TWI786095B - 用於鑑別復發性或轉移性癌症風險或預測癌症患者預後之方法 - Google Patents

用於鑑別復發性或轉移性癌症風險或預測癌症患者預後之方法 Download PDF

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Abstract

本發明揭示一種用於鑑別處於發生復發性或轉移性癌症風險中的個體 的方法，包含檢測該個體的一血液樣本、一組織液樣本或一試樣中的PD-L1+循環腫瘤細胞的量。本發明亦揭示一種治療癌症的方法，包含鑑別出具有較一對照組升高的PD-L1+循環腫瘤細胞的量的個體，以及對該個體投予一治療。

Description

用於鑑別復發性或轉移性癌症風險或預測癌症患者預後之方 法
本發明涉及用於診斷及治療癌症的方法。
循環腫瘤細胞(CTCs)在循環中扮演調節轉移的活化角色。循環腫瘤細胞的計數已被證明為轉移性大腸直腸癌(mCRC)患者的預後標記[2]。在大多數過去的研究中，循環腫瘤細胞數量的記數來自前臂靜脈穿刺抽取的血液[3、4]。之前的研究提出，在保疾伏(Nivolumab，PD-1抑制劑)治療後6個月，非小細胞肺癌患者存在表現PD-L1之循環腫瘤細胞可對應到治療無效或預後不良[5]。
迄今為止，還沒有用於早期檢測或診斷轉移癌症的有潛力的方法或試劑盒。
本發明不可預期的發現患有一胃腸癌或頭頸部鱗狀細胞癌的患者，於該胃腸癌或頭頸部鱗狀細胞癌之一治療前或一根治性切除手術中循環腫瘤細胞表現PD-L1(稱作PD-L1+循環腫瘤細胞)的存在/量與患者的癌症轉移或預後有關。
因此，在一方面，本發明提供一種用於鑑別處於發生復發性或轉移性癌症風險中的個體的方法，包含檢測該個體的一血液樣本、一組織液樣本或一試樣中的PD-L1+ 循環腫瘤細胞的量，其中較一對照組升高的量表示該個體處於發生復發性或轉移性癌症的風險中，及其中該個體患有一胃腸癌或頭頸部鱗狀細胞癌，且該血液樣本、該組織液樣本或該試樣係該個體於該胃腸癌或頭頸部鱗狀細胞癌之一治療前或一根治性切除手術中取得。
在本發明之一具體實施例，該癌症為一胃腸癌，尤其是大腸直腸癌。在另一具體實施例，該癌症為頭頸部鱗狀細胞癌。
另一方面，本發明提供一治療癌症的方法，包含：(a)藉由檢測一血液樣本、一組織液樣本或一試樣中的PD-L1+ 循環腫瘤細胞，鑑別出具有較一對照組升高的PD-L1+ 循環腫瘤細胞的量的個體，其中該個體患有一胃腸癌或頭頸部鱗狀細胞癌，且該血液樣本、該組織液樣本或該試樣係該個體於該胃腸癌或頭頸部鱗狀細胞癌之一治療前或一根治性切除手術中取得；以及(b)對該個體投予一治療。
又一方面，本發明提供一種用於預測患有一胃腸癌或頭頸部鱗狀細胞癌患者的預後的方法，包含檢測該癌症患者的一血液樣本、一組織液樣本或一試樣中的PD-L1+ 循環腫瘤細胞，其中較一對照組升高的量表示該癌症患者的預後不良，其中該血液樣本、該組織液樣本或該試樣係該個體於該胃腸癌或頭頸部鱗狀細胞癌之一治療前或一根治性切除手術中取得。
根據本發明之部分較佳具體實施例，該療法為一免疫治療。在一些其他具體實施例，對該個體投予一免疫療法，結合一化學治療或標靶治療。
根據本發明之部分具體實施例，該癌症為一復發性或轉移性癌症。
在本發明之一具體實施例中，該癌症為一胃腸癌，尤其是大腸直腸癌。在另一具體實施例中，該癌症為頭頸部鱗狀細胞癌。
應了解先前之一般描述及以下之詳述兩者皆僅為示例性及解釋性且並不限制本發明。
