2, 0,1 mol/l NaCI, 10 g/l bovint serum albumin (Fraction V, Boehringer-Mannheim, Penzberg, Tyskland) og 1 g/l Tween 20. Standarder ble fremstilt ved seriefortynning av en stamløsning med renset fri TIMP-1 for å gi konsentrasjoner på 10, 5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,313 og 0,156 ug/l. Inkludert på hver plate var en blank som inneholdt kun prøvefortynningsbuffer og 2 kontroller laget av en citratplasmasammenslåing fortynnet 1:25. En kontrollplasmasammenslåing ble tilsatt som den første prøven på platen, og den andre kontrollen ble tilsatt som den siste. Alle standarder, blanker, kontroller og prøver ble kjørt i triplikat på hver plate for hvert assay. Etter TIMP-l-binding ble brønnene vasket 5 ganger, deretter behandlet i 1 time ved 30 °C med 100 ul/brønn med det rensede murine monoklonale anti-TIMP MAC-19 (0,5 mg/l) i prøvefortynningsbuffer. Etter ytterligere 5 vaskinger ble brønnene innkubert i 1 time ved 30 °C med 100 pl/brønn med kanin anti-mus immunglobulin/alkalisk fosfatasekonjugat fortynnet 1:2000 i prøvefortynningsbuffer. Etter 5 vaskinger med vaskeløsning og 3 vaskinger med destillert vann, ble 100 ul med nylig laget p-nitrofenylfosfat (Sigma, St. Louis, MO) substratløsning (1,7 g/l i 0,1 mol/l Tris.HCl, pH 9,5, 0,1 mol/l NaCI, 5 mmol/l MgCI2) tilsatt til hver brønn, og platen ble plassert i en Ceres 900J plateleser (Bio-Tek Instruments, Winooski, VT) ved 23 °C. Den gule fargeutviklingen ble monitorert automatisk og avlesninger ble utført ved 405 nm mot en luftblank hvert 10. minutt i 1 time. KinetiCalc II programvare ble benyttet for å analysere dataene, for å beregne hastigheten på fargeforandringene for hver brønn (lineær regresjonsanalyse) og for å beregne en 4-parameters tilpasset standardkurve, som den frie TIMP-l-konsentrasjonen for hver plasmaprøve ble beregnet fra.

Disse eksperimentene ble utført i det vesentlige som beskrevet i eksempel 1, men ved å benytte MAC19 i stedet for MAC15 for deteksjon av fri TIMP-1 (som beskrevet over).

108 donorplasmaprøver ble oppnådd. Donorer ga blod på frivillig basis og var alle tilsynelatende friske. Informert samtykke ble oppnådd fra alle bloddonorene og tillatelse ble oppnådd fra den lokale etiske komiteen. Blodprøvetakingen og håndteringen ble utført som beskrevet i eksempel 1.

Utvikling av farge i hver brønn var en lineær funksjon av tid for alle konsentrasjonene av fri TIMP-1 målt i disse eksperimentene, med korrelasjonskoeffisienter for de automatisk tilpassede linjene typisk bedre enn 0,9.

Korrelasjonskoeffisienten for 4-parametertilpasningen var typisk bedre enn 0,999. Intra-assay-variasjonen for 24 triplikatmålinger av kontrollplasmasammenslåing var 9,6 %.

Spesifikk signalgjenvinning ble bestemt ved tilsetning av økende konsentrasjoner med renset TIMP-l-standard til en plasmasammenslåing, og deretter måling av ELISA-signalet. I den fortynnede citratplasmasammenslåingen ble det oppnådd 105 % gjenvinning, mens 96 % gjenvinning ble oppnådd i den fortynnede EDTA-plasmasammenslåingen (figur 12).

Seriefortynninger av citrat- og EDTA-plasmasammenslåinger ble utført og frie TIMP-l-nivåer målt for å teste for lineær reduksjon i ELISA-signaler. Citrat- og EDTA-plasma ga alle god linearitet av signal som en funksjon av fortynning.

Fri TIMP-1 var målbar i alle plasmaprøvene. Midlere fri TIMP-l-konsentrasjon var 70,9 Mg/1 (område: 32,3-169,7 ug/l).

Dette assayet måler direkte plasmafrie TIMP-l-nivåer i plasma. Når man sammenligner frie TIMP-l-nivåer med totale TIMP-l-nivåer (sistnevnte målt med assay beskrevet i eksempel 1) i de 108 friske bloddonorene, ble det oppnådd en korrelasjonskoeffisient på 0,46 (Rho, Spearman Rank, p < 0,0001).

Eksempel 4

Diagnostisk verdi av total TIMP-1 i pasienter med kolorektal kreft.

Totale TIMP-l-nivåer i plasma fra 591 pasienter med kolorektal kreft (338 kolon og 253 rektal) og i plasma fra 108 alders- og kjønnsmessig tilpassede friske individer ble målt med TIMP-l-assayet beskrevet i eksempel 1. TIMP-1-verdiene ble analysert og sammenlignet ved å benytte standard biostatistiske parametere.

