JP7454756B2 - がんを診断するための方法、がん診断用組成物、がん診断用キット、がんの状態を評価する方法、並びにがん予防薬及び／又は治療薬をスクリーニングする方法 - Google Patents

がんを診断するための方法、がん診断用組成物、がん診断用キット、がんの状態を評価する方法、並びにがん予防薬及び／又は治療薬をスクリーニングする方法 Download PDF

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Description

本発明は、がんを診断するための方法、がん診断用組成物、がん診断用キット、がんの状態を評価する方法、並びにがん予防薬及び／又は治療薬をスクリーニングする方法に関する。
生細胞は、細胞外シグナルに応答して、遺伝子発現を制御又は調節する、膨大な数の細胞内シグナル伝達経路を含んでいる。プロテインキナーゼによるリン酸化は、これらの細胞内シグナル伝達経路における標的タンパク質を活性化し、細胞増殖において重要な役割を果たしている（非特許文献１～３参照）。リン脂質依存型セリン／スレオニンキナーゼの１つであるプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）は、最も重要なキナーゼの一つであり、構成及び活性化の特徴に基づいて３つのサブファミリーに分類される。すなわち、従来又は古典的ＰＫＣ（ｃＰＫＣ；α、βＩ、βＩＩ及びγ）、新規又は非古典的ＰＫＣ（ｎＰＫＣ；δ、ε、η及びθ）、ならびに非定型ＰＫＣ（ζ、ι及びλ）（非特許文献４～６参照）である。
ＰＫＣアイソザイムのうち、ＰＫＣαに関しては、正常組織においてはごくわずかな活性しか示さず、ほとんどのがん細胞（例えば、肝がん、乳がん及びメラノーマ）において過剰発現又は高活性化されることが知られている（非特許文献７～１０参照）。
Adjei, A. A., andHidalgo, M. (2005) Intracellular signal transduction pathway proteins astargets for cancer therapy. J. Clin. Oncol. 23, 5386-5403. Cross, T. G.,Scheel-Toellner, D., Henriquez, N. V., Deacon, E., Salmon, M., and Lord, J. M.(2000) Serine/threonine protein kinases and apoptosis. Exp. Cell Res. 256,34-41. Bode, A. M., andDong, Z. (2005) Signal transduction pathways in cancer development and astargets for cancer prevention. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 79, 237-297. Newton, A. C.(1997) Regulation of protein kinase C. Curr. Opin. Cell Biol. 9, 161-167. Blobe, G. C.,Obeid, L. M., and Hannun, Y. A. (1994) Regulation of protein kinase C and rolein cancer biology. Cancer Metastasis Rev. 13, 411-431. Webb, B. L. J.,Hirst, S. J., and Giembycz, M. A. (2000) Protein kinase C isoenzymes: a reviewof their structure, regulation and role in regulating airways smooth muscletone and mitogenesis. Br. J. Pharmacol. 130, 1433-1452. Oka, M., andKikkawa, U. (2005) Protein kinase C in melanoma. Cancer Metast. Rev. 24,287-300. Mackay, H. J., andTwelves, C. J. (2003) Protein kinase C: a target for anticancer drugs?Endocrin. Relat. Cancer 10, 389-396. Hofmann, J. (2004)Protein kinase C isozymes as potential targets for anticancer therapy. Curr.Cancer Drug Targets 4, 125-146. Goekjian, P. G.,and Jirousek, M. R. (2001) Protein kinase C inhibitors as novel anticancerdrugs. Expert. Opin. Investig. Drugs 10, 2117-2140. O’Brian, C. A.,Chu, F., Bornmann, W. G., and Maxwell, D. S. (2006) Protein kinase Cα and εsmall-molecule targeted therapeutics: a new roadmap to two holy grails in drugdiscovery? Expert. Rev. Anticancer Ther. 6, 175-186.
本発明は、新規ながんのバイオマーカーを提供することを目的とする。
上述のように、ほとんどのがん細胞で高発現又は高活性化されることが報告されている一方で、ＰＫＣαは、腎小体の糸球体の機能から、尿中には排出されないと予想される。ＰＫＣαは分子量８２ｋＤａの陰性荷電分子であるが、腎小体の糸球体は、６０ｋＤａ以上のタンパク質分子を通過させないサイズバリア効果と、陰性荷電物質が電気的に反発して通過できないチャージバリアという２つの機能を有しているためである。
本発明者らは、この予想に反して、がん患者の尿中で活性型プロテインキナーゼＣα（活性型ＰＫＣα）が検出できることを見いだし、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、例えば、以下の〔１〕～〔９〕を含む。
〔１〕
尿中の活性型プロテインキナーゼＣα（活性型ＰＫＣα）を検出する工程を含む、がんを診断するための方法。
〔２〕
上記がんが、泌尿器系がんを含む、〔１〕に記載の方法。
〔３〕
上記がんが、尿路上皮がんを含む、〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
〔４〕
上記がんが、筋層非浸潤がんを含む、〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕
活性型ＰＫＣαを検出するための抗体又は基質ペプチドを含み、被験者の尿を用いて診断することを特徴とする、がん診断用組成物。
〔６〕
活性型ＰＫＣαを検出するための抗体又は基質ペプチドを含み、被験者の尿を用いて診断することを特徴とする、がん診断用キット。
〔７〕
活性型ＰＫＣαに対する抗体と被験者の尿とを反応させて活性型ＰＫＣαを検出し、得られる検出結果を指標としてがんの状態を評価する方法。
〔８〕
活性型ＰＫＣαの基質ペプチドを被験者の尿と反応させ、リン酸化された当該ペプチドを検出し、得られる検出結果を指標としてがんの状態を評価する方法。
〔９〕
がんの予防薬及び／又は治療薬をスクリーニングする方法であって、
泌尿器系がんモデル非ヒト哺乳動物に候補物質を投与する工程、
上記非ヒト哺乳動物の尿中の活性型ＰＫＣαを検出する工程、及び
得られる結果を指標として目的のがん予防薬及び／又は治療薬を選択する工程を含む、方法。
