ITAN20110057A1 - Identificazione di un nuovo fattore molecolare per la diagnosi precoce del carcinoma uroteliale della vescica. - Google Patents

Description

Descrizione

IDENTIFICAZIONE DI UN NUOVO FATTORE MOLECOLARE PER LA DIAGNOSI PRECOCE DEL CARCINOMA UROTELIALE DELLA VESCICA.

Campo dell'invenzione

La presente invenzione si riferisce all'identificazione di un nuovo marker tumorale precoce del carcinoma uroteliale della vescica.

Stato della Tecnica

La vescica à ̈ l’organo in cui si raccoglie l’urina filtrata dai reni, prima di essere eliminata dal corpo. Il carcinoma della vescica consiste nella trasformazione in senso maligno delle cellule che la compongono; in particolare, le cellule tumorali assumono caratteristiche morfologicamente e funzionalmente differenti da quelle normali, sostituendosi a quest'ultime. Il tumore della vescica può diffondere localmente e a distanza, ad esempio ai polmoni, al fegato e alle ossa attraverso il circolo sanguigno. Nonostante i numerosi studi sulla sua genesi ed i più avanzati metodi diagnosticoterapeutici, questa neoplasia continua ad essere gravata da un'elevata mortalità (1). Il carcinoma della vescica à ̈ infatti uno dei tumori di più frequente riscontro da parte dell'urologo, rappresentando la seconda principale causa di decesso di tutte le neoplasie del tratto genito-urinario (1); nell'uomo à ̈ il quarto tipo più frequente dopo quello prostatico, polmonare e colorettale costituendo circa il 5-6% di tutti i casi di cancro (1). Nelle donne à ̈ l'ottavo tipo di tumore più comune e costituisce circa il 2-3% di tutte le neoplasie (1). Il carcinoma della vescica à ̈ più frequente nella razza bianca e nel sesso maschile con un incremento di incidenza in età più avanzata (1,2). Il processo che promuove l'insorgenza della neoplasia e la sua evoluzione appare multifattoriale con coinvolgimento di molteplici alterazioni genetiche e di numerosi fattori di rischio ambientali. Il cancro della vescica à ̈ tumore per il quale si à ̈ suggerita, in aggiunta ad una predisposizione genetica necessaria per l'instaurarsi e lo sviluppo della malattia, un'associazione con alcuni prodotti chimici. Essi sono i derivati del benzene e le amine aromatiche, sostanze usate nell'industria delle vernici e, non di minore importanza, i composti nitro-aromatici e le nitrosamine, identificati negli scarichi dei motori diesel (3,4,5). Ma anche coloro che si sottopongono a tinture di capelli o che fumano sigarette (6,7,8) sono soggetti esposti al rischio di cancro della vescica.

Più del 90% delle neoplasie maligne della vescica à ̈ rappresentato dai carcinomi delle cellule uroteliali dove con urotelio si vuole indicare l'epitelio di rivestimento della via escretrice urinaria. Questo rivestimento continua a generare nuove cellule durante tutta la vita. Tuttavia, in taluni casi, tale crescita epiteliale diventa incontrollata generando il tumore. La crescita del tumore può essere superficiale quando esso si sviluppa nel lume vescicale (polipo o papilloma vescicale) o infiltrante quando si sviluppa all'interno della parete della vescica (9). Il tumore superficiale può essere trattato in modo conservativo per asportazione mediante resezione endoscopica (9,10). Ha solitamente tendenza a recidivare nel corso del tempo, anche a distanza di anni, e a manifestarsi in punti differenti della vescica o delle vie escretrici comportando la necessità di terapie farmacologiche e di costanti controlli endoscopici (9,10). Solo in una piccola parte dei casi (10%) questi tumori vanno infiltrando in progressione la parete vescicale. Il tumore infiltrante, molto più aggressivo, richiede una terapia più impegnativa sino all'asportazione completa della vescica (cistectomla) e alla sua ricostruzione (9,11). L'approccio terapeutico prevede interventi che vedono impiegati non solo la chirurgia ma anche la radioterapia, che utilizza dosi elevate di raggi X per distruggere le cellule tumorali, la chemioterapia. che consiste nella somministrazione sistemica di farmaci efficaci nel distruggere le cellule neoplastiche, anche se distanti dalla sede del tumore primitivo, e la terapia biologica o immunoterapia che mira a stimolare, orientare o ripristinare il sistema immunitario dell'organismo per combattere il tumore attraverso la somministrazione di sostanze prodotte dall'organismo stesso o di origine sintetica (12).

La diagnosi precoce non può impedire la formazione del tumore ma permette di individuare, già in uno stadio precoce della malattia, le alterazioni morfologiche e molecolari che indicano la presenza di una neoplasia. Prima viene individuato un cancro, più facile sarà trattarlo adeguatamente e maggiori saranno in generale le probabilità di guarigione e sopravvivenza con la prospettiva di una vita più lunga e qualitativamente migliore. Anche per la collettività i vantaggi della diagnosi precoce sono considerevoli: il trattamento delle forme avanzate di tumore comporta, infatti, costi economici e sociali elevatissimi, con enormi difficoltà nell'organizzazione e gestione delle risorse.

