CN115267187B - Mct1定位检测方法及其在尿路系统癌症中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及MCT1定位检测方法及其在尿路系统癌症危险度分级和治疗方案选择上的应用,在86例尿路上皮癌病例中通过免疫组化方法观察MCT1表达情况对预后预测和靶向治疗筛选的研究结果;结果表明,MCT1在细胞不同位置,病例的预后不一样,故可以根据定位检测来对病例采取不同治疗方案,本发明检测技术操作简便、过程快捷、判读方便,可以准确判断预后和靶点筛选。
Description
技术领域
本发明涉及检测医学和临床诊断领域,具体涉及单羧酸转运蛋白1(MCT1)定位检测方法及其在尿路系统癌症危险度分级和治疗方案选择中的应用领域。
背景技术
尿路上皮癌是泌尿系统最常见、发病部位最多的恶性肿瘤,可发生于膀胱、肾脏及输尿管等器官,尤其是膀胱。根据细胞异型程度,尿路上皮癌可分为低级别和高级别两种亚型;根据浸润深度,可分为非肌层浸润性和肌层浸润性病变。美国癌症联合委员会(AJCC)分期是目前尿路上皮癌预后预测的常用指标,以发生在膀胱的尿路上皮癌为例,对于膀胱全切标本,根据AJCC的疾病进展情况,可分为0、I、II、III和IV期,其中0-I期定义为早期病变,包括原位癌和未浸润肌层、未出现淋巴结和远处转移的病例;II-IV期为进展期病变,依次表现为肌层浸润、肌层外浸润、出现淋巴结或远处转移。而对于电切标本,因无法判断浸润深度、淋巴结累犯以及远处转移情况,所以无法行AJCC分期来判断预后,提示AJCC分期在尿路上皮癌病例预后预测方面具有一定的局限性。
SLC16A1基因编码的单羧酸转运蛋白1(MCT1)是一种跨膜蛋白,属于MCT家族成员基因,具有乳酸/质子同向转运功能,可调节肿瘤细胞内pH稳态和线粒体代谢。一系列证据表明MCT1在实体瘤中具有致癌性。通过公共数据库肿瘤测序分析,与低级别胶质瘤和正常组织对照相比,高级别胶质瘤中的SLC16A1 mRNA表达水平显著增加。
对现有技术的国内外文献和专利进行检索,获得如下现有技术的成果:
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研究显示由于肿瘤细胞生长旺盛的特点,因此肿瘤细胞是在一种相对缺氧环境下生长的,它们常常通过无氧糖酵解产生ATP获取能量,这将导致肿瘤细胞内乳酸等酸性物质生长增多,引起肿瘤细胞胞内酸化,但通常肿瘤细胞可能是通过胞膜上的单羧酸转运泵(monocarboxylate transporter MCT)将大量酸性产物排出细胞外。其中,MCT1在子宫内膜癌、鳞癌、尿路上皮癌进展期病例中膜浆阳性的病例比无MCT1表达病例预后差。因此在相关尿路上皮癌研究(如图1所示)方法中,有学者尝试对MCT1胞浆阳性程度进行评分,根据着色深浅人为分为3+、2+、1+三个级别,评分从高至低着色逐渐减弱。但是这种方法重复性差、不同病理医生之间一致性低,因此可行性低;此外该项研究中将MCT1膜浆阳性定义为阳性病例,并未与正常非肿瘤性膀胱粘膜表达情况相比较,也未提及何为MCT1阴性病例,因此MCT1定位检测方法目前还不完整,也不成熟,更重要的,在尿路系统癌症危险度分级和治疗方案选择中无法开展应用。
发明内容
本发明的目的在于本发明提供快速准确判定尿路系统癌症危险度级别和治疗方案预测的MCT1定位检测方法,并填补MCT1定位检测应用的空白,填补尿路系统癌症危险程度判断缺乏分子指标的空白,即MCT1定位检测方法在尿路系统癌症危险度分级和治疗方案选择中的应用。
本发明旨在提供一种MCT1定位检测方法,从而辅助评估尿路系统癌症危险度以及尿路系统癌症的治疗方案的选择。
本发明旨在提供一种尿路系统癌症危险度分级的方法,即MCT1定位检测方法在确定尿路系统癌症危险度中的应用,从而辅助尿路系统癌症的治疗。
鉴于本领域的上述要求,本发明的一些实施方式提供确定受试者样本中MCT1表达水平在确定诊断尿路系统癌症,特别是尿路上皮癌危险度的用途。
在一些实施方式中,本发明提供一种单羧酸转运蛋白1(MCT1)定位检测方法,用于对尿路系统癌症危险度进行分级并选择对应的治疗方案,包括:
S1,通过免疫组织化学染色法在尿路系统癌症的尿路上皮癌组织中检测MCT1在所述尿路上皮癌组织上的不同定位;
S2,根据MCT1在所述尿路上皮癌组织上的不同定位判定癌症患者的危险度层级;
