ES2535261T3 - Marcadores para la detección del cáncer gástrico - Google Patents
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Abstract
Un método para detectar cáncer gástrico, que comprende: (a) proporcionar un muestra biológica; y (b) detectar la sobreexpresión de un miembro de la familia GTM en dicha muestra, caracterizado porque el miembro de la familia GTM es un inhibidor de la serina o cisteína proteinasa clado H ("SERPINH1)
Description
Marcadores para la detección del cáncer gástrico
[0001] La supervivencia de pacientes con cáncer se aumenta enormemente cuando el cáncer se detecta y se trata de forma temprana. En el caso del cáncer gástrico, los pacientes diagnosticados con una enfermedad en fase temprana tienen tasas de supervivencia a 5 años del 90%, en comparación con de aproximadamente el 10% para
10 pacientes diagnosticados con una enfermedad avanzada. Sin embargo, la gran mayoría de los pacientes con cáncer gástrico se presentan actualmente con una enfermedad avanzada. Por lo tanto, los desarrollos que conducen a un diagnóstico temprano del cáncer gástrico pueden conducir a un pronóstico mejorado para los pacientes.
[0002] La identificación de marcadores específicos asociados a cáncer en muestras biológicas, incluyendo fluidos
15 corporales, por ejemplo, sangre, orina, lavados peritoneales y extractos de heces puede proporcionar una estrategia valiosa para el diagnóstico temprano del cáncer, conduciendo al tratamiento temprano y a un pronóstico mejorado. Los marcadores específicos de cáncer también pueden proporcionar un medio para controlar la progresión de la enfermedad, permitiendo realizar un seguimiento de la eficacia de tratamientos quirúrgicos, radioterápicos y quimioterápicos. Sin embargo, para varios cánceres de gran importancia, los marcadores disponibles experimentan
20 una sensibilidad y especificidad insuficientes. Por ejemplo, los marcadores usados más frecuentemente para el cáncer gástrico, ca19-9, ca72-4 y antígeno corioembrionario (CEA), detectan sólo aproximadamente el 15-50% de los tumores gástricos en cualquier fase, disminuyendo hasta aproximadamente el 2-11% para la enfermedad en fase temprana. Por lo tanto, existe una frecuencia muy elevada de ensayos falsos negativos que puede llevar a que los pacientes y el personal de atención sanitaria crean que no existe enfermedad, mientras que de hecho el paciente
25 puede tener un cáncer grave que requiera una atención inmediata. Además, estos marcadores pueden dar señales falsas positivas en hasta 1/3 de los individuos afectados por una enfermedad gástrica benigna.
[0003] WO 98/41864 describe métodos para el diagnóstico temprano de cáncer gástrico mediante la detección de expresión incrementada de mRNA o proteína COX2.
30 EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
[0004] Por lo tanto, existe una necesidad aguda de mejores métodos para detectar la presencia de cáncer. Aspectos de esta descripción describen métodos, composiciones y dispositivos que pueden proporcionarse para la
35 detección del cáncer en fase temprana, y que disminuyen la frecuencia de resultados de ensayo falsos positivos y falsos negativos.
[0005] Por lo tanto, la invención se refiere a un método para detectar cáncer gástrico, que comprende:
(a) proporcionar una muestra biológica; y
40 (b) detectar la sobreexpresión de un miembro de la familia GTM en dicha muestra, caracterizado porque el miembro de la familia de GTM es un inhibidor de la serina o cisteína proteinasa clado H (“SERPINH1”).
[0006] Algunas de las realizaciones de detección de GTM descritas en la presente memoria están sobreexpresadas de una forma altamente selectiva en células tumorales y de forma escasa, si en absoluto, en
45 células no tumorales, permitiendo una detección sensible y precisa del cáncer con la medición de un solo GTM sobreexpresado. En otras realizaciones, puede detectarse la sobreexpresión de dos, tres o más GTM en una muestra y puede proporcionar mayor certeza de diagnóstico.
[0007] Los genes seleccionados que codifican proteínas pueden secretarse por o escindirse a partir de la célula.
50 Estas proteínas, en solitario o en combinación entre sí, tienen utilidad como marcadores de suero o fluido corporal para el diagnóstico del cáncer gástrico o como marcadores para controlar la progresión de una enfermedad establecida. La detección de marcadores proteicos puede llevarse a cabo usando métodos conocidos en la técnica, e incluyen el uso de anticuerpos monoclonales, antisueros policlonales y similares.
[0008] Esta invención se ilustra en general con referencia a las figuras, en las que:
La Figura 1 representa una tabla de marcadores y secuencias oligonucleotídicas de marcadores para cáncer
60 gástrico de esta invención. La Figura 2 representa una tabla de resultados obtenidos de estudios llevados a cabo usando métodos de micromatrices. La Figura 3 representa una tabla de resultados obtenidos de estudios llevados a cabo usando PCR cuantitativa. Las Figuras 4a-4d representan las relaciones entre el log2 de resultados en veces obtenidos usando métodos de
matrices y qPCR, en los que los datos se centran sobre la mediana normal para cuatro marcadores de cáncer gástrico. Los cuadrados grises corresponden a muestras no malignas (“normales”) y los triángulos negros a muestras tumorales. Figura 4a: ASPN. Figura 4b: SPP1. Figura 4c: SPARC. Figura 4d: MMP12. Las Figuras 5a-5w representan histogramas que muestran los datos de frecuencia relativa frente al log2 del
5 cambio en veces obtenidos a partir de estudios de PCR cuantitativa de diversos marcadores tumorales. Figura 5a: ASPN; Figura 5b: CST1,2 y 4; Figura 5c: CSPG2; Figura 5d: IGFBP7; Figura 5e: INHBA; Figura 5f: LOXL2; Figura 5g: LUM; Figura 5h: SFRP4; Figura 5i: SPARC; Figura 5j: SPP1; Figura 5k: THBS2; Figura 5l: TIMP1; Figura 5m: adlicán; Figura 5n: PRS11; Figura 5o: ASAH1; Figura 5p: SFRP2; Figura 5q: GGH; Figura 5r: MMP12; Figura 5s: KLK10; Figura 5t: LEPRE1; Figura 5u: TG; Figura 5v: EFEMP2 y Figura 5w: TGFBI.
10 La Figura 6 es un histograma que muestra el número de marcadores con una expresión superior al 95º percentil de la mediana de la expresión normal. Los resultados se basan en los datos de qPCR y se muestran por separado para cada muestra tumoral. Las Figuras 7a-7c representan gráficas que muestran el log2 de expresión relativa de los marcadores en muestras tumorales individuales y muestras no malignas en comparación con la expresión del gen para el
15 marcador tumoral, CEA. CEA es el marcador sérico más usado actualmente para controlar la progresión del cáncer gástrico. La Figura 3 muestra una tabla que complementa la Figura 3. La Figura 8 resume los niveles de expresión determinados por qPCR para los marcadores tumorales candidato, pero usando los datos relacionados (es decir, muestras tumorales (“T”) y no malignas (“N”) del mismo individuo) para proporcionar una relación de T:N. La
20 Figura 8 también incluye marcadores adicionales no incluidos en la Figura 3, en concreto MMP2, CGR11, TGFB1, PCSK5, SERPINB5, SERPINH1. Por comparación, también se muestra el nivel de expresión del gen de marcador sérico establecido, CEACAM5 (CEA). 27 de los 29 marcadores tienen una diferencia de T:N mediana superior a o igual a CEA. Además, en comparación con CEA, 29/29 de los marcadores tienen un mayor porcentaje de muestras relacionadas en las que la expresión en la muestra tumoral supera la expresión en la
25 muestra normal. Tres marcadores, CST1,2,44, ASPN y SFRP4, mostraron una discriminación del 100% entre las muestras tumorales y normales relacionadas. Las secuencias génicas de estos marcadores y la localización de los cebadores y sondas usados para detectarlas se muestran en la presente memoria. Las Figuras 9a-9d representan los datos del cambio en veces de T:N individuales y la mediana para 29 marcadores de cáncer gástrico en 40 pacientes con muestras relacionadas.
30 Las Figuras 10a-10ad representan gráficas de la fase tumoral y del log2 del cambio en veces en la expresión de CEA y otros GTM de esta invención. Figura 10a: adlicán; Figura 10b: ASPN; Figura 10c: CSPG2; Figura 10d: CST1,2,4; Figura 10e: EFEMP2; Figura 10f: GGF; Figura 10g: INHBA; Figura 10h: IGFBP7; Figura 10i: KLK10; Figura 10j: LEPRE1; Figura 10k: LUM; Figura 10l: LOXL2; Figura 10m: MMP12; Figura 10n;TIMP1; Figura 10o: ASAH1; Figura 10p: SPP1; Figura 10q SFRP2; Figura 10r. SFRP4; Figura 10s: SPARC; Figura 10t: PRSS11;
35 Figura 10u: THBS2: Figura 10v: TG; Figura 10w: TGFBI; Figura 10x: CGR11; Figura 10y: SERPINH1; Figura 10z: MMP2; Figura 10aa: PCSK5; Figura 10ab: SERPINB5; Figura 10ac: TGFB1 y Figura 10ad: CEA (CEACAM5). Las Figuras 11a-11ad representan gráficas del tipo tumoral (difuso (D) o intestinal (I)) y del log2 del cambio en veces en la expresión de 29 GTM de esta invención y CEA. Figura 11a: adlicán; Figura 11 b: ASPN; Figura 11 c: CSPG2; Figura 11d, CST1,2,4; Figura 11e: EFEMP2; Figura 11 f: GGH; Figura 11g: INHBA; Figura 11h: IGFBP7;
40 Figura 11i: KLK10; Figura 11j: LEPRE1: Figura 11k: LUM; Figura 11l: LOXL2; Figura 11m: MMP12; Figura 11n: TIMP1; Figura 11o: ASAH1; Figura11p: SPP1; Figura 11q: SFRP2; Figura 11r: SFRP4: Figura11s; SPARC; Figura 11t: PRSS11: Figura 11u: THBS2; Figura 11v: TG; Figura 11w: TGFBI; Figura 11x: CGR11: Figura 11y: SERPINH1; Figura 11z: MMP2; Figura 11aa: PCSK5; Figura 11ab: SERPINB5; Figura 11ac: TGFB1 y Figura 11ad: CEA (CEACAM5).