在一方面，本發明提供一種用於鑑別處於發生復發性或轉移性癌症風險中的個體的方法，包含檢測該個體的一血液樣本、一組織液樣本或一試樣中的PD-L1+ 循環腫瘤細胞，其中PD-L1+ 循環腫瘤細胞的存在表示該個體處於發生復發性或轉移性癌症的風險中，及其中該個體患有一胃腸癌或頭頸部鱗狀細胞癌，且該血液樣本、該組織液樣本或該試樣係該個體於該胃腸癌或頭頸部鱗狀細胞癌之一治療前或一根治性切除手術中取得。
根據本發明，一較高量的PD-L1+ 循環腫瘤細胞表示具有一較高發生復發性或轉移性癌症的風險。
在本發明之一具體實施例中，該癌症為一胃腸癌，尤其是大腸直腸癌。針對胃腸癌，該血液樣本較佳地為一腸系膜靜脈血樣本。該胃腸癌包括但不限於一食道癌、一胃癌、一胃腸道間質瘤、一胰腺癌、一肝癌、一膽囊癌、一大腸直腸癌或一肛門癌。在本發明的一具體實例中，該癌症為大腸直腸癌。
在另一具體實施例中，該癌症為頭頸部鱗狀細胞癌。
另一方面，本發明提供一治療癌症的方法，包含：（a）藉由檢測一血液樣本、一組織液樣本或一試樣中的PD-L1+ 循環腫瘤細胞，鑑別出具有PD-L1+ 循環腫瘤細胞的個體，其中該個體患有胃腸癌或頭頸部鱗狀細胞癌，且該血液樣本、該組織液樣本或該試樣係該個體於該胃腸癌或頭頸部鱗狀細胞癌之一治療前或一根治性切除手術中取得；以及（b）對該個體投予一治療。
又一方面，本發明提供一種用於預測患有一胃腸癌或頭頸部鱗狀細胞癌患者的預後的方法，包含檢測該患者的一血液樣本、一組織液樣本或一試樣中的PD-L1+ 循環腫瘤細胞，其中較一對照組升高的量表示該患者的預後或整體存活期不良，且其中該血液樣本、該組織液樣本或該試樣係該個體於該胃腸癌或頭頸部鱗狀細胞癌之一治療前或一根治性切除手術中取得。
根據本發明，一較高量的PD-L1+ 循環腫瘤細胞表示該患者的預後不良。
該療法包括但不限於免疫療法、化學療法、放射線療法、賀爾蒙療法或者其他結合。
根據本發明之部分較佳具體實施例，該療法為一免疫治療。在一些其他具體實施例，對該個體投予一免疫療法，結合一化學治療或標靶治療。
根據本發明之部分具體實施例，該癌症為一復發性或轉移性癌症。
在本發明之一具體實施例中，該癌症為一胃腸癌，尤其是大腸直腸癌。在另一具體實施例，該癌症為頭頸部鱗狀細胞癌。
針對胃腸癌，該血液樣本較佳地為一腸系膜靜脈血樣本。該腸系膜靜脈血樣本可於該胃腸癌治癒性手術切除中取得。
在本發明之部分具體實施例，該癌症為一胃腸癌，包括但不限於一食道癌、一胃癌、一胃腸道間質瘤、一胰腺癌、一肝癌、一膽囊癌、一大腸直腸癌和一肛門癌。 在本發明的具體實例中，該癌症為一大腸直腸癌。
在本發明之一些其他具體實施例中，該癌症為一頭頸部鱗狀細胞癌。
本發明藉由以下實例進一步說明，其提供作為例示之用而非限制本發明。
實例
材料與方法
1. 患者之特徵
2016年4月至2017年9月共有116名在台北榮民總醫院接受了根治性切除手術的患者。 2016年10月至2017年9月在台北榮民總醫院接受免疫治療的26名頭頸部鱗狀細胞癌（HNSCC）患者，9名肝癌（HCC）患者，5名子宮頸癌（UC）患者和2名腎臟惡性腫瘤（RCC）患者也入組。入組程序依照台北榮民總醫院內部審查委員會批准之流程。所有患者均提供書面知情同意書。在大腸鏡檢查之前或懷疑患有未經證實的臨床階段的大腸直腸癌（CRC）的患者被招募。還有6名患有組織學診斷的管狀腺瘤的患者入選。可評估患者的平均年齡（±SD）為63.6±12.5歲（中位數64）（見下表 1 ）。原發腫瘤分期通過切除的原發腫瘤的組織學檢查證實。根據組織學檢查，受試者由116位大腸直腸癌患者組成（I期24例，II期38例，III期42例，IV期12例）。
表 1 ：研究族群的臨床病理特徵
Figure 107108604-A0304-0001
2. 血液樣本收集
