JPH08136548A - 泌尿器癌の診断法 - Google Patents
泌尿器癌の診断法Info
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- JPH08136548A JPH08136548A JP30161694A JP30161694A JPH08136548A JP H08136548 A JPH08136548 A JP H08136548A JP 30161694 A JP30161694 A JP 30161694A JP 30161694 A JP30161694 A JP 30161694A JP H08136548 A JPH08136548 A JP H08136548A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 泌尿器癌を容易に診断する方法を提供するこ
と。 【構成】 尿中のティッシュー・インヒビター・オブ・
メタロプロテイナーゼ−１（ＴＩＭＰ−１）を定量する
ことを特徴とする泌尿器癌の診断法。
と。 【構成】 尿中のティッシュー・インヒビター・オブ・
メタロプロテイナーゼ−１（ＴＩＭＰ−１）を定量する
ことを特徴とする泌尿器癌の診断法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、尿中のＴＩＭＰ−１を
定量することにより行う、簡便な泌尿器癌の診断方法に
関するものである。
定量することにより行う、簡便な泌尿器癌の診断方法に
関するものである。
【０００２】
【従来の技術】細胞外マトリックス（細胞間の結合組
織）は、コラーゲン、プロテオグリカン、グリコサミノ
グリカン、フィブロネクチンやラミニン等のグリコプロ
テイン、エラスチンなどを主な構成成分とする複雑な構
造を有している。細胞外マトリックスの代謝過程でタン
パク質の分解に携わる主要な一群の酵素はマトリックス
・メタロプロテイナーゼ(MMP) と総称される。これらの
MMP は細胞から酵素前駆体として分泌され、細胞外マト
リックスにおいて活性化されてタンパク質の分解作用を
発揮する。これらMMP の酵素活性は、生体中の種々の賦
活物質や阻害物質により制御されている［Matrisian (1
990) Trends Genet. 6, 121-125; Murphy et al. (199
1)Br. J. Rheumatol. 30, Suppl. 1, 25-31]。種々のMM
P を包括的に阻害する生体物質はティッシュー・インヒ
ビター・オブ・メタロプロテイナーゼ（TIMP）の名で知
られ、現在までに少なくともTIMP-1［Docherty et al.
(1985) Nature 318,66-69; Gasson et al. (1985) Natu
re 315, 768-771; Carmichael et al. (1986) Proc. Na
tl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 2407-2411] および TIMP-2
[Boone etal. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
87, 2800-2804; Stetler-Stevenson et al. (1990) J.
Biol. Chem. 265, 13933-13938]の２種類が知られてい
る。TIMP-1は、184 個のアミノ酸残基から成る分子量 2
8.5kD の糖タンパク質であり、分子内に６個の -S-S-結
合を有する。
織）は、コラーゲン、プロテオグリカン、グリコサミノ
グリカン、フィブロネクチンやラミニン等のグリコプロ
テイン、エラスチンなどを主な構成成分とする複雑な構
造を有している。細胞外マトリックスの代謝過程でタン
パク質の分解に携わる主要な一群の酵素はマトリックス
・メタロプロテイナーゼ(MMP) と総称される。これらの
MMP は細胞から酵素前駆体として分泌され、細胞外マト
リックスにおいて活性化されてタンパク質の分解作用を
発揮する。これらMMP の酵素活性は、生体中の種々の賦
活物質や阻害物質により制御されている［Matrisian (1
990) Trends Genet. 6, 121-125; Murphy et al. (199
1)Br. J. Rheumatol. 30, Suppl. 1, 25-31]。種々のMM
P を包括的に阻害する生体物質はティッシュー・インヒ
ビター・オブ・メタロプロテイナーゼ（TIMP）の名で知
られ、現在までに少なくともTIMP-1［Docherty et al.
(1985) Nature 318,66-69; Gasson et al. (1985) Natu
re 315, 768-771; Carmichael et al. (1986) Proc. Na
tl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 2407-2411] および TIMP-2
[Boone etal. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
87, 2800-2804; Stetler-Stevenson et al. (1990) J.
Biol. Chem. 265, 13933-13938]の２種類が知られてい
る。TIMP-1は、184 個のアミノ酸残基から成る分子量 2
8.5kD の糖タンパク質であり、分子内に６個の -S-S-結
合を有する。
【０００３】TIMP-1は活性型の間質コラゲナーゼ、活性
型ストロームライシン、あるいは92kDのIV型コラゲナー
ゼなどと１：１の分子比で結合してこれらの酵素活性を
阻害する［Welgus et al. (1983) J. Biol. Chem. 253,
12259-12264; Welgus et al. (1985) Collagen Relat.
Res. 5, 167-179; Wilhelm et al. (1989) J. Biol.Ch
em. 264, 17213-17221]。関節リューマチ、歯根膜疾
患、腫瘍の浸潤・転移などの種々の病変は活性型のMMP
とそれらの阻害物質であるTIMP-1との間のバランスが崩
れたときに起こるとされている［Emonard et al. (199
0) Cell. Mol. Biol. 36, 131-153; Lennarz et al. (1
991) Biochim. Biophys. Acta 1071, 149-158; Murphy
et al. (1991) Br. J. Rheumatol. 30, Suppl. 1, 25-3
1; Page (1991) J. Periodont. Res. 26, 230-242] 。
例えば、MMP の１つである間質コラゲナーゼを生産する
細胞は、同時にTIMP-1をも生産・分泌し、生体内での正
味のコラーゲン分解活性は、活性型コラゲナーゼのレベ
ルとTIMP-1のレベルのバランスにより決まる［Stetler-
Stevenson et al. (1990) J. Biol. Chem. 265, 13933-
13938]。また、別のMMP であるIV型コラーゲン分解酵素
が癌の転移と密接な関係のあること［Liotta et al. (1
991) Cell 64, 327-336]や、ヒトの腫瘍細胞の浸潤性と
TIMP-1レベルの間に逆の相関性のあること［Khokha et
al.(1989) Science 243, 947-950] も知られており、癌
とTIMP-1の間には深い関係があると考えられている。
型ストロームライシン、あるいは92kDのIV型コラゲナー
ゼなどと１：１の分子比で結合してこれらの酵素活性を
阻害する［Welgus et al. (1983) J. Biol. Chem. 253,
12259-12264; Welgus et al. (1985) Collagen Relat.