45 La Figura 12 representa una gráfica tridimensional que muestra 3 marcadores, SERPINH1, CST1,2,4 e INHBA, en una serie de muestras de tumor gástrico y muestras gástricas no malignas. La Figura 13 representa una tabla que muestra el efecto de múltiples marcadores sobre la capacidad para discriminar con precisión entre tejido tumoral y tejido no maligno. La tabla se ha obtenido a partir de distribuciones normales procedentes de datos de qPCR.
50 La Figura 14 es una transferencia de Western de 4 marcadores tumorales procedentes de tejido tumoral y no tumoral. La Figura 15 es una transferencia de Western del marcador tumoral SPARC en tejido de tumor gástrico y en suero. La Figura 16 es una inmunotransferencia que representa la cistatina SN en el sobrenadante de una línea celular
55 gástrica, AGS.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
60 [0009] Antes de describir realizaciones de la invención en detalle, será útil proporcionar algunas definiciones de términos como se usan en la presente memoria.
[0010] Los términos “GTM” o “marcador tumoral gástrico” o “miembro de la familia de GTM” se refieren a una
proteína o fragmento proteico relacionado u otra molécula de identificación asociada con el cáncer gástrico, que no incluyen moléculas que se sepa en la técnica anterior que están asociadas con el cáncer gástrico, ca19-9, ca72-4 y CEA. Se incluyen ejemplos de GTM a continuación en la presente memoria.
5 [0011] El término “marcador” se refiere a una molécula que está asociada cuantitativamente o cualitativamente con la presencia de un fenómeno biológico. Son ejemplos de marcadores los “GTM”, sin embargo, los “marcadores” también incluyen metabolitos, subproductos, relacionados ya sea directa o indirectamente con un mecanismo subyacente a una afección.
10 [0012] El término “qPCR” significa reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa.
[0013] El término “expresión” incluyen la producción de ARNm a partir de un gen o porción de un gen, e incluye la producción de una proteína codificada por un ARN o gen o porción de un gen, e incluye la aparición de un material de detección asociado con la expresión. Por ejemplo, la unión de un ligando de unión, tal como un anticuerpo, a un
15 gen u otro oligonucleótido, una proteína o un fragmento proteico, y la visualización del ligando de unión se incluyen dentro del alcance del término “expresión”. Por lo tanto, una densidad aumentada de una mancha en una inmunotransferencia, tal como una transferencia de Western, se incluye dentro del término “expresión” de la molécula biológica subyacente.
20 [0014] El término “CPN2” significa carboxipeptidasa humana N, polipéptido 2, cadena de 83 kDa; y carboxipeptidasa N.
[0015] El término “HAPLN4” significa proteína ligada a glicoproteína de hialuronano 4 humana.
25 [0016] El término “MMP12” significa metaloproteinasa de la matriz 12 humana.
[0017] El término “INHBA” significa inhibina humana, beta A (también incluye activina A, activina AB o polipéptido alfa).
30 [0018] El término “IGFBP7” significa factor de crecimiento de tipo insulina 7 humano.
[0019] El término “GGH” significa gamma-glutamil hidrolasa humana (también conocida como conjugasa, folilpoligammaglutamil hidrolasa).
35 [0020] El término “LEPRE1” significa proteoglicano enriquecido con leucina-prolina humano (también conocido como leprecán 1).
[0021] El término “CST4” significa cistatina S humana.
40 [0022] El término “SFRP4” significa proteína relacionada con Frizzled secretada 4 humana.
[0023] El término “ASPN” significa asporina humana (también conocida como LRR clase 1).
[0024] El término “CGREF1 o “CGR11” significa regulador del crecimiento celular humano con domino de mano EF
45 1. [0025] El término “KLK” significa calicreína 10 humana, variante 1 o calicreína 10 humana, variante 2, o ambas, a menos que se especifique otra cosa. 50 [0026] El término “TIMP1” significa inhibidor tisular de metaloproteinasa 1 humano (también conocido como inhibidor de colagenasa o actividad de potenciación eritroide). [0027] El término “SPARC” significa proteína secretada humana, ácida, rica en cisteína (también conocida como osteonectina). 55 [0028] El término “TGFBI” significa factor de crecimiento transformante humano, beta-inducido, 68kDa. [0029] El término “EFEMP2” significa proteína de la matriz extracelular de tipo fibulina que contiene EGF 2 humana.
60 [0030] El término “LUM” significa lumicán humano. [0031] El término “SNN” significa estanina humana. [0032] El término “SPP1” significa fosfoproteína secretada 1 humana (también conocida como osteopontina, o
sialoproteína ósea I, o activación de linfocitos T temprana 1).
[0033] El término “CSPG2” significa proteoglicano de sulfato de condroitina 2 humano (también conocido como versicán).
5 [0034] El término “ASAH1” significa N-acilesfingosina amidohidrolasa humana, variante 1, o N-acilesfingosina amidohidrolasa, variante 2, o ambas variantes 1 y 2 de N-acilesfingosina amidohidrolasa (también conocidas como ceramidasa ácida 1, variantes 1 y 2).
10 [0035] El término “PRSS11” significa serina proteasa humana 11 (también conocida como serina proteasa de unión a IGF).
[0036] El término “SFRP2” significa proteína relacionada con Frizzled secretada 2 humana.
15 [0037] El término “PLA2G12B” significa fosfolipasa A2 humana, grupo XIIB.
[0038] El término “SPON2” significa espondina 2 humana, proteína de la matriz extracelular. El término “OLFM1” significa olfactomedina humana 1.
20 [0039] El término “TSRC1” significa trombospondina que contiene repeticiones 1 humana.
[0040] El término “THBS2” significa trombospondina 2 humana.
[0041] El término “adlicán” significa DKFZp564l1922. 25 [0042] El término “CST2” significa cistatina SA humana.
[0043] El término “CST1” significa cistatina SN humana.
30 [0044] El término “LOXL2” significa enzima de tipo lisil oxidasa 2 humana.
[0045] El término “TG” significa tiroglobulina humana.
[0046] El término “TGFB1” significa factor de crecimiento transformante, beta 1 humano.
35 [0047] El término “SERPINH1” significa inhibidor de serina o cisteína proteinasa humano, clado H (también conocido como proteína de choque térmico 47, miembro 1, o proteína de unión a colágeno 1).
[0048] El término “SERPINB5” significa inhibidor de serina o cisteína proteinasa humano, clado B (también 40 conocido como ovoalbúmina, miembro 5).
[0049] El término “CEACAM5” o “CEA” significa molécula de adhesión celular relacionada con el antígeno carcinoembrionario humano 5.
45 [0050] El término “MMP2” significa metaloproteinasa de la matriz 2 humana (también conocida como gelatinasa A
o gelatinasa de 72 kDa, o colagenasa de tipo IV de 72 kDa).
[0051] El término “PCSK5” significa proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 5 humana.
50 [0052] Debe entenderse que los términos anteriores pueden referirse a una proteína. También debe entenderse que los términos anteriores también se refieren a proteínas no humanas que tienen las mismas secuencias que las representadas en la presente memoria.
55 [0053] Se proporcionan marcadores para la detección y evaluación de tumores, incluyendo el cáncer gástrico, que tienen una mayor fiabilidad en la detección del cáncer gástrico que los marcadores de la técnica anterior. Mediante el término “fiabilidad” los inventores incluyen la ausencia de falsos positivos y/o falsos negativos. Por lo tanto, con una mayor fiabilidad de un marcador, se asocian menos falsos positivos y/o falsos negativos con los diagnósticos
60 realizados usando ese marcador. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, se proporcionan marcadores que permiten la detección del cáncer gástrico con una fiabilidad superior a la fiabilidad de los marcadores de la técnica anterior de aproximadamente el 50%. En otras realizaciones, se proporcionan marcadores que tienen una fiabilidad superior a aproximadamente el 70%; en otras realizaciones, superior a aproximadamente el 73%, en otras realizaciones más superior a aproximadamente el 80%, en otras realizaciones más superior al 90%, en otras más superior a
aproximadamente el 95%, en otras realizaciones más superior a aproximadamente el 98% y, en ciertas realizaciones, una fiabilidad de aproximadamente el 100%.