在根治性切除腫瘤之前從大腸直腸癌患者獲得用於循環腫瘤細胞分析的血液樣品。在手術前從大腸直腸癌患者的肘靜脈取血。在手術期間，從結腸病變節段的主要引流靜脈抽取腸系膜靜脈血樣，例如，大腸或直腸的腸系膜下靜脈或如果腫瘤位於右側直腸之回結腸靜脈。為了盡量減少通過機械手段釋放循環腫瘤細胞的可能性，術前至少一天之前安排一次大腸鏡檢查。手術方法首先尋找血管控制，即開始時結紮供血動脈，然後進行腸系膜靜脈插管和採血。直到手術的後期，腫瘤才保持原狀。從116位患者獲得用於循環腫瘤細胞分析的周邊血（PB）和腸系膜靜脈血（MVB）樣品。用於循環腫瘤細胞分析的血液樣品也在給藥之前從其他癌症患者獲得。
3. 循環腫瘤細胞計數及PD-L1在循環腫瘤細胞的表現測試
樣品製備如圖 1 所示。將來自K2 EDTA管的兩個4毫升等份的血液轉移到兩個相應標記的50毫升錐形離心管中。樣品與SelectKit的分選試劑（PE-綴合的抗EpCAM抗體）在室溫下培養20分鐘。染色後，將每4毫升血液分散兩個2毫升等分試樣中，分別放入兩個相應標記的50ml錐形離心管中，向每個試管中加入24毫升ISOTON稀釋劑。在室溫下使用搖擺式離心機在800x g離心樣品10分鐘，並關閉制動器。離心後，取出24毫升每管的上清液，混合樣品後，回收兩個2毫升等分進入4毫升等分試樣進行循環腫瘤細胞分析。樣品製備1小時內在MiSelect R系統上進行處理。
具有SelectChip Dual的MiSelect R系統（MiCareo台灣有限公司）可以對循環腫瘤細胞進行分類和收集。一旦含有循環腫瘤細胞的等分試樣已經被收集在SelectChip中，則通過片上過濾系統從循環腫瘤細胞中除去血細胞，特別是RBC。在富集循環腫瘤細胞後，自動添加SelectKit的固色和染色試劑以鑑定和列舉循環腫瘤細胞。抗panCK APC特異性靶向細胞內蛋白細胞角蛋白，DAPI染色細胞核，抗CD45 FITC對白細胞具有特異性。當一個事件的形態特徵與腫瘤細胞的形態特徵一致時，事件被分類為腫瘤細胞，並且其表現出表型EpCAM+ ，CK+ ，DAPI+ 和CD45- 。
循環腫瘤細胞號碼將由實驗者統計和分析並直接記錄。為了進一步對循環腫瘤細胞進行免疫染色，抗PD-L1將自動注入SelectChip，在MiSelect R系統上標記循環腫瘤細胞。將獲取循環腫瘤細胞上每個生物標誌物的螢光圖像並記錄生物標誌物的強度以供進一步分析。
4. 統計分析
所有數據用SPSS軟件（v19.0）和GraphPad Prism（v5.0）進行統計分析。 連續變量的分佈被描述為中位數值和範圍。 進行Mann-Whitney U檢驗和Wilcoxon符號等級檢驗以適當評估組間差異。 所有的P值都是雙面的。 P值小於0.05表示統計學顯著性。
結果
1. 循環腫瘤細胞在周邊血及腸系膜靜脈血之相關性
循環腫瘤細胞被定義為具有完整細胞核的細胞，表達EpCAM和細胞角蛋白，但不存在CD45表達。 典型的循環腫瘤細胞圖像顯示在圖 2 中。即使在相同的CRC患者內，EpCAM表達顯示出循環腫瘤細胞之間的異質性。 在PB中幾乎沒有發現循環腫瘤細胞（平均每8ml全血0.17±0.89；範圍= 0-8，n = 116），但MVB更豐富（平均每8ml全血7.1±48.1；範圍= 0-515，n = 116）（圖 3 ； P ＜0.001）。
2. 循環腫瘤細胞計數之機率分布及檢測率
大腸直腸癌患者的循環腫瘤細胞計數列於下表 2 和圖 4 中。PB中循環腫瘤細胞計數在非轉移性大腸直腸癌中為0至8而轉移性大腸直腸癌中為0至4；在MVB中，循環腫瘤細胞計數在非轉移性大腸直腸癌中為0-515，在轉移性大腸直腸癌中為0-20。 循環腫瘤細胞的總體檢測率在周邊血和腸系膜靜脈血分別為6％和40.5％。 在每個亞組內，檢出率隨著亞組病情的嚴重程度而增加。 在MVB中，I，II，III和IV期的循環腫瘤細胞檢測率分別為20.8％，42.1％，45.2％和58.3％。 此外，循環腫瘤細胞的數量在後期比早期階段明顯更豐富（圖4）。