Res. 5, 167-179; Wilhelm et al. (1989) J. Biol.Ch
em. 264, 17213-17221]。関節リューマチ、歯根膜疾
患、腫瘍の浸潤・転移などの種々の病変は活性型のMMP
とそれらの阻害物質であるTIMP-1との間のバランスが崩
れたときに起こるとされている［Emonard et al. (199
0) Cell. Mol. Biol. 36, 131-153; Lennarz et al. (1
991) Biochim. Biophys. Acta 1071, 149-158; Murphy
et al. (1991) Br. J. Rheumatol. 30, Suppl. 1, 25-3
1; Page (1991) J. Periodont. Res. 26, 230-242] 。
例えば、MMP の１つである間質コラゲナーゼを生産する
細胞は、同時にTIMP-1をも生産・分泌し、生体内での正
味のコラーゲン分解活性は、活性型コラゲナーゼのレベ
ルとTIMP-1のレベルのバランスにより決まる［Stetler-
Stevenson et al. (1990) J. Biol. Chem. 265, 13933-
13938]。また、別のMMP であるIV型コラーゲン分解酵素
が癌の転移と密接な関係のあること［Liotta et al. (1
991) Cell 64, 327-336]や、ヒトの腫瘍細胞の浸潤性と
TIMP-1レベルの間に逆の相関性のあること［Khokha et
al.(1989) Science 243, 947-950] も知られており、癌
とTIMP-1の間には深い関係があると考えられている。
【０００４】TIMP-1は、その遺伝子がＸ染色体上に配座
し、健常人においても血清、脳脊髄液、羊水、涙液、唾
液、尿などの体液中に普遍的に存在することが知られて
いる。TIMP-1と癌との関連についてのこれまでの知見に
よれば、浸潤性の高い癌細胞が産生するTIMP-1のレベル
が正常細胞あるいは浸潤性の低い癌細胞に比べて著しく
低いことや、マウスのメラノーマ細胞による基底膜への
浸潤と肺への転移がTIMP-1によって抑制されるなど、TI
MP-1は癌の浸潤・転移と深い係わりのあることが示唆さ
れている。膀胱癌とTIMP-1との関係については、膀胱癌
患者の血清中のTIMP-1を測定した結果が報告されてお
り、健常人の血清中濃度168.5 ±33.2 ng/mlに対して膀
胱癌患者の血清中濃度は251.1 ±96.0 ng/mlと統計上の
有意差が認められるものの、その差は膀胱癌の診断に応
用できるほど充分に大きな差とはいえず、実用化には到
っていない。また、尿中のTIMP-1濃度と病態については
未だ詳しい報告はなく、尿中のTIMP-1濃度を測定するこ
とにより泌尿器癌の診断を可能とした例はない。TIMP-1
の定量方法としては、従来、生物活性を測定する方法
［Terato et al.(1976) Biochim. Biophys. Acta 445,
753］、酵素免疫測定法［Clark et al. (1991) Matrix
11, 76-85; Kodama et al. (1990) J. Immunol. Meth.
127, 103-108]等が報告されている。
し、健常人においても血清、脳脊髄液、羊水、涙液、唾
液、尿などの体液中に普遍的に存在することが知られて
いる。TIMP-1と癌との関連についてのこれまでの知見に
よれば、浸潤性の高い癌細胞が産生するTIMP-1のレベル
が正常細胞あるいは浸潤性の低い癌細胞に比べて著しく
低いことや、マウスのメラノーマ細胞による基底膜への
浸潤と肺への転移がTIMP-1によって抑制されるなど、TI
MP-1は癌の浸潤・転移と深い係わりのあることが示唆さ
れている。膀胱癌とTIMP-1との関係については、膀胱癌
患者の血清中のTIMP-1を測定した結果が報告されてお
り、健常人の血清中濃度168.5 ±33.2 ng/mlに対して膀
胱癌患者の血清中濃度は251.1 ±96.0 ng/mlと統計上の
有意差が認められるものの、その差は膀胱癌の診断に応
用できるほど充分に大きな差とはいえず、実用化には到
っていない。また、尿中のTIMP-1濃度と病態については
未だ詳しい報告はなく、尿中のTIMP-1濃度を測定するこ
とにより泌尿器癌の診断を可能とした例はない。TIMP-1
の定量方法としては、従来、生物活性を測定する方法
［Terato et al.(1976) Biochim. Biophys. Acta 445,
753］、酵素免疫測定法［Clark et al. (1991) Matrix
11, 76-85; Kodama et al. (1990) J. Immunol. Meth.
