CN114836539B

CN114836539B - 一种用于胃癌转移预测和预后判断的circRNA标志物及应用

Info

Publication number: CN114836539B
Application number: CN202210486533.XA
Authority: CN
Inventors: 蔡娟; 左学良
Original assignee: First Affiliated Hospital of Wannan Medical College
Current assignee: First Affiliated Hospital of Wannan Medical College
Priority date: 2022-05-06
Filing date: 2022-05-06
Publication date: 2022-12-06
Anticipated expiration: 2042-05-06
Also published as: CN114836539A

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，尤其是一种用于胃癌转移预测和预后判断的circRNA标志物及应用，现提出如下方案，包括一种circRNA生物标志物在制备胃癌诊断的产品中的应用，所述circRNA生物标志物为CircPCSK5，其核酸序列如SEQIDNO.1所示，还包括一种circRNA生物标志物在制备胃癌诊断的生物制品，包括所述CircPCSK5，所述生物制品包括：试剂、试剂盒、芯片，还包括一种胃癌治疗药物。本发明明确了CircPCSK5在胃癌中高表达，并能够促进胃癌细胞的增殖、侵袭和上皮‑间质转化，CircPCSK5可作为胃癌良好的预后预测指标和潜在的分子治疗靶点。

Description

一种用于胃癌转移预测和预后判断的circRNA标志物及应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种用于胃癌转移预测和预后判断的circRNA标志物及应用。

背景技术

全球胃癌发病率和死亡率分别居所有恶性肿瘤的第五位和第四位，每年新发病例数近109万，约44％发生在中国[1]。早期胃癌缺乏特征性临床表现，大多患者确诊时已处于进展期。我国胃癌总体预后较差，转移仍然是其主要死亡原因。因此，深入探讨胃癌侵袭转移的发生机制、挖掘新的治疗靶点对提高患者生存率有重要研究意义。

环状RNA(Circular RNA，circRNA)已被证实能在多层面调控肿瘤增殖、侵袭转移、上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)、免疫逃逸以及代谢重编程等生物学行为，进而影响肿瘤的发生发展；既往研究报道circ_0058106通过miR-185-3p调控Wnt2b/β-catenin/c-Myc通路，促进下咽鳞状细胞癌的增殖、侵袭转移和EMT；circ-CPA4以竞争性内源RNA机制吸附let-7，上调 PD-L1表达，促进非小细胞肺癌免疫逃逸；也发现circHECTD1可通过调控β-catenin/c-Myc信号通路促进胃癌谷氨酰胺代谢重编程和肿瘤进展；circRHBDD1能促进肝癌细胞糖酵解和肿瘤进展并降低肿瘤对PD-1抑制剂的疗效。

为了明确环状RNA在胃癌中的表达特征和功能情况，为胃癌的转移预测和预后判断提供理论依据和潜在的治疗靶点，为此需要一种用于胃癌转移预测和预后判断的circRNA标志物及应用。

发明内容

本发明提出的一种用于胃癌转移预测和预后判断的circRNA标志物及应用，解决了现有技术中存在的问题。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种circRNA生物标志物在制备胃癌诊断的产品中的应用，所述 circRNA生物标志物为CircPCSK5，其核酸序列如SEQIDNO.1所示。

一种circRNA生物标志物在制备胃癌诊断的生物制品，包括所述 CircPCSK5。

优选的，所述生物制品包括：试剂、试剂盒、芯片。

一种胃癌治疗药物，包括：如CircPCSK5，或CircPCSK5的抑制剂。

优选的，所述CircPCSK5作为作用靶标。

优选的，所述抑制剂包括：si-circPCSK5#1:5，其序列为 -AGUCCUACGAUAAGGCAUGTT-3’。

优选的，所述抑制剂包括：si-circPCSK5#2:5，其序列为： -CUACGAUAAGGCAUGGGACTT-3。

本发明中，申请人通过高通量测序构建胃癌组织和癌旁正常胃粘膜组织的circRNA差异表达谱，利用RT-qPCR检测circPCSK5在胃癌中的表达情况；

采用χ²检验分析circPCSK5表达水平与胃癌临床病理资料相关性，利用Kaplan-Meier法绘制患者的总生存和无疾病生存曲线，Cox 比例风险模型分析影响胃癌患者预后的独立危险因素；