表 2 ：循環腫瘤細胞在不同期之周邊血及腸系膜靜脈血計數
Figure 107108604-A0304-0002
Figure 107108604-A0304-0003
3. 循環腫瘤細胞數量與臨床病理特徵的關係
我們研究了循環腫瘤細胞數量（存在或不存在）與各種臨床和病理參數之間的雙變量關係。 結果顯示在下表 3 中。 臨床分期（TNM）與MVB中的循環腫瘤細胞數目（表 2 ）和術前血清CEA水平和腫瘤侵入深度（pT）正相關，與MVB中的循環腫瘤細胞水平正相關。循環腫瘤細胞數目與肝臟或肺部轉移、原發性大腸直腸癌分化、組織學、淋巴結狀態(N)、淋巴/靜脈侵入/神經周圍浸潤、癌周圍炎性變化、癌組織浸潤模式和術前血清CA-19-9水平之間沒有發現關聯。
表 3 ：臨床病理參數與循環腫瘤細胞現狀的相關性
Figure 107108604-A0304-0004
4.大腸直腸癌患者中循環腫瘤細胞的PD-L1生物標記評估
檢測從周邊血及腸系膜靜脈血分離的循環腫瘤細胞的PD-L1蛋白表達。 PD-L1生物標記表達顯示患者之間和同一血樣內的分離的循環腫瘤細胞之間的異質性（圖 5 ）。 在8例可檢測的循環腫瘤細胞患者中評估PB中循環腫瘤細胞的PD-L1狀態（見下表 4 ）。 在47例可檢測循環腫瘤細胞患者中評估MVB中循環腫瘤細胞的PD-L1狀態。 在這47名患者中，31名（65.9％）顯示PD-L1+ 循環腫瘤細胞亞群（參見下面的圖 6 和表 5 ）。 PD-L1+ 循環腫瘤細胞的數量從1到33變化（中位數= 3），PD-L1+ 循環腫瘤細胞的比例在可檢測循環腫瘤細胞總數的16-100％範圍內。 隨著分期的增加，PD-L1+ 循環腫瘤細胞數量逐漸增加（圖 7 ），而循環腫瘤細胞中PD-L1+ 循環腫瘤細胞的頻率也隨著分期增加而增加（圖 8 ）。
表 4 ：PL-D1+ 循環腫瘤細胞在不同期周邊血的數目
Figure 107108604-A0304-0005
表 5 ：PL-D1+ 循環腫瘤細胞在不同期腸系膜靜脈血的數目
Figure 107108604-A0304-0006
5. 大腸直腸癌患者之PD-L1+ 循環腫瘤細胞數量與臨床病理特徵的關係
我們研究了PD-L1+ 循環腫瘤細胞數目（存在或不存在）與各種臨床和病理參數之間的雙變量關係。結果顯示在下表 6 和表 7 中。 臨床分期（TNM）與MVB中的PD-L1+ 循環腫瘤細胞數量呈正相關（表 6 ），術前血清CEA水平、腫瘤浸潤深度（pT）、淋巴結狀態（N）與MVB中PD-L1+ 循環腫瘤細胞水平呈正相關。 此外，原發性大腸直腸癌淋巴和靜脈浸潤與MVB中的PD-L1+ 循環腫瘤細胞水平相關（表 7 ）。 PD-L1+ 循環腫瘤細胞數與原發性CRC分化、神經周圍浸潤、癌周炎症變化、癌組織浸潤模式和手術前血清CA-19-9水平之間沒有關聯。
表 6 ：循環腫瘤細胞之PD-L1(+)存在及臨床分期之關係
Figure 107108604-A0304-0007
表 7 ：臨床病理參數與PD-L1+ 循環腫瘤細胞存在的相關性
Figure 107108604-A0304-0008
6. 對其他癌症患者的循環腫瘤細胞進行PD-L1生物標記評估