Non esistono al momento programmi di screening o metodi di diagnosi precoce scientificamente affidabili (12). La raccolta dei dati clinici, l'analisi dell'urina con ricerca del sangue o di cellule tumorali e l'osservazione al microscopio di parti di tessuto vescicale prelevate dal paziente rappresentano oggi i mezzi più standardizzati e consolidati per diagnosticare e monitorare il cancro della vescica (12). Tuttavia, questo tipo di indagini mostra una serie di limiti che derivano dalla loro onerosità, dalla invasività e talvolta dalla scarsa specificità e sensibilità che contraddistingue parte di essi. Gli approcci tradizionali di cui sopra non sono quindi sufficienti a fare riconoscere e monitorare il cancro, da qui la necessità di individuare indicatori biochimici e genetici valutabili, oltre che nei liquidi biologici (siero ed urina) (13,14), anche su frammenti di tessuto ottenuti mediante analisi bioptica (15). Tali indicatori (marcatori tumorali), per offrire l'opportunità di identificare precocemente l'insorgenza e la progressione del tumore, devono essere lo specchio degli eventi molecolari che si verificano in quelle alterazioni biologiche, morfologiche e cliniche che caratterizzano le lesioni maligne anche durante le prime fasi. Il marcatore à ̈ quindi un segnale di neoplasia o di evoluzione di neoplasia in assenza di segni clinici, capace di indirizzare in modo più preciso una diagnosi iniziale o una diagnosi di ripresa/ricaduta dalla malattia (prognosi). I marcatori tumorali per definirsi tali devono essere sensibili, cioà ̈ quantificabili in tutti i pazienti affetti da una determinata neoplasia, e specifici in quanto espressi nei soggetti affetti solo da quel tipo di neoplasia. Essi sono sostanze prodotte direttamente dal tumore, come ormoni, enzimi o altre proteine, più o meno correlate con la crescita numerica delle cellule tumorali, o prodotte dall'organismo in risposta al tumore, come le proteine della fase acuta dell'infiammazione. I marcatori tumorali ottimali per la routine clinica sono quelli accessibili con un semplice prelievo di sangue o di urina, ripetibili nel tempo e dosabili in ogni laboratorio.

Nonostante i decennali sforzi compiuti dalla comunità scientifica per l'identificazione di biomarcatori tumorali della vescica, ad oggi non à ̈ stato ancora individuato un marcatore ideale cioà ̈ un indicatore che possa essere facilmente dosato ma che soprattutto sia caratterizzato da un'elevata sensibilità e specificità.

Esistono, viceversa, diverse sostanze che possono essere dosate nel siero e nell' urina e la cui contemporanea determinazione fornisce utili informazioni al clinico. Fra queste sostanze vanno innanzitutto inseriti alcuni enzimi come la timidilato sintetasi, le metalloproteinasi, le ialuronidasi e la telomerasi; alcune proteine nucleari come l'NMP22, alcune citocheratine come l' antigene polipeptidico tissutale (TP A), l' antigene polipeptidico tissutale specifico (TPS), l'antigene urinario del cancro della vescica (UBC) ed il Cyfra 21 (9,16).

Accanto ai marcatori dosabili nell'urina e nei sieri, anche alcuni indicatori tumorali tissutali sono stati ampiamente caratterizzati ed attualmente utilizzati in associazione tra di loro. Essi comprendono oncogeni, recettori per il fattore di crescita ed antigeni di membrana rivelati con anticorpi monoclonali

La proteina HtrA1 (SEQ. ID. NO.: 1) (NP_002766.1) à ̈ una serina proteasi appartenente alla famiglia delle HtrA (High temperature requirement factor A), anche conosciute come Degp, identificate inizialmente in E.Coli (17). L'HtrA1 à ̈ una proteina fisiologicamente presente in vari tessuti, la cui espressione viene modulata negli organismi superiori durante lo sviluppo (18) ed in situazioni patologiche sia di natura infiammatoria (19)-degenerativa (20) che neoplastica. Diversi studi mostrano che l'HtrA1 à ̈ sottoregolata nei tessuti cancerosi e prodotta in quantità più elevate nei tessuti normali e che la maggiore espressione inibisce la crescita delle cellule tumorali e la loro proliferazione sia in vivo che in vitro (21). L'HtrA1 gioca quindi un ruolo protettivo in molte forme tumorali comportandosi da oncosoppressore (22,23). In linea con tale scoperta, il livello di mRNA e l'espressione proteica dell'HtrA1 diminuiscono in modo significativo con l'aumentare del grado del carcinoma endometriale (24) e l'espressione dell'HtrA1 si abbassa con l'aumentare della gravità delle malattie del trofoblasto (25). L'HtrA1 agisce nelle cellule neoplastiche anche come mediatore endogeno dell'azione chemioterapica del cisplatino. Infatti, i livelli di HtrA1 possono essere considerati predittivi della risposta tumorale nei confronti del trattamento con cisplatino sia dei tumori dell'ovaio che dello stomaco (26). Recentemente si à ̈ analizzata l'espressione dell'HtrAl in un ampio gruppo di mesoteliomi e lo studio ha dimostrato che la sua espressione correla significativamente e positivamente con la sopravvivenza dei pazienti (27).