本発明によれば、尿中の活性型ＰＫＣαをバイオマーカーとして利用した、がんを診断するための方法、がん診断用組成物、がん診断用キット、がんの状態を評価する方法、並びにがん予防薬及び／又は治療薬をスクリーニングする方法を提供することができる。本発明は、尿中のバイオマーカーを用いるため、簡便であり、非侵襲的である。また、後述するように、初期がんに対する特異度及び感度も高い。
膀胱がん由来の培養細胞（ＫＵ－１、ＫＵ－７、Ｔ２４、ＴＣＣＳＵＰ、ＵＭＵＣ－３）における基質ペプチドのリン酸化反応をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳにより分析した結果を示す、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳスペクトルを表す図である。 膀胱がん由来の培養細胞（ＫＵ－１、ＫＵ－７、Ｔ２４、ＴＣＣＳＵＰ、ＵＭＵＣ－３）における基質ペプチドのリン酸化率（％）を示すグラフである。 尿路上皮がん患者の症例情報を示す。グレーのセルは、結果が陽性又は数値が閾値以上であることを表す。Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｙｐｅ（ｐｒｉｍａｒｙ）はがんの組織型（一次）、ｕｒｉｎａｌｙｓｉｓ（ＲＢＣ）は尿検査（赤血球）、ｕｒｉｎａｌｙｓｉｓ（ＷＢＣ）は尿検査（白血球）、ｕｒｉｎｅ ｃｙｔｏｌｏｇｙは尿細胞診を示す。 非尿路上皮がん患者の症例情報を示す。グレーのセルは、結果が陽性又は数値が閾値以上であることを表す。ｕｒｉｎａｌｙｓｉｓ（ＲＢＣ）は尿検査（赤血球）、ｕｒｉｎａｌｙｓｉｓ（ＷＢＣ）は尿検査（白血球）を示す。 尿路上皮がん患者及び非尿路上皮がん患者からの尿中サンプルにおける基質ペプチドのリン酸化率を示すヒストグラフである。白丸の線は尿路上皮がん患者、黒丸の線は、非尿路上皮がん患者を示す。 尿路上皮がん患者及び非尿路上皮がん患者からの尿中サンプルにおける基質ペプチドのリン酸化率及び頻度の関係を確率密度関数で示したグラフである。白丸の線は尿路上皮がん患者、黒丸の線は、非尿路上皮がん患者を示す。 尿路上皮がん患者及び非尿路上皮がん患者からの尿中サンプルにおける基質ペプチドのリン酸化率及び頻度の関係を累積分布関数で示したグラフである。白丸の線は尿路上皮がん患者、黒丸の線は、非尿路上皮がん患者を示す。 ｌｏｗ ｇｒａｄｅの尿路上皮がん患者及びｈｉｇｈ ｇｒａｄｅの尿路上皮がん患者からの尿中サンプルにおける基質ペプチドのリン酸化率を示すグラフである（＊：Ｐ＜０．０５）点線はカットオフ値（リン酸化率２％）を示す。 尿中サンプルを用いた基質ペプチドのリン酸化率に基づく診断の受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線である。一点鎖線はｌｏｗ ｇｒａｄｅの尿路上皮がん患者のＲＯＣ曲線、実線はｈｉｇｈ ｇｒａｄｅの尿路上皮がん患者のＲＯＣ曲線を示す。
本発明は、がん患者の尿中に活性型ＰＫＣαが存在するという発見に基づき、尿中の活性型ＰＫＣαをがんのマーカーとして利用するものである。
［活性型ＰＫＣα］
活性型ＰＫＣαは、ヒトのＰＫＣαにおける４９７番目のスレオニン残基、６３８番目のスレオニン残基、及び６５７番目のセリン残基、又は他の動物のＰＫＣαにおけるそれに対応するスレオニン残基とセリン残基がリン酸化されることで活性化したＰＫＣαを意味する。
［対象となるがん］
診断や評価の対象となるがん（がん種）は、特に限定はされず、２種以上のがん種を診断や評価の対象とすることができる。対象となるがんは、泌尿器系がんを含むことが好ましい。泌尿器系がんとしては、例えば、腎実質と腎盂・尿管・膀胱・尿道から成る尿路、及び前立腺、精嚢、陰茎、精巣等の生殖器における腫瘍が挙げられ、代表的なものとしては、尿路上皮がん、前立腺がん、腎がん、精巣がんが挙げられる。
対象となるがんは、尿路上皮がんを含んでいてもよい。尿路上皮がんとしては、例えば、膀胱がん、尿管がん、尿道がん及び腎盂がんが挙げられる。対象となるがんは、膀胱がん、尿管がん、尿道がん及び腎盂がんからなる群から選択されてもよい。
尿路上皮がんは、腎盂から尿管、膀胱、尿道の一部へとつながる尿路の内側の尿路上皮（移行上皮）と呼ばれる粘膜尿路の細胞から発生するがんを言う。尿路上皮がんの主な一つが膀胱がんであり、膀胱がんの異型度（Ｔｕｍｏｒ ｇｒａｄｅ）は、低異型度(ｌｏｗ ｇｒａｄｅ)と高異型度（ｈｉｇｈ ｇｒａｄｅ）の二段階、又はＧ１からＧ３までの３段階で評価され、高異型度及びＧ３の方が細胞異型が強く、悪性度が高い。また、深達度（Ｔ ｓｔａｇｅ）は以下のように分けられ、ＴａからＴ１が筋層非浸潤がん、その内Ｔｉｓは上皮内がんと呼ばれ、Ｔ２かそれ以上が筋層浸潤がんである（日本泌尿器科学会・日本病理学会・日本医学放射線学会編「腎盂・尿管・膀胱癌取扱い規約 ２０１１年４月（第１版）」（金原出版））。
ＴＸ ：原発腫瘍の評価が不可能
Ｔ０ ：原発腫瘍なし
Ｔａ ：乳頭状非浸潤がん
Ｔｉｓ：上皮内がん（ＣＩＳ）
Ｔ１ ：上皮下結合組織に浸潤する腫瘍
Ｔ２ａ：筋層の半ばまでの浸潤
Ｔ２ｂ：浸潤が筋層の半ばを越えるもの
Ｔ３ａ：膀胱周囲脂肪組織への顕微鏡的浸潤が想定される
Ｔ３ｂ：膀胱周囲脂肪組織への肉眼的にはっきりとした壁外浸潤が想定される
Ｔ４ａ：前立腺、精嚢、子宮あるいは腟への浸潤
Ｔ４ｂ：骨盤壁あるいは腹壁への浸潤
現在、がんのバイオマーカーとして、Ｎｕｃｌｅａｒ ｍａｔｒｉｘ ｐｒｏｔｅｉｎ ２２ （ＮＭＰ２２）、Ｂｌａｄｄｅｒ ｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ ｔｅｓｔ（ＢＴＡ ｔｅｓｔ）等が使用されているが、いずれも膀胱がんマーカーとしての感度（特にｌｏｗ ｇｒａｄｅのがんに対する感度）が低いことが問題となっている。これに対し、本発明の尿中の活性型ＰＫＣαを利用したマーカーは、筋層非浸潤がん、特にｌｏｗ ｇｒａｄｅのがんに対しても高い特異度及び感度を示す。したがって、対象となるがんは、例えば、筋層非浸潤がんであってよく、ｌｏｗ ｇｒａｄｅのがんであってよく、上皮内がんであってもよい。
［がんを診断するための方法］
本実施形態に係る方法は、がん患者の尿中に活性型ＰＫＣαが存在することに基づき、対象（被験者）ががんであることを診断するための指標を提供するものである。本実施形態に係るがんを診断するための方法は、尿中の活性型ＰＫＣαを検出する工程を含む。
本実施形態に係る方法は、被験試料である尿（尿検体）を採取する工程をさらに含んでいてもよい。尿は、例えば、採尿容器を用いて採取することができる。尿は、対象から採取したものを用いることができる。対象は、ヒトであってよく、非ヒト哺乳類動物であってもよい。対象は、がんを有すると疑われる動物であってもよい。
本実施形態に係る方法は、活性型ＰＫＣαの検出方法に合わせて、尿検体を適宜前処理する工程を含んでいてもよい。そのような前処理としては、例えば、遠心処理、加温、界面活性剤添加、ホモジナイザー及び超音波破砕処理装置等による細胞の破砕、サンプルバッファー等による希釈、プロテアーゼ阻害剤による処理等が挙げられる。
本実施形態に係る方法は、例えば、尿中の活性型ＰＫＣαの量に基づいて、がんを診断するための指標を提供することができる。がんを診断するための指標としては、例えば、がんを発症しているか又は発症する可能性が高いとの指標、逆にがんを発症している可能性又は発症する可能性が低いとの指標が挙げられる。例えば、対象の尿中の活性型ＰＫＣαの量が基準値と比べて多いことが、がんを発症しているか又は発症する可能性が高いことを示すものであってよい。基準値は、例えば、健常者の尿における活性型ＰＫＣαの量に基づいて設定した値でもよく、がん患者の尿における活性型ＰＫＣαの量に基づいて設定した値でもよく、健常者の尿における活性型ＰＫＣαの量とがん患者の尿における活性型ＰＫＣαの量を比較することにより設定した値であってもよい。当該基準値は、例えば、対象の活性型ＰＫＣαの量を直接比較するための値であってもよく、健常者の尿における活性型ＰＫＣαの量と比較した場合の倍率（例えば、１０倍）として設定された値であってもよい。基準値は、複数のサンプルに基づいて設定された値、例えば、平均値であってもよい。ここで、上記における「健常者」を、がんを発症していない者（非がん患者）に置き換えてもよく、非がん患者は、例えば、特定のがん（例えば、泌尿器系がん）を発症していないと診断されている者であってもよい。