127, 103-108]等が報告されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】膀胱癌、尿管癌、腎臓
癌など泌尿器系の癌の診断は、従来主として、膀胱鏡な
どによる内覗鏡検査、造影剤注入後のＸ線撮影などによ
る透視検査、バイオプシーによる病理組織検査などによ
って行われ、多検体を簡便に検査する有効な方法がなか
ったために集団検診などによる早期発見が困難であっ
た。本発明者らは、ヒト細胞（HeLa細胞）から得たTIMP
-1に対する新たなモノクローナル抗体を応用した酵素免
疫測定法により、健常人と泌尿器癌患者の尿中における
TIMP-1の濃度の差が血清中におけるTIMP-1濃度の差と比
べて顕著であることを見いだし、これに基づき、尿中の
TIMP-1を測定することにより被検者に苦痛を与えること
なく泌尿器癌を容易に診断することを可能にする方法を
見いだした。
癌など泌尿器系の癌の診断は、従来主として、膀胱鏡な
どによる内覗鏡検査、造影剤注入後のＸ線撮影などによ
る透視検査、バイオプシーによる病理組織検査などによ
って行われ、多検体を簡便に検査する有効な方法がなか
ったために集団検診などによる早期発見が困難であっ
た。本発明者らは、ヒト細胞（HeLa細胞）から得たTIMP
-1に対する新たなモノクローナル抗体を応用した酵素免
疫測定法により、健常人と泌尿器癌患者の尿中における
TIMP-1の濃度の差が血清中におけるTIMP-1濃度の差と比
べて顕著であることを見いだし、これに基づき、尿中の
TIMP-1を測定することにより被検者に苦痛を与えること
なく泌尿器癌を容易に診断することを可能にする方法を
見いだした。
【０００６】
【課題を解決するための手段】即ち、本発明は、尿中の
ティッシュー・インヒビター・オブ・メタロプロテイナ
ーゼ−１（ＴＩＭＰ−１）を定量することを特徴とする
泌尿器癌の診断法に係わる。本発明によって診断するこ
とが可能な癌としては、特に、膀胱癌，尿管癌及び腎臓
癌を挙げることが出来る。本発明方法は、特にモノクロ
ーナル抗体を利用した免疫測定法により行うことが好ま
しい。更に、該モノクローナル抗体の少なくとも一種が
抗ヒトＴＩＭＰ−１マウスモノクローナル抗体ＴＩＭ−
２２５（ＩｇＧ）又はＴＩＭ−２９３（ＩｇＧ）である
ことが好ましい。抗ヒトＴＩＭＰ−１マウスモノクロー
ナル抗体ＴＩＭ−２２５及びＴＩＭ−２９３を産生する
マウスハイブリドーマであるＴＩＭ−２２５−１４及び
ＴＩＭ−２９３−２１は、平成６年11月８日に通産省工
業技術院生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センタ
ーに寄託され、それぞれ、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４
６１６及びＦＥＲＭ Ｐ−１４６１５を付与されてい
る。ヒトＴＩＭＰ−１に対するマウスモノクローナル抗
体の作製は例えば岩崎らの方法（単クローン抗体、講談
社、１９８３年）に準じて行うことができる。また、Ｔ
ＩＭＰ−１の免疫測定法は、例えば石川の方法（超高感
度酵素免疫測定法、学会出版センター、１９９３年）を
応用することにより実施することが出来る。
ティッシュー・インヒビター・オブ・メタロプロテイナ
ーゼ−１（ＴＩＭＰ−１）を定量することを特徴とする
泌尿器癌の診断法に係わる。本発明によって診断するこ
とが可能な癌としては、特に、膀胱癌，尿管癌及び腎臓
癌を挙げることが出来る。本発明方法は、特にモノクロ
ーナル抗体を利用した免疫測定法により行うことが好ま
しい。更に、該モノクローナル抗体の少なくとも一種が
抗ヒトＴＩＭＰ−１マウスモノクローナル抗体ＴＩＭ−
２２５（ＩｇＧ）又はＴＩＭ−２９３（ＩｇＧ）である
ことが好ましい。抗ヒトＴＩＭＰ−１マウスモノクロー
ナル抗体ＴＩＭ−２２５及びＴＩＭ−２９３を産生する
マウスハイブリドーマであるＴＩＭ−２２５−１４及び
ＴＩＭ−２９３−２１は、平成６年11月８日に通産省工
業技術院生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センタ
ーに寄託され、それぞれ、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４
６１６及びＦＥＲＭ Ｐ−１４６１５を付与されてい
る。ヒトＴＩＭＰ−１に対するマウスモノクローナル抗
体の作製は例えば岩崎らの方法（単クローン抗体、講談
社、１９８３年）に準じて行うことができる。また、Ｔ
ＩＭＰ−１の免疫測定法は、例えば石川の方法（超高感
度酵素免疫測定法、学会出版センター、１９９３年）を
応用することにより実施することが出来る。
【０００７】
実施例１ −抗TIMP-1モノクローナル抗体の作製− （ａ）ヒトTIMP-1により免疫したマウス脾細胞の調製 ヒト子宮頸部癌細胞株であるHeLa細胞の培養上清中より
Cawston他の方法（Cawston et al. (1981) Biochem.
J., 195, 159-165 ）に準じて精製したTIMP-1をRibiア
ジュバント（Ribi Immunochem Research, Inc.社製）と
混合し、NZB マウス（８週令）の腹腔内と皮下の２カ所
へ１匹当り20μg 注射し、免疫した。その後初回免疫と
同様の方法で、３週間おきに２回追加免疫を行い、最終
免疫の３日後に脾臓を摘出し、以下のようにして脾細胞
をミエローマ細胞と融合させた。
Cawston他の方法（Cawston et al. (1981) Biochem.