Le oramai note implicazioni biologiche dell'HtrAl nello sviluppo dei tessuti normali,così come nella progressione di alcune neoplasie, ci hanno suggerito di indagare la presenza, l'eventuale alterazione e quindi il possibile ruolo dell'HtrAl nel carcinoma uroteliale della vescica.

Descrizione dell'invenzione

Gli studi di immunoistochimica che abbiamo preliminarmente condotto dimostrano che l'HtrAl à ̈ una molecola espressa dall'urotelio della vescica in condizioni fisiologiche ed in patologie infiammatorie come la cistite batterica. Al contrario, la proteina à ̈ assente a livello uroteliale in tutti i casi esaminati di carcinoma uroteliale con diverso grado di malignità e a differenti stadi di infiltrazione, quindi fin dalle fasi più precoci.

Inoltre, il Western Blotting ha evidenziato nei tessuti vescicali normali e neoplastici due bande: una a 38 kDa ed una a 53 kDa. La forma a 38 kDa si origina con molta probabilità dall'autocatalisi della forma nativa a 53 kDa, come descritto in letteratura (28). Per quanto riguarda la banda a 53 kDa, non si à ̈ osservata alcuna differenza d'espressione tra la condizione fisiologica e la patologica mentre la banda a 38 kDa ha sempre mostrato una diminuzione nei tessuti patologici. Questi risultati ci hanno suggerito che l'HtrAl, ed in particolare la sua forma a più basso peso molecolare, potesse rappresentare un buon candidato per essere considerato a tutti gli effetti un nuovo marker tumorale precoce del carcinoma uroteliale vescicale.

Poiché questa proteina fu originariamente descritta come una proteasi di secrezione (29), i nostri dati ci hanno indotto a pensare che essa potesse essere secreta da parte dell'urotelio nella cavità vescicale ed essere così rintracciata a livello urinario, in cui facilmente dosarla. Nella seconda fase del nostro studio abbiamo quindi esaminato la presenza dell'HtrAl nell'urina di soggetti sani, nell' urina di pazienti con carcinoma uroteliale con diverso grado di malignità e a differenti stadi di infiltrazione ed in soggetti affetti da cistite batterica. Il Western Blotting condotto sui campioni di urina ha evidenziato, come per i tessuti, due bande: una a 38 kDa ed una a 53 kDa. La forma a 53 kDa à ̈ risultata notevolmente e significativamente più rappresentata nelle urine patologiche rispetto alle urine dei soggetti sani e di quelli con cistite, prevalentemente negative. La forma a 38 kDa nell'urina, invece, à ̈ risultata non omogeneamente presente in condizioni patologiche e principalmente assente in quelle fisiologiche e negli stati infiammatori.

La presente invenzione si riferisce quindi alla identificazione delle due forme della proteina HtrAl, a 38 kDa nel tessuto vescicale e a 53 kDa nell'urina, quali markers tumorali utili nella diagnosi precoce del carcinoma uroteliale della vescica.

La procedura seguita per il raggiungimento dei sopracitati risultati viene di seguito descritta dettagliatamente.

FASE 1 - Raccolta dei campioni di tessuto e di urina sottoposti ad analisi.

Sono stati raccolti campioni tissutali di carcinoma uroteliale con diverso grado di malignità (classificazione WHO del 2004) (30) e a differenti stadi di infiltrazione (classificazione TNM del 2002) (31) e campioni di tessuto visivamente normale dalla stessa vescica ma lontano dalla zona interessata dalla patologia. I tessuti normali e tumorali sono stati ottenuti da pazienti sottoposti a cistectomla radicale (n=18) (Tabelle 1, 2). Sono stati inoltre prelevati, con biopsia vescicale, campioni di tessuto tumorale da pazienti sottoposti a TURV (n=30) e di tessuto infiammato da soggetti affetti da cistite batterica (n=10) (Tabelle 1, 2). I pazienti affetti da carcinoma uroteliale e da cistite (età media 68,2 anni) hanno anche fornito i campioni urinari usati in questo studio. Sono stati inoltre analizzati campioni di urina provenienti da soggetti sani (n=15) (età media 62 anni) (Tabella 2). Tutti i pazienti, ricoverati presso la Clinica Urologica dell'Università Politecnica delle Marche, hanno firmato il consenso informato e non erano affetti da nessun'altra patologia.

FASE 2 - Immunoistochimica dei campioni di tessuto vescicale normale, tumorale e di soggetti affetti da cistite.

Per l'analisi immunoistochimica (Tabella 2), i campioni di tessuto vescicale normale, tumorale e di soggetti affetti da cistite sono stati fissati in formalina al 4%, inclusi in paraffina e tagliati in sezioni di 3Î1⁄4m.