通过RNase R和Actinomycin D实验检测circPCSK5的稳定性；通过CCK-8和EdU实验检测circPCSK5对胃癌细胞增殖能力的影响，通过transwell实验检测circPCSK5对胃癌细胞迁移和侵袭能力的影响；利用western blot和RT-qPCR检测敲低或过表达circPCSK5后胃癌细胞上皮-间质转化标记物的表达变化；

因此在胃癌组织和细胞中，circPCSK5的表达明显升高(P<0.001， P<0.01)；CircPCSK5表达水平与患者的肿瘤大小、脉管侵犯、淋巴结转移和AJCC分期存在明显正相关性(P<0.05)；CircPCSK5高表达患者有更差的总生存和无病生存时间(P<0.001)，并且circPCSK5 高表达是胃癌患者预后的独立危险因素(P<0.05)；敲低circPCSK5 表达能明显抑制HGC27细胞的增殖、迁移和侵袭能力(P<0.01)，上皮-间质转化标记物E-cadherin表达升高，N-cadherin和Vimentin 表达降低(P<0.01)；过表达circPCSK5能促进MKN45细胞的增殖、迁移和侵袭能力(P<0.01)，降低E-cadherin表达，升高N-cadherin 和Vimentin表达(P<0.01)；CircPCSK5在胃癌中高表达，并能够促进胃癌细胞的增殖、侵袭和上皮-间质转化，可作为胃癌良好的预后预测指标和潜在的分子治疗靶点。

附图说明

图1为胃癌组织中差异表达的circRNA测序分析谱；其中：

图1A为胃癌组织和邻近正常胃粘膜组织中差异表达的circRNA 的热图；

图1B为circBase数据库表明circPCSK5的结构示意图；

图1C为Sanger测序分析显示circPCSK5的反向剪接位点的示意图；

图1D为使用HGC27细胞中随机引物和oligodT引物逆转录的模板cDNA，RT-qPCR检测circPCSK5和PCSK5mRNA的表达水平的示意图；

图1E为RT-qPCR检测用RNaseR处理后的HGC27细胞中circPCSK5 和PCSK5mRNA的表达的示意图；

图1F为RT-qPCR检测在指定时间点用放线菌素D处理后的HGC27 细胞中circPCSK5和PCSK5mRNA的表达的示意图；

图2为CircPCSK5在胃癌中高表达的测试图谱；其中：

图2A为采用RT-qPCR方法检测62对胃癌及癌旁组织中 circPCSK5的表达的示意图；

图2B为采用RT-qPCR方法检测circPCSK5在胃癌细胞系和正常人胃细胞系GES-1中的表达的示意图；

图2C为检测胃癌患者淋巴结转移阳性组与阴性组间circPCSK5 的表达水平差异的示意图；

图2D为检测胃癌患者AJCC分期为I-II期组与III期组间 circPCSK5的表达水平差异的示意图；

图3为CircPCSK5高表达在胃癌患者不良预后的测试图谱；其中：

图3A为对circPCSK5表达与胃癌患者总生存期相关性的 Kaplan-Meier分析的结果的示意图；

图3B为对circPCSK5表达与胃癌患者无疾病生存期相关性的 Kaplan-Meier分析的结果的示意图；

图3C为Cox比例风险回归分析显示胃癌患者总生存的独立危险因素的示意图；

图3D为Cox比例风险回归分析显示胃癌患者无疾病生存的独立危险因素的示意图；

图4为敲低circPCSK5表达能够抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭后的测试图谱；其中：

图4A为转染两种靶向抑制circPCSK5的siRNA后，RT-qPCR检测HGC27细胞中circPCSK5和PCSK5 mRNA的表达差异的示意图；

图4B为CCK-8实验检测circPCSK5敲低后HGC27细胞的增殖能力变化的示意图；

图4C为EdU实验检测敲低circPCSK5对HGC27细胞增殖能力的影响的示意图；

图4D为Transwell实验检测敲低circSMARCA5对HGC27细胞的迁移和侵袭能力影响的示意图；

图5为过表达circPCSK5能够促进胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭的测试图谱；其中：