J., 195, 159-165 ）に準じて精製したTIMP-1をRibiア
ジュバント（Ribi Immunochem Research, Inc.社製）と
混合し、NZB マウス（８週令）の腹腔内と皮下の２カ所
へ１匹当り20μg 注射し、免疫した。その後初回免疫と
同様の方法で、３週間おきに２回追加免疫を行い、最終
免疫の３日後に脾臓を摘出し、以下のようにして脾細胞
をミエローマ細胞と融合させた。
【０００８】（ｂ）細胞融合 2X107 個のマウスミエローマ細胞株 P3-X63-Ag8-U1(P3U
1)と1X108 個の脾細胞を用いて、岩崎の方法（単クロー
ン抗体：講談社、1983年）に従い、50% ポリエチレング
リコール1500（ベーリンガー・マンハイム社製）の存在
下に細胞融合を行った。融合後の細胞を、15% 牛胎児血
清（M. A. Bioproducts 社製）を添加したERDF培地（極
東製薬株式会社製）に懸濁し、96ウェルプレート（Falc
on社製）上で培養を行った。翌日、100 μM ヒポキサン
チン、0.4 μM アミノプテリン、16μM チミジンおよび
15% 牛胎児血清を含むERDF培地（以下HAT 培地という）
を添加し、更に３日後に HAT培地を追加した。１週間後
HAT 培地からアミノプテリンを除いた培地（以下 HT 培
地という）に交換し、以後３〜４日おきにHT培地の交換
を行った。細胞融合から約２週間後、融合細胞の生育が
肉眼的に確認された段階で、培養上清中の抗TIMP-1抗体
価を以下に示す酵素免疫測定法により測定し、抗TIMP-1
抗体を産生する細胞のスクリーニングを行った。
1)と1X108 個の脾細胞を用いて、岩崎の方法（単クロー
ン抗体：講談社、1983年）に従い、50% ポリエチレング
リコール1500（ベーリンガー・マンハイム社製）の存在
下に細胞融合を行った。融合後の細胞を、15% 牛胎児血
清（M. A. Bioproducts 社製）を添加したERDF培地（極
東製薬株式会社製）に懸濁し、96ウェルプレート（Falc
on社製）上で培養を行った。翌日、100 μM ヒポキサン
チン、0.4 μM アミノプテリン、16μM チミジンおよび
15% 牛胎児血清を含むERDF培地（以下HAT 培地という）
を添加し、更に３日後に HAT培地を追加した。１週間後
HAT 培地からアミノプテリンを除いた培地（以下 HT 培
地という）に交換し、以後３〜４日おきにHT培地の交換
を行った。細胞融合から約２週間後、融合細胞の生育が
肉眼的に確認された段階で、培養上清中の抗TIMP-1抗体
価を以下に示す酵素免疫測定法により測定し、抗TIMP-1
抗体を産生する細胞のスクリーニングを行った。
【０００９】（ｃ）酵素免疫測定法による抗TIMP-1抗体
産生株のスクリーニング イムノプレート（Maxisorp, Nunc社製）の各ウェルに、
1 μg/mlのTIMP-1溶液50μl を添加して４℃にて１晩コ
ーティングし、リン酸緩衝化生理食塩水−0.05% Tween
20（以下 PBS-Tweenという）にて１回洗浄後、0.1%牛血
清アルブミンを含む PBS-Tweenによりブロッキング処理
を行った。処理後のウェルに、上記ｂで得られたハイブ
リドーマの培養上清 50 μl を加えて37℃で１時間反応
させた。PBS-Tween にて洗浄後、２次抗体としてペルオ
キシダーゼ標識抗マウスIgG ヤギ抗体を加え、37℃にて
１時間反応させた。洗浄後のウェルにペルオキシダーゼ
の基質溶液である 0.3 mg/ml 2,2'-アジノ- ビス（３-
エチルベンゾチアゾリン-6- スルホン酸）二アンモニウ
ム塩−0.003%過酸化水素−0.1 M リン酸クエン酸緩衝液
(pH 4.0)を100 μl 加え、30分間反応させた。100 μl
の1.5%シュウ酸溶液を加えて反応を停止後、415 nmにお
ける吸光度をマイクロプレート光度計（MPR-4 、東ソー
株式会社製）にて測定した。
産生株のスクリーニング イムノプレート（Maxisorp, Nunc社製）の各ウェルに、
1 μg/mlのTIMP-1溶液50μl を添加して４℃にて１晩コ
ーティングし、リン酸緩衝化生理食塩水−0.05% Tween
20（以下 PBS-Tweenという）にて１回洗浄後、0.1%牛血
清アルブミンを含む PBS-Tweenによりブロッキング処理
を行った。処理後のウェルに、上記ｂで得られたハイブ
リドーマの培養上清 50 μl を加えて37℃で１時間反応
させた。PBS-Tween にて洗浄後、２次抗体としてペルオ
キシダーゼ標識抗マウスIgG ヤギ抗体を加え、37℃にて
１時間反応させた。洗浄後のウェルにペルオキシダーゼ
の基質溶液である 0.3 mg/ml 2,2'-アジノ- ビス（３-
エチルベンゾチアゾリン-6- スルホン酸）二アンモニウ
ム塩−0.003%過酸化水素−0.1 M リン酸クエン酸緩衝液
(pH 4.0)を100 μl 加え、30分間反応させた。100 μl
の1.5%シュウ酸溶液を加えて反応を停止後、415 nmにお
ける吸光度をマイクロプレート光度計（MPR-4 、東ソー
株式会社製）にて測定した。
【００１０】（ｄ）抗TIMP-1抗体を産生するハイブリド
ーマのクローニング 上記（ｃ）の酵素免疫測定法によるスクリーニングによ
って抗TIMP-1抗体の産生が確認されたウェル中の細胞
を、次に限界希釈法によりクローニングした。即ち、96
ウェルプレートの各ウェル当りに含まれる細胞数が３
個、１個、0.3 個になるように細胞を蒔き、HT培地で培
養した。10から14日後、細胞の生育が肉眼的に確認でき
るようになった段階で、培養上清中の抗TIMP-1抗体価を
上記（ｃ）と同様にして酵素免疫測定法により測定し
た。抗TIMP-1抗体の産生が認められたウェル中の細胞に
ついてクローニング操作を繰り返し行い、最終的に全て
のウェルで抗TIMP-1抗体の産生が確認されるまでクロー
ニングを繰り返した。このようにして、最終的に８株の
抗TIMP-1モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株が得
られた。
ーマのクローニング 上記（ｃ）の酵素免疫測定法によるスクリーニングによ
って抗TIMP-1抗体の産生が確認されたウェル中の細胞
を、次に限界希釈法によりクローニングした。即ち、96
ウェルプレートの各ウェル当りに含まれる細胞数が３
個、１個、0.3 個になるように細胞を蒔き、HT培地で培
養した。10から14日後、細胞の生育が肉眼的に確認でき
るようになった段階で、培養上清中の抗TIMP-1抗体価を
上記（ｃ）と同様にして酵素免疫測定法により測定し
た。抗TIMP-1抗体の産生が認められたウェル中の細胞に
ついてクローニング操作を繰り返し行い、最終的に全て
のウェルで抗TIMP-1抗体の産生が確認されるまでクロー
ニングを繰り返した。このようにして、最終的に８株の
抗TIMP-1モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株が得