Le sezioni in paraffina sono state deparaffinate e reidratate attraverso passaggi in xilene e in una serie graduata di alcoli a percentuale decrescente (dal 100% al 50%), incubate per un'ora con acqua ossigenata al 3% in acqua deionizzata per inibire l'attività delle perossidasi endogene e infine trattate per 10 minuti a 37°C con tripsina 0,1% e cloruro di calcio 0,1% in Tris-HCl 0,05M pH 7,6. Le sezioni sono state poi lavate in Tris-HCl. Per eliminare l'eventuale fondo dovuto ai legami non specifici, le sezioni sono state incubate per un'ora a temperatura ambiente e sotto agitazione in non-fat dry milk (NFDM) (BioRad, Hercules CA) al 6% in Tris-HCl. È stata fatta seguire quindi un'incubazione overnight a 4°C con l' anticorpo primario policlonale preparato in coniglio contro la proteina umana HtrAl (Abcam, Cambridge, UK), diluito 1:100 in Tris-HCl+ NFDM 3%. Una volta eseguiti alcuni lavaggi in Tris-HCl, le sezioni sono state incubate per un'ora con l'anticorpo secondario biotinilato anti-coniglio diluito 1:200 in Tris-HCl+NFDM 3%. Dopo ulteriori lavaggi in Tris-HCl, la reazione immunoistochimica à ̈ stata rilevata tramite il metodo ABC (Vector Laboratories, Burlingame, CA), (Ih a temperatura ambiente) utilizzando la DAB (3'3'diaminobenzidinatetraidrocloruro) (SIGMA-ALDRICH, Milano, Italia) come croniogeno. Lavate con acqua del rubinetto e poi con acqua tuli deionizzata, le sezioni sono state contrastate con ematossilina di Mayer (Merck Chemicals SpA, Milano, Italia) per 2 minuti circa, poste in acqua corrente e disidratate. Si à ̈ poi proceduto al montaggio dei vetrini utilizzando la soluzione di Eukitt (Kindler GmbH and Co., Freiburg, Germany).

I campioni normali di vescica e quelli di soggetti affetti da cistite hanno evidenziato un'immunocolorazione per l'HtrA1 prevalentemente omogenea a livello uroteliale, presente in tutti gli strati dell'urotelio ma con maggiore positività nella zona apicale delle cellule cupoliformi (Figura la,b). La tonaca media dei vasi vescicali così come la tonaca muscolare della vescica sono risultate positive per l'HtrA1 (Figura 1a).

Nell'urotelio delle neoplasie papillifere a basso potenziale di malignità, l'HtrA1 si à ̈ mostrato debolmente presente nelle cellule dello strato uroteliale basale (Figura le), mentre gli strati uroteliali più alti si sono rivelati negativi per l'HtrA1. Si à ̈ invece continuato ad osservare positività nella tonaca media dei vasi dello stroma così come nella tonaca muscolare della vescica. Le altre neoplasie prese in esame, le papillifere con potenziale di malignità crescente e le infiltranti, hanno riportato una immunocolorazione per l'HtrA1 prevalentemente negativa a livello delle cellule uroteliali, mentre la tonaca muscolare della vescica e la tonaca media dei vasi hanno mostrato una debole positività per l'HtrA1 (Figure ld,e,f).

FASE 3 - Preparazione degli estratti proteici di campioni di tessuto vescicale normale e tumorale per analisi Western Blotting

Porzioni di tessuto vescicale normale e tumorale, adiacenti a quelle analizzate in immunoistochimica, sono state immediatamente congelate in azoto liquido dopo il prelievo chirurgico e successivamente conservate a -80°C. I campioni di tessuto tumorale provenivano solo da vesciche di pazienti sottoposti a cistectomla radicale poiché con la TURV il materiale tissutale recuperato essere insufficiente per essere assoggettato ad analisi Western Blotting. Per il medesimo motivo, anche i tessuti prelevati con biopsia vescicale dai soggetti affetti da cistite non sono stati esaminati con tale tecnica (Tabella 2).

Prima di essere analizzati, i campioni di tessuto vescicale sono stati scongelati e lavati con tampone fosfato di sodio 0,1M pH 7,4. Ad ogni lavaggio, per evitare di perdere il materiale, i campioni sono stati centrifugati a 800g per 1 minuto a 4°C. Essi sono stati quindi pesati e ridotti in polvere tramite rottura manuale con mortaio e pestello. Ogni campione à ̈ stato risospeso nel tampone di lisi (Tris-HCl 20mM, pH 8,0, Nonidet-P401%, glicerolo 10%, NaCl 137mM, CaCh ImM, MgCh ImM) contenente gli inibitori di fosfatasi e di proteasi (SIGMA-ALDRICH), rispettando il rapporto 0,lg tessuto/lml tampone. I campioni sono stati quindi omogeneizzati mediante potter (Ultra-Turrax T8, IKA®-WERKE, Lille, France) e centrifugati a 20000g. I sopranatanti ottenuti, definiti estratti grezzi, sono stati aliquotati e conservati a -80°C. La concentrazione delle proteine à ̈ stata misurata con il metodo di Bradford (32).