图5A为在MKN45细胞中使用RT-qPCR检测circPCSK5的过表达效率的示意图；

图5B为CCK-8实验检测过表达circPCSK5后MKN45细胞的增殖能力变化的示意图；

图5C为EdU实验检测circPCSK5过表达对MKN45细胞增殖能力的影响的示意图；

图5D为Transwell实验检测circPCSK5过表达后MKN45细胞的迁移和侵袭能力影响的示意图；

图6为CircPCSK5对胃癌细胞EMT的影响的测试图谱；其中：

图6A为Western blot检测敲低circPCSK5的胃癌细胞中EMT标记物的表达变化的示意图；

图6B为RT-qPCR检测敲低circPCSK5的胃癌细胞中EMT标记物的表达变化的示意图；

图6C为Western blot检测过表达circPCSK5的胃癌细胞中EMT 标记物的表达变化的示意图；

图6D为RT-qPCR检测过表达circPCSK5的胃癌细胞中EMT标记物的表达变化的示意图。

具体实施方式

下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。

实施例1：

通过对3对胃癌和癌旁正常胃粘膜组织进行高通量测序构建 circRNA差异表达谱，如图1A所示，我们发现hsa_circ_0087234在胃癌组织中表达显著升高 [log2(foldchange)＝7.35,pvalue＝2.08E-07]；

通过circBase数据库检索结果显示，hsa_circ_0087234是一个新的circRNA，由PCSK5基因的6、7、8和9号外显子反向剪接形成，文中我们称之为circPCSK5，如图1B所示；

通过Sanger测序验证了circPCSK5接头处的成环序列，如图1C 所示；

之后利用oligo-dT引物的RT-qPCR检测结果表明circPCSK5缺少poly(A)尾，如图1D所示；

经RNaseR消化细胞后，RT-qPCR结果显示circPCSK5较 PCSK5mRNA表达升高，如图1E所示；

之后利用ActinomycinD处理细胞，在不同时间点利用RT-qPCR 检测circPCSK5和PCSK5mRNA表达，结果显示circPCSK5比线性mRNA 更稳定，如图1F所示。

实施例2：

将收集的62例胃癌患者的癌组织和癌旁组织，通过RT-qPCR检测circPCSK5的表达水平，结果显示胃癌组织中circPCSK5的表达明显升高，差异有统计学意义(P<0.001)，如图2A所示；

之后通过RT-qPCR结果显示circPCSK5在胃癌细胞系MKN45、 MKN28、AGS和HGC27中的表达较GES-1细胞显著升高，如图2B所示；

在整理62例胃癌患者的临床病理资料，按照胃癌组织中 circPCSK5表达水平中位数分为circPCSK5高表达组和circPCSK5低表达组，分析circPCSK5表达水平与患者临床病理变量的相关性，结果提示circPCSK5高表达与患者的肿瘤大小(P＝0.004)、脉管侵犯 (P＝0.022)、淋巴结转移(P＝0.010)和AJCC分期(P＝0.011)存在明显正相关，如表1所示；

表1为胃癌组织中circPCSK5表达水平与患者临床病理特征的相关性：

之后对患者的临床病理资料进行亚组分析，结果显示在伴有淋巴结转移和AJCC分期III期的患者中circPCSK5表达更高，差异具有统计学意义(P<0.001)，如图2C和2D所示。

实施例3：

对纳入的62例胃癌患者进行随访，Kaplan-Meier生存曲线结果显示，胃癌组织中circPCSK5高表达的患者具有更短的总生存时间和无疾病生存时间，如图3A和3B所示，差异均有统计学意义(P<0.001)；单因素生存分析结果显示，肿瘤大小≥5cm、脉管侵犯、淋巴结转移、 AJCC分期III期、circPCSK5高表达是影响胃癌患者总生存和无疾病生存的危险因素，如表2和3所示；

表2为胃癌患者总生存期的单因素和多因素回归分析：

表3为胃癌患者无病生存期的单因素和多因素回归分析：

将单因素分析中有统计学意义的变量纳入Cox多因素生存分析，结果表明淋巴结转移、AJCC分期III期、circPCSK5高表达是影响胃癌患者总生存和无疾病生存的独立危险因素，如图3C和D所示。