また、本実施形態に係る方法は、同一対象の活性型ＰＫＣα量を定期的にモニターすることで、がんの状態（病状）を判断することにも利用できる。例えば、対象の尿中の活性型ＰＫＣαの量が増加傾向にあることが、がんを発症しているか又は発症する可能性が高いことを示すものであってよい。
対象の尿中の活性型ＰＫＣαを検出する方法は、特に制限されるものではなく、公知の方法により行うことができる。例えば、活性型ＰＫＣαは、リン酸化作用を有するため、対象の尿中と、活性型ＰＫＣαの基質ペプチドを反応させ、リン酸化された当該ペプチドを検出することもできる。また、例えば、活性型ＰＫＣαに対する抗体を尿と反応させて活性型ＰＫＣαを直接検出することができる。したがって、尿中の活性型ＰＫＣαを検出する工程は、例えば、活性型ＰＫＣαの基質ペプチドと尿とを反応させて、リン酸化された当該ペプチドを検出することを含んでもよく、活性型ＰＫＣαに対する抗体と尿とを反応させてＰＫＣαを検出することを含んでもよい。
［基質ペプチドを用いた検出］
尿中の活性型ＰＫＣαを検出する工程が、活性型ＰＫＣαの基質ペプチドと尿とを反応させて、リン酸化された当該ペプチドを検出することを含む場合には、リン酸化されたＰＫＣα基質ペプチドの検出量が基準値と比べて多いことが、対象ががんであることを示すものであってよい。基準値は、例えば、健常者の尿におけるリン酸化されたＰＫＣα基質ペプチドの検出量に基づいて設定した値でもよく、がん患者の尿におけるリン酸化されたＰＫＣα基質ペプチドの検出量に基づいて設定した値でもよく、健常者の尿におけるリン酸化されたＰＫＣα基質ペプチドの検出量とがん患者の尿におけるリン酸化されたＰＫＣα基質ペプチドの検出量を比較することにより設定した値であってもよい。当該基準値は、例えば、対象のリン酸化されたＰＫＣα基質ペプチドの検出量を直接比較するための値であってもよく、健常者の尿におけるリン酸化されたＰＫＣα基質ペプチドの検出量と比較した場合の倍率（例えば、１０倍）として設定された値であってもよい。基準値は、複数のサンプルに基づいて設定された値、例えば、平均値であってもよい。後述するように、リン酸化されたＰＫＣα基質ペプチドの定量を、反応に用いたＰＫＣα基質ペプチドに対するリン酸化率を求めることにより行う場合には、リン酸化率を基準値としてもよい。基準値となるリン酸化率は、例えば、１～７％、１．５％～５％、１．５～４％、又は２％～３％の範囲から設定してもよい。
活性型ＰＫＣαの基質ペプチドは、ＰＫＣαにより特異的にリン酸化され得るペプチドであればよく、限定はされないが、例えば、１０～３０アミノ酸残基（好ましくは１０～２０アミノ酸残基、より好ましくは１０～１５アミノ酸残基）からなる基質ペプチドが挙げられる。当該ペプチドの具体例としては、配列番号１に示されるアミノ酸配列（ＦＫＫＱＧＳＦＡＫＫＫ）からなるペプチド、及び配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチド（ＦＫＫＱＧＴＦＡＫＫＫ）等が好ましく挙げられる。なお、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチドは、本明細書中「アルファトメガ」とも称する。
ＰＫＣα基質ペプチドは、例えば、自動ペプチドシンセサイザーを使用し、標準的なＦｍｏｃ化学手順に従って合成することができる。合成後は、各種クロマトグラフィー等を用いた公知の精製方法により精製することができる。
本実施形態に係る方法において、用いるＰＫＣα基質ペプチドの量は、当業者が適宜設定することができるが、例えば、１～１０００μＭ（好ましくは１～５００μＭ、より好ましくは１～５０μＭ）であってよい。
（ｉ）リン酸化されたＰＫＣα基質ペプチドの検出
被験試料として採取した尿は、例えば、遠心処理、加温、界面活性剤添加、ホモジナイザー及び超音波破砕処理装置等による細胞の破砕、サンプルバッファー等による希釈、プロテアーゼ阻害剤による処理等適宜前処理をしていてもよい。当該希釈を行う場合、サンプルバッファーとしては、例えば、ＨＥＰＥＳ（４－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ等を用いることができる。
必要に応じて前処理を行った後、被験試料を、ＰＫＣα基質ペプチドと接触させると、被験試料に活性型ＰＫＣαが存在する場合には、そのリン酸化作用により、ＰＫＣα基質ペプチドがリン酸化される。当該リン酸化反応では、反応媒体は、特に限定はされないが、例えばＴｒｉｓ－ＨＣｌ及び塩化マグネシウム等を混合してなるバッファーを用いることができ、リン酸基供与基質として、例えばアデノシン３リン酸（ＡＴＰ）等を当該バッファー中に混合して用いることができる。
被験試料とＰＫＣα基質ペプチドとの反応は、３０～４０℃（好ましくは３７℃）で、１０～６０分間（好ましくは３０～６０分間）行う。
リン酸化されたＰＫＣα基質ペプチドの検出は、限定はされないが、公知の免疫検定法（ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）を、その常法に従い、利用して行うことができる。免疫検定法としては、標識化免疫測定法や免疫比濁法（ＴＩＡ）があり、例えば、ＥＬＩＳＡ等の酵素免疫検定法（ＥＩＡ）のほか、放射線免疫検定法（ＲＩＡ）や蛍光免疫検定法（ＦＩＡ）等が挙げられる。また、標識化免疫測定法としては、他の分離方法との組合せを利用したものとして、ウェスタンブロット法（電気泳動法との組合せ）等も挙げられる。これらの中でも、ＥＬＩＳＡ及び／又はウェスタンブロット法が好ましい。また、１種又は２種以上の、リン酸化されたＰＫＣα基質ペプチドに対するモノクローナル抗体を用い、２種以上の免疫検定法を組み合わせて検出を行ってもよく、より一層感度及び信頼性等の高い優れた検出を行うことができる。
リン酸化されたＰＫＣα基質ペプチドの検出方法として、さらに、金属ナノ粒子等の金属コロイドを用いた方法を採用することもできる。当該方法は、詳しくは、基質ペプチドとプロテインキナーゼとを金属コロイドの存在下で反応させた場合、又は基質ペプチドとプロテインキナーゼとの反応後に金属コロイドを添加した場合に、プロテインキナーゼによる基質ペプチドのリン酸化のレベルが、金属コロイドの色調変化に基づいて評価することができる、という原理に基づく方法である。この色調変化は、プロテインキナーゼによる基質ペプチドのリン酸化反応において金属コロイドを存在させることにより、金属コロイド粒子の介在によるリン酸化基質ペプチドの凝集が起こり、この凝集の程度に基づいて金属コロイドの色調が変化する、というものである。また、この金属コロイドの色調は、基質ペプチドのリン酸化の割合に実質的に比例した凝集の程度に応じて変化する。
したがって、上述のように、被験試料とＰＫＣα基質ペプチドとの反応を金属コロイドの存在下で行うか、又は当該反応後に金属コロイドを添加して、試料の色調の変化を、当該反応前の試料と比較する、又はコントロール（健常者から採取した試料との反応）における色調変化と比較することにより、ＰＫＣα基質ペプチドのリン酸化の有無を検出することができる。
上記金属コロイドを用いた方法においては、反応媒体としては、例えば、ＨＥＰＥＳ（４－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）と塩化マグネシウムとを混合してなるバッファー等が用いられ、リン酸基供与基質としては、前述と同様にＡＴＰ等が用いられる。
また、金属ナノ粒子等の金属コロイドとしては、例えば、金コロイド、銀コロイド、白金コロイド、鉄コロイド、水酸化鉄コロイド、水酸化アルミニウムコロイド、パラジウムコロイド、ロジウムコロイド等が用いられる。これらの金属コロイドのうち、金コロイド、銀コロイド等が好ましく、金コロイドがより好ましい。これら金属コロイドは、公知文献に記載の方法により製造することができ、また市販されている製品を用いることもできる。例えば、金ナノ粒子は、一般には、金イオンを含む溶液に還元液を添加して、金イオンを還元する液相還元法によって製造することができる（例えば、特開２００３－２５３３１０号公報、特開２００６－１５２４３８号公報参照。）。