591 pasienter som undergikk valgfri kirurgi for patologisk bekreftet kolorektal kreft ble inkludert i studiet. Blodprøver ble oppnådd preoperativt med informert samtykke fra alle pasienter i overensstemmelse med Helsinkideklarasjonen, og tillatelse ble gitt av den lokale etiske komite ved Hvidovre Hospital, Danmark. Alle pasienter hadde patologisk verifisert adenokarsinom i kolon og rektum. Det ble funnet at 59 (10 %) pasienter kunne bli klassifisert til å ha Dukes fase A-sykdom, 219 (37 %) pasienter med Dukes fase B, 170 (29 %) pasienter med Dukes fase C og 143 (24 %) pasienter med Dukes fase D. 338 tumorer var kolonkreft og 253 var rektalkreft. Kliniske data så som alder, kjønn og overlevelse etter kirurgi ble samlet. Den midlere alderen til pasientene var 69 år (varierte fra 33 til 90 år) med 237 kvinner og 354 menn representert i pasientgruppen.

En annen pasientgruppe ble samlet prospektivt. Denne gruppen besto av 21 pasienter med rektalkreft og 43 pasienter med kolonkreft. Der var 11 pasienter med Dukes fase A, 27 med Dukes fase B, 14 med Dukes fase C og 13 med Dukes fase D-sykdom.

Den samme donorpopulasjonen som beskrevet i eksempel 3.

Blodprøver (5 ml) ble samlet preoperativt fra alle pasienter på dagen for kirurgi. For å sikre gyldige TIMP-l-målinger ble perifert blod tatt med minimumsstase og samlet i EDTA antikoaguleringsrør (Becton-Dickinson, Mountain View, CA) i overensstemmelse med en tidligere beskrevet protokoll (eksempel 1).

TIMP-l-nivåer ble målt i EDTA-plasma prøver ved å benytte assayet beskrevet i eksempel 1.

Ved å benytte et kinetisk hastighetsassay ble TIMP-l-nivåer bestemt i alle pasienter og friske donorplasmaprøver. Hver plasmaprøve hadde målbare nivåer av TIMP-1, med en midlere total TIMP-l-verdi for de 591 pasientene med kolorektal kreft på 141,1 ug/l (område 53,7-788,7 ug/l). Når gruppert i kolon- og rektalkreft, var middelverdiene 158,6 ug/l (område: 53,7-788,7 ug/l) for kolon og 126,3 (område: 64,1-640,1 ug/l) for rektalkreft. Det var en statistisk signifikant forskjell i TIMP-l-nivåer når pasientmaterialet ble gruppert i henhold til Dukes fase, der Dukes A var den laveste og Dukes D den høyeste (Kruskal-Wallis-test, P

< 0,0001). Imidlertid var de høyeste TIMP-l-nivåene ikke begrenset til langt-kommet sykdom, og ingen signifikant forskjell i totale plasma TIMP-l-nivåer ble sett blant pasienter med Dukes A-C-sykdom. En relativt svak korrelasjon mellom plasma TIMP-1 og alder ble funnet (r = 0,35; p < 0,0001). Det var ingen signifikant forskjell i TIMP-l-nivåer mellom menn og kvinner (p = 0,97).

Det midlere TIMP-l-nivået i plasma fra friske donorer var 88,6 ug/l med et område fra 51,0-156,2 ug/l. Det var en høy statistisk forskjell i de totale plasma TIMP-l-verdiene mellom pasientene med kolorektal kreft og de friske bloddonorene.

Den midlere TIMP-l-verdien for de 64 pasientene med kolorektal kreft var 138,2 Mg/I (område: 80,7-790,6 \ ig/\). Gruppering av pasientene i kolon- og rektal kreft, de midlere totale TIMP-l-verdier var 152,2 Mg/I (område: 80,7-626,2 Mg/I) for kolon og 133,6 (område: 84,3-790,6 \ ig/\) for rektalkreft. Det var en høy statistisk forskjell i de totale plasma TIMP-l-verdiene mellom pasientene med kolon- og rektalkreft hver sammenlignet med friske bloddonorer.

Ved å benytte de målte totale TIMP-l-nivåene i plasma fra friske donorer og de 591 pasientene med kolorektal kreft, ble det oppnådd Receiver Operation Characteristics (ROC) kurver for å evaluere den diagnostiske verdien av total TIMP-1. Som det kan ses i figur 13 var ROC-kurven bratt, noe som indikerer en høy sensitivitet og spesifisitet for total TIMP-1 som en markør for kolorektal kreft. Det synes som om AUC er større for kolonkreft enn for rektalkreft. Figur 14 viser en lignende ROC-kurve som nå kun inkluderer pasienter med tidlig fase kolorektal kreft, det vil si Dukes fase A- eller B-sykdom. Også vist er ROC-kurven for tidlig fase (Dukes fase A og B) høyresidig kolonkreft.

Ved å benytte de totale TIMP-l-nivåene i plasma fra friske donorer og i den andre gruppen av 64 pasienter med kolorektal kreft, ble ROC-kurver igjen konstruert for å bekrefte den diagnostiske verdien av TIMP-1. Som det kan ses i figur 15 var kurven initielt bratt, noe som indikerer en høy sensitivitet og spesifisitet for total TIMP-1 som en markør for kolorektal kreft.

En ytterligere studie på 180 friske bloddonorer og 20 pasienter med kolorektal kreft, ved å benytte forskjellige antistoffer (anti TIMP-1 11E/C6, anti-TIMP-1 RRU-T6) (disse to klonene som produserer antistoffer var deponert 10. april 2000 ved ATTC) i et automatisert immunoassay, understøttet ytterligere de tidligere kliniske resultatene. Videre viste de absolutte verdiene generert fra det automatiserte assayet en høy grad av korrelasjon med de som ble oppnådd ved assayet beskrevet i eksempel i (r = 0,9).