实施例4：

在HGC27细胞中利用siRNA技术敲低circPCSK5表达，RT-qPCR 结果显示si-circPCSK5#1的敲低效率最显著，并且不影响PCSK5mRNA 的表达水平，如图4A所示；

之后利用CCK-8和EdU实验结果表明si-circPCSK5#1组细胞的增殖能力明显受抑制(P<0.01)，如图4B和C所示；

再利用Transwell实验结果显示si-circPCSK5#15组细胞的迁移和侵袭能力较si-NC组显著降低(P<0.001)，如图4D所示。

实施例5：

在MKN45细胞中转染circPCSK5的过表达质粒，RT-qPCR验证转染效率，如图5A所示；

之后利用CCK-8实验和EdU实验结果表明过表达circPCSK5能够促进胃癌细胞的增殖能力(P<0.01)，如图5B和C所示；

再利用Transwell实验结果表明过表达circPCSK5组细胞的迁移和侵袭能力较对照组明显提高(P<0.001)，如图5D所示。

实施例6：

为了检测circPCSK5能否影响胃癌细胞的EMT进程，我们利用 western blot和RT-qPCR方法检测EMT标记物E-cadherin、 N-cadherin和Vimentin的表达变化；

结果显示：与对照组相比，circPCSK5敲低组细胞中上皮细胞标记物E-cadherin表达显著升高，间质细胞标记物N-cadherin及Vimentin的表达明显降低(P<0.01)，如图6A和B所示，而过表达 circPCSK5后E-cadherin表达下降，N-cadherin及Vimentin的表达升高(P<0.01)，如图6C和D所示。

实施例7：

circRNA测序：

用TRIzol试剂提取3对胃癌及癌旁正常胃粘膜组织总RNA， ND-100Nanodrop检测总RNA的纯度，利用Agilent2200TapeStation 检测RNA完整度，使用EpicentreRiboZerorRNA去除试剂盒从总RNA 中去除rRNA，利用RNaseR降解线性RNA，质检合格后委托广州锐博生物技术有限公司进行高通量测序。

实施例8：

细胞培养和转染：

利用含10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的 RPMI-1640培养基，将细胞置于37℃、5％CO2的培养箱中培养。在胃癌细胞中利用LipofectamineTM3000转染circPCSK5的siRNA和过表达质粒，48h后通过RT-qPCR检测circPCSK5的表达水平。circPCSK5 的siRNA序列为：

si-circPCSK5#1:5’-AGUCCUACGAUAAGGCAUGTT-3’

si-circPCSK5#2:5’-CUACGAUAAGGCAUGGGACTT-3’。

实施例9：

RT-qPCR实验：

通过TRIzol法提取组织和细胞总RNA，利用反转录试剂盒将RNA 反转录成cDNA。以cDNA为模板，GAPDH为内参，按照实时荧光定量 PCR试剂盒说明书进行PCR实验，利用2-ΔΔCt法计算circPCSK5 和PCSK5mRNA的相对表达量。circPCSK5、PCSK5和GAPDH的引物序列由广州锐博生物技术有限公司设计并合成。引物序列如下：

circPCSK5的正向引物为5’-AGCACGTGCACATTTACAGC-3’

circPCSK5的反向引物为5’-GCAGTGGTCTTTGCTCCTTC-3’

PCSK5的正向引物为5’-ACTCTTCAGAGGGTGGCTA-3’

PCSK5的反向引物为5’-GCTGGAACAGTTCTTGAATC-3’

GAPDH的正向引物为5’-AATCCCATCACCATCTTCC-3’

GAPDH的反向引物为5’-CATCACGCCACAGTTTCC-3’。

实施例10：

环状RNA稳定性检测：

提取细胞总RNA，经RNaseR消化后，利用RT-qPCR检测circPCSK5 和PCSK5mRNA的表达水平。细胞经ActinomycinD处理0、4、8、12 和24h后，提取细胞总RNA，利用RT-qPCR检测circPCSK5和PCSK5mRNA 的表达水平。

实施例11：

CCK-8实验：

将circPCSK5的siRNA或过表达质粒转染48h后的胃癌细胞按照 1×103个/孔的密度接种于96孔板，加入100μL培养基分别分别培养1、2、3、4和5d，每天在同一时间点加入10μLCCK-8试剂，置于细胞培养箱中避光温育2h，用酶标仪检测450nm波长处各孔的吸光度值。