金属コロイドの粒径は、特に限定はされないが、例えば、約１ｎｍ～５００ｎｍであることが好ましく、より好ましくは３ｎｍ～２００ｎｍ、さらに好ましくは５ｎｍ～１００ｎｍである。
金属コロイドは、その粒径にも依存するが、通常、金コロイドであれば赤色を呈し、銀コロイドであれば黄色を呈する。これに対し、例えば、金コロイドを存在させた場合においては、ＰＫＣα基質ペプチドがリン酸化され凝集することにより、当該金コロイドの色調は赤色から青色に変化する。このような色調変化に基づいて、リン酸化されたＰＫＣα基質ペプチドを検出することができる。なお、金属コロイドの色調変化は、好ましくは約６００ｎｍ～８００ｎｍの範囲、より好ましくは約６００ｎｍ～７５０ｎｍの範囲、さらに好ましくは約７００ｎｍ前後の吸光度を測定することによって調べることが望ましい。
（ｉｉ）リン酸化されたＰＫＣα基質ペプチドの定量
定量は、限定はされないが、例えば、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析法（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ）を用いて、反応に用いたＰＫＣα基質ペプチドに対するリン酸化率（リン酸化基質と非リン酸化基質とのイオン強度比）を求めることにより行うことができる。
また、前述の金属コロイドを用いる方法により、リン酸化されたＰＫＣα基質ペプチドを検出する場合は、その金属コロイドの色調変化の程度に基づいて（具体的には、適当なコントロールでの色調変化の程度や予め作成した検量線との比較を行うことにより）、当該リン酸化基質ペプチドを実質的に定量することができる。
リン酸化されたＰＫＣα基質ペプチドの定量又は検出は、市販のキットを用いることもできる。
［抗体を用いた検出］
尿中の活性型ＰＫＣαを検出する工程が、活性型ＰＫＣαに対する抗体と尿とを反応させてＰＫＣαを検出することを含む場合には、活性型ＰＫＣαの検出量が基準値と比べて多いことが、対象ががんであることを示すものであってよい。基準値は、例えば、健常者の尿における活性型ＰＫＣαの検出量に基づいて設定した値でもよく、がん患者の尿における活性型ＰＫＣαの検出量に基づいて設定した値でもよく、健常者の尿における活性型ＰＫＣαの検出量とがん患者の尿における活性型ＰＫＣαの検出量を比較することにより設定した値であってもよい。当該基準値は、例えば、対象の活性型ＰＫＣαの検出量を直接比較するための値であってもよく、健常者の尿における活性型ＰＫＣαの検出量と比較した場合の倍率（例えば、１０倍）として設定された値であってもよい。基準値は、複数のサンプルに基づいて設定された値、例えば、平均値であってもよい。
活性型ＰＫＣαに対する抗体（抗ＰＫＣα抗体）は、以下のようにして作製することができる。
（Ａ）ポリクローナル抗体の作製
（ｉ）抗原及びその溶液の調製
抗ＰＫＣα抗体を作製するに当たり、まず、免疫源（抗原）として用いるタンパク質を調製又は入手することが必要である。
抗原タンパク質としては、精製ＰＫＣαを用いることができるが、これに限定はされず、例えば、ＰＫＣαのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＰＫＣα活性を有するタンパク質を用いることもできる。なお、ＰＫＣαとしては、例えば哺乳動物由来のＰＫＣα、具体的にはヒト由来のＰＫＣα、マウス由来のＰＫＣα又はラット由来のＰＫＣα等を用いることができる。ここで、各動物由来のＰＫＣαの塩基配列及びアミノ酸配列情報は、それぞれ以下のアクセッション番号から入手可能である。
＜ヒト由来のＰＫＣα＞
・ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号：ＮＭ ００２７３７（塩基配列；配列番号３），ＮＰ ００２７２８（アミノ酸配列；配列番号４）
・ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号：Ｘ５２４７９（塩基配列；配列番号５），ＣＡＡ３６７１８（アミノ酸配列；配列番号６）
＜マウス由来のＰＫＣα＞
・ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号：ＮＭ ０１１１０１（塩基配列；配列番号７），ＮＰ ０３５２３１（アミノ酸配列；配列番号８）
・ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号：Ｍ２５８１１（塩基配列；配列番号９），ＡＡＡ３９９３４（アミノ酸配列；配列番号１０）
＜ラット由来のＰＫＣα＞
・ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号：ＮＭ ００１１０５７１３．１（塩基配列；配列番号１１），ＸＭ ３４３９７５（塩基配列；配列番号１２）
抗原となる精製ＰＫＣαの調製方法としては、限定はされないが、例えば、適当な宿主細胞（ヒト由来の培養繊維芽細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、酵母等）の形質転換体を用いてＰＫＣαを産生し、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いて、調製する方法が挙げられる。
次に、得られた精製ＰＫＣαを、緩衝液に溶解させて抗原溶液を調製する。その際、必要に応じて、免疫を効果的に行うためのアジュバントを添加してもよい。アジュバントとしては、例えば、市販のフロイント完全アジュバントやフロイント不完全アジュバント等を用いることができる。これらアジュバントは、１種のみで用いても２種以上を併用してもよく、限定はされない。
（ｉｉ）免疫、及び抗血清の採取
免疫は、上記精製ＰＫＣαを含む溶液を、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ等）に投与することにより行う。投与は、主として静脈内、皮下、腹腔内に注入して行う。
抗原溶液の１回当たりの投与量は、限定はされず、例えば、動物１匹に対して精製ＰＫＣαが２～５００μｇとなる量とすることが好ましく、より好ましくは１０～１００μｇである。
投与間隔は、限定はされず、例えば、数日～数週間間隔であることが好ましく、より好ましくは２～３週間間隔である。また投与回数は、例えば、２～１０回である。
上記免疫により得られる血清（抗血清）の採取は、限定はされないが、例えば、最終投与の日から１～２８日後に行うことが好ましく、より好ましくは２～１４日後である。抗血清の採取方法は、常法に従い、免疫した動物の血液から採取することができる。
（ｉｉｉ）目的の抗血清の選別
免疫した動物のそれぞれから採取した抗血清の中から、目的の抗血清、すなわち抗ＰＫＣα抗体を含む抗血清をスクリーニングする。
スクリーニング方法は、限定はされないが、例えば、採取した抗血清と、抗原としての精製ＰＫＣαや組換えＰＫＣα（ヒト由来の培養繊維芽細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、酵母等で産生されたもの）又はそれらの変異型酵素とを用い、公知の免疫検定法（ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）を、その常法に従い、利用して行うことができる。免疫検定法としては、標識化免疫測定法や免疫比濁法（ＴＩＡ）があるが、なかでも前者が好ましく、例えば、ＥＬＩＳＡ等の酵素免疫検定法（ＥＩＡ）のほか、放射線免疫検定法（ＲＩＡ）や蛍光免疫検定法（ＦＩＡ）等が好ましく挙げられる。また、標識化免疫測定法としては、他の分離方法との組合せを利用したものとして、ウェスタンブロット法（電気泳動法との組合せ）等も好ましく挙げられる。なお、ウェスタンブロット法の場合は、検出対象となるタンパク質サンプルを熱及び界面活性剤により変性させて用いるため、スクリーニング法における抗原は変異型酵素となる。