Disse dataene tyder på at totale TIMP-l-målinger i plasma kan bli benyttet som en screeningsprosedyre som hjelp i å identifisere pasienter med en høy risiko for å ha kolorektal kreft. Spesielt var total TIMP-1 like effektiv i å identifisere pasienter med tidlig kreft (Dukes fase A+B) som til å identifisere pasienter med mer frem-skreden sykdom. Videre var total TIMP-1 til og med mer effektiv til å identifisere pasienter med tidlig fase, høyresidig kolonkreft, en diagnose som er vanskelig med tradisjonelle diagnostiske prosedyrer. Høyresidig kolonkreft kan ikke bli visualisert ved fleksibel sigmoidoskopi, en standard kolonkreftscreenings-metodologi. Den har en mer lunefull start enn venstresidige skader, og kliniske symptomer utvikler seg kun i senfasesykdom. Tidlig diagnose av høyresidig kolonkreft har potensiale til å redusere dødeligheten ved denne sykdommen. Videre underbygger de mindre, prospektive forsøkende resultatene til det større retrospektive studiet, noe som ytterligere bekrefter den diagnostiske verdien av total TIMP-1 i pasienter som lider av kolorektal kreft.

Eksempel 5

Kvantifisering av total TIMP-1 i plasma fra pasienter med inflammatorisk tarmsykdom. 46 pasienter med IBD (inflammatorisk tarmsykdom) ble inkludert i studiet. 22 pasienter hadde ulcerøs kolitt og 24 pasienter hadde Crohns sykdom. De totale TIMP-l-nivåene i EDTA-plasma fra friske bloddonorer og pasienter med kolorektal kreft (eksemplene 3 og 4) ble inkludert for sammenligning.

Totale TIMP-l-nivåer ble målt i EDTA-plasmaprøvene ved å benytte sandwich-assayet beskrevet i eksempel 1.

De målte totale TIMP-l-verdiene er vist i tabell 2.

Det var ingen signifikant forskjell når totale TIMP-l-verdier fra pasienter med IBD og friske bloddonorer ble sammenlignet (Mann-Whitney; p = 0,45). Det var en høy signifikant forskjell mellom totale plasma TIMP-l-nivåer mellom pasienter med IBD og de 591 pasientene med kolorektal kreft (Mann-Whitney; p < 0,0001). En grafisk representasjon av disse resultatene er avtegnet i figur 16.

Disse resultatene viser at pasienter med kolorektal kreft har signifikant høyere totale TIMP-l-plasmanivåer enn pasienter med IBD. Videre hadde pasienter med IBD totale TIMP-l-nivåer ekvivalente til de som er funnet i friske bloddonorer, noe som viser at plasma total TIMP-1 kan bli benyttet som en svært sensitiv og spesifikk markør for å skille mellom godartede og ondartede sykdommer i gastrointestinal traktus.

Eksempel 6

Diagnostisk verdi av total TIMP-1 i kombinasjon med CEA i pasienter med kolorektal kreft.

Total TIMP-1 i plasma fra 591 pasienter med kolorektal kreft (338 kolon og 253 rektal) og i plasma fra 108 alders- og kjønnstilpassede friske individer ble målt ved å benytte TIMP-l-assayet beskrevet i eksempel 1. I tillegg ble CEA målt i de korresponderende pasientene og donorserumprøver ved å benytte et kommersielt tilgjengelig kjemiluminescerende CEA EIA-sett (Immulite CEA, DPC©, Los Angeles, California, USA). TIMP-1- og CEA-verdiene fra friske donorer og kreftpasienter ble kombinert ved logistikkregresjonsanalyse og ROC-kurver ble generert.

Å beregne sensitiviteten og spesifisiteten til CEA i 591 pasienter med kolorektal kreft når man inkluderte de 108 friske donorene førte til en cut-off som tilveie-brakte 98 % spesifisitet til en sensitivitet på 35 %. Når pasientene ble gruppert i kolon- eller rektalkreft, var sensitiviteten henholdsvis 37 % og 33 % med det samme nivået av spesifisitet. Ved kun å inkludere pasienter med høyresidig kolonkreft, er det vist i figur 17 at sensitiviteten økte til 45 %.

Når de totale TIMP-l-verdiene fra eksempel 4 blir inkludert sammen med CEA, ble sensitiviteten av markørkombinasjonen funnet ved logistikkregresjonsanalyse å være 52 %. Den ytterligere diagnostiske sensitiviteten oppnådd ved addisjonen av CEA-målinger i serum er svært signifikant (p < 0,0001). Når pasientene ble delt i grupper på kolon- og rektalkreft, var sensitiviteten henholdsvis 61 % og 39 %, ved 98 % spesifisitetsnivå. Inkludert kun pasienter med høyresidig kolonkreft var sensitiviteten 74 %. En grafisk illustrasjon av disse resultatene fremgår av figur 17.

Disse dataene viser at ved å addere en ytterligere markør, kan det oppnås en forbedring i den diagnostiske sensitiviteten av total TIMP-1, mens man opprett-holder en høy spesifisitet på 98 %. Således kan kombinasjonen av CEA og TIMP-1 være nyttig som en screeningsprosedyre for å identifisere pasienter med en høy risiko for å ha kolorektal kreft. Spesielt var denne kombinasjonen effektiv for å identifisere pasienter med tidlig fase kreft (Dukes fase A+B). Denne kombinasjonen var også svært effektiv for å identifisere pasienter med tidlig fase, høyresidig kolonkreft.

Eksempel 7

Mangel på diagnostisk verdi av plasmafrie TIMP-l-verdier i pasienter med kolorektal kreft.