られた。
【００１１】（ｅ）抗TIMP-1モノクローナル抗体の生産 上記８株のハイブリドーマによるモノクローナル抗体の
生産は、各ハイブリドーマ株を牛胎児血清を添加したER
DF培地等の適当な培地中で培養するか、もしくはハイブ
リドーマをヌードマウス腹腔中で培養したあと腹水を採
取することにより行った。ERDF培地中の培養では、培養
液中のモノクローナル抗体濃度は１〜50μg/mlであっ
た。一方、ヌードマウス腹腔中の培養では、予めプリス
タン（2,6,10,14-テトラメチルペンタデカン）を１匹当
り0.5 ml腹腔内に投与し１〜３週間後にハイブリドーマ
5X106 個を腹腔内に投与した場合、細胞を投与後10〜14
日の腹水中の抗体濃度は１〜10 mg/mlであった。
生産は、各ハイブリドーマ株を牛胎児血清を添加したER
DF培地等の適当な培地中で培養するか、もしくはハイブ
リドーマをヌードマウス腹腔中で培養したあと腹水を採
取することにより行った。ERDF培地中の培養では、培養
液中のモノクローナル抗体濃度は１〜50μg/mlであっ
た。一方、ヌードマウス腹腔中の培養では、予めプリス
タン（2,6,10,14-テトラメチルペンタデカン）を１匹当
り0.5 ml腹腔内に投与し１〜３週間後にハイブリドーマ
5X106 個を腹腔内に投与した場合、細胞を投与後10〜14
日の腹水中の抗体濃度は１〜10 mg/mlであった。
【００１２】（ｆ）モノクローナル抗体の精製 上記（ｅ）により得られた培養上清もしくは腹水に含ま
れるモノクローナル抗体は、培養上清もしくは腹水を0.
1 M リン酸緩衝液（pH 7.0) で平衡化したプロテインA-
セファロースCL-4B カラムに流し、0.1 M リン酸緩衝液
（pH 7.0）で洗浄後、吸着したモノクローナル抗体を0.
1 M グリシン- 塩酸緩衝液（pH 3.0）で溶出することに
より精製した。
れるモノクローナル抗体は、培養上清もしくは腹水を0.
1 M リン酸緩衝液（pH 7.0) で平衡化したプロテインA-
セファロースCL-4B カラムに流し、0.1 M リン酸緩衝液
（pH 7.0）で洗浄後、吸着したモノクローナル抗体を0.
1 M グリシン- 塩酸緩衝液（pH 3.0）で溶出することに
より精製した。
【００１３】実施例２ −モノクローナル抗体の同定− このようにして得られた８種類のモノクローナル抗体の
性質を、以下に述べる方法により調べた。まず、それぞ
れのモノクローナル抗体によるＴＩＭＰ−１活性の阻害
を、14Ｃ−コラーゲンを用いたコラゲナーゼ活性測定系
（K.Terato etal. (1976) Biochim. Biophys. Acta, 44
5, 753-762 ）により調べた。次に、ヒトＴＩＭＰ−１
をメルカプトエタノールの存在下および非存在下におい
て１２％のポリアクリルアミドゲル上でＳＤＳ電気泳動
し（U.K.Laemmli (1970) Nature, 227, 680-685 ）、ニ
トロセルロース膜に転写後それぞれのモノクローナル抗
体を用いたイムノブロッティングを行い（日本生化学会
編、続生化学実験講座２、タンパク質の化学（上）(198
7) pp.41-57 ）、抗体の反応性を比較した。さらに、そ
れぞれのモノクローナル抗体のヒトＴＩＭＰ−２あるい
はウシＴＩＭＰ−１との交差反応性を、上記（ｃ）と同
様の酵素免疫測定法により調べた。１ウェル当たり４０
ｎｇのヒトＴＩＭＰ−２もしくはウシＴＩＭＰ−１をコ
ーティングしたイムノプレートを用い、得られたモノク
ローナル抗体を１次抗体として用いた。また、基質溶液
として１ｍｇ／ｍｌ ｏ−フェニレンジアミン−0.012%
過酸化水素−50mMリン酸クエン酸緩衝液（ｐＨ５．
０）、反応停止液として１Ｎ硫酸溶液を用いた。測定は
４９２ｎｍの吸光度を測定した。これらの結果から、８
種のモノクローナル抗体はそれぞれ表１のような特性を
示した。
性質を、以下に述べる方法により調べた。まず、それぞ
れのモノクローナル抗体によるＴＩＭＰ−１活性の阻害
を、14Ｃ−コラーゲンを用いたコラゲナーゼ活性測定系
（K.Terato etal. (1976) Biochim. Biophys. Acta, 44
5, 753-762 ）により調べた。次に、ヒトＴＩＭＰ−１
をメルカプトエタノールの存在下および非存在下におい
て１２％のポリアクリルアミドゲル上でＳＤＳ電気泳動
し（U.K.Laemmli (1970) Nature, 227, 680-685 ）、ニ
トロセルロース膜に転写後それぞれのモノクローナル抗
体を用いたイムノブロッティングを行い（日本生化学会
編、続生化学実験講座２、タンパク質の化学（上）(198
7) pp.41-57 ）、抗体の反応性を比較した。さらに、そ
れぞれのモノクローナル抗体のヒトＴＩＭＰ−２あるい
はウシＴＩＭＰ−１との交差反応性を、上記（ｃ）と同
様の酵素免疫測定法により調べた。１ウェル当たり４０
ｎｇのヒトＴＩＭＰ−２もしくはウシＴＩＭＰ−１をコ
ーティングしたイムノプレートを用い、得られたモノク
ローナル抗体を１次抗体として用いた。また、基質溶液
として１ｍｇ／ｍｌ ｏ−フェニレンジアミン−0.012%
過酸化水素−50mMリン酸クエン酸緩衝液（ｐＨ５．
０）、反応停止液として１Ｎ硫酸溶液を用いた。測定は
４９２ｎｍの吸光度を測定した。これらの結果から、８
種のモノクローナル抗体はそれぞれ表１のような特性を
示した。
【００１４】
【表１】 表１ モノクローナル抗体の性質 ──────────────────────────────────── 反 応 性 モノクロー ───────────────────── TIMP-1阻害活性 イムノブロッティング 酵素免疫測定法 ナル抗体 （Ａ492) 非還元 還元 ヒト ウシ TIMP-2 TIMP-1 ──────────────────────────────────── TIM-33 有り 反応 反応 0.00 0.34 TIM-211 無し 反応 反応せず 0.00 0.20 TIM-216 有り 反応 反応せず 0.04 0.00 TIM-225 無し 反応 反応 0.00 0.00 TIM-280 無し 反応 反応せず 0.00 0.09 TIM-293 有り 反応 反応せず 0.00 0.00 TIM-347 無し 反応 反応せず 0.00 0.00 TIM-625 無し 反応 反応 0.00 0.00 Clark のモノクローナル抗体 RRU-T1 無し 反応 反応せず 反応せず − RRU-T2 有り 反応 反応 反応せず − ────────────────────────────────────
【００１５】実施例３ −TIMP-1の定量− （ａ）モノクローナル抗体の組み合わせ TIMP-1のサンドイッチ酵素免疫測定法を行うために、上
記８種類のモノクローナル抗体の中から測定に最も適切
な抗体の組合せを調べた。イムノプレートのウェルに、
８種類の精製モノクローナル抗体をそれぞれ１μg/mlの
濃度で別々にコートし、ブロッキング処理した後、精製