上記スクリーニングによる目的の抗血清に含まれる、抗ＰＫＣα抗体は、通常、ポリクローナル抗体である。当該抗体の精製を必要とする場合は、例えば、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー等の公知の精製方法を、１種のみ又は２種以上組み合わせて、適宜採用し実施すればよい。
当該抗ＰＫＣα抗体が特異的に結合し得る（認識し得る）ＰＫＣα中の反応部位は、特に限定はされない。
（Ｂ）モノクローナル抗体の作製
（ｉ） 抗原及びその溶液の調製
抗原及びその溶液の調製は、上記ポリクローナル抗体の作製の場合と同様に行うことができる。
（ｉｉ）免疫、及び抗体産生細胞の採取
免疫方法や、上記抗原溶液を用いた投与量、投与間隔及び投与回数は、上記ポリクローナル抗体の作製の場合と同様の方法及び条件が採用できる。
上記免疫により得られる抗ＰＫＣα抗体を産生する細胞（抗体産生細胞）の採取は、限定はされないが、例えば、最終投与の日から１～１４日後に行うことが好ましく、より好ましくは２～４日後である。
抗体産生細胞としては、例えば、脾臓細胞、リンパ節細胞（特に、局所リンパ節細胞）、末梢血細胞等が好ましく挙げられるが、なかでも脾臓細胞や局所リンパ節細胞（例えば、膝下リンパ節細胞等）がより好ましい。
（ｉｉｉ）細胞融合
採取した抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行うことにより、融合細胞（ハイブリドーマ）を得ることができる。
ミエローマ細胞としては、例えば、マウス等の哺乳動物において一般に入手可能な株化細胞を用いることができる。詳しくは、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミン含有培地）で生育できないが、抗体産生細胞と融合した状態では生育できる性質の株化細胞が好ましい。具体的には、マウスミエローマ細胞としては、例えば、ＰＡＩ、Ｐ３Ｘ６３－Ａｇ．８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）、ＮＳ－Ｉなどを用いることができる。
上記細胞融合は、例えば、血清を含まないＲＰＭＩ－１６４０培地等の動物細胞培養用培地中で、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを混合して融合反応させることにより行う。抗体産生細胞とミエローマ細胞との混合比は、例えば５：１である。
融合反応は、一般には、細胞融合促進剤の存在下で行うことが好ましく、当該促進剤としては、平均分子量１０００～６０００ダルトンのポリエチレングリコール等を使用することができる。また、電気刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。
融合反応後の細胞は、例えばＨＡＴ選択培地による培養を行う。上記培養後、ＨＡＴ選択培地での増殖が認められる細胞が融合細胞（ハイブリドーマ）となる。
（ｉｖ）目的のハイブリドーマの選別、及びそのクローニング
上記培養により得られたハイブリドーマから、目的のハイブリドーマ、すなわち抗ＰＫＣα抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングする。具体的には、培養上清中に、目的とする抗ＰＫＣα抗体が存在するものをスクリーニングする。
スクリーニング方法は、限定はされないが、例えば、培養上清の一部を採取し、抗原として精製ＰＫＣαや組換えＰＫＣα（ヒト由来の培養繊維芽細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、酵母等で産生されたもの）又はそれらの変異型酵素を用いて、公知の免疫検定法（ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）を、その常法に従い、利用して行うことができる。免疫検定法としては、例えばＥＬＩＳＡ等の酵素免疫検定法（ＥＩＡ）のほか、放射線免疫検定法（ＲＩＡ）や蛍光免疫検定法（ＦＩＡ）等が好ましく挙げられる。また、ウェスタンブロット法（電気泳動法との組合せ）等も好ましく挙げられる。なお、ウェスタンブロット法の場合は、検出対象となるタンパク質サンプルを熱及び界面活性剤により変性させて用いるため、スクリーニング法における抗原は変異型酵素となる。
上記スクリーニング後の目的のハイブリドーマの培養上清に含まれる抗ＰＫＣα抗体は、ハイブリドーマのクローニング前に得られている抗体であるが、単一の分子からなる抗体（モノクローナル抗体）であってもよく、限定はされない。
当該抗ＰＫＣα抗体が特異的に結合し得る（認識し得る）ＰＫＣα中の反応部位は、特に限定はされず、例えば、ＰＫＣαがリン酸化される部位（例えば、Ｔｈｒ４９７部位、Ｔｈｒ６３８部位、及びＳｅｒ６５７部位）を特異的に認識する抗体であってもよい。ＰＫＣαがリン酸化される部位を特異的に認識する抗体を用いることで、活性型ＰＫＣαの検出の精度が向上することが期待できる。
上記スクリーニングによる目的のハイブリドーマのクローニング、すなわちモノクローナル抗体産生細胞株の樹立は、一般には、限界希釈法を用いた培養等により、１細胞由来のコロニーを選択することによって行うことができる。
（ｖ）モノクローナル抗体の採取
上記クローニングにより得られたハイブリドーマから、モノクローナル抗体を採取する方法としては、限定はされないが、一般には、細胞培養法若しくは腹水形成法等を採用することができる。
細胞培養法では、クローニングにより得られたハイブリドーマを、例えば、動物細胞培養用培地中で、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で、７～１４日間培養し、その後の培養上清から目的のモノクローナル抗体を採取することができる。
腹水形成法では、例えば、細胞融合の際に用いたミエローマ細胞の由来元である哺乳動物と同種系列の動物の腹腔内に、クローニングにより得られたハイブリドーマを、動物１匹当たり１０６個程度投与して、当該ハイブリドーマを大量増殖させ、投与してから７～１４日間後に採取した腹水又は血清から、目的のモノクローナル抗体を採取することができる。
細胞培養法及び腹水形成法のいずれにおいても、モノクローナル抗体の採取時又は採取後に当該抗体の精製を必要とする場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー等の公知の精製方法を、１種のみ又は２種以上組み合わせて、適宜採用し実施することができる。
本実施形態に係る方法において、用いる抗ＰＫＣα抗体の量は、当業者が適宜設定することができるが、例えば１μｇを基準として、１μｇ～１０μｇ、１μｇ～１００μｇ、又は１μｇ～１０００μｇであってもよい。
（Ｃ）活性型ＰＫＣαの検出及び定量
（ｉ）活性型ＰＫＣαの検出
被験試料として採取した尿は、例えば、遠心処理、加温、界面活性剤添加、ホモジナイザー及び超音波破砕処理装置等による細胞の破砕、サンプルバッファー等による希釈、プロテアーゼ阻害剤による処理等適宜前処理をしていてもよい。当該希釈を行う場合、サンプルバッファーとしては、例えば、ＨＥＰＥＳ（４－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ等を用いることができる。
必要に応じて前処理を行った後、被験試料を、抗ＰＫＣα抗体（一般にはモノクローナル抗体が好ましい）と反応させると、被験試料に活性型ＰＫＣαが含まれる場合には、抗原－抗体反応が起こる。
被験試料と抗ＰＫＣα抗体との反応は、２０～４０℃（好ましくは３０～３７℃）で、３０～７２０分間（好ましくは３０～９０分間）行う。