S3,基于所述危险度层级确定治疗策略评估。
在一些实施方式中,所述S1采用尿路上皮癌的石蜡标本检测MCT1在所述尿路上皮癌组织上的不同定位;所述石蜡样本为尿路上皮癌组织样本,通过活检、内镜切除、电切或外科手术的方式获得。
在一些实施方式中,所述S2的不同定位包括在蛋白水平确定MCT1在所述尿路上皮癌组织上的表达水平。
在一些实施方式中,在蛋白水平确定MCT1在所述尿路上皮癌组织上的表达水平时,采用抗MCT1蛋白或其可溶性蛋白片段的抗体,多克隆抗体或单克隆抗体均可用于实施本公开的技术方案。例如利用免疫组化的原理,采用抗MCT1蛋白或其可溶性蛋白片段的抗体确定MCT1蛋白的表达水平。
在一些实施方式中,所述S2包括:
若所述MCT1的蛋白定位为MCT1核阳性,判定癌症患者的危险度层级为低危险度;
若所述MCT1的蛋白定位为MCT1膜浆阳性,判定癌症患者的危险度为高危险度。
在一些实施方式中,所述S3所述治疗策略评估包括预测尿路系统癌症预后和治疗方法筛选。
在一些实施方式中,所述预测尿路系统癌症预后包括:
若所述MCT1的蛋白定位为MCT1核阳性,所述预测尿路系统癌症预后为预后好;
若所述MCT1的蛋白定位为MCT1膜浆阳性,所述预测尿路系统癌症预后为预后差,提示疾病进展快。
在一些实施方式中,所述治疗方法筛选包括:
若所述MCT1的蛋白定位为MCT1核阳性,所述MCT1核阳性提示微卫星不稳定(MSI-H),所述治疗方法筛选为MCT1核阳性组对免疫疗法更敏感,能从免疫治疗药物获益;
若所述MCT1的蛋白定位为MCT1膜浆阳性,所述MCT1膜浆阳性的所述治疗方法筛选为MCT1靶向治疗。
在正常生理pH值条件下,乳酸不能自由通过细胞膜,其转运主要依靠单羧酸转运蛋白MCT;尿路恶性肿瘤的特点是在正常供氧情况下,有氧糖酵解仍是主要方式。乳酸堆积过多会导致细胞内pH值下降,而导致细胞凋亡,为了使细胞内乳酸堆积减少,肿瘤细胞内的MCT1的表达会显著增强,从而应对乳酸堆积而导致的细胞内酸化。MCT1在癌细胞癌变过程中出现高表达,从而MCT1可能作为肿瘤治疗的潜在靶点,且MCT1高表达与较差的无进展生存相关,与淋巴结转移和远处转移相关,MCT1高表达总生存率与低表达短(中)位生存率低,通过体外和体内实验,MCT1的下调抑制了尿路移行上皮癌细胞的增殖、迁移和侵袭;MCT1致癌作用是通过影响上皮间质转化和有氧糖酵解来表现的。
在一些实施方式中,本发明提供MCT1定位检测方法在尿路系统癌症危险度分级中的应用。
在一些实施方式中,本发明提供MCT1定位检测方法在尿路系统癌症治疗方案选择中的应用。
本发明的有益效果:
根据MCT1的不同定位,可以准确判定癌症患者的危险度层级,并针对该危险度提供治疗策略评估,故本发明相对于现有技术而言,检测技术操作简便、过程快捷、判读方便,可以准确进行危险度分层和提供相应治疗方案预测;而且无论对全膀胱或肾脏切除标本,还是电切活检标本均适用,应用范围广。
说明书附图
图1为既往研究中尿路上皮癌MCT1胞浆不同阳性程度代表性图片:
图1A被定义为3+;
图1B被定义为2+;
图1C被定义为1+;
图1D被定义为-。
图2为本发明中MCT1不同定位代表性图片:
图2A示正常膀胱尿路上皮HE形态;
图2B示正常尿路上皮MCT1核定位;
图2C示代表性MCT1核定位的高级别尿路上皮癌HE形态;
图2D示相应的MCT1核定位;
图2E示代表性MCT1膜浆阳性定位的高级别尿路上皮癌HE形态;
图2F示相应的MCT1膜浆定位;
图3为MCT1不同定位与生存期和mRNA水平的关系:
图3A示核定位组癌症特异性生存期明显高于膜浆定位组(p<0.0001);
图3B示核定位组MCT1蛋白相关基因SLC16A1 mRNA水平远远低于膜浆定位组水平(p<0.0001);
图4为核定位组基因高度微卫星不稳定性情况:
图4A示核定位组DNA错配修复基因下调(p<0.05);
图4B示MSH6在核定位组几乎无表达;
图5示MCT1定位检测后的危险度分级和治疗方案评估流程。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明。需注意的是,以下实施例只用于说明本发明,而不用于限制本发明的范围。对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