[0054] Por lo tanto, los inventores han descubierto sorprendentemente numerosos genes y proteínas cuya
5 presencia está asociada con tumores gástricos. La detección de productos génicos (por ejemplo, oligonucleótidos tales como ARNm) y proteínas y péptidos traducidos a partir de dichos oligonucleótidos puede usarse por tanto para diagnosticar tumores, tales como tumores gástricos. El análisis de matrices de muestras tomadas de pacientes con tumores gástricos y de tejidos no malignos de los mismos sujetos ha conducido a los presentes inventores al sorprendente descubrimiento de que, en muchos tumores gástricos, patrones específicos de sobreexpresión de
10 ciertos genes están asociados con la enfermedad.
[0055] También pueden detectarse marcadores de cáncer usando anticuerpos generados contra marcadores de cáncer.
15 [0056] Analizando la presencia y las cantidades de expresión de una pluralidad de marcadores de cáncer puede aumentar por tanto la sensibilidad del diagnóstico, al tiempo que se disminuye la frecuencia de resultados falsos positivos y/o falsos negativos.
20 [0057] Las siguientes estrategias son métodos no limitantes que pueden usarse para detectar el cáncer, incluyendo el cáncer gástrico, usando miembros de la familia de GTM.
Ensayos inmunológicos ligados a enzimas (ELISA).
25 Inmunohistoquímica usando anticuerpos anti-marcador en tumores gástricos y metástasis de ganglios linfáticos. Inmunohistoquímica usando anticuerpos anti-marcador en otros tumores incluyendo, pero sin limitación, colorrectal, pancreático, ovárico, melanoma, hepático, esofágico, de vejiga, endometrial y cerebral. Inmunodetección de miembros de la familia de marcadores en sueros de pacientes con cáncer gástrico tomados antes y después de la cirugía para extirpar el tumor.
30 Inmunodetección de miembros de la familia de marcadores en sueros de individuos sanos e individuos con enfermedades no malignas tales como gastritis, ulceración, metaplasia y displasia gástrica. Inmunodetección de miembros de la familia de marcadores en pacientes con otros cánceres incluyendo, pero sin limitación, colorrectal, pancreático, ovárico, melanoma, hepático, esofágico, de vejiga, endometrial y cerebral. Detección de marcadores en fluidos corporales incluyendo suero, linfa, líquido peritoneal, líquido cefalorraquídeo,
35 líquido sinovial y similares. Inmunodetección de miembros de la familia de marcadores en fluido gástrico, lavados peritoneales, orina y heces de pacientes con cáncer gástrico. Análisis de datos de matrices o qPCR usando ordenadores. Se recogen los datos principales y se realiza un análisis del cambio en veces por comparación de los niveles de expresión génica de tumor gástrico con la expresión
40 de los mismos genes en tejido no tumoral. Se proporciona un umbral para concluir que la expresión está aumentada (por ejemplo, un aumento de 1,5 x, un aumento de 2 veces y, en realizaciones alternativas, un aumento de 3 veces, un aumento de 4 veces o un aumento de 5 veces). Puede apreciarse que pueden seleccionarse otros umbrales para concluir que se ha producido un aumento de la expresión sin alejarse del alcance de esta invención. Un análisis adicional de la expresión génica de tumores incluye relacionar esos genes que muestran una expresión aumentada
45 con perfiles de expresión de tumores gástricos conocidos para proporcionar el diagnóstico de tumores.
[0058] En ciertos aspectos, esta descripción permite métodos para detectar el cáncer que comprenden:
(a) proporcionar una muestra biológica; y
50 (b) detectar la sopreexpresión de un miembro de la familia de GTM en dicha muestra. [0059] En otros aspectos, la descripción permite una etapa de detección de la sobreexpresión de ARNm de GTM.
[0060] En otros aspectos, la descripción permite una etapa de detección de la sobreexpresión de una proteína GTM.
55 [0061] En otros aspectos adicionales, la descripción permite una etapa de detección de la sobreexpresión de un péptido GTM.
[0062] En otros aspectos adicionales, la descripción permite un dispositivo para detectar un GTM, que comprende
60 un sustrato que tiene un reactivo de captura de GTM sobre el mismo; y un detector asociado con dicho sustrato, siendo dicho detector capaz de detectar un GTM asociado con dicho reactivo de captura, en el que el reactivo de captura incluye un oligonucleótido o un anticuerpo.
[0063] Otros aspectos permitidos incluyen kits para detectar el cáncer, que comprenden:
un sustrato; un reactivo de captura de GTM, incluyendo uno o más de un oligonucleótido específico de GTM y un anticuerpo 5 específico de GTM; y instrucciones para su uso.
[0064] Otros aspectos permitidos más incluyen un método para detectar un GTM usando qPCR, que comprende:
10 un cebador directo específico para dicho GTM; un cebador inverso específico para dicho GTM; reactivos de PCR; un vial de reacción; y instrucciones para su uso.
15 [0065] Otros aspectos permitidos comprenden un kit para detectar la presencia de una proteína o péptido GTM, que comprende:
un sustrato que tiene un agente de captura para dicha proteína o péptido GTM;
20 un anticuerpo específico para dicha proteína o péptido GTM; un reactivo capaz de marcar un anticuerpo unido para dicha proteína o péptido GTM; y instrucciones para su uso.
[0066] Otros aspectos permitidos incluyen un método para fabricar un anticuerpo monoclonal, que comprende las 25 etapas de:
[0067] En otros aspectos permitidos más, un método para detectar el cáncer gástrico comprende las etapas de:
proporcionar una muestra a partir de un paciente sospechoso de tener cáncer gástrico, 30 medir la presencia de una proteína GTM usando un método de ELISA.
[0068] Como se describe en la presente memoria, la detección de tumores puede efectuarse midiendo la expresión de uno o más marcadores específicos de tumor. Los inventores han descubierto inesperadamente que la asociación entre una expresión aumentada de GTM y la presencia de cáncer gástrico diagnosticado es
35 extremadamente elevada. La asociación menos significativa detectada tiene un valor p de aproximadamente 1,6 x 10-6 . Muchas de las asociaciones eran significativas a valores p de menos de 10-20 . Con una significación tan elevada, puede no ser necesario detectar una expresión aumentada en más de un GTM. Sin embargo, la redundancia en los GTM de esta invención puede permitir la detección de cánceres gástricos con una fiabilidad aumentada.
40 [0069] Los métodos proporcionados en la presente memoria también incluyen ensayos de alta sensibilidad. Con dicha sensibilidad, se hace posible una detección muy temprana de acontecimientos que están asociados con cáncer gástrico.
[0070] Los siguientes métodos generales se usaron para evaluar la idoneidad de diversas estrategias para la identificación molecular de marcadores asociados con tumores gástricos.
[0071] Se recogieron muestras de tumor gástrico y tejidos gástricos no malignos a partir de especímenes quirúrgicos resecados en el Seoul National University Hospital, Korea y en el Dunedin Hospital, Nueva Zelanda. El 55 diagnóstico de cáncer gástrico se realizó basándose en los síntomas, los hallazgos físicos y el examen histológico de los tejidos.
60 [0072] En algunos casos, la expresión de genes asociados con tumores gástricos se analizó por determinación de los cambios en el ARN de muestras tomadas de tumores. Se embebieron especímenes quirúrgicos congelados en medio OCT. Se cortaron secciones de 60 m a partir de los bloques de tejido usando un microtomo, se homogeneizaron en una mezcla de TriReagent:agua (3:1), después se extrajeron con cloroformo. El ARN total se purificó después a partir de la fase acuosa usando el procedimiento RNeasy (Qiagen). También se extrajo ARN de
16 líneas celulares de cáncer y se combinaron para que sirvieran como ARN de referencia.
5 [0073] Se obtuvieron portaobjetos de vidrio recubiertos con epoxi de MWG Biotech AG, (Ebersberg, Alemania) y se imprimieron con 30.000 oligonucleótidos de 50 unidades usando un robot de generación de micromatrices Gene Machines, de acuerdo con el protocolo del fabricante. En la Figura 2 se muestran los números de referencia (nº oligo MWG) para los oligonucleótidos pertinentes y las secuencias de referencia de ARNm y proteína del NCBI. Las secuencias de ADN completas de los GTM de esta invención se muestran a continuación en la presente memoria.
[0074] Se transcribió el ADNc a partir de 10 g de ARN total usando la transcriptasa inversa Superscript II (Invitrogen) en reacciones que contenían 5-(3-aminoalil)-2’-desoxiuridina-5’-trifosfato. La reacción se desionizó 15 después en una columna Microcon, antes de incubarse con Cy3 o Cy5 en tampón bicarbonato durante 1 hora a temperatura ambiente. Los colorantes no incorporados se eliminaron usando una columna Qiaquick (Qiagen) y la muestra se concentró hasta 15 l en un SpeedVac. Los ADNc marcados con Cy3 y Cy5 se mezclaron después con tampón Ambion ULTRAhyb, se desnaturalizaron a 100 ºC durante 2 minutos y se hibridaron con los portaobjetos de micromatrices en cámaras de hibridación a 42 ºC durante 16 horas. Los portaobjetos se lavaron después y se
20 exploraron dos veces en un explorador Axon 4000A a dos ajustes de energía para dar los datos de fluorescencia primaria sobre la expresión génica.