TIMP-1を反応させた。つぎに熊谷、奥村（免疫実験操作
法VIII、pp.2425-2430、1979年、日本免疫学会編）の方
法によりビオチン化した各々のモノクローナル抗体（２
次抗体）をペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン
（Vector社製）と共に加えて反応させた。洗浄後のウェ
ルに基質溶液を加えて酵素反応を行い、415 nmの吸光度
を測定した。この結果、８種類のモノクローナル抗体の
中で、ＴＩＭ−２９３のモノクローナル抗体を固定化抗
体としてコーティングに用い、ビオチン化したＴＩＭ−
２２５もしくはＴＩＭ−３４７のモノクローナル抗体を
標識抗体（２次抗体）として用いる組合せが最も高感度
な測定を可能とする組合せであった。
記８種類のモノクローナル抗体の中から測定に最も適切
な抗体の組合せを調べた。イムノプレートのウェルに、
８種類の精製モノクローナル抗体をそれぞれ１μg/mlの
濃度で別々にコートし、ブロッキング処理した後、精製
TIMP-1を反応させた。つぎに熊谷、奥村（免疫実験操作
法VIII、pp.2425-2430、1979年、日本免疫学会編）の方
法によりビオチン化した各々のモノクローナル抗体（２
次抗体）をペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン
（Vector社製）と共に加えて反応させた。洗浄後のウェ
ルに基質溶液を加えて酵素反応を行い、415 nmの吸光度
を測定した。この結果、８種類のモノクローナル抗体の
中で、ＴＩＭ−２９３のモノクローナル抗体を固定化抗
体としてコーティングに用い、ビオチン化したＴＩＭ−
２２５もしくはＴＩＭ−３４７のモノクローナル抗体を
標識抗体（２次抗体）として用いる組合せが最も高感度
な測定を可能とする組合せであった。
【００１６】（ｂ）モノクローナル抗体の酵素標識 ＴＩＭ−２２５の抗体をImagawa らの方法（Imagawa et
al. (1982) J. Appl.Biochem., 4, 41）によりペルオ
キシダーゼで標識を行った。
al. (1982) J. Appl.Biochem., 4, 41）によりペルオ
キシダーゼで標識を行った。
【００１７】（ｃ）モノクローナル抗体を用いたサンド
イッチ酵素免疫測定法 ＴＩＭ−２９３を10μｇ/ml の濃度でイムノプレートに
コーティングを行い、２次抗体として上記（ｂ）のペル
オキシダーゼ標識したＴＩＭ−２２５、基質溶液として
１ｍｇ／ｍｌ ｏ−フェニレンジアミン−0.012%過酸化
水素−50mMリン酸クエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、反応
停止液として１Ｎ硫酸溶液を用いて実施例１（ｃ）と同
様にして精製ＴＩＭＰ−１の測定を行った。測定は４９
２ｎｍの吸光度を測定した。この結果、従来法に比べて
１０倍高感度なＴＩＭＰ−１の測定法が確立された（図
１）。本測定法は、図１に示したように０．２５ｎｇ／
ｍｌ以上のＴＩＭＰ−１を正確に定量することが可能で
ある。本発明者らが高感度測定用に用いたＴＩＭＰ−１
に対するマウスモノクローナル抗体ＴＩＭ−２２５およ
びＴＩＭ−２９３は、Ｃｌａｒｋらが用いたマウスモノ
クローナル抗体とはＴＩＭＰ−１阻害活性およびイムノ
ブロッティングでの反応性が異なることから、認識する
エピトープが異なると考えられ、この違いが１０倍の高
感度を生み出したと考えられる。
イッチ酵素免疫測定法 ＴＩＭ−２９３を10μｇ/ml の濃度でイムノプレートに
コーティングを行い、２次抗体として上記（ｂ）のペル
オキシダーゼ標識したＴＩＭ−２２５、基質溶液として
１ｍｇ／ｍｌ ｏ−フェニレンジアミン−0.012%過酸化
水素−50mMリン酸クエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、反応
停止液として１Ｎ硫酸溶液を用いて実施例１（ｃ）と同
様にして精製ＴＩＭＰ−１の測定を行った。測定は４９
２ｎｍの吸光度を測定した。この結果、従来法に比べて
１０倍高感度なＴＩＭＰ−１の測定法が確立された（図
１）。本測定法は、図１に示したように０．２５ｎｇ／
ｍｌ以上のＴＩＭＰ−１を正確に定量することが可能で
ある。本発明者らが高感度測定用に用いたＴＩＭＰ−１
に対するマウスモノクローナル抗体ＴＩＭ−２２５およ
びＴＩＭ−２９３は、Ｃｌａｒｋらが用いたマウスモノ
クローナル抗体とはＴＩＭＰ−１阻害活性およびイムノ
ブロッティングでの反応性が異なることから、認識する
エピトープが異なると考えられ、この違いが１０倍の高
感度を生み出したと考えられる。
【００１８】（ｄ）尿中のTIMP-1の定量 （ａ）に記載した組合せのモノクローナル抗体を用いた
サンドイッチ酵素免疫測定法により、尿中のTIMP-1の定
量を行った。この定量において、精製したTIMP-1を標準
物質として用いた。健常人の尿中TIMP-1の濃度は、測定
した６例中56 pg/mlを示す１例を除いて５例が０ pg/ml
であり、平均値は 9.33 （標準偏差22.9）pg/ml である
（表２）のに対して、
サンドイッチ酵素免疫測定法により、尿中のTIMP-1の定
量を行った。この定量において、精製したTIMP-1を標準
物質として用いた。健常人の尿中TIMP-1の濃度は、測定
した６例中56 pg/mlを示す１例を除いて５例が０ pg/ml
であり、平均値は 9.33 （標準偏差22.9）pg/ml である
（表２）のに対して、
【００１９】
【表２】 表２． 健常人尿中のTIMP-1濃度 ───────────────────── 症例番号 TIMP-1濃度（pg/ml) ───────────────────── Ａ ０ Ｂ ０ Ｃ 56 Ｄ ０ Ｅ ０ Ｆ ０ ─────────────────────
【００２０】同じく６例測定した膀胱癌患者の尿では、
６例中３例が1000-5000 pg/ml という極めて高い値を、
また、２例が 500-1000 pg/ml の高値を示し、平均値は
1535（標準偏差 1737 ）pg/ml であった（表３）。
６例中３例が1000-5000 pg/ml という極めて高い値を、
また、２例が 500-1000 pg/ml の高値を示し、平均値は
1535（標準偏差 1737 ）pg/ml であった（表３）。
【００２１】
【表３】 表３． 膀胱癌患者尿中のTIMP-1濃度 ───────────────────── 症例番号 TIMP-1濃度（pg/ml) ───────────────────── １ 907 ２ 1240 ３ 1467 ４ 4933 ５ 48 ６ 613 ─────────────────────
【００２２】また、尿管癌患者の尿中TIMP-1濃度も、２
例中１例が 1500 pg/ml 以上の高値を示した（表４）。
例中１例が 1500 pg/ml 以上の高値を示した（表４）。
【００２３】