将86名患者的福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE)标本用于免疫组织化学(IHC)研究。具体步骤如下:
实验病例石蜡包埋标本用于免疫组化的切片厚度为4um,65℃烘干两小时后进行脱蜡和水化,PH7.4磷酸盐缓冲溶液冲洗3遍,每次3min,置于PH8.0 EDTA缓冲液中120℃高压2分30秒抗原修复,冷却至室温后自来水冲洗,PH7.4磷酸盐缓冲溶液冲洗,加入过氧化氢酶阻断剂20分钟,PH7.4磷酸盐缓冲溶液冲洗,加入单克隆小鼠抗MCT1抗体(1:200稀释度;Santacruz,Abcam,Cambridge,Ma,USA)4℃过夜、PH7.4磷酸盐缓冲溶液3遍,每次3min,滴加二抗(Maxvision-HRP、山羊抗兔,购自福州迈新生物技术有限公司),37℃孵育20分钟,PH7.4磷酸盐缓冲溶液冲洗3遍,每次3min,滴加DAB染色液显色,苏木素复染,盐酸乙醇分化,碱性缓冲溶液返蓝,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。
MCT1不同定位方式代表性HE染色和免疫组化染色结果如图2所示。图2A图为正常膀胱尿路上皮HE形态;图2B图为正常尿路上皮MCT1核定位;图2C图为代表性MCT1核定位的高级别尿路上皮癌HE形态;图2D为相应的MCT1核定位;图2E图为代表性MCT1膜浆阳性定位的高级别尿路上皮癌HE形态;图2F为相应的MCT1膜浆定位。
通过对上述分组病例生存期的分析,发现核定位组病例(62例)癌症特异性生存期明显高于膜浆定位组(24例)(图3A所示,p<0.0001),进展期病例中膜浆阳性定位更常见(表1,p<0.0001)。同时RNA测序分析显示膜浆定位组MCT1蛋白相关基因SLC16A1mRNA水平远远高于核定位组水平(图3B所示,p<0.0001),提示膜浆定位组病例可在MCT1通路靶向治疗中受益。
表1 MCT1蛋白不同定位方式在早期(0-I期)和进展期(II-IV期)尿路上皮病例分布情况
通过GO分析和GSEA富集分析发现,核定位组DNA错配修复基因下调(如图4A所示,p<0.05),其中MSH6基因在核定位组几乎无表达(如图4B所示),提示核定位组为高度微卫星不稳定(MSI-H),可在免疫治疗中获益。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (1)
1.一种MCT1定位检测方法在制备对尿路系统癌症危险度进行分级的试剂中的应用,其特征在于,包括:
S1,通过免疫组织化学染色法在尿路系统癌症的尿路上皮癌组织中检测MCT1在所述尿路上皮癌组织上的不同定位;
S2,根据MCT1在所述尿路上皮癌组织上的不同定位判定癌症患者的危险度层级;
S3,基于所述危险度层级确定治疗策略评估;
所述S1采用尿路上皮癌的石蜡标本检测MCT1在所述尿路上皮癌组织上的不同定位;所述石蜡样本为尿路上皮癌组织样本,通过活检、内镜切除、电切或外科手术的方式获得;
所述S2的不同定位包括在蛋白水平确定MCT1在所述尿路上皮癌组织上的表达水平;
在蛋白水平确定MCT1在所述尿路上皮癌组织上的表达水平时,采用抗MCT1蛋白或其可溶性蛋白片段的抗体,所述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体;
所述S2包括:
若所述MCT1的蛋白定位为MCT1核阳性,判定癌症患者的危险度层级为低危险度;
若所述MCT1的蛋白定位为MCT1膜浆阳性,判定癌症患者的危险度层级为高危险度;
所述S3所述治疗策略评估包括预测尿路系统癌症预后和治疗方法筛选;
所述预测尿路系统癌症预后包括:
若所述MCT1的蛋白定位为MCT1核阳性,所述预测尿路系统癌症预后为预后好;
若所述MCT1的蛋白定位为MCT1膜浆阳性,所述预测尿路系统癌症预后为预后差,提示疾病进展快;
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若所述MCT1的蛋白定位为MCT1核阳性,所述MCT1核阳性提示微卫星高不稳定,所述治疗方法筛选为MCT1核阳性组对免疫疗法更敏感,能从免疫治疗药物获益;
若所述MCT1的蛋白定位为MCT1膜浆阳性,所述MCT1膜浆阳性的所述治疗方法筛选为MCT1靶向治疗。
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