Fase 4 -Analisi in Western Blotting dei campioni di tessuto vescicale normale e tumorale.

Gli estratti proteici da analizzare per la quantizzazione della banda relativa al prodotto di autoproteolisi dell'HtrAl sono stati preparati denaturando 100Î1⁄4g di proteine totali con sample buffer IX (Tris-HCl 1M pH 6,8, SDS 2% e β-mercaptoetanolo 1%), tenendoli in ebollizione per 8 minuti. I campioni sono stati quindi sottoposti alla corsa elettroforetica denaturante in SDS-PAGE (sodio dodecil solfato-elettroforesi su gel di poliacrilamide) con il metodo di Laemmli (33), facendo passare una corrente di 14mA costante per 20 ore in un gel al 10% di acrilamide. Terminata la corsa elettroforetica, à ̈ stato effettuato il trasferimento delle proteine dal gel membrana di polivinildenfluoruro (PVDF), utilizzando il tampone Tris-base 20mM, glieina 150mM, metanolo 20%. Il trasferimento à ̈ stato protratto per una intera notte, a voltaggio costante (30V) a 4°C. Le membrana à ̈ stata quindi lavata con acqua, poi in metanolo per 15-20 secondi per fissare le bande, poi di nuovo in acqua ed infine in TBS-T (Tris-HCl 0,02M, pH 7,5, NaCl 0,15M, Tween-20 0,1%). Successivamente, à ̈ stata immersa per 2 ore in agitazione nel tampone di bloccaggio (TBS-T BSA 5%), al fine di aumentare la specificità dell'anticorpo alla sua proteina target. La membrana à ̈ stata quindi incubata per tutta la notte a 4°C con l'anticorpo primario monoclonale diretto contro la proteina umana HtrAl/PRSSll (aminoacidi 23-480) (R&D Systems, Minneapolis, USA) diluito 1:1000 in TBS-T BSA 5%. Una volta eseguiti 8 lavaggi di 8 minuti ciascuno con il TBS-T, la membrana à ̈ stata incubata per 2 ore a temperatura ambiente con l'anticorpo secondario anti IgG murino coniugato con la perossidasi di rafano (HRP) (Amersham Srl, Milano Italia), diluito 1:5000 in TBS-T BSA 5%, e nuovamente lavata 8 volte in un'ora con TBS-T. Per la visualizzazione della banda della β-actina, proteina utilizzata quale housekeeping per la normalizzazione dei dati, à ̈ stato impiegato l'anticorpo primario monoclonale anti-β-actina (SIGMA), anch'esso lasciato incubare per tutta la notte a 4°C.

Per lo sviluppo della reazione di chemiluminescenza, à ̈ stata adoperata la soluzione ECL - plus (Amersham Srl), fatta agire sulla membrana per 5 minuti. La membrana asciugata à ̈ stata quindi rivestita da pellicola, inserita in una cassetta autoradiografica assieme alla lastra ed esposta overnight. Si à ̈ proceduto quindi allo sviluppo ed al fissaggio.

In figura 2a à ̈ stata riportata l'immagine Western Blotting rappresentativa dell'espressione proteica della forma autoproteolitica dell'HtrAl nei campioni di tessuto vescicale, che evidenzia una significativa e costante differenza d'espressione tra campioni normali e patologici. In particolare, la forma autoproteolitica dell'HtrA1 à ̈ risultata significativamente ridotta nei campioni di tessuto patologico, nei quali essa appare estremamente flebile ed in alcuni casi difficilmente rilevabile.

L'espressione proteica in Western Blotting della β-actina negli stessi lìsati di tessuto vescicale normale e patologico già analizzati per la valutazione dei livelli della forma autoproteolitica dell'HtrAl ha dato conferma del caricamento omogeneo del gel (Figura 2b).

Fase 5 - Calcolo del peso molecolare, analisi densitometrica e valutazione statistica dei segnali. ottenuti in Western Blotting, della forma autoproteolitica dell'HtrA1 nei campioni di tessuto normale e tumorale.

Della retta di taratura, costruita considerando i pesi molecolari (P.M.) di ogni proteina standard ed i corrispondenti Rf (mobilità relativa), à ̈ stata ricavata l'equazione ed il rispettivo coefficiente di correlazione R<2>.

Inserendo la misura dell'Rf della banda relativa alla forma autoproteolitica dell'HtrA1 nell'equazione della retta di taratura, ne à ̈ stato calcolato il rispettivo P.M., che à ̈ risultato di 38 kDa, come già riportato in letteratura (28).

Le immagini delle lastre autoradiografiche sono state acquisite con lo scanner, trasformate in formato TIFF, eliminando ogni informazione sul colore, e analizzate in densitometria ottica ricorrendo al programma Quantity One 4.6.1 (BioRad). Le quantità di proteina così ricavate dalla banda dell'HtrAl a 38 kDa sono stata espresse in valori di intensità (in scala di grigio).