实施例12：

EdU实验：

质粒转染48h后，按5×104细胞/孔接种到24孔板上，用4％多聚甲醛固定30min，0.5％TritonX-100溶液通透10min后，按照Cell-LightEdUApollo567InVitroKit说明书进行EdU标记、Apollo 染色和DNA染色，在荧光显微镜下随机挑选3个视野进行拍照并计算增殖细胞百分比。

实施例13：

Transwell实验：

质粒转染48h后，用含250μL无血清培养基将2×104个细胞置入预铺Matrigel基质胶的transwell上室，将500μL含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基加入下室，培养36-48h后，用4％多聚甲醛固定20min，0.1％结晶紫染色10min，在显微镜下拍照并计数，观察细胞侵袭能力。在transwell上室中不预铺Matrigel基质胶，按照同样方法进行实验，观察细胞迁移能力.

实施例14：

Western blot实验裂解细胞提取总蛋白，用BCA试剂盒测定各组细胞蛋白浓度，取等量蛋白进行SDS-PAGE，将分离的蛋白电转至PVDF膜上。用含5％脱脂奶粉的TBST溶液室温封闭2h，加入按比例稀释的E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和GAPDH一抗，4℃温育过夜。第二天加入辣根过氧化物酶偶联二抗，室温孵育2h，用超敏ECL化学发光试剂盒显色并曝光。

实施例15：

统计学方法

采用SPSS 25.0软件进行统计学分析。两组间计数资料采用χ2 检验，计量资料采用独立样本t检验。Kaplan-Meier曲线和log-rank 检验用于比较患者生存差异，Cox比例风险模型用于多因素生存分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。

实施例16：

研究对象：

均选取2018年4月至2019年4月在本院行胃癌根治术的患者共62 例，其中男性50例，女性12例，中位年龄63岁，收集患者的组织标本和临床病理资料。本研究患者纳入标准：(1)术后病理确诊为胃腺癌；(2)临床病理资料完整；(3)患者依从性好，所有患者均签署知情同意书。排除标准：(1)术后病理证实为非腺癌或合并其他病理类型；(2)合并其他部位恶性肿瘤；(3)非根治性切除；(3) 合并血液和自身免疫性疾病、精神类疾病等可能影响本研究结果。所有患者术前均未接受化疗、放疗、靶向或免疫治疗。术后对这些患者进行定期电话或门诊随访，记录患者疾病状态和生存情况，随访时间从手术日期至2022年3月31日，中位随访时间26月。本研究经皖南医学院第一附属医院(弋矶山医院)伦理委员会批准。

综上所述本申请人通过高通量测序构建胃癌组织和癌旁正常胃粘膜组织的circRNA差异表达谱，利用RT-qPCR检测circPCSK5在胃癌中的表达情况；

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”、“顺时针”、“逆时针”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的设备或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 皖南医学院第一附属医院（皖南医学院弋矶山医院）

<120> 一种用于胃癌转移预测和预后判断的circRNA标志物及应用

<130> 2010

<141> 2022-05-06

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 469

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

gcatgggact cgctgtgctg gagaagtggc agccgctgca aacaattcgc actgcacagt 60

cggaattgct ttcaacgcca agatcggagg agtgcgaatg ctggacggag atgtcacgga 120

catggttgaa gcaaaatcag ttagcttcaa cccccagcac gtgcacattt acagcgccag 180

ctggggcccg gatgatgatg gcaagactgt ggacggacca gcccccctca cccggcaagc 240

ctttgaaaac ggcgttagaa tggggcggag aggcctcggc tctgtgtttg tttgggcatc 300

tggaaatggt ggaaggagca aagaccactg ctcctgtgat ggctacacca acagcatcta 360

caccatctcc atcagcagca ctgcagaaag cggaaagaaa ccttggtacc tggaagagtg 420

ttcatccacg ctggccacaa cctacagcag cggggagtcc tacgataag 469

Claims

1.一种circRNA生物标志物在制备胃癌诊断的产品中的应用，所述circRNA生物标志物为CircPCSK5，其核酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品为生物制品，生物制品包括：试剂、试剂盒、芯片。