Frie TIMP-l-nivåer i plasma fra 64 pasienter med kolorektal kreft (43 kolon og 21 rektal) og i plasma fra 108 alderstilpassede, friske individer ble målt ved å benytte TIMP-l-assayet beskrevet i eksempel 3. De frie TIMP-l-verdiene ble analysert og sammenlignet ved å benytte standard biostatistiske parametere.

Ved å benytte kinetisk hastighets-ELISA som beskrevet i eksempel 3, ble frie TIMP-l-nivåer målt i alle pasienter og friske donorplasmaprøver. Alle prøver hadde målbare nivåer av TIMP-1, med en midlere fri TIMP-l-verdi på 82,0 ug/l

(område: 44,7-424,0 ug/l) for pasientene med kolorektal kreft. Midlere fri TIMP-1-nivå i plasma fra friske donorer var 70,9 ug/l, med et område på 32,3-169,7 ug/l. Mens ingen signifikant forskjell i frie TIMP-l-nivåer ble funnet blant pasienter med Dukes fase A-C-sykdom, hadde pasienter med Dukes fase D signifikant forhøyede

frie TIMP-l-nivåer sammenlignet med pasienter med Dukes fase A- og B-sykdom. Når man sammenlignet totale TIMP-l-verdier med frie TIMP-l-verdier i plasma fra disse 64 pasientene med kolorektal kreft, ble det funnet en korrelasjonskoeffisient på 0,91 (Rho, Spearman Rank, p < 0,001).

Figur 18 viser ROC-kurvene generert fra plasmamålingene av fri TIMP-1. AUC er 0,61 når man bestemmer den diagnostiske utførelsen av fri TIMP-1.

Disse dataene viser at fri TMP-1 alene sannsynligvis ikke er nyttig som screeningsmarkør for å identifiser pasienter med høy risiko for å ha kolorektal kreft.

Eksempel 8

Diagnostisk verdi av TIMP-l:MMP-9-kompleksmålinger i pasienter med kolorektal kreft.

TIMP-1 :MMP-9-kompleksnivåer i plasma fra pasienter med kolorektal kreft og i plasma fra alders- og kjøn nsti I passede friske individer kan bli målt ved å benytte TIMP-1 :MMP-9-assayet beskrevet i eksempel 2. TIMP-l:MMP-9-kompleksverdier fra friske donorer og kreftpasienter kan bli sammenlignet og de diagnostiske verdiene bestemt.

Ved å benytte de målte verdiene for fri, total og TIMP-1 :MMP-9-kompleksnivåer, kan den diagnostiske verdien av forhold eller fraksjoner bli beregnet. I tillegg kan andre molekyler, for eksempel serum CEA bli addert til disse beregningene for å generere matematiske algoritmer for å øke den totale diagnostiske verdien.

Eksempel 9

Diagnostisk verdi av kombinasjonen av plasma total TIMP-1 og plasma fri TIMP-1 i pasienter med kolorektal kreft.

Totale TIMP-l-nivåer i plasma fra 64 pasienter med kolorektal kreft og i plasma fra 108 alders- og kjøn nsti I passede friske individer ble målt med TIMP-l-assayet beskrevet i eksempel 1. Ved å benytte assayet beskrevet i eksempel 3, ble plasmafrie TIMP-l-nivåer målt i de samme individene som beskrevet over. De totale og de frie TIMP-l-verdiene ble analysert og sammenlignet ved å benytte logistikkregresjonsanalyse. 64 pasienter som undergikk frivillig kirurgi for patologisk bekreftet kolorektal kreft var inkludert i studiet. Denne gruppen besto av 21 pasienter med rektal kreft og 43 pasienter med kolonkreft. Det var 11 pasienter med Dukes fase A, 27 med Dukes fase B, 14 med Dukes fase C og 13 med Dukes fase D-sykdom. Blodprøver ble oppnådd preoperativt med informert samtykke fra alle pasienter i overensstemmelse med Helsinkideklarasjonen, og tillatelse ble gitt av den lokale etiske komiteen ved Hvidovre Hospital, Danmark. Alle pasienter hadde patologisk verifiserte adenocarcinoma i kolon eller rektum. Kliniske data så som alder, kjønn og overlevelse etter kirurgi ble samlet.

Friske donorer: Den samme donorpopulasjonen som beskrevet i eksempel 3.

Blodprøver (5 ml) ble samlet preoperativt fra alle pasienter på dagen for kirurgi. For å sikre korrekte TIMP-l-målinger ble perifert blod tatt med minimale staser og samlet i EDTA antikoaguleringsrør (Becton-Dickinson, Mountain View, CA) i overensstemmelse med en tidligere beskrevet protokoll (eksempel 1).

TIMP-l-nivåer ble målt i EDTA plasmaprøver ved å benytte assayene beskrevet i eksempel 1 og i eksempel 3.

De totale TIMP-l-nivåer i disse 64 pasientene med kolorektal kreft er beskrevet i eksempel 4, og de frie TIMP-l-nivåene i disse pasientene er beskrevet i eksempel 7.

Ved å benytte de totale og de frie TIMP-l-nivåene i plasma fra friske donorer og fra de 64 pasientene med kolorektal kreft, ble ROC-kurver konstruert for hver av disse TIMP-l-formene. De totale TIMP-l-verdiene oppnådd bekrefter den diagnostiske verdien av totale TIMP-l-målinger i pasienter med kolorektal kreft. Som det kan ses i figur 15, var kurven igjen initielt bratt, noe som indikerer en høy sensitivitet og spesifisitet av total TIMP-1 som en markør for kolorektal kreft. ROC-kurven for fri TIMP-1 var diskutert i eksempel 7.