La β-actina à ̈ stata utilizzata come controllo di caricamento ed i suoi valori di espressione, ottenuti dall'analisi densitometrica, sono stati impiegati per normalizzare i dati densitometrici relativi all'espressione della forma autoproteolitica dell'HtrA1.

I risultati ottenuti sono stati presentati come media deviazione standard (SD). L'analisi statistica dei dati à ̈ stata effettuata utilizzando il T-test a due code. Dall'analisi semiquantitativa dell'HtrA1, si à ̈ osservata una riduzione di espressione della forma a 38 kDa nei tessuti patologici rispetto a quelli normali e tale riduzione si à ̈ mostrata altamente significativa (p<0,001) (*) (Figura 3). ;Fase 6 - Preparazione dei campioni di urina di soggetti sani, di soggetti con cistite e di pazienti affetti da carcinoma uroteliale per analisi Western Blotting. ;;I campioni di urina dei soggetti sani, di quelli con cistite e dei pazienti affetti da carcinoma uroteliale (Tabelle 1, 2) sono stati raccolti in contenitori sterili alla prima minzione del mattino e, nei casi di carcinoma, prelevati lo stesso giorno dell'intervento (TURV o cistectomla totale). Immediatamente centrifugati per 15 minuti a 1500g a 4°C, essi hanno originato un pellet ed un sopranatante, quest'ultimo stoccato a -20°C. ;Al momento dell'analisi, le urine sono state scongelate, centrifugate per 20 minuti a 3000g a 4°C e portate al Laboratorio Analisi dell'Azienda Ospedaliera Universitaria Ospedali Riuniti "Umberto I -G.M.Lancisi -G.Salesi (Ancona) per la misurazione della creatinina (mg/dl) e della concentrazione proteica (g/L). ;I campioni urinari sono stati poi concentrati con appositi dispositivi (Amicon Ultra-4 e Amicon Ultra-15) (Millipore, Milano, Italia), scegliendo come riferimento un campione di urina normale che, precedentemente concentrato e analizzato in Western Blotting, mostrava un segnale quantizzabile. Tutti i campioni urinari sono stati quindi concentrati un numero di volte variabile a seconda dei rispettivi valori di creatinina rapportati a quelli del campione preso come riferimento (normalizzazione). I concentrati ottenuti sono stati poi posti a -20°C. ;Fase 7 - Analisi in Western Blotting dei campioni di urina di soggetti sani, di soggetti con cistite e di pazienti affetti da carcinoma uroteliale. ;;Per la quantizzazione della forma nativa dell'HtrA1 nell'urina si à ̈ ricorso alla metodica dell'immunoprecipitazione. A tal fine à ̈ stata utilizzata una sospensione al 50% di palline di sefarosio legate alla proteina G (GE Healthcare, Bio-Sciences AB, Uppsala, Sweden) ed equilibrate nel tampone di lisi. Per ogni campione di urina da immunoprecipitare, 50Î1⁄41 della sospensione di palline sono stati fatti incubare per tutta la notte, a 4°C ed in rotazione, con 3Î1⁄4g dell'anticorpo primario monoclonale diretto contro la proteina umana HtrA1/PRSS11 (aminoacidi 23-480) (R&D Systems). Le palline di sefarosio sono state prima lavate per 8 volte con il tampone di lisi, poi, una volta raccolte, risospese delicatamente in 50Î1⁄41 dello stesso tampone e infine lasciate incubare per tutta la notte, a 4°C ed in rotazione con 225Î1⁄41 di ciascuna urina concentrata. Esse sono state quindi raccolte, lavate per 3 volte con il tampone di lisi e centrifugate a 13000g per 1 minuto per pellettarle. Le proteine legate sono state eluite dalle palline tramite loro incubazione con 45Î1⁄41 di glieina lOOmM, pH 2,5, per 30 min., a temperatura ambiente e in agitazione. Gli eluati (40Î1⁄41) sono poi stati prelevati, denaturati in sample buffer 1X, neutralizzati con soda e bolliti per 8 minuti. ;Gli immunoprecipitati di urina sono stati caricati in un gel al 10% di acrilamide e trasferiti su membrana di PVDF. Si à ̈ proceduto poi alla reazione anticorpale con l'anticorpo primario monoclonale diretto contro la proteina umana HtrA1/PRSS11 (aminoacidi 23-480) (R&D Systems) e alla rivelazione delle bande mediante chemiluminescenza, seguendo lo stesso protocollo utilizzato per i tessuti. ;L'espressione dell'HtrAl urinaria nella sua forma nativa (53 kDa) à ̈ risultata positiva, seppur in modo variabile, nel 100% dei pazienti con carcinoma uroteliale sottoposti a cistectomia radicale o a TURV (Figura 4), mentre si à ̈ mostrata quasi assente in tutti i casi normali e con cistite (Figura 5), suggerendo che l'HtrA1 non à ̈ generalmente coinvolta nelle patologie a carattere infiammatorio. ;;Fase 8 -Analisi densitometrica e valutazione statistica dei segnali, ottenuti in Western Blotting, della forma nativa dell'HtrA1 nei campioni di urina di soggetti sani, di soggetti con cistite e di pazienti affetti da carcinoma uroteliale. ;;Ricorrendo alla densitometria, sono stati calcolati i valori d'intensità (in scala di grigio) della forma nativa dell'HtrA1 in tutti i campioni urinari analizzati. I valori ottenuti sono stati assoggettati all'analisi della varianza ad una via (ANOVA). ;Dall'analisi semiquantitativa dell'HtrA1, si à ̈ osservato un aumento significativo di espressione della forma a 53 kDa nelle urine di pazienti con carcinoma uroteliale, sia sottoposti a cistectomia totale che a TURV, rispetto alle urine di soggetti sani o con cistite (Figura 6). Tali incrementi si sono mostrati altamente significativi (p<0,0001). ;Bibliografia ;1) Jemal A, Siegei R, Xu J, et al. Cancer statistics, 2010. CA Cancer J Clin. 2011;61(2):133-4. ;2) Horner MJ, Ries LA, Krapcho M, et al, eds. SEER Cancer Statistics Review, 1975-2006. Bethesda, MD: National Cancer Institute; 2009. ;3) Vineis P, Pirastu R. Aromatic amines and cancer. Cancer Causes Control. 1997;8:346-55. ;4) Delclos GL, Lerner SP. Occupational risk factors. Scand J Urol Nephrol Suppl.2008;(218):58-63. ;5) Nilsson S, Ullen A. Chemotherapy-induced bladder cancer. 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Claims (30)