25 [0075] Para comparar la expresión de genes de cáncer de tumores y tejidos no cancerosos, las intensidades de fluorescencia medianas detectadas por el software Genepix se corrigieron restando las intensidades de fluorescencia de fondo locales. Se excluyeron las manchas con una intensidad corregida por el fondo de menos de cero. Para facilitar la normalización, se realizó una transformación logarítmica de las relaciones de intensidad y de las intensidades de manchas globales. Las relaciones de intensidad transformadas logarítmicamente se corrigieron
30 por colorante y sesgo espacial usando una regresión local aplicada en el paquete LOCFIT. Se realizó una regresión de las relaciones de intensidad transformadas logarítmicamente simultáneamente con respecto a la intensidad de manchas global y a la localización. Los residuos de la regresión local proporcionaron los cambios en veces logarítmicos corregidos. Para el control de calidad, las relaciones de cada micromatriz normalizada se representaron con respecto a la intensidad de manchas y a la localización. Las representaciones se inspeccionaron
35 visualmente posteriormente para determinar posibles artefactos restantes. Además, se aplicó un modelo de análisis de varianza (ANOVA) para la detección de sesgo de punta de pin. Todos los resultados y parámetros de la normalización se insertaron en una base de datos Postgres para su análisis estadístico.
40 [0076] Se identificaron cambios estadísticamente significativos en la expresión génica en muestras tumorales frente a tejidos normales por los cambios en veces medidos entre matrices. Para lograrlo, los log2 (relaciones) se aumentaron a escala para tener la misma desviación estándar global por matriz. Este procedimiento de normalización reducía el promedio de variabilidad dentro de clase de tejido. Los log2 (relaciones) se desplazaron
45 adicionalmente para que tuvieran una mediana de valor de cero para cada oligonucleótido para facilitar la inspección visual de los resultados. Un ensayo de rango basado en cambios en veces se usó después para mejorar la robustez de las interferencias. Este ensayo consistía en dos etapas: (i) cálculo del rango del cambio en veces (Rfc) dentro de matrices y ii) resta de la mediana (Rfc) para tejido normal de la mediana (Rfc) para tejido tumoral. La diferencia de ambas medianas de rango define la puntuación del rango del cambio en veces presentada en la Figura 2. También
50 se realizaron dos ensayos estadísticos adicionales sobre estos datos normalizados: 1) Prueba t de student de dos muestras, con y sin el ajuste de Bonferroni y 2) la prueba de Wilcoxon.
55 [0077] Para determinar el valor de usar combinaciones de dos o tres de los marcadores para discriminar entre muestras tumorales y no malignas, los datos de qPCR de 40 muestras relacionadas (muestras tumorales y no malignas del mismo paciente) se sometieron al análisis siguiente. Se generaron distribuciones normales para las muestras no malignas y tumorales usando las medias y desviaciones típicas de las muestras. La probabilidad de que valores tomados de los datos de expresión tumoral superarían un umbral definido (por ejemplo, superior al 50%,
60 70%, 73%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100%) en la distribución no maligna se determinó después (es decir, sensibilidad). Para combinaciones de marcadores, se determinó la probabilidad de que al menos un marcador superase el umbral.
- nombre
- símbolo Nº de Ensayo Biosystems “assay on demand” aplicado cebador directo Sec ID Nº cebador inverso Sec ID Nº sonda Sec ID Nº
- asporina (lrr clase 1)
- ASPN AAATACAAAAGGACACATTCAAAGGA 1 TGCTTCTGCAATTCTGATATGGA 23 TTGGAAATGAGTGCAAACCCTCTTGATAATAATG 45
- proteoglicano de sulfato de condroitina 1 (versicán)
- CSPG2 GCCAGTGGAATGATGTTCCC 2 TCTTGGCATTTTCTACAACAGGG 24 AGGAACAGTTGCTTGCGGCCAGC 46
- cistatinas SN, SA y S
- CST1, 2, 4 AGTCCCAGCCCAACTTGGA 3 GGGAACTTCGTAGATCTGGAAAGA 25 AGCCAGAACTGCAGAAGAAACAGTTGTGC 47
- gamma-glutamilhidrolasa
- GGH GTGGCAATGCCGCTGAA 4 TGACAGCAACAACTCAGTAGGAAAA 26 TTCACTGGGGTCAATTGCACAGCAGAAT 48
- proteína de unión a factor de crecimiento de tipo insulina 7
- IGFBP7 CAGGTCAGCAAGGGCACC 5 TCACAGCTCAAGTACACCTGGG 27 AGCAAGGTCCTTCCATAGTGACGCCC 49
- calicreína 10
- KLK10 ACAACATGATATGTGCTGGACTGG 6 GAGAGGATGCCTTGGAGGGT 28 CTTGCCAGAGTGACTCTGGAGGCCC 50
- proteoglicano enriquecido con leucinaprolina 1 (leprecán 1)
- LEPRE1 CTTGAGTACAACGCTGACCTCTTC 7 CCGTGACACAGTTCTGCTTACAG 29 CCATCACAGATCATTACATCCAGGTCCTCA 51
- lumicán
- LUM GATTCTTGTCCATAGTGCATCTGC 8 CCAATCAATGCCAGGAAGAGA 30 TAAGGATTCAAACCATTTGCCAAAAATGAGTCTAAG 52
- tipo lisil oxidasa 2
- LOXL2 AGGCCAGCTTCTGCTTGGA 9 CCTGATCGCCGAGTTG 31 CGTAATTCTTCTGGATGTCTCCTTCACATTCTG 53
- metaloproteinasa de la matriz 12
- MMP12 GCCTCTCTGCTGATGACATACGT 10 AGTGACAGCATCAAAACTCAAATTG 32 TCAGTCCCTGATATGGAGACCCAAAAGAGAA 54
- inhibidor de la metaloproteinasa 1
- TIMP1 CCAGACCACCTTATACCAGCG 11 GGACCTGTGGAAGTATCCGC 33 CAAGATGACCAAGATGTATAAAGGGTTCCAAGC 55
- n-acilesfingosina amidohidrolasa
- ASAH1 CGCAGAACGCCTGCAAA 12 ACAGGACATCATACATGGTTTCAAA 34 TGTCTGAACCGCACCAGCCAAGAGAATA 56
- proteína relacionada con Frizzled secretada 2
- SFRP2 CGCTAGCAGCGACCACCT 13 TTTTGCAGGCTTCACATACCTTT 35 CTGCCAGCACCGAGGAAGCTC 57
- proteína secretada, ácida, rica en cisteína
- SPARC TCTTCCCTGTACACTGGCAGTTC 14 GAAAAAGCGGGTGGTGCA 36 TGGACCAGCACCCCATTGACGG 58
- serina proteasa 11 (unión a IGF)
- PRSS11 TCGGGAGGCCCGTTAGTAA 15 AAGGAGATTCCAGCTGTCACTTTC 37 AGTGTTAATTCCAATCACTTCACCGTCCAGG 59
- trombospondina 2
- THBS2 TGGAAGGACTACACGGCCTATAG 16 TAGGTTTGGTCATAGATAGGTCCTGAGT 38 AGGCCCAAGACCGGCTACATCAGAGTC 60
- tiroglobulina
- TG GACGGTTCCTCGCAGTTCAA 17 TGTAAACCGCTCCACTTCACAT 39 TCTGGCAGATTCCGATGCCCCACAAA 61
- regulador del crecimiento de células humanas con dominio de mano EF 1
- CGR11 CTGCCCACCCCTTCCA 18 TTCTGTCCTTCCTAGTCCCTTTAGG 40 CCAGGCCAGGAGCAGCTCGG 62
- inhibidor de serina o cisteína proteinasa clado B humano
- SERPINB5 TCCACGCATTTTCCAGGATAA 19 AAGCCGAATTTGCTAGTTGCA 41 TGACTCCAGGCCCGCAATGGA 63
- factor de crecimiento transformante 1
- TGFB1 GGTCCATGTCATCACCAATGTT 20 TCTGCAAGTTCATCCCCTCTTT 42 CAGCCTCCAGCCAACAGACCTCAGG 64
- proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 5 humana
- PCSK5 AAAAATCTTTGCCGGAAATGC 21 AGTCCTGGCCGTTGAAATACC 43 ACAGAATGTAGGGATGGGTTAAGCCTGCA 65
- metaloproteinasa de la matriz 2
- MMP2 TTGATGGCATCGCTCAGATC 22 TGTCACGTGGCGTCACAGT 44 TTCAAGGACCGGTTCATTTGGCG 66
- inhibidor de la serina o cisteína proteinasa clado H
- SERPINH1 Hs00241844_m1
- nombre
- símbolo Nº de EnsayoBiosystems“assay ondemand”aplicado cebador directo SecIDNº cebador inverso SecIDNº sonda SecIDNº
- adlicán
- Hs00377849_m1
- proteína de la matrizextracelular de tipo fibulina que contiene egf2
- EFEMP2 Hs00213545_m1
- proteína relacionada conFrizzled secretada 4
- SFRP4 Hs00180066_m1
- cadena beta A de inhibina
- INHBA Hs00170103_m1
- osteopontina
- SPP1 Hs00167093_m1
- factor de crecimientotransformante B-inducido
- TGFBI Hs00165908_m1
- Figura 1
Tabla 1
[0078] En otros casos, puede usarse PCR a tiempo real o cuantitativa (qPCR) para una cuantificación absoluta o relativa del número de copias de molde por PCR. Se diseñaron conjuntos de cebadores y sondas Taqma usando 5 Primer Express V 2.0 (Applied Biosystems). Cuando fue posible, se incluyeron todas las variantes potenciales de corte y empalme en el amplicón resultante, dándose preferencia en el amplicón a las regiones abarcadas por el oligonucleótido de micromatriz procedente de MWG-Biotech. Como alternativa, si el gen diana estaba representado por un ensayo de expresión Assay-on-Demand (Applied Biosystems) que abarcaba los amplicones deseados, se usaron estos. El nombre del gen, el símbolo, el número de Applied Biosystems "assay on demand", la secuencia del 10 cebador directo, del cebador inverso y de las sondas usadas para qPCR se muestran en la Tabla 1 y en la Figura 1. En los ensayos diseñados en el laboratorio de los inventores, la concentración de cebador se valoró usando un protocolo de marcaje con SYBR green y ADNc generado a partir de ARN de referencia. La amplificación se llevó a cabo en un sistema de detección de secuencia ABI Prism 7000 en condiciones de ciclado convencionales. Cuando se observaron productos de amplificación individuales en las curvas de disociación, se generaron curvas patrón 15 sobre un intervalo de concentraciones de 625 veces usando concentraciones de cebadores óptimas y la sonda Taqman 5’FAM-3’TAMRA fosfato (Proligo) a una concentración final de 250 nM. Se usaron ensayos que proporcionaban curvas patrón con coeficientes de regresión por encima de 0,98 en los ensayos posteriores. Puede apreciarse que en otras realizaciones, los coeficientes de regresión no tienen que ser tan elevados. En su lugar, puede usare cualquier curva patrón siempre que los coeficientes de regresión sean lo bastante altos para permitir
20 una determinación estadísticamente significativa de diferencias en la expresión. Dichos coeficientes de regresión pueden estar por encima de aproximadamente 0,7, por encima de aproximadamente 0,8, por encima de aproximadamente 0,9 o por encima de aproximadamente 0,95 en realizaciones alternativas.