De korresponderende dataene for total TIMP-1 i denne pasientpopulasjonen ga en AUC på 0,88 Imidlertid ble en økning i diagnostisk verdi oppnådd når man kombinerte fri og total TIMP-1 (AUC = 0,94). Denne økningen er statistisk svært signifikant, p < 0,0001, og viser verdien av den viktige utformingen ved å benytte både fri og total TIMP-1 i den samme analysen.

Disse dataene tyder på at kombinasjonen av totale TIMP-1- og frie TIMP-l-målinger i plasma kan bli benyttet som en screeningsprosedyre for å hjelpe til med identifiseringen av pasienter med en høy risiko for å ha kolorektal kreft.

På tilsvarende måte som beskrevet i det foreliggende eksempelet kan andre forhold og/eller kombinasjoner eller matematiske permutasjoner mellom frie og totale TIMP-l-verdier bli beregnet og benyttet for diagnostiske hensikter.

Beregninger av forhold mellom de ulike formene av TIMP-1, inkludert total og fri TIMP-1, total konsentrasjon av komplekser (total TIMP-l-fri TIMP-1), og/eller konsentrasjonen av TIMP-l:MMP-9, kan være ekstremt nyttige i håndteringen og spesielt i de forskjellige diagnosene av pasienter med godartede sykdommer og pasienter med kreft.

Eksempel 10

Mangel på diagnostisk verdi av totale TIMP-l-målinger i pasienter med primær (fase I og II) brystkreft.

Ved å benytte det totale TIMP-l-assayet beskrevet i eksempel 1, ble preoperative plasmaprøver fra 322 pasienter med primær brystkreft analysert for totalt TIMP-1- innhold. I tillegg ble 108 plasmaprøver fra friske bloddonorer evaluert. Den totale midlere TIMP-1 for brystkreftpasienter var 88,3 ug/l (område: 45,5-289,3 ug/l) med midlere totalt TIMP-l-nivå for friske bloddonorer var 88,9 ug/l (område: 51,0-156,2 ug/l). Det var ingen statistisk signifikant forskjell i totale TIMP-1 plasmanivåer mellom de to gruppene (Mann-Whitney, p = 0,87). Figur 19 viser en ROC-kurve som inkluderer de ovennevnte dataene.

Disse dataene viser at pasienter med primær brystkreft har totale TIMP-l-verdier som ikke er signifikant forskjellige fra de til friske bloddonorer. Således støtter disse dataene spesifisiteten av TIMP-l-målinger i diagnostiseringen av pasienter med kolorektal kreft.

Eksempel 11

Diagnostisk verdi av plasma total TIMP-1 i pasienter med metastatisk (fase IV) brystkreft.

Dette eksempelet beskriver totale TIMP-l-bestemmeiser fra pasienter med brystkreft i fase IV.

Blod ble samlet fra 19 pasienter med brystkreft i fase IV (alder 45 til 70 år) ved Onkologiavdelingen, Herlev Universitetshospital, København, Danmark, og fra 87 friske kvinnelige bloddonorer (eksempel 1).

Totale TIMP-l-nivåer ble målt i alle EDTA-plasmaprøvene ved å benytte assayet beskrevet i eksempel 1.

Total TIMP-1 ble målt i EDTA-plasmaprøver fra 19 brystkreftpasienter med sykdom i fase IV. Disse nivåene ble sammenlignet med totale TIMP-l-nivåer i 87 friske kvinnelige donorer. Gjennomsnittet, totalt TIMP-l-nivå målt i de 19 brystkreftpasientene var 292 ±331 ug/l (middelverdi: 236 ug/l), sammenlignet med et gjennomsnitt, totalt TIMP-l-nivå på 63,5 ± 10,5 ug/l (middelverdi: 62,0 ug/l) i 87 friske kvinnelige donorer. En Wald-Wolfowitz-kjøringstest indikerte en svært signifikant forskjell (p < 0,0001) mellom pasient totale TIMP-l-nivåer og de til friske donorer. Figur 20 viser et persentilplott av totale TIMP-l-nivåer fra de 19 brystkreftpasientene og TIMP-l-nivåene funnet i plasma fra de 87 friske kvinnelige donorene.

Disse dataene viser at plasma TIMP-l-målinger kan bli benyttet for å monitorere brystkreftpasienter for tilbakekomst av sykdom.

Eksempel 12

Diagnostisk verdi av TIMP-2-målinger i pasienter med kolorektal kreft.

TIMP-2-nivåer ble målt med et innomhus TIMP-2-assay i plasma fra 64 pasienter med kolorektal kreft (43 kolon og 21 rektal) og i plasma fra 108 alderstilpassede friske individer. De målte TIMP-2-verdiene fra friske donorer og kreftpasienter ble sammenlignet.

TIMP-2 var målbar i alle prøver. Ingen signifikante forskjeller i TIMP-2-nivåer ble funnet mellom friske donorer og pasienter med kolorektal kreft.

Disse dataene støtter spesifisiteten til TIMP-l-målinger i diagnostiseringen av pasienter med kolorektal kreft, noe som støtter den unike verdien av TIMP-1 som en hjelp i tidlig diagnostisering av kolorektal kreft.

REFERANSER

Baker T, Tickle S, Wasan H, Docherty A, Isenberg D & Waxman J (1994) Serum metalloproteinases and their inhibitors: markers for malignant potential. Br. J. Cancer 70, 506-512.