1. Rivendicazioni Ciò che viene rivendicato à ̈: 1. La proteina HtrA1 come biomarker specifico del cancro.
2. 2. La proteina HtrAl come biomarker specifico precoce del cancro uroteliale della vescica.
3. 3. La proteina HtrAl secondo le rivendicazioni 1 e 2 costituita dalla sequenza aminoacidica (SEQ. ID. NO.: 1) (NP_002766.1) o da un suo frammento di autoproteolisi o da loro rispettive varianti, o da una molecola proteica che comprende la sequenza aminoacidica SEQ. ID. NO.: 1.
4. 4. La proteina HtrA1 secondo la rivendicazione 3, le cui le varianti comprendono qualsiasi sequenza aminoacidica che abbia almeno il 50%, il 60%, il 70%, il 75%, l'80%, l'85%, il 90%, il 95%, il 96%, il 97%, il 98% o il 99% di identità aminoacidica con la sequenza SEQ. ID. NO.: 1 o con quella del rispettivo frammento di autoproteolisi.
5. 5. La proteina HtrA1 secondo le rivendicazioni 3 e 4, in cui le varianti della sequenza SEQ. ID. NO.: 1 o del rispettivo frammento di autoproteolisi, o la molecola proteica che comprende la sequenza aminoacidica SEQ. ID. NO.: 1 sono funzionali.
6. 6. La proteina HtrA1 secondo le rivendicazioni 3-5, in cui la sequenza aminoacidica SEQ. ID. NO.: 1 o le sue rispettive varianti, o la molecola proteica che comprende la sequenza aminoacidica SEQ. ID. NO.: 1 vengono immunoprecipitate dall' urina per mezzo di un metodo standard.
7. 7. La proteina HtrA1 secondo le rivendicazioni 3-5, in cui la sequenza aminoacidica SEQ. ID. NO.: 1 o le sue rispettive varianti, o la molecola proteica che comprende la sequenza aminoacidica SEQ. ID. NO.: 1 vengono immunoprecipitate dall'urina opportunamente concentrata.
8. 8. La proteina HtrA1 secondo la rivendicazione 7, in cui le concentrazioni nell'urina vengono normalizzate sulla base della concentrazione di creatinina.
9. 9. La proteina HtrA1 secondo le rivendicazioni 3-5, in cui il frammento di autoproteolisi della sequenza aminoacidica SEQ. ID. NO.: 1 o le sue varianti vengono analizzate direttamente nell'estratto proteico dei tessuti vescicali.
10. 10. La proteina HtrA1 secondo la rivendicazione 9, in cui la normalizzazione degli estratti proteici vescicali viene operata sulla base dei valori della β-actina usata come proteina housekeeping.
11. 11. Un metodo per la diagnosi precoce del cancro uroteliale della vescica.
12. 12. Un metodo secondo la rivendicazione 11 che prevede la determinazione della quantità della proteina HtrA1, secondo le rivendicazioni 3-10, in campioni ottenuti da un qualsivoglia soggetto.
13. 13. Un metodo secondo la rivendicazione 12, in cui i campioni sono rappresentati dai fluidi biologici o dal tessuto vesricale del soggetto.
14. 14. Un metodo secondo la rivendicazione 13, in cui i fluidi biologici comprendono l'urina.
15. 15. Un metodo secondo le rivendicazioni 11-14, in cui viene effettuata una comparazione della quantità della proteina HtrA1, secondo le rivendicazioni 3-10, nel campione prelevato dal soggetto in esame con quella misurata nel campione di un soggetto considerato sano ed in cui una differenza di suddetta quantità tra i due campioni sia associata alla presenza di cancro uroteliale della vescica.
16. 16. Un metodo secondo le rivendicazioni 11-14, in cui un incremento della quantità della proteina HtrAl SEQ. ID. NO.: 1 o delle sue varianti, o della molecola proteica comprendente la sequenza aminoacidica SEQ. ID. NO.: 1, secondo le rivendicazioni 3-8, nell'urina del soggetto in esame rispetto a quella del soggetto considerato sano à ̈ indicativo di cancro uroteliale della vescica.