[0079] Se realizaron ensayos sobre dos placas de 96 pocillos con cada muestra de ARN representada por un solo
25 ADNc. Cada placa contenía una curva patrón de ADNc de referencia, a lo largo de un intervalo de concentraciones de 625 veces, por duplicado. El análisis consistió en el cálculo del CT (CT de gen diana – CT de ADNc de referencia medio). El CT es directamente proporcional al log2 del cambio en veces. Los log2 del cambio en veces respecto a la mediana de log2 del cambio en veces no maligno se calcularon después (log2 del cambio en veces – mediana de log2 del cambio en veces normal). Estos cambios en veces se agruparon después en clases de
30 frecuencia y se representaron gráficamente.
[0080] El ARN de 58 tumores gástricos y 58 muestras de tejido gástrico no maligno (“normal”) se marcó con Cy5 y
35 se hibridó por duplicado o triplicado con ARN de referencia marcado con Cy3. Después de la normalización, el cambio en la expresión en cada uno de los 29.718 genes se estimó entonces mediante tres medidas: (i) cambio en veces: la relación de la mediana de la expresión génica (no normalizada) en las muestras tumorales dividida por la mediana del nivel en las muestras no malignas, (ii) rango del cambio en veces y (iii) la probabilidad estadística de que los cambios en veces observados fueran significativos.
[0081] En ciertos casos, el marcador de cáncer puede encontrarse en fluidos biológicos, incluyendo suero. Los marcadores séricos se seleccionaron de los datos de matrices basándose en (i) la presencia de una secuencia señal
45 característica de proteínas secretadas o escindidas a partir de la parte externa de la membrana, (ii) la mediana del nivel de sobreexpresión (cambio en veces) en tumores en comparación con controles no malignos, (iii) la mediana del cambio en el rango de expresión entre tumores y controles no malignos y (iv) el grado de superposición entre los intervalos de expresión en los tumores y los controles no malignos.
50 [0082] Se sabe que los 29 GTM tienen una secuencia peptídica señal en el extremo 5' de sus secuencias codificantes. La secuencia señal dirige a las proteínas GTM para su transporte hacia un compartimento extracelular a través de la membrana plasmática (Gunner von Heijne, Journal of Molecular Biology 173: 243-251 (1984). Además, ninguno de los GTM tiene motivos de secuencia transmembrana que darían como resultado que la proteína de longitud completa quedara retenida dentro de la membrana plasmática. Por consiguiente, es probable que todos los marcadores GTM de esta invención se
55 secreten hacia el compartimento extracelular y, por lo tanto, puedan estar en contacto con los vasos sanguíneos, captándose por los capilares o transportándose hacia el sistema linfático y después hacia los vasos sanguíneos. Como resultado, cada uno de estos marcadores derivados de tumores estará presente en la sangre.
[0083] A continuación, los genes se excluyeron si >50% de las muestras tumorales mostraban niveles de expresión dentro
60 del 95º percentil del rango no maligna. La variación en el grado de sobreexpresión en las muestras tumorales refleja, no sólo la heterogeneicidad tumoral, sino también variaciones en el grado de contaminación de las muestras tumorales con tejido "normal", incluyendo músculo, células estromales y glándulas epiteliales no malignas. Esta contaminación "normal" variaba del 5 al 70%, con una mediana de aproximadamente el 25%. Otros genes se excluyeron debido a su elevada expresión
relativa en células hematopoyéticas, o a su elevada expresión en tejido gástrico metaplásico. Puede apreciarse que, dependiendo del grado de contaminación por células normales o células que expresan normalmente el marcador, pueden seleccionarse diferentes intervalos umbral que pueden proporcionar una separación suficiente entre una fuente de cáncer y una fuente normal.
5 [0084] Los GTM que los inventores han encontrado útiles incluyen genes (ADN), ADN complementario (ADNc), ARN, proteínas y fragmentos proteicos de los marcadores siguientes: carboxipeptidasa N, polipéptido 2, cadena de 83 kDa (también conocida como carboxipeptidasa N (CPN2), metaloproteinasa de la matriz 12 (MMP12), inhibina ("INHBA"), factor de crecimiento de tipo insulina 7 ("IGFBP7"), gamma-glutamil hidrolasa ("GGH"), proteoglicano enriquecido con leucina-prolina
10 ("LEPRE1"), cistatina S ("CST4"), proteína relacionada con Frizzled secretada 4 ("SFRP4"), asporina ("ASPN"), regulador del crecimiento celular con dominio de mano EF 1 ("CGREF1"), calicreína (KLK10), inhibidor tisular de metaloproteinasa 1 ("TIMP1"), proteína rica en cisteína ácida secretada ("SPARC"), factor de crecimiento transformante, -inducido ("TGFBI"), proteína de la matriz extracelular de tipo fibulina que contiene EGF 2 ("EFEMP2"), lumicán ("LUM"), estanina ("SNN"), fosfoproteína secretada 1 ("SPP1"), proteoglicano de sulfato de condroitina 2 ("CSPG2"), N-acil-esfingosina amidohidrolasa ("ASAH1"), serina
15 proteasa 11 ("PRSS11"), proteína relacionada con Frizzled secretada 2 ("SFRP2"), fosfolipasa A2, grupo XIIB ("PLA2G12B"), espondina 2, proteína de la matriz extracelular ("SPON2"), olfactomedina 1 ("OLFM1"), trombospondina que contiene repeticiones 1 ("TSRC1"), trombospondina 2 ("THBS2"), adlicán, cistatina SA ("CST2"), cistatina SN (CST1), enzima de tipo lisil oxidasa 2 ("LOXL2"), tiroglobulina ("TG"), factor de crecimiento transformante beta I ("TGFB1"), inhibidor de serina o cisteína proteinasa clado H ("SERPINH1"), inhibidor de serina o cisteína proteinasa clado B ("SERPINB5"), metaloproteinasa de la
20 matriz 2 ("MMP2"), proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 5 ("PCSK5"), y proteína ligada a proteoglicano hialuronano 4 ("HAPLN4").
[0085] Las secuencias de ADN de GTM de esta invención junto con la información de identificación se muestran a continuación en la presente memoria.