活性型ＰＫＣαの検出は、公知の免疫検定法（ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）を、その常法に従い、利用して行うことができる。免疫検定法としては、標識化免疫測定法や免疫比濁法（ＴＩＡ）があるが、なかでも前者が好ましく、例えば、ＥＬＩＳＡ等の酵素免疫検定法（ＥＩＡ）のほか、放射線免疫検定法（ＲＩＡ）や蛍光免疫検定法（ＦＩＡ）等が好ましく挙げられる。また、標識化免疫測定法としては、他の分離方法との組合せを利用したものとして、ウェスタンブロット法（電気泳動法との組合せ）等も好ましく挙げられる。これらの中でも、ＥＬＩＳＡ及び／又はウェスタンブロット法が好ましい。また、１種又は２種以上の抗ＰＫＣαモノクローナル抗体を用い、２種以上の免疫検定法を組み合わせて検出を行ってもよく、より一層感度及び信頼性等の高い優れた検出を行うことができる。
（ｉｉ）活性型ＰＫＣαの定量
定量は、限定はされないが、抗原量（抗原濃度：ＰＫＣα濃度）とその検出値との関係に基づく検量線から、被験試料に含まれる活性型ＰＫＣαを定量することが好ましい。上記検量線は、精製ＰＫＣαを抗原とし、前述した抗ＰＫＣα抗体を用いて得られる検出値（検出データ）を基に、予め作成しておく。詳しくは、検出の方法として説明した免疫検定法（ＥＬＩＳＡやウェスタンブロット法等）と同様の方法により、抗原濃度に対する検出値の情報を取得し、これを基に作成しておくようにする。当該検量線と、実際の検出値（実測値）とを対比させることで、被験試料中の活性型ＰＫＣα量を求めることができる。ＰＫＣαの定量又は検出は、市販のキットを用いることもできる。
［がん診断用組成物］
本実施形態に係るがん診断用組成物は、活性型ＰＫＣαを検出するための抗体又は基質ペプチドを含み、被験者の尿を用いて診断することを特徴とする。
活性型ＰＫＣαを検出するための抗体又は基質ペプチドは、上述したものを用いることができる。本実施形態におけるがん診断用組成物は、被験者の尿中の活性型ＰＫＣαを検出し、定量するために用いられ、上述した診断に利用することができる。活性型ＰＫＣαを検出する方法等についても上述したとおりである。
がん診断用組成物における上記抗体の配合割合は特に限定はされないが、例えば、上記組成物の全重量を基準として１～１００重量、５～１００重量％、１０～１００重量％、３～９９重量％、５～９９重量％、１０～９９重量％、１０～９５重量％、又は２０～９５重量％であってよい。本実施形態におけるがん診断用組成物は、抗ＰＫＣα抗体以外にも、本発明の効果が著しく損なわれない範囲で、他の構成成分を含んでいてもよく、限定はされない。例えば、１次抗体検出用試薬、発色基質等を含むことができる。
がん診断用組成物におけるＰＫＣα基質ペプチドの配合割合は特に限定はされないが、例えば、上記組成物の全重量を基準として１～１００重量、５～１００重量％、１０～１００重量％、３～９９重量％、５～９９重量％、１０～９９重量％、１０～９５重量％、又は２０～９５重量％であってよい。本実施形態におけるがん診断用組成物は、ＰＫＣα基質ペプチド以外にも、本発明の効果が著しく損なわれない範囲で、他の構成成分を含んでいてもよく、限定はされない。例えば、リン酸化されたＰＫＣα基質ペプチドに対する抗体等を含むことができる。
［がん診断用キット］
本実施形態に係るがん診断用キットは、活性型ＰＫＣαを検出するための抗体又は基質ペプチドを含み、被験者の尿を用いて診断することを特徴とする。
活性型ＰＫＣαを検出するための抗体又は基質ペプチドは、上述したものを用いることができる。本実施形態におけるがん診断用キットは、被験者の尿中の活性型ＰＫＣαを検出し、定量するために用いられ、上述した診断に利用することができる。活性型ＰＫＣαを検出する方法等についても上述したとおりである。
本実施形態に係るがん診断用キットは、上記がん診断用組成物を含むものであってもよい。
がん診断用キットにおいて、抗ＰＫＣα抗体を含む場合は、当該抗体は、安定性（保存性）及び使用容易性等を考慮して、溶解した状態で備えられていることが好ましい。
がん診断用キットにおいて、ＰＫＣα基質ペプチドを含む場合は、当該基質ペプチドは、安定性（保存性）及び使用容易性等を考慮して、粉末の状態又は溶液の状態（純水、バッファー、生理食塩水などに溶かした状態）で、冷蔵又は冷凍（－３０℃～－８０℃）の条件下で保存することが好ましい。
当該キットは、上記のＰＫＣα基質ペプチド又は抗ＰＫＣα抗体以外に、他の構成要素を含むことができる。他の構成要素としては、例えば、ＥＬＩＳＡやウェスタンブロットに用い得る１次抗体検出用試薬及び発色基質等を挙げることができる。
当該キットは、構成要素として、少なくとも上記のＰＫＣα基質ペプチド又は抗ＰＫＣα抗体を備えているものであればよい。従って、がんの診断に必須となる構成要素の全てを、ＰＫＣα基質ペプチド又は抗ＰＫＣα抗体と共に備えているものであってもよいし、そうでなくてもよく、限定はされない。
また、当該キットは、尿を採取する手段、例えば採尿容器を含むものであってもよい。
また、当該キットは、当該キットを用いて、被験者の尿における活性型ＰＫＣαを検出し、がんの診断に用いるための説明書が付属されていてもよい。
［がんの状態を評価する方法］
本実施形態におけるがんの状態を評価する方法は、活性型ＰＫＣαに対する抗体と被験者の尿とを反応させて活性型ＰＫＣαを検出し、得られる検出結果を指標としてがんの状態を評価するものである。また、別の実施形態におけるがんの状態を評価する方法は、活性型ＰＫＣαの基質ペプチドを被験者の尿と反応させ、リン酸化された当該ペプチドを検出し、得られる検出結果を指標としてがんの状態を評価するものである。
活性型ＰＫＣαを検出するための抗体又は基質ペプチドは、上述したものを用いることができる。また、被験者の尿と反応させて検出する方法についても、上述したとおりである。
本実施形態に係るがんの状態を評価する方法により、検出及び定量した活性型ＰＫＣα又はリン酸化された上記基質ペプチドの検出結果（検出量）を指標として、がんの状態を評価することができる。すなわち、活性型ＰＫＣαに対する抗体と被験者の尿とを反応させて活性型ＰＫＣαを検出すること、又はＰＫＣα基質ペプチドと尿とを反応させてリン酸化された当該基質ペプチドを検出することにより、得られる検出結果を指標としてがんの状態を評価する。
ここで、「がんの状態を評価する」とは、がんの発病の有無、進行度、重症度、治療反応性、予後等を判断することを意味する。評価は、活性型ＰＫＣαの検出量又はリン酸化されたＰＫＣα基質ペプチドの検出量のほか、自覚症状等を組み合わせて行ってもよい。例えば、定期健診のように、年に１～２回の頻度で、活性型ＰＫＣα又はリン酸化されたＰＫＣα基質ペプチドを測定することにより評価することもできるが、活性型ＰＫＣα又当該リン酸化基質ペプチドの検出量の推移を定期的にモニタリングすることで、総合的にがんの状態を評価する（がんの再発の有無をモニタリングすることも含む）ことが好ましい。このような評価法として、例えば、活性型ＰＫＣα又リン酸化されたＰＫＣα基質ペプチドの検出量が一定値を超えれば何らかのがんが発症している可能性高いと診断する、既に治療中のがん症例において活性型ＰＫＣα又当該リン酸化基質ペプチドの検出量が低下すれば治療が奏効していると診断する、活性型ＰＫＣα又当該リン酸化基質ペプチドの検出量が一定値を超え高値で推移する症例は治療及び回復が不能であると診断することも可能になる。
［がんの予防薬及び／又は治療薬をスクリーニングする方法］
本実施形態に係るがんの予防薬及び／又は治療薬をスクリーニングする方法は、
（ａ）泌尿器系がんモデル非ヒト哺乳動物に候補物質を投与する工程（投与工程）、
（ｂ）上記非ヒト哺乳動物の尿中の活性型ＰＫＣαを検出する工程（検出工程）、及び
（ｃ）得られる結果を指標として目的のがん予防薬及び／又は治療薬を選択する工程（評価工程）を含む。なお、本実施形態に係るスクリーニング方法は、必要に応じ、他の工程を含んでいてもよい。
以下に、上記各工程について説明する。
（ａ）投与工程
被験動物となる泌尿器系がんモデル非ヒト哺乳動物、及び対照動物としては、特に限定されないが、通常、正確な比較実験を行うことができる点で、同種の非ヒト哺乳動物を用いることが好ましく、同腹の非ヒト哺乳動物を用いることがより好ましく、同性及び同齢の非ヒト哺乳動物を用いることがさらに好ましい。また、被験動物及び対照動物は、飼料の摂取量以外の飼育条件は同様であることが好ましい。