17. 17. Un metodo secondo le rivendicazioni 11-14, in cui un decremento della quantità del frammento di autoproteolisi della sequenza aminoacidica SEQ. ID. NO.: 1 o delle sue varianti, secondo le rivendicazioni 3-5 e 9-10, nel tessuto del soggetto in esame rispetto a quello del soggetto considerato sano à ̈ indicativo di cancro uroteliale della vescica.
18. 18. Un metodo secondo le rivendicazioni 11-17, in cui il soggetto à ̈ sintomatico.
19. 19. Un metodo secondo le rivendicazioni 11-17, in cui il soggetto à ̈ asintomatico.
20. 20. Un metodo per il monitoraggio dell'efficacia di trattamento del cancro uroteliale della vescica, in cui la proteina HtrA1 viene quantizzata, secondo le rivendicazioni 16 e 17, nell'urina o nel tessuto di un paziente.
21. 21. Un kit diagnostico che include l'uso di un ligando capace di riconoscere in modo specifico, di legare e di quantizzare la proteina HtrA1 SEQ. ID. NO.: 1 o il suo frammento di autoproteolisi o le loro rispettive varianti, o la molecola proteica che comprende la sequenza aminoacidica SEQ. ID. NO.: 1, secondo le rivendicazioni 3-5, nei fluidi biologici o nel tessuto vescicale del soggetto in esame.
22. 22. Il kit secondo la rivendicazione 21 per l'uso dei metodi secondo le rivendicazioni 11-20.
23. 23. Un metodo per il trattamento del cancro uroteliale della vescica, in cui viene somministrata al paziente una dose terapeuticamente attiva: (i) di un anticorpo che in modo specifico si lega alla proteina HtrAl SEQ. ID. NO.: 1 o al suo frammento di autoproteolisi o alle loro rispettive varianti, o alla molecola proteica che comprende la sequenza aminoacidica SEQ. ID. NO.: 1, secondo le rivendicazioni 3-5; e/o (ii) del frammento di autoproteolisi della sequenza aminoacidica SEQ. ID. NO.: 1 o di sue varianti, secondo le rivendicazioni 3-5.
24. 24. Un metodo secondo la rivendicazione 23, in cui l'anticorpo à ̈ coniugato ad un agente citotossico.
25. 25. Una composizione farmaceutica che consiste (i) di un anticorpo che in modo specifico si lega alla proteina HtrAl SEQ. ID. NO.: 1 o al suo frammento di autoproteolisi o alle loro rispettive varianti, o alla molecola proteica che comprende la sequenza aminoacidica SEQ. 1, secondo le rivendicazioni 3-5; e/o (ii) del frammento di autoproteolisi della sequenza aminoacidica SEQ. ID. NO.: 1 o di sue varianti, secondo le rivendicazioni 3-5.
26. 26. Una composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 25, in cui l' anticorpo à ̈ coniugato ad un agente citotossico.
27. 27. Un metodo per l'imaging del cancro della vescica, in cui al paziente viene somministrato un anticorpo che si lega in modo specifico alla proteina HtrAl SEQ. ID. NO.: 1 o al suo frammento di autoproteolisi o alle loro rispettive varianti, o alla molecola proteica che comprende la sequenza aminoacidica SEQ. ID. NO.: 1, secondo le rivendicazioni 3-5.
28. 28. Un metodo secondo la rivendicazione 27, in cui l' anticorpo à ̈ coniugato ad un marker rilevabile.
29. 29. Una composizione farmaceutica che consiste di un anticorpo che in modo specifico si lega alla proteina HtrAl SEQ. ID. NO.: 1 o al suo frammento di autoproteolisi o alle loro rispettive varianti, o alla molecola proteica che comprende la sequenza aminoacidica SEQ. ID. NO.: 1, secondo le rivendicazioni 3-5, in cui l' anticorpo à ̈ coniugato ad un marker rilevabile.
30. 30. Una composizione farmaceutica secondo le rivendicazioni 25, 26 e 29 in cui l'anticorpo lega l'epitopo costituito dalla sequenza aminoacidica compresa tra l' aminoacido 23 e raminoacido 480 della proteina HtrAl SEQ. ID. NO.: 1. 31. 1 metodi secondo le rivendicazioni 23, 24 e 27, 28 in cui l'anticorpo lega l’epitopo costituito dalla sequenza aminoacidica compresa tra Γ aminoacido 23 e l' aminoacido 480 della proteina HtrAl SEQ. ID. NO.: 1.