[0086] >gil4505206IrefINM_002426.1I Homo sapiens metaloproteinasa de la matriz 12 (elastasa de macrófago) (MMP12), ARNm) emparejamiento de cebador directo de qPCR [758..780] emparejamiento de cebador inverso de qPCR [888..864]
30 emparejamiento de sonda de qPCR [786..815]
5 [0087] >gil4504698lreflNM_002192.1I Homo sapiens inhibina, beta A (activina A, activina AB, polipéptido alfa) (INHBA), ARNm emparejamiento en contexto de ensayo a petición de qPCR [457..481]
5 [0088] >gil4504618lreflNM_001553.1I Homo sapiens proteína de unión a factor de crecimiento de tipo insulina 7 (IGFBP7), ARN emparejamiento de cebador director de qPCR [470..487] emparejamiento de cebador inverso de qPCR [567..546] emparejamiento de sonda de qPCR [492..517]
5 [0089] >gil4503986lreflNM_003878.1I Homo sapiens gamma-glutamil hidrolasa (conjugasa, folilpoligammaglutamil hidrolasa) (GGH), ARNm emparejamiento de cebador directo de qPCR [531..547] emparejamiento de cebador inverso de qPCR [611.. 587] emparejamiento de sonda de qPCR [549..577]
[0090] >gil21361917lrefINM_022356.2I Homo sapiens proteoglicano enriquecido con leucina-prolina (leprecán) 1 (LEPRE1), ARNm emparejamiento de cebador director de qPCR [813..836] emparejamiento de cebador inverso de qPCR [894..872] 15 emparejamiento de sonda de qPCR [841..870]
5 [0091] >gil19882254lreflNM_001899.2I Homo sapiens cistatina S (CST4), ARNm emparejamiento de cebador directo de qPCR [343..361] emparejamiento de cebador inverso de qPCR [434..411] emparejamiento de sonda de qPCR [382..410]
[0092] >gil8400733lreflNM_003014.2I Homo sapiens proteína relacionada con Frizzled secretada 4 (SFRP4), ARNm emparejamiento en contexto de ensayo a petición de qPCR [1079.. 1103]
[0093] >gil41350213lreflNM_017680.3I Homo sapiens asporina (LRR clase 1) (ASPN), ARNm emparejamiento de cebador directo de qPCR [798..823] emparejamiento de cebador inverso de qPCR [934..912] emparejamiento de sonda 5 de qPCR [842..875]
5 [0094] >gil33589823lref INM_006569.2I Homo sapiens regulador de crecimiento celular con dominio de mano EF 1 (CG REF1), ARNm, emparejamiento de cebador directo de qPCR [378..394] emparejamiento de cebador inverso de qPCR [455..431] emparejamiento de sonda de qPCR [396..415]
5 [0095] >gil22208981lreflNM_002776.3l Homo sapiens calicreína 10 (KLK10), variante de transcripción 1, ARNm emparejamiento de cebador director de qPCR [851..874] emparejamiento de cebador inverso de qPCR [950..931] emparejamiento de sonda de qPCR [890..914]
[0096] >gil22208983lreflNM_145888.1I Homo sapiens calicreína 10 (KLK10), variante de transcripción 2, ARNm emparejamiento de cebador directo de qPCR [714..737] emparejamiento de cebador inverso de qPCR [813..794] 15 emparejamiento de sonda de qPCR [753..777]
5 [0097] >gil4507508lreflNM_003254.1l Homo sapiens inhibidor tisular de metaloproteinasa 1 (actividad de potenciación eritroide, inhibidor de colagenasa) (TIMF1), ARNm emparejamiento de cebador directo de qPCR [221..241] emparejamiento de cebador inverso de qPCR [359..340] emparejamiento de sonda de qPCR [251..283]
[0100] >gil48675809lreflNM_003118.2I Homo sapiens proteína secretada, ácida, rica en cisteína (osteonectina) (SPARC), ARNm emparejamiento de cebador directo de qPCR [788..810] emparejamiento de cebador inverso de qPCR 5 [915..898] emparejamiento de sonda de qPCR [818..839]
5 [0101] >gil4507466lreflNM_900358.1I Homo sapiens factor de crecimiento transformante, beta-inducido, 68 kDa (TGFBI), ARNm emparejamiento en contexto de ensayo a petición de qPCR [170..194]
5 [0102] >gil8393298lreflNM_016938.1I Homo sapiens proteína de la matriz extracelular de tipo fibulina que contiene EGF 2 (EFEMP2), ARNm emparejamiento en contexto de ensayo a petición de qPCR [1248..1272]
5 [0103] >gil21359858lreflNM_002345.2l Homo sapiens lumicán (LUM), ARNm emparejamiento de cebador directo de qPCR [61..84] emparejamiento de cebador inverso de qPCR [182..162] emparejamiento de sonda de qPCR [117..152]
Estanina 5 [0104] >gil29893560lreflNM_003498.3l Homo sapiens estanina (SNN), ARNm
[0105] >gil38146097lreflNM_000582.2l Homo sapiens fosfoproteína secretada 1 (osteopontina, sialoproteína ósea I, activación de linfocitos T temprana 1) (SPP1), ARNm emparejamiento en contexto de ensayo a petición de qPCR [253..277]
5 [0106] >gil21361115lrefINM_004385.2I Homo sapiens proteoglicano de sulfato de condroitina 2 (versicán) (CSPG2), ARNm emparejamiento de cebador director de qPCR [10087..10106] emparejamiento de cebador inverso de qPCR [10185..10163] emparejamiento de sonda de qPCR [10139.. 10161]
5 [0107] >gil30089929lreflNM_004315.2l Homo sapiens N-acilesfingosina amidohidrolasa (ceramidasa ácida) 1 (ASAH1), variante de transcripción 2, ARNm emparejamiento de cebador directo de qPCR [1212..1228] emparejamiento de cebador inverso de qPCR [1290.. 266] emparejamiento de sonda de qPCR [1233..1260]
5 [0108] >gil30089927lreflNM_177924.1I Homo sapiens N-acilesfingosina amidohidrolasa (ceramidasa ácida) 1 (ASAH1), variante de transcripción 1, ARNm emparejamiento de cebador directo de qPCR [1050..1066] emparejamiento de cebador inverso de qPCR [1128..1104] emparejamiento de sonda de qPCR [1071..1098]
5 [0109] >gil21327712lreflNM_002775.2l Homo sapiens serina proteasa 11 (unión a IGF) (PRSS11), ARNm emparejamiento de cebador directo de qPCR [1030..1048] emparejamiento de cebador inverso de qPCR [1106..1083] emparejamiento de sonda de qPCR [1080..1050]
5 [0110] >gil42656988lreflXM_050625.4l Homo sapiens proteína relacionada con Frizzled secretada 2 (SFRP2), ARNm emparejamiento de cebador directo de qPCR [686..703] emparejamiento de cebador inverso de qPCR [750..728] emparejamiento de sonda de qPCR [705..726]
Fosfolipasa A2, grupo XIIB 5 [0111] >gil45505134lreflNM_032562.2l Homo sapiens fosfolipasa A2, grupo XIIB (PLA2G12B), ARNm
[0112] >gil6912681lreflNM_012445.1l Homo sapiens espondina 2, proteína de la matriz extracelular (SPON2), ARNm
Olfactomedina 1, variante de transcripción 3 5 [0113] >gil34335282lreflNM_058199.2l Homo sapiens olfactomedina 1 (OLFM1), variante de transcripción 3, ARNm
Trombospondina que contiene repeticiones 1 5 [0114] >gil38016903lreflNM_019032.21 Homo sapiens trombospondina que contiene repeticiones 1 (TSRC1), ARNm
5 [0115] >gil40317627lreflNM_003247.2l Homo sapiens trombospondina 2 (THBS2), ARNm emparejamiento de cebador directo de qPCR [3558..3580] emparejamiento de cebador inverso de qPCR [3682..3655] emparejamiento de sonda de qPCR [3597..3623]
5 [0116] >gil18390318lreflNM_015419.11 Homo sapiens adlicán (DKFZp564I1922), ARNm emparejamiento en contexto de ensayo a petición de qPCR [694..718]
5 [0117] >gil19882252lrefINM_001322.2I Homo sapiens cistatina SA (CST2), ARNm emparejamiento de cebador directo de qPCR [302..320] emparejamiento de cebador inverso de qPCR [393..370] emparejamiento de sonda de qPCR [341..369]
Cistatina SN [0118] >gil19882250lreflNM_001898.2l Homo sapiens cistatina SN (CST1), ARNm emparejamiento de cebador
directo de qPCR [358..376] emparejamiento de cebador inverso qPCR [449..426] emparejamiento de sonda de qPCR [397..425]
[0119] >gil4505010lreflNM_002318.1I Homo sapiens tipo lisil oxidasa 2 (LOXL2), ARNm emparejamiento de cebador directo de qPCR [2205..2223] emparejamiento de cebador inverso de qPCR [2286..2269] 10 emparejamiento de sonda de qPCR [2261..2229]
Tiroglobulina 5 [0120] >gil33589851lreflNM_003235.3I Homo sapiens tiroglobulina (TG),ARNm emparejamiento de cebador directo
de qPCR [886..905] emparejamiento de cebador inverso de qPCR [962..941] emparejamiento de sonda de qPCR [915..939]
5 [0121] >gil10863872lreflNM_000660.1l Homo sapiens factor de crecimiento transformante, beta 1 (enfermedad de Camurati-Engelmann) (TGFB1), ARNm emparejamiento de cebador directo de qPCR [1651..1668] emparejamiento de cebador inverso de qPCR [1539..1557] emparejamiento de sonda de qPCR [1687..1713]
5 [0122] >gil32454740lreflNM_001235.2l Homo sapiens inhibidor de serina (o cisteína) proteinasa, clado H (proteína de choque térmico 47), miembro 1, (proteína de unión a colágeno 1) (SERPINH1), ARNm emparejamiento en contexto de ensayo a petición de qPCR [184..208]
5 [0123] >gil4505788lreflNM_002639.1l Homo sapiens inhibidor de serina (o cisteína) proteinasa, clado B (ovoalbúmina), miembro 5 (SERPINB5), ARNm emparejamiento de cebador directo de qPCR [36..56] emparejamiento de cebador inverso de qPCR [106..86] emparejamiento de sonda de qPCR [60..80]
[0124] >gil1386170lreflNM_004363.1I Homo sapiens molécula de adhesión celular relacionada con el antígeno carcinoembrionario 5 (CEACAM5), ARNm emparejamiento en contexto de ensayo a petición de qPCR [2128..2152]
5 [0125] >gil11342665lreflNM_004530.1l Homo sapiens metaloproteinasa de la matriz 2 (gelatinasa A, gelatinasa de 72 kDa, colagenasa de tipo IV de 72 kDa) (MMP2), ARNm emparejamiento de cebador directo de qPCR [1713..1732] emparejamiento de cebador inverso de qPCR [1793..1775] emparejamiento de sonda de qPCR [1751..1773]
5 [0126] >gil20336245lreflNM_006200.2l Homo sapiens proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 5 (PCSK5), ARNm emparejamiento de cebador directo de qPCR [2677..2697] emparejamiento de cebador inverso de qPCR [2821..2801] emparejamiento de sonda de qPCR [2737..2765]
Carboxipeptidasa N, polipéptido 2, 83 kD 5 [0127] >gil8554966lreflXM_087358.1I Homo sapiens carboxipeptidasa N, polipéptido 2, 83 kD (CPN2), ARNm Proteína ligada a hialuronano y proteoglicano 4 5 [0128] >gil30794471lreflNM_023002.1I Homo sapiens proteína ligada a hialuronano y proteoglicano 4 (HAPLN4), ARNm
[0129] Se cortaron secciones congeladas de 8 m a partir de bloques de tejido y se montaron sobre portaobjetos
5 APES. El tejido se fijó después en acetona durante 10 minutos antes de secarse al aire. Los portaobjetos se sumergieron después en peróxido de hidrógeno al 0,3% en metanol durante 10 minutos, y se lavaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Los sitios de unión inespecíficos se bloquearon por incubación de los portaobjetos en suero al 20% del animal apropiado, y lavado de nuevo en PBS. Después, se añadió a los portaobjetos anticuerpo primario diluido en PBS que contenía suero al 1%. Después de una incubación durante 1
10 hora, los portaobjetos se lavaron de nuevo en PBS antes de la incubación con el anticuerpo secundario durante 1 hora más. Después del lavado final en PBS, el anticuerpo secundario se detectó con tetraclorhidrato de diaminobenzidina disuelto en solución salina tamponada con Tris (TBS), antes de lavarse en TBS y agua. Los portaobjetos se contratiñeron después en hematoxilina y se observaron bajo un microscopio óptico.