Birkedal-Hansen H, Moore WG, Bodden MK, Windsor LJ, Birkedal-Hansen B, DeCarlo A & Engler JA (1993) Matrix metalloproteinases: a review. Crit. Rev. Oral Biol. Med. 4, 197-250.

Clark IM, Powell LK, Wright JK & Cawston TE (1991) Polyclonal and monoclonal anti-bodies against human tissue inhibitor of metalloproteinases (TIMP) and the design of an enzyme-linked immunosorbent assay to measure TIMP. Matrix 11, 76-85.

Cooksley S, Hipkiss JB, Tickle SP, Holmes IE, Docherty AJ, Murphy G & Lawson AD

(1990) Immunoassays for the detection of human collagenase, stromelysin, tissue inhibitor of metalloproteinases (TIMP) and enzyme-inhibitor complexes. Matrix 10, 285-291.

Cooper TW, Eisen AZ, Stricklin GP & Welgus HG (1985) Platelet-derived collagenase inhibitor: characterization and subcellular localization. Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 82, 2779-2783.

DeClerk YA, Perez N, Shimada H, Boone TC, Langley KE & Taylor SM (1992) Inhibition of invasion and metastasis in cells transfected with an inhibitor of metalloproteinases. Cancer Res. 701-708.

Fujimoto N, Zhang J, Iwata K, Shinya T, Okada Y & Hayakawa T (1993) A one-istep sandwich enzyme immunoassay for tissue inhibitor of metalloproteinases-2 using monoclonal antibodies. Clin. Chim. Acta 220, 31-45.

Goldberg GI, Strongin A, Collier IE, Genrich LT & Marmer BL (1992) Interaction of 92-kDa type IV collagenase with the tissue inhibitor of metalloproteinases prevents dimerization, complex formation with interstitial collagenase, and activation of the proenzyme with stromelysin. J. Biol. Chem. 267, 4583-4591

Hembry RM, Murphy G & Reynolds JJ (1985) Immunolocalization of tissue inhibitor of metalloproteinases (TIMP) in human cells. Characterization and use of a specific antiserum. J. Cell Sei. 73, 105-119.

Holten-Andersen M, Murphy G, Nielsen HJ, Pedersen AN, Christensen IJ, Høyer-Hansen G, Briinner N and Stephens RW (1999) Quantitation of TIMP-1 in plasma of healthy blood donors and patients with advanced cancer. Br J Cancer 80, 495-503.

Jung K, Nowak L, Lein M, Priem F, Schnorr D, Loening SA (1997) Matrix metalloproteinases 1 and 3, tissue inhibitor of metalloproteinase-1 and the complex of metalloproteinase-l/tissue inhibitor in plasma of patients with prostate cancer. Int. J. Cancer 74, 220-223.

Jung K, Nowak L, Lein M, Henke W, Schnorr D & Loening SA (1996) What kind of specimen should be selected for determining tissue inhibitor of metalloproteinase-1 (TIMP-1) in blood? [letter]. Clin. Chim. Acta 254, 97-100.

Jung K, Nowak L, Lein M, Henke W, Schnorr D & Loening SA (1996) Role of specimen collection in preanalytical variation of metalloproteinases and their inhibitors in blood. Clin. Chem. 42, 2043-2045.

Keyszer G, Lambiri I, Nagel R, Keysser C, Keysser M, Gromnica-Ihle E, Franz J, Burmester GR, Jung K (1999) Circulating levels of matrix metalloproteinases MMP-3 and MMP-1, tissue inhibitor of metalloproteinases 1 (TIMP-1) and MMP-l/TIMP-1 complex in rheumatic disease. Correlation with clinical activity of rheumatoid arthritis versus other surrogate markers. J. Rheum. 26, 251-258.

Kjeldsen L, Bjerrum OW, Askaa J, Borregaard N (1992) Subcellular localization and release of human neutrophil gelatinase, confirming the existence of separate gelatinase-containing granules. Biochem. J. 287, 603-610.

Khokha R & Waterhouse P (1993) The role of tissue inhibitor of metalloproteinase-1 in specific aspects of cancer progression and reproduction. J. Neurooncol. 18, 123-127.

Khokha R, Zimmer MJ, Graham CH, Lala PK & Waterhouse P (1992a) Suppression of invasion by inducible expression of tissue inhibitor of metalloproteinase-1 (TIMP-1) in B16-F10 melanoma cells. J. Nati. Cancer Inst. 84, 1017-1022.

Khoka R, Zimmer MJ, Wilson SM & Chambers AF (1992b) Up-regulation of TIMP-1 expression in B16-F10 melanoma cells suppresses their metastatic ability in chick embryo. Clin. Exp. Metastasis 10, 365-370.

Kleiner Jr DE, Tuuttila A, Tryggvason K & Stetler-Stevenson WG (1993) Stability analysis of latent and active 72-kDa type IV collagenase: the role of tissue inhibitor of metalloproteinases-2 (TIMP-2). Biochemistry 32, 1583-1592.

Kodama S, Yamashita K, Kishi J, Iwata K & Hayakawa T (1989) A sandwich enzyme immunoassay for collagenase inhibitor using monoclonal antibodies. Matrix 9, 1-6.

Liotta LA, Steeg PS & Stetler-Stevenson WG (1991) Cancer metastasis and angiogenesis: an imbalance of positive and negative regulation. Cell 64, 327-336.

MacDougall JR & Matrisian LM (1995) Contributions of tumor and stromal matrix metalloproteinases to tumor progression, invasion and metastasis. Cancer Metastasis Rev. 14, 351-362.

Matrisian LM (1992) The matrix-degrading metalloproteinases. Bioessays 14, 455-463.