【表４】 表４． 尿管癌患者尿中のTIMP-1濃度 ───────────────────── 症例番号 TIMP-1濃度（pg/ml) ───────────────────── ７ 54 ８ 1573 ─────────────────────
【００２４】腎臓癌患者の尿においても、２例中１例が
2200 pg/ml の高濃度を示した（表５）。
2200 pg/ml の高濃度を示した（表５）。
【００２５】
【表５】 表５． 腎臓癌患者尿中のTIMP-1濃度 ───────────────────── 症例番号 TIMP-1濃度（pg/ml) ───────────────────── ９ 0 １０ 2200 ─────────────────────
【００２６】上記のサンドイッチ酵素免疫測定法に供し
た癌患者および健常人の尿を用いてリバースザイモグラ
フィー法による分析を行ない、それぞれの尿中に含まれ
るTIMP-1量をバンドの濃さによって定性的に比較する
と、サンドイッチ酵素免疫測定法の結果をよく反映する
結果を示した。このことは、上記のサンドイッチ酵素免
疫測定法が確かに尿中のTIMP-1の濃度を測定するもので
あることを裏付けている。
た癌患者および健常人の尿を用いてリバースザイモグラ
フィー法による分析を行ない、それぞれの尿中に含まれ
るTIMP-1量をバンドの濃さによって定性的に比較する
と、サンドイッチ酵素免疫測定法の結果をよく反映する
結果を示した。このことは、上記のサンドイッチ酵素免
疫測定法が確かに尿中のTIMP-1の濃度を測定するもので
あることを裏付けている。
【００２７】
【発明の効果】本発明により、従来困難であった泌尿器
癌の多検体測定が可能となり、集団検診などによる癌の
早期発見に大きく貢献することが可能と考えられる。
癌の多検体測定が可能となり、集団検診などによる癌の
早期発見に大きく貢献することが可能と考えられる。
【図１】図１は実施例３に記載したＴＩＭＰ−１の測定
法による結果を示すグラフである。
法による結果を示すグラフである。
Claims (8)
- 【請求項１】 尿中のティッシュー・インヒビター・オ
ブ・メタロプロテイナーゼ−１（ＴＩＭＰ−１）を定量
することを特徴とする泌尿器癌の診断法。 - 【請求項２】 診断する癌が膀胱癌であることを特徴と
する特許請求の範囲第１項に記載の泌尿器癌の診断法。 - 【請求項３】 診断する癌が尿管癌であることを特徴と
する特許請求の範囲第１項に記載の泌尿器癌の診断法。 - 【請求項４】 診断する癌が腎臓癌であることを特徴と
する特許請求の範囲第１項に記載の泌尿器癌の診断法。 - 【請求項５】 ＴＩＭＰ−１の定量をモノクローナル抗
体を利用した免疫測定法により行うことを特徴とする特
許請求の範囲第１項に記載の泌尿器癌の診断法。 - 【請求項６】 前記モノクローナル抗体の少なくとも一
種が抗ヒトＴＩＭＰ−１マウスモノクローナル抗体ＴＩ
Ｍ−２２５である、請求項５記載の泌尿器癌の診断法。 - 【請求項７】 前記モノクローナル抗体の少なくとも一
種が抗ヒトＴＩＭＰ−１マウスモノクローナル抗体ＴＩ
Ｍ−２９３である、請求項５記載の泌尿器癌の診断法。 - 【請求項８】 抗ヒトＴＩＭＰ−１マウスモノクローナ
ル抗体ＴＩＭ−２２５及び抗ヒトＴＩＭＰ−１マウスモ
ノクローナル抗体ＴＩＭ−２９３を用いた請求項５記載
の泌尿器癌の診断法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30161694A JPH08136548A (ja) | 1994-11-11 | 1994-11-11 | 泌尿器癌の診断法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30161694A JPH08136548A (ja) | 1994-11-11 | 1994-11-11 | 泌尿器癌の診断法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08136548A true JPH08136548A (ja) | 1996-05-31 |
Family
ID=17899095
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP30161694A Pending JPH08136548A (ja) | 1994-11-11 | 1994-11-11 | 泌尿器癌の診断法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08136548A (ja) |
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000062070A3 (en) * | 1999-04-09 | 2001-01-25 | Holten Andersen Mads | Tissue inhibitor of matrix metalloproteinases type-1 (timp-1) as a cancer marker |
| WO2004029627A1 (en) | 2002-09-26 | 2004-04-08 | Rigshospitalet | A method for detecting, screening and/or monitoring a cancer in an individual |
| US6906036B2 (en) | 2001-08-16 | 2005-06-14 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Anti-aging and wound healing compounds |
| US7041787B2 (en) | 2000-12-29 | 2006-05-09 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Design and use of advanced zinc chelating peptides to regulate matrix metalloproteinases |
| US7071164B2 (en) | 2001-08-16 | 2006-07-04 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Anti-cancer and wound healing compounds |
| US7094754B2 (en) | 2001-08-16 | 2006-08-22 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Anti-aging and wound healing compounds |
| US7148194B2 (en) | 2002-12-30 | 2006-12-12 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Method to increase fibronectin |