15 [0130] En ciertos casos, los tumores gástricos pueden localizarse in situ usando tinciones basadas en marcadores de cáncer de esta invención. Al menos un marcador puede estar formando estructuras amiloides que pueden visualizarse usando rojo Congo o tinciones amiloides inespecíficas equivalentes.
[0131] En varios casos, pueden llevarse a cabo de forma deseable ensayos para GTM en muestras obtenidas de sangre, plasma, suero, líquido peritoneal obtenido, por ejemplo, usando lavados peritoneales, u otros fluidos corporales, tales como orina, linfa, líquido cefalorraquídeo, fluido gástrico o muestras de heces.
[0132] En general, se conocen en la técnica métodos de ensayo para determinar oligonucleótidos, proteínas y péptidos en estos fluidos. La detección de oligonucleótidos puede llevarse a cabo usando procedimientos de hibridación tales como transferencias de Northern, transferencias de Southern o métodos de micromatrices o qPCR. Los métodos para detectar proteínas incluyen tales como ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) microplacas de proteínas que tienen anticuerpos, radioinmunoensayo de perlas en suspensión (RIA), transferencia de Western y unión a lectina. Sin embargo, con fines ilustrativos, los niveles en fluido de un GTM pueden cuantificarse usando un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas de tipo sándwich (ELISA). Para ensayos en plasma, se añade una alícuota de 5 l de una muestra apropiadamente diluida o GTM patrón diluido en serie y 75 l de anticuerpo anti-GTM humano conjugado con peroxidasa a pocillos de una placa de microtitulación. Después de un periodo de incubación de 30 minutos a 30 ºC, los pocillos se lavan con Tween 20 al 0,05% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) para eliminar el anticuerpo no unido. Los complejos unidos de GTM y anticuerpo anti-GTM se incuban después con H2O2 que contiene o-fenilendiamina durante 15 minutos a 30 ºC. La reacción se interrumpe por adición de H2SO4 1 M y se mide la absorbancia a 492 nm con un lector de placas de microtitulación.
[0133] Puede apreciarse que los anticuerpos anti-GTM pueden ser anticuerpos monoclonales o antisueros policlonales. También puede apreciarse que puede estudiarse convenientemente cualquier otro fluido corporal.
[0134] Se sabe que ciertos marcados están presentes en plasma o suero. Estos incluyen osteopontina (Hotte et al., Cancer 95(3): 507-510 (2002)), antígeno prostático específico (Martin et al., Prostate Cancer Prostatic Dis. (9 de marzo de 2004) (Pub Med Nº: PMTD: 15007379), tiroglobulina (Hall et al., Laryngoscope 113(1): 77-81 (2003); Mazzaferri et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 88(4): 1433-14421 (2003), metaloproteinasa de la matriz 2 y 9 (Kuo et al., Clin. Chem. Acta. 294(1-2): 157-168 (2000), CEA y TEMPI (Pellegrini et al., Cancer Immunol. Immunother. 49(7): 388-394 (2000). Por lo tanto, debido a que algunos de los marcadores anteriores también son marcadores útiles para GTM, ya están disponibles ensayos de plasma, suero u otros fluidos para su detección y cuantificación. Debido a que muchas proteínas (1) se secretan por las células, (2) se desprenden a partir de membranas celulares o (3) se pierden de las células tras la muerte celular, también están presentes otros GTM en fluidos corporales, tales como plasma, suero o similares. Por lo tanto, en realizaciones de esta descripción, la detección de GTM en muestras obtenidas convenientemente será útil y deseable y puede ser la base para el diagnóstico del cáncer gástrico.
[0135] Se extrajeron proteínas a partir de tejido gástrico usando un método de extracción con TriReagent y guanidina HCI. La fase no acuosa de la extracción de ARN con TriReagent se mezcló con 1,5 volúmenes de etanol y se centrifugó para eliminar el ADN y el medio OCT. Se mezclaron 0,5 ml de sobrenadante con 0,75 ml de isopropanol, se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos y después se centrifugó. El sedimento se lavó tres veces en 1 ml de guanidina HCl 0,3 M en etanol al 95% y una vez en etanol solamente, después se resuspendió en 50 l de SDS al 1%.
[0136] Las proteínas se cuantificaron y se sometieron a electroforesis en geles de SDS-poliacrilamida usando métodos convencionales. En resumen, las proteínas separadas se transfirieron a una membrana de PVDF usando la celda de transferencia electroforética Trans-blot de BioRad, usando una metodología convencional. Después, las membranas se bloquearon con una solución que contenía leche en polvo desnatada durante 30 minutos, antes de incubarse con anticuerpo primario durante 2 horas a temperatura ambiente. Después del lavado, la membrana se incubó con anticuerpo secundario durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de los lavados finales, el anticuerpo unido se visualizó usando el sistema de detección de ECL (Amersham Biosciences).
[0137] La detección de marcadores en el suero puede efectuarse proporcionando una muestra de suero usando métodos conocidos, y sometiendo después la muestra de suero a análisis, usando sondas oligonucleotídicas o anticuerpos dirigidos contra la proteína de interés. La inmunotransferencia, incluyendo el análisis de transferencia de Western, puede ser especialmente útil para determinar si están presentes en el suero proteínas expresadas de forma alternativa. Además, otros fluidos corporales pueden contener marcadores e incluyen líquido peritoneal, líquido cefalorraquídeo y similares. No es necesario que un marcador se secrete, en un sentido fisiológico, para que sea útil. En su lugar, cualquier mecanismo por el que una proteína o gen marcador entra en el suero puede ser eficaz para producir un nivel detectable cuantificable del marcador. Por lo tanto, la secreción normal de proteínas solubles a partir de células, el desprendimiento de proteínas de membrana a partir de membranas plasmáticas, la secreción de formas de corte y empalme alternativas de ARNm o proteínas expresadas a partir de las mismas, la muerte celular (apoptótica) pueden producir niveles suficientes del marcador que sean útiles. Cada vez se respalda más el uso de marcadores séricos como herramientas para diagnosticar y/o evaluar la eficacia de la terapia para una diversidad de tipos de cáncer.
[0138] Yoshikawa et al., (Cancer Letters, 151: 81-86 (2000) describe un inhibidor tisular de la metaloproteinasa de la matriz 1 en plasma de pacientes con cáncer gástrico.
[0139] Rudland et al., (Cancer Research 62: 3417-3427 (2002) describe la osteopontina como una proteína asociada a metástasis en el cáncer de mama humano.
[0140] Buckhaults et al., (Cancer Research 61: 6996-7001 (2002) describe ciertos genes de superficie celular y secretados expresados en tumores colorrectales.