被験動物としては、正常非ヒト哺乳動物に公知の方法により腫瘍組織や腫瘍細胞を移植してがんを発症させた、泌尿器系がんモデル非ヒト哺乳動物を用いることができる。さらに、上記泌尿器系がんモデル非ヒト哺乳動物から、腫瘍組織や腫瘍細胞を外科的に切除した非ヒト哺乳動物も用いることができる。当該切除後の非ヒト哺乳動物を被験動物として用いた場合、例えば、再発がんの予防薬のスクリーニング方法を行うこともできる。
対照動物としては、被験動物との比較対照に使用されるに適している限り限定されるものではなく、例えば、腫瘍組織等を移植していない正常非ヒト哺乳動物が用いられるほか、候補物質を投与しない泌尿器系がんモデル非ヒト哺乳動物又は候補物質を投与する前の被験動物を対照動物として用いることもできる。
被験動物に投与する候補物質としては、限定はされないが、天然又は人為的に合成された各種ペプチド、タンパク質（酵素や抗体を含む）、核酸（ポリヌクレオチド（ＤＮＡ，ＲＮＡ）、オリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ等）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）など）、低分子又は高分子有機化合物等を例示することができる。
候補物質の投与は、経口的又は非経口的に行うことができ、限定はされず、いずれの場合も公知の投与方法及び投与条件等を採用することができる。投与量についても、被験動物の種類及び状態、並びに候補物質の種類等を考慮して、適宜設定可能である。
（ｂ）検出工程
本工程では、候補物質が投与された被験動物の尿中（尿サンプル）から活性型ＰＫＣαを検出する。尿サンプルの採取方法は、公知の方法が適用できる。活性型ＰＫＣαの検出回数及び検出期間等は、特に限定はされず、目的のがん予防薬又はがん治療薬の効能等を考慮して適宜設定することができる。
尿中のＰＫＣαの検出及び定量方法は、限定はされないが、上述した方法を適宜採用することができる。
（ｃ）評価工程
がん予防薬及び／又はがん治療薬をスクリーニングする場合は、例えば、候補物質が投与された被験動物、及び候補物質が投与されていない対照動物について、尿中活性型ＰＫＣα検出量（検出レベル）を比較評価する。この評価により、候補物質が目的のがん予防薬及び／又はがん治療薬であるかどうかを選択することが好ましい。
具体的には、尿中の活性型ＰＫＣα量が同レベルの泌尿器系がんモデル非ヒト哺乳動物について、一方を候補物質を投与する被験動物とし、他方を候補物質を投与しない対照動物とした場合は、被験動物における尿中の活性型ＰＫＣα量が、対照動物における尿中の活性型ＰＫＣα量よりも低いレベルとなったとき、候補物質を目的のがん治療薬として選択することができる。これに対し、被験動物における尿中の活性型ＰＫＣα量が、対照動物における尿中の活性型ＰＫＣα量と同レベルを維持するか又はより高いレベルとなったときは、候補物質は目的のがん治療薬として選択することはできない。この場合、対照動物としては、候補物質を投与する前の被験動物自体とすることもできる。
また、腫瘍組織等を外科的切除した泌尿器系がんモデル非ヒト哺乳動物、又は外科的切除以外の方法（内科的方法等）により一旦がんの治療が完了した泌尿器系がんモデル非ヒト哺乳動物を、候補物質を投与する被験動物とし、正常非ヒト哺乳動物を対照動物とした場合は、被験動物における尿中の活性型ＰＫＣα量が、対照動物における尿中ＰＫＣα量と同レベルを継続的に維持したときに、候補物質をがん予防薬（詳しくは再発がんの予防薬）として選択することができる。これに対し、被験動物における尿中ＰＫＣα量が、対照動物における尿中の活性型ＰＫＣα量より高いレベルとなったときは、候補物質は目的のがん予防薬として選択することはできない。この場合、対照動物としては、候補物質を投与する直前の（再発前の）被験動物自体とすることもできる。
なお、尿中の活性型ＰＫＣα量に基づくがんの予防及び／又は治療薬のスクリーニングは、複数のがん種（好ましくは全てのがん種）に対して行うことが可能であるため、泌尿器系がんモデル非ヒト哺乳動物として、特定のがん種の泌尿器系がんモデル非ヒト哺乳動物を作製し使用した場合は、当該特定のがん種についての予防及び／又は治療薬をスクリーニングすることができる。
［がんの治療方法］
本実施形態に係るがんの治療方法は、
被験者の尿中の活性型ＰＫＣαを検出することを含む、がんの診断工程と、
がんと診断された被験者に治療薬を投与する工程と、を含む。
がんの診断工程は、上述したがんの診断のための方法において提供される指標に基づき、被験者ががんか否かを診断する工程であってよい。また、上述したがんの状態を評価する方法に基づき、被験者ががんか否かを診断する工程であってよい。
がんと診断された被験者に治療薬を投与する工程において、被験者に投与する治療薬は、がんの種類によって当業者が適宜選択することができるが、例えば、泌尿器系がんであれば、経尿道的手術後再発予防薬としてアントラサイクリン系抗がん抗生物質、マイトマイシン、ＢＣＧが、治療薬としてシスプラチン、ゲムシタビンが通常よく用いられる。上述したがんの予防薬及び／又は治療薬をスクリーニングする方法により選択された治療薬を用いることもできる。また、投与は、経口的又は非経口的に行うことができ、限定はされず、いずれの場合も公知の投与方法及び投与条件等を採用することができる。投与量についても、がんの種類及び被験者の状態、並びに治療薬の種類等を考慮して、適宜設定可能である。
また、本実施形態に係るがんの治療方法は、治療薬を投与した後、上述したがんの状態を評価する方法により、活性型ＰＫＣα又当該リン酸化基質ペプチドの検出量をモニタリングすることで、治療薬による治療が奏効しているか否か判断する工程をさらに含んでもよい。例えば、治療薬の投与後に活性型ＰＫＣα又当該リン酸化基質ペプチドの検出量が低下すれば治療が奏効していると判断すること、及び／又は活性型ＰＫＣα又当該リン酸化基質ペプチドの検出量が一定値を超え高値で推移する症例は治療が奏効していないと診断することを含んでいてもよい。
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
［実施例１ がん細胞サンプルでの基質ペプチドのリン酸化］
（基質ペプチドの合成）
自動ペプチドシンセサイザーを使用し、標準的なＦｍｏｃ化学手順に従って、基質ペプチドとしてのアルファトメガ（ＦＫＫＱＧＳＦＡＫＫＫ（配列番号１））を合成した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で処理した後、ペプチドをＩｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ－３カラム（２５０×２０ ｍｍ、３．５μｍ；ジーエルサイエンス、東京、日本）上で、ＢｉｏＣＡＤパーフュージョンクロマトグラフィー系（池本理化工業株式会社）、及び流速８ ｍｌ／分のＡ－Ｂ直線勾配（溶離液Ａは０．１％ＴＦＡ含有水、溶離液Ｂは０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル）を使用して精製した。
このペプチドを、ＰＫＣα特異的基質ペプチドとして以下の実験に用いた。なお、この基質ペプチドＦＫＫＱＧＳＦＡＫＫＫ－ＮＨ２の分子量は１３３８Ｄａであるが、ＰＫＣαによるリン酸化反応により、８０Ｄａ増加し、１４１８Ｄａとなる。
（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ分析）