Mimori K, Mori M, Shiraishi T, Fujie T, Baba K, Haraguchi M, Abe R, Ueo H & Akiyoshi T (1997) Clinical significance of tissue inhibitor of metalloproteinase expression in gastric carcinoma. Br. J. Cancer 76, 531-536.

Moll UM, Youngleib GL, Rosinski KB & Quigley JP (1990) Tumor promoter-stimulated Mr 92,000 gelatinase secreted by normal and malignant human cells: isolation and characterization of the enzyme from HT1080 tumor cells. Cancer Res. 50, 6162-6170.

Moutsiakis D, Mancuso P, Krutzsch H, Stetler-Stevenson WG & Zucker S (1992) Characterization of metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in human plasma. Connect. Tissue Res. 28, 213-230.

Murphy G, Houbrechts A, Cockett MI, Williamson RA, 0'Shea M & Docherty AJ

(1991) The N-terminal domain of tissue inhibitor of metalloproteinases retains metalloproteinase inhibitory activity [published erratum appears in Biochemistry 1991 Oet 22; 30(42): 10362]. Biochemistry 30, 8097-8102.

Stetler-Stevenson WG, Hewitt R & Corcoran M (1996) Matrix metalloproteinases and tumor invasion: from correlation and causality to the clinic. Semin. Cancer Biol. 7, 147-154.

Stetler-Stevenson WG, Krutzsch HC & Liotta LA (1989) Tissue inhibitor of metalloproteinase (TIMP-2). A new member of the metalloproteinase inhibitor family. J. Biol. Chem. 264, 17274-17378.

Stetler-Stevenson WG, Liotta LA & Kleiner Jr DE (1993) Extracellular matrix 6: role of matrix metalloproteinases in tumor invasion and metastasis. FASEB J. 7, 1434-1441.

Thorgeirsson UP, Lindsay CK, Cottam DW & Gomez DE (1993) Tumor invasion, proteolysis, and angiogenesis. J. Neurooncol. 18, 89-103.

Welgus HG, Jeffrey JJ, Eisen AZ, Roswit WT & Stricklin GP 81985) Human skin fibroblast collagenase: interaction with substrate and inhibitor. Coll. Relat. Res. 5, 167-179.

Wilhelm SM, Collier IE, Marmer BL, Eisen AZ, Grant GA & Goldberg GI (1989) SV40-transformed human lung fibroblasts secrete a 92-kDa type IV collagenase which is identical to that secreted by normal human macrophages [published erratum appears in J boil Chem 1990 Dec 25; 265(36): 22570]. J. Biol. Chem. 264, 17213-17221.

Zucker S, Lysik RM, DiMassimo BI, Zarrabi HM, Moll UM, Grimson R, Tickle SP & Docherty AJ (1995) Plasma assay of gelatinase B: tissue inhibitor of metalloproteinase complexes in cancer. Cancer 76, 700-708.

Claims

1. Fremgangsmåte for å bestemme hvorvidt et individ sannsynligvis har kolorektal kreft, karakterisert ved at fremgangsmåten omfatter å bestemme en første parameter som representerer enten a) den totale konsentrasjonen av TIMP-1 i plasmaprøver, eller b) kombinasjonen av konsentrasjonen av total TIMP-1 med konsentrasjonen av fri TIMP-1 i plasmaprøver, og som indikerer at det er stor sannsynlighet for at individet har kolorektal kreft dersom parameteren er ved eller over en diskriminerende verdi, og som indikerer at det er lite sannsynlig at individet har kolorektal kreft dersom parameteren ikke er ved eller over den diskriminerende verdien, nevnte diskriminerende verdi blir bestemt ved å måle nevnte i det minste ene første parameter i både en frisk kontrollpopulasjon og en populasjon med kjent kolorektal kreft, og derved bestemme den diskriminerende verdien som identifiserer kreftpopulasjonen med en forutbestemt spesifisitet eller en forutbestemt sensitivitet.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at kombinasjonen blir utført ved logistikkregresjonsanalyse.

3. Fremgangsmåte som angitt i et hvilket som helst av de foregående kravene, karakterisert ved at den ytterligere omfatter å bestemme minst en andre parameter, der den andre parameteren representerer konsentrasjonen av en ytterligere markør forskjellig fra en hvilken som helst form av TIMP-1, i en kroppsvæskeprøve fra individet.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 3, karakterisert ved at den første parameteren som representerer konsentrasjonen av TIMP-1 i plasmaprøver og den i det minste ene andre parameteren som er forskjellig fra en hvilken som helst form av TIMP-1, blir kombinert for å resultere i en kombinert parameter, og indikerer at det er stor sannsynlighet for at individet har kolorektal kreft dersom den kombinerte parameteren er ved eller over en diskriminerende verdi, og indikerer at det er lite sannsynlig at individet har kolorektal kreft dersom den kombinerte parameteren ikke er ved eller over den diskriminerende verdien.

5. Fremgangsmåte som angitt i krav 4, karakterisert ved at kombineringen blir utført ved logistikkregresjonsanalyse.

6. Fremgangsmåte som angitt i krav 4 eller 5, karakterisert ved at den diskriminerende verdien til den kombinerte parameteren er en verdi som er blitt bestemt ved å bestemme nevnte kombinerte parameter i både en frisk kontrollpopulasjon og en populasjon med kjent kolorektal kreft, for derved å bestemme den diskriminerende verdien som identifiserer kreftpopulasjonen med en forutbestemt spesifisitet eller en forutbestemt sensitivitet.