[0141] Kim et al., (JAMA 287(13): 1671-1679 (2002) describe la osteopontina como un biomarcador de diagnóstico potencial para el cáncer de ovario.
[0142] Hotte et al., (AJ. American Cancer Society 95(3): 507-512 (2002) describe la osteopontina plasmática como una proteína detectable en fluidos corporales humanos y está asociada con ciertos tumores malignos.
[0143] Martin et al., (Prostate Cancer Prostatic Dis. 9 de marzo de 2004 (PMID: 15007379) (Resumen) describieron el uso de calicreína 2 humana, antígeno prostático específico (PSA) y PSA libre como marcadores para la detección del cáncer de próstata.
[0144] Hall et al., (Laryngoscope 113(1): 77-81 (2003) (PMID: 12679418) (Resumen) describieron el valor predictivo de la tiroglobulina sérica en el cáncer tiroideo.
[0145] Mazzaferri et al., (J. Clin. Endocrinol. Metab. 88(4): 1433-1441 (2003) (Resumen) describe la tiroglobulina como un método de control potencial para pacientes con carcinoma tiroideo.
[0146] Whitley et al, (Clin. Lab. Med. 24(1):29-47 (2004) (Resumen) describe la tiroglobulina como un marcador sérico para el carcinoma tiroideo.
[0147] Kuo et al (Clin. Chim. Acta. 294(1-2): 157-168 (2000) (Resumen) describe las metaloproteinasas de la matriz 2 y 9 en suero en pacientes infectados con HCF y HBV.
[0148] Koopman et al., (Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev 13(3): 487-491 (2004) (Resumen) describe la osteopontina como un biomarcador para el adenocarcinoma pancreático.
[0149] Pellegrini et al, (Cancer Immunol. Immunother. 49(7): 388-394 (2000) (Resumen) describe la medición del antígeno carcinoembrionario soluble y TIMP1 como marcadores para el cáncer colorrectal preinvasivo.
[0150] Por lo tanto, los inventores han identificado numerosos genes y/o proteínas que son útiles para desarrollar reactivos, dispositivos y kits para detectar y evaluar el cáncer gástrico. Pueden usarse uno o más marcadores gástricos, individualmente o en combinación, para proporcionar un ensayo molecular fiable para el cáncer gástrico.
EJEMPLOS
[0151] Los ejemplos descritos en la presente memoria son con el fin de ilustrar en general la invención. Otras realizaciones, métodos y tipos de análisis están dentro del alcance de expertos en la técnica de diagnóstico molecular y no es necesario describirlos en detalle en la presente memoria.
Ejemplo 1: Identificación de marcadores para tumor gástrico maligno
[0152] La Figura 2 representa una tabla que muestra resultados de estudios usando 38 marcadores para tumor gástrico maligno seleccionados usando los criterios anteriores. La Figura 2 incluye el símbolo para el gen (“símbolo”), el número de oligo MWG, el número de secuencia de referencia de ARNm del NCBI, el número de secuencia de referencia de proteína, el cambio en veces entre expresión génica tumoral y no tumoral, el rango de cambio en veces respecto a otros genes en el análisis de micromatrices, los resultados de una prueba t de Student sin ajustar original, los resultados del valor p ajustado por Bonferroni y los resultados de la prueba de Wilcoxon de 2 muestras.
[0153] La mediana del cambio en veces (tejido tumoral:no maligno) para estos 34 genes variaba de 1,6 a 7 y la mediana del rango de cambio en veces variaba de -16,995 a -25,783. El cambio máximo posible en el rango de cambio en veces era de -29,718. Para cada uno de los marcadores mostrados, se descubrió que la significación estadística de su especificidad como marcadores de cáncer era extremadamente elevada. Los valores p ajustados por Bonferroni estaban en general todos por debajo de 10-6 o menos, indicando que el diagnóstico usando estos marcadores está muy asociado con cáncer gástrico.
[0154] Las tres cistatinas (CST1, CST2 y CST4) son altamente homólogas y están representadas por el mismo oligonucleótido en la micromatriz y, a menos que se indique otra cosa, se denominan en su conjunto “CST,2,4”.
[0155] Se predijo que todas las proteínas representadas en la Figura 2 tenían péptidos señal usando el paquete SMART (European Molecular Biology Laboratory). Se sabe que los péptidos señal dirigen a las proteínas sintetizadas al compartimento extracelular y, por lo tanto, pueden secretarse en el líquido intersticial, a partir del cual pueden tener acceso a la sangre. De hecho, algunas proteínas de esta invención se han detectado en suero.
[0156] Cada uno de los genes representados en la Figura 2 presentaba un cambio en rango de intensidad superior a los dos oligonucleótidos en la matriz correspondientes a CEA, el marcador usado más frecuentemente en la práctica clínica para controlar la progresión del cáncer gástrico.
Ejemplo 2: Análisis de qPCR
[0157] Se obtuvo una cuantificación más sensible y precisa de la expresión génica para un subconjunto de los genes mostrados en la Figura 3 usando ARN de qPCR de 46 muestras tumorales y 49 no malignas que se analizaron para 23 genes identificados por el análisis de micromatrices (Figura 2), y los resultados se muestran en la Figura 3. La Figura 3 incluye el símbolo de gen, la mediana del cambio en veces entre cáncer y tejido normal y el % de muestras tumorales con niveles de expresión superiores al 95º percentil de los niveles de expresión en muestras no malignas. 12 muestras tumorales y 9 muestras normales se excluyeron del análisis debido a una elevada contaminación de células normales (>75%), un alto grado de necrosis (>40%) o una escasa señal de hibridación en las micromatrices. La mediana del cambio en veces (tejidos tumorales en comparación con la mediana de expresión de tejido no maligno) para estos 23 genes variaba de 3 a 525 veces (Figura 3).
[0158] El nivel de expresión de los genes de ASPN, CST1,2,4, LOXL2, TIMP1, SPP1, SFRP4, INHBA, THBS2 y SPARC era superior en tumores que el 95º percentil del rango no maligno para 90% de los casos (Figura 3). Para el resto de los genes, la expresión en tumores era superior al 95º percentil en >50% de las muestras. Cada tumor sobreexpresaba al menos siete genes en mayor medida que el 95º percentil, indicando que combinaciones de marcadores conducirán a una cobertura exhaustiva de todos los tumores gástricos.
Ejemplo 3: Validación de los datos de matrices usando qPCR
[0159] Los datos de matrices se validaron usando PCR a tiempo real cuantitativa (qPCR) sobre las muestras tumorales y no malignas con sondas para 24 genes. De los 24 genes estudiados, 20 mostraron una fuerte correlación entre las dos técnicas. Cuatro de estos análisis se muestran en las Figuras 4a-4d, que representan gráficas de la expresión relativa para los 4 marcadores de cáncer seleccionados detectados usando métodos de matrices y qPCR. Para cada gráfica en la Figura 4, el eje horizontal representa el log2 del cambio en veces en la expresión génica por matrices, y el eje vertical representa el log2 del cambio en veces de la expresión génica por qPCR. Los inventores descubrieron que había una fuerte correlación entre los dos métodos, según se indicaba por la relación de covarianza entre los métodos. La fuerte correlación indica que tanto el análisis del cambio en veces por micromatrices como la qPCR son métodos adecuados para detectar cambios en la expresión de genes marcadores de cáncer gástrico y, por lo tanto, pueden usarse como un método de exploración sensible y preciso. También puede apreciarse a partir de las Figuras 4a-4d que la qPCR puede ser más sensible en la detección de cambios en la expresión de lo que lo son los métodos de matrices. Por lo tanto, en situaciones en las que es especialmente deseable una detección temprana, la qPCR puede ser especialmente útil.
[0160] Las Figuras 5a-5w representan histogramas que comparan la frecuencia de observación de la expresión de cada uno de una serie de 23 genes (eje vertical) y el log2 del cambio en veces en la expresión para ese gen (eje horizontal) para tanto tejido normal (barras en blanco) como tejidos tumorales (barras negras). Los inventores descubrieron sorprendentemente que para cada uno de estos 23 genes, había una separación sustancial en las distribuciones de frecuencia entre tejido normal y tumoral, según se reflejaba por el bajo grado de superposición entre las curvas de distribución de frecuencia. Por ejemplo, la Figura 5b representa los resultados para CST 1, 2, 4, para las que sólo se observó una muestra normal que tuviera un nivel de expresión en el intervalo tumoral. En otros casos, (por ejemplo, Figura 5n; para PRS11) cada curva de distribución de frecuencia era relativamente estrecha y había un grado de superposición. Sin embargo, incluso para este marcador, la mediana del log2 del cambio en veces mostraba una separación sustancial de la cantidad de expresión génica. En otros casos, (por ejemplo, Figura 5a; ASPN), aunque había cierta superposición, había una clara separación de la mediana del log2 de la expresión en veces entre muestras normales y tumorales.
[0161] La Figura 6 representa un histograma del número de genes que presentan una expresión significativamente aumentada (“sobreexpresión”) en muestras tumorales en comparación con muestras normales (eje vertical) y las muestras individuales ensayadas. En cada caso, la muestra tumoral presentaba múltiples genes con niveles de expresión elevados. El menor número de genes que tenían una expresión aumentada era de 7, encontrado en la muestra E