α－シアノ－４－ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡ）マトリックス（１０ ｍｇ／ｍｌ）を、５０％水／アセトニトリル及び０．１％ＴＦＡ中で調製した。このマトリックスとサンプルとを、２０：１の比率で混合した。合計１μｌ容量の検体／マトリックス混合液をサンプルプレートに塗布し、乾燥させて結晶化させた。本実施例では、Ｂｒｕｋｅｒ社製Ａｕｔｏ Ｆｌｅｘ Ｓｐｅｅｄを、Ｐｏｓｉｔｉｖｅ又はＮｅｇａｔｉｖｅモードで使用して行った。加速電圧は２０ ｋＶ、抽出遅延時間は１００ｎｓとした。典型的に、１００本のレーザショットを平均化して、シグナル／ノイズ比を改善した。Ｆｌｅｘ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（Ｂｒｕｋｅｒ）を用いて、全てのスペクトルを分析した。リン酸化率は、リン酸化物質対非リン酸化物質のイオン強度比と規定し、既存の説明に従って計算した(Kang,J.-H.et al.(2007)J. Am. Soc. Mass Spectrom.18, 106-112.；Kang J.- H. et al. (2007) J.Am. Soc. Mass Spectrom.18, 1925-1931.)。
ＰＫＣα特異的基質ペプチドが膀胱がんによってリン酸化され得るか否かを調査するために、５種類の異なる膀胱がん由来の培養細胞（ＫＵ－１、ＫＵ－７、Ｔ２４、ＴＣＣＳＵＰ、ＵＭＵＣ－３）をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳにより分析した。ＫＵ－１、ＫＵ－７、ＴＣＣＳＵＰ、ＵＭＵＣ－３を、１０％ウシ胎仔血清、ペニシリン（１００ Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）及びアムホテリシンＢ（０．２５μｇ／ｍｌ；全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補ったダルベッコ改変イーグル培地中で維持させた。Ｔ２４はＲＰＭＩ－１６４０培地で維持させた。当該がん細胞を、５％ＣＯ２及び９５％空気を含む３７℃の加湿雰囲気中においた。培養細胞を剥離し、１，５００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、沈殿（細胞）を、基質ペプチドとのリン酸化反応のために使用した。基質ペプチドのリン酸化は、３０μＭの合成ペプチドを含む３０μｌ緩衝液（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００μＭ ＡＴＰ及び０．２ｍｇ／ｍｌ細胞）中で行った。３７℃にて６０分間のインキュベーションの後、サンプルをＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳにより分析した。
結果を図１及び２に示す。「未処理」は、細胞なしを意味する。ｍ／ｚ値における８０Ｄａの増加によって、基質ペプチドのリン酸化を確認し、膀胱がん由来の培養細胞から調整したサンプルすべてにおいて、高いリン酸率を確認した。
［実施例２ ヒト尿中サンプル中のＰＫＣα活性検出］
２８名の尿路上皮がん患者の尿を採取し、これをサンプルとして用いて基質ペプチドのリン酸化を行った。対照群として２４名の非尿路上皮がん患者の尿を用いた。尿路上皮がん患者及び非尿路上皮がん患者の症例情報は、それぞれ図３及び図４に示す。
患者の尿検体２０ｍｌを採取し、遠心（５０００ｇ、１５分間）をし、沈殿物を回収した。ＨＥＰＥＳ緩衝液（１０％スクロース含有）１６０μｌ、ｃＯｍｐｌｅｔｅプロテアーゼインヒビターカクテル４０μｌを加え、再懸濁させた。プローブ型超音波破砕装置（ＢＲＡＮＳＯＮ社製ＳＯＮＩＦＩＥＲ２５０）を用いて氷上で１０秒間照射し、細胞を破砕した。遠心（５０００ｇ、１５分間）をし、上澄みを回収後、タンパク定量を行い、タンパク濃度を求めた。基質ペプチドのリン酸化は、タンパク濃度０．２ｍｇ／ｍｌ、ＡＴＰ １００μＭ、ＭｇＣｌ２ １０ｍＭ、基質ペプチド３０μＭで行った。３７℃にて６０分間のインキュベーションの後、サンプルをＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳにより分析した。基質ペプチド及びＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳの分析は実施例１と同様に行った。
尿路上皮がん患者及び非尿路上皮がん患者のリン酸化率をそれぞれ測定し、ヒストグラム（図５）、確率密度関数（図６）、累積分布関数を表した（図７）。尿路上皮がん患者は、非尿路上皮がん患者に比べて高いリン酸化を示し、差が大きいリン酸化率２％を閾値と設定した。
また、図８に、ｌｏｗ ｇｒａｄｅの尿路上皮がん患者９名及びｈｉｇｈ ｇｒａｄｅの尿路上皮がん患者１９名からの尿中サンプルにおける基質ペプチドのリン酸化率を示す。ｌｏｗ ｇｒａｄｅ及びｈｉｇｈ ｇｒａｄｅともに非尿路上皮がん患者に比べて高いリン酸化を示した。
［実施例３ 他の尿路上皮がんマーカーとの比較］
実施例２において算出した尿路上皮がん患者及び非尿路上皮がん患者のＰＫＣαのリン酸化率より、陽性反応の閾値を２％と設定し、他の既存の尿路上皮がんマーカー（尿細胞診、ＮＭＰ２２（Ａｌｅｒｅ）、ＢＴＡ（富士レビオ）、ＣＫ１８－８（ｉＤＬ Ｂｉｏｔｅｃｈ））と比較した。既存の尿路上皮がんマーカーは添付書類に従って使用した。
尿路上皮がん患者のＰＫＣαの閾値を２％とし、他の尿路上皮がんマーカーであるＣＫ１８－８は１６ｎｇ／ｍｇＣｒ、ＮＭＰ２２は１２Ｕ／ｍｌと閾値を設定し、各測定法の感度、特異度及び正診率を検討した。尿細胞診とＢＴＡについては定性法であるため陽性及び陰性の判定を使用し検討した。ＰＫＣαの感度は８９．３％、特異度８３．３％、正診率８６．５％といずれも高い結果が得られた。一方、ＮＭＰ２２の感度は５０．０％、特異度９１．７％、正診率６９．２％であり、ＢＴＡは感度３９．４％、特異度７５．０％、正診率５５．８％、ＣＫ１８－８は感度７５．０％、特異度５８．３％、正診率６７．３％となり、特異度は高いものの感度は低いという結果であった（表１）。
Figure 0007454756000001
また、図９に、ｌｏｗ ｇｒａｄｅの尿路上皮がん患者９名及びｈｉｇｈ ｇｒａｄｅの尿路上皮がん患者１９名からの尿中サンプルを用いた基質ペプチドのリン酸化率に基づく診断の受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す。尿中の活性型ＰＫＣαは、ｈｉｇｈ ｇｒａｄｅ尿路上皮がんだけでなく、ｌｏｗ ｇｒａｄｅの尿路上皮がんにおいても高い検出感度と特異性を示した。

Claims (6)

  1. 尿中の活性型プロテインキナーゼＣαを検出する工程を含む、がんを診断するための方法であって、前記がんが、尿路上皮がんを含む、方法。
  2. 活性型プロテインキナーゼＣαを検出するための抗体又は基質ペプチドを含み、被験者の尿を用いて診断することを特徴とする、がん診断用組成物であって、前記がんが、尿路上皮がんを含む、組成物。
  3. 活性型プロテインキナーゼＣαを検出するための抗体又は基質ペプチドを含み、被験者の尿を用いて診断することを特徴とする、がん診断用キットであって、前記がんが、尿路上皮がんを含む、キット。
  4. 活性型プロテインキナーゼＣαに対する抗体と被験者の尿とを反応させて活性型プロテインキナーゼＣαを検出し、検出された尿中の活性型プロテインキナーゼＣαの量を指標として前記被験者ががんを発症しているか又は発症する可能性が高いかを評価するための方法であって、
    前記がんが、尿路上皮がんを含む、方法。
  5. 活性型プロテインキナーゼＣαの基質ペプチドを被験者の尿と反応させ、リン酸化された前記ペプチドを検出し、検出されたリン酸化された当該ペプチドの量を指標として前記被験者ががんを発症しているか又は発症する可能性が高いかを評価するための方法であって、
    前記がんが、尿路上皮がんを含む、方法。
  6. がんの予防薬及び／又は治療薬をスクリーニングする方法であって、
    泌尿器系がんモデル非ヒト哺乳動物に候補物質を投与する工程、
    前記非ヒト哺乳動物の尿中の活性型プロテインキナーゼＣαを検出する工程、及び
    検出された尿中の活性型プロテインキナーゼＣα量を指標として目的のがん予防薬及び／又は治療薬を選択する工程を含み、
    前記泌尿器系がんが、尿路上皮がんを含む、方法。
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