7. Fremgangsmåte som angitt i et hvilket som helst av kravene 3-6, karakterisert ved at den i det minste ene andre parameteren som blir bestemt er en parameter som representerer konsentrasjonen av en tumormarkør.

8. Fremgangsmåte som angitt i krav 7, karakterisert ved at tumormarkøren er valgt fra gruppen som består av CEA, løselig u-PAR, katepsin B, HER2-neu, CA15-3 og YKL-40.

9. Fremgangsmåte som angitt i krav 8, karakterisert ved at den i det minste ene andre parameteren som blir bestemt er konsentrasjonen av CEA.

10. Fremgangsmåte som angitt i et hvilket som helst av de foregående kravene, karakterisert ved at individet er et medlem av en ikke-selektert populasjon.

11. Fremgangsmåte som angitt i et hvilket som helst av de foregående kravene, karakterisert ved at individet er et medlem av en populasjon som allerede er identifisert til å ha en økt risiko for å utvikle kolorektal kreft.

12. Fremgangsmåte for å bestemme hvorvidt det er sannsynlig at en pasient som har blitt behandlet for primær brystkreft har metastatisk brystkreft, karakterisert ved at den omfatter å bestemme en første parameter som representerer enten a) den totale konsentrasjonen av TIMP-1 i plasmaprøver, eller b) kombinasjonen av total TIMP-1 med konsentrasjonen av fri TIMP-1 i plasmaprøver, og som indikerer at det er stor sannsynlighet for at individet vil få metastatisk brystkreft dersom parameteren er ved eller over en diskriminerende verdi og som indikerer at det er lite sannsynlig at individet har metastatisk brystkreft dersom parameteren ikke er ved eller over den diskriminerende verdien, nevnte diskriminerende verdi blir bestemt ved å måle nevnte i det minste en første parameter i både en frisk kontrollpopulasjon og en populasjon med kjent metastatisk brystkreft og derved bestemme den diskriminerende verdien som identifiserer kreftpopulasjonen med en forutbestemt spesifisitet eller en forutbestemt sensitivitet.

13. Fremgangsmåte som angitt i krav 12, karakterisert ved at kombinasjonen blir utført ved logistikkregresjonsanalyse.

14. Fremgangsmåte som angitt i krav 12 eller 13, karakterisert ved at den ytterligere omfatter å bestemme i det minste en andre parameter, der den andre parameteren representerer konsentrasjonen av en ytterligere markør forskjellig fra en hvilken som helst form av TIMP-1, i en kroppsvæskeprøve fra individet.

15. Fremgangsmåte som angitt i krav 14, karakterisert ved at den første parameteren som representerer konsentrasjonen av TIMP-1 i plasmaprøver og den i det minste ene andre parameteren forskjellig fra en hvilken som helst form av TIMP-1, blir kombinert for å resultere i en kombinert parameter, og som indikerer en stor sannsynlighet for at individet har metastatisk kreft dersom den kombinerte parameteren er ved eller over en diskriminerende verdi, og som indikerer det som lite sannsynlig at individet har metastatisk kreft dersom den kombinerte parameteren ikke er ved eller over den diskriminerende verdien.

16. Fremgangsmåte som angitt i krav 15, karakterisert ved at kombineringen blir utført ved logistikkregresjonsanalyse.

17. Fremgangsmåte som angitt i krav 15 eller 16, karakterisert ved at den diskriminerende verdien til den kombinerte parameteren er en verdi som er blitt bestemt ved å bestemme nevnte kombinerte parameter i både en frisk kontrollpopulasjon og en populasjon med kjent metastatisk kreft, og derved bestemme den diskriminerende verdien som identifiserer den metastatiske kreftpopulasjonen med en forutbestemt spesifisitet eller en forutbestemt sensitivitet.

18. Fremgangsmåte som angitt i et hvilket som helst av kravene 14-17, karakterisert ved at den i det minste ene andre parameteren som er bestemt er en parameter som representerer konsentrasjonen av en tumormarkør.

19. Fremgangsmåte som angitt i krav 18, karakterisert ved at tumormarkøren er valgt fra gruppen som består av CEA, løselig u-PAR, katepsin B, HER2-neu, CA15-3 og YKL-40.

20. Fremgangsmåte som angitt i krav 19, karakterisert ved at den i det minste ene andre parameteren som er bestemt er konsentrasjonen av CEA.

21. Fremgangsmåte som angitt i et hvilket som helst av kravene 12-20, karakterisert ved at bestemmelsen blir utført ved flere tidspunkter ved intervaller, som del av en monitorering av en kreftpasient etter behandlingen for primærkreft.

22. Fremgangsmåte som angitt i et hvilket som helst av kravene 1-11, karakterisert ved at den blir benyttet for å detektere tidlig fase kolorektal kreft.

23. Fremgangsmåte som angitt i krav 22, karakterisert ved at den tidlige fase kolorektale kreften er valgt fra gruppen som består av kolonkreft Dukes fase A, kolonkreft Dukes fase B, kolonkreft Dukes fase C, rektalkreft Dukes fase A, rektalkreft Dukes fase B og rektalkreft Dukes fase C.

24. Fremgangsmåte som angitt i et hvilket som helst av de foregående kravene, karakterisert ved at konsentrasjonsbestem meisen blir utført ved hjelp av et immunoassay eller et aktivitetsassay.

25. Fremgangsmåte som angitt i krav 24, karakterisert ved at immunassayet er et ELISA.

26. Fremgangsmåte som angitt i krav 24, karakterisert ved at aktivitetsassayet er zymografi.