在頭頸部鱗狀細胞癌（HNSCC）、肝癌（HCC）和子宮頸癌（UC）患者中循環腫瘤細胞的總體檢測率分別為31％，55％和40％（參見下面的表 8 ）。 檢測從HNSCC，HCC和UC患者分離的循環腫瘤細胞的PD-L1蛋白表達。 PD-L1生物標記表達顯示患者之間和同一血樣內的分離的循環腫瘤細胞之間的異質性（圖 9 ）。 在可檢測的循環腫瘤細胞患者中評估循環腫瘤細胞的PD-L1狀態。 在這些患者中，100％的HNSCC，50％的HCC和100％的UC顯示PD-L1+循環腫瘤細胞亞群（表 8 ）。 PD-L1(+)循環腫瘤細胞的存在與HNSCC患者的疾病進展顯著相關（參見下表 9 ）。
表 8 ：循環腫瘤細胞和PD-L1(+)在晚期癌症中的循環腫瘤細胞檢測率
Figure 107108604-A0304-0009
表 9 ：循環腫瘤細胞或PD-L1(+)循環腫瘤細胞存在與疾病進展之間的相關性
Figure 107108604-A0304-0010
參考資料： 1. Pantel, K., C. Alix-Panabieres, and S. Riethdorf, Nat Rev Clin Oncol, 2009.6 (6): p. 339-51. 2. Cohen, S.J., et al., J Clin Oncol, 2008.26 (19): p. 3213-21. 3. Thorsteinsson, M., G. Soletormos, and P. Jess, Anticancer Res, 2011.31 (2): p. 613-7. 4. Sastre, J., et al., Ann Oncol, 2008.19 (5): p. 935-8. 5. Nicolazzo, C. et al., Sci Rep. 2016 Aug 24;6:31726.
無
本發明先前之概述以及以下詳述在配合隨附圖式閱讀時得以更佳地被了解。為說明本發明，在圖式中顯示目前較佳之實施例。
在圖式中：
圖1顯示循環腫瘤細胞（CTC）透過MiSelect R System計數之樣本製備。
圖2顯示典型的循環腫瘤細胞影像。
圖3顯示循環腫瘤細胞在周邊血（PB）及腸系膜靜脈血（MVB）計數的比較。
圖4A顯示大腸直腸癌（CRC）患者在不同期之周邊血循環腫瘤細胞的計數。圖4B顯示大腸直腸癌患者在不同期之腸系膜靜脈血循環腫瘤細胞的計數。
圖5顯示PD-L1在循環腫瘤細胞表現的異質性。
圖6顯示PD-L1+ 在周邊血及腸系膜靜脈血循環腫瘤細胞的計數。
圖7顯示PD-L1+ 在不同期之腸系膜靜脈血循環腫瘤細胞的計數。
圖8顯示PD-L1+ 在不同期之循環腫瘤細胞的發生頻率。
圖9顯示PD-L1在循環腫瘤細胞表現的異質性。
無

Claims (4)

  1. 一種用於鑑別處於發生復發性或轉移性胃腸癌風險中的個體的方法，包含檢測該個體的一血液樣本中的PD-L1+循環腫瘤細胞，其中較一對照組升高的量表示該個體處於發生復發性或轉移性癌症的風險中，其中該個體患有一胃腸癌或頭頸部鱗狀細胞癌，且該血液樣本為該個體於該胃腸癌或頭頸部鱗狀細胞癌治療前或根治性切除手術中取得，其中該血液樣本為一腸系膜靜脈血液樣本。
  2. 如請求項1所述之方法，其中該胃腸癌為一大腸直腸癌。
  3. 一種用於預測患有胃腸癌患者的預後的方法，包含檢測該患者的一血液樣本中的PD-L1+循環腫瘤細胞，其中較一對照組升高的量表示該患者的預後不良，且其中該組織液樣本為該個體於該胃腸癌或頭頸部鱗狀細胞癌治療前或根治性切除手術中取得，其中該血液樣本為一腸系膜靜脈血液樣本。
  4. 如請求項3所述之方法，其中該胃腸癌為一大腸直腸癌。
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