| US7186693B2 (en) | 2001-08-16 | 2007-03-06 | Kimberly - Clark Worldwide, Inc. | Metalloproteinase inhibitors for wound healing |
| US7189700B2 (en) | 2003-06-20 | 2007-03-13 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Anti-chrondrosarcoma compounds |
| US7374886B2 (en) | 1999-04-09 | 2008-05-20 | Rigshospitalet | Tissue inhibitor of matrix metalloproteinases type-1 (TIMP-1) as a cancer marker and postoperative marker for minimal residual disease or recurrent disease in patients with a prior history of cancer |
| JP2013152088A (ja) * | 2011-12-28 | 2013-08-08 | Mitsubishi Chemical Medience Corp | 神経変性疾患の検出方法 |
-
1994
- 1994-11-11 JP JP30161694A patent/JPH08136548A/ja active Pending
Cited By (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7108983B1 (en) | 1999-04-09 | 2006-09-19 | Rigshospitalet | Tissue inhibitor of matrix metalloproteinases type-1 (TIMP-1) as a cancer marker |
| EP1619206A3 (en) * | 1999-04-09 | 2006-02-15 | Rigshospitalet | Tissue inhibitor of matrix metallproteinases type-1 (TIMP-1) as a cancer marker |
| US7807379B2 (en) | 1999-04-09 | 2010-10-05 | Rigshospitalet | Tissue inhibitor of matrix metalloproteinases type-1 (TIMP-1) as a cancer marker |
| US7374886B2 (en) | 1999-04-09 | 2008-05-20 | Rigshospitalet | Tissue inhibitor of matrix metalloproteinases type-1 (TIMP-1) as a cancer marker and postoperative marker for minimal residual disease or recurrent disease in patients with a prior history of cancer |
| WO2000062070A3 (en) * | 1999-04-09 | 2001-01-25 | Holten Andersen Mads | Tissue inhibitor of matrix metalloproteinases type-1 (timp-1) as a cancer marker |
| US7041787B2 (en) | 2000-12-29 | 2006-05-09 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Design and use of advanced zinc chelating peptides to regulate matrix metalloproteinases |
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| US7094754B2 (en) | 2001-08-16 | 2006-08-22 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Anti-aging and wound healing compounds |
| US7186693B2 (en) | 2001-08-16 | 2007-03-06 | Kimberly - Clark Worldwide, Inc. | Metalloproteinase inhibitors for wound healing |
| US7196162B2 (en) | 2001-08-16 | 2007-03-27 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Anti-aging and wound healing compounds |
| US6906036B2 (en) | 2001-08-16 | 2005-06-14 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Anti-aging and wound healing compounds |
| WO2004029627A1 (en) | 2002-09-26 | 2004-04-08 | Rigshospitalet | A method for detecting, screening and/or monitoring a cancer in an individual |
| JP2006500574A (ja) * | 2002-09-26 | 2006-01-05 | リグスホスピタレット | 個体における癌の検出、スクリーニングおよび／またはモニタリング方法 |
| US7148194B2 (en) | 2002-12-30 | 2006-12-12 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Method to increase fibronectin |
| US7189700B2 (en) | 2003-06-20 | 2007-03-13 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Anti-chrondrosarcoma compounds |
| JP2013152088A (ja) * | 2011-12-28 | 2013-08-08 | Mitsubishi Chemical Medience Corp | 神経変性疾患の検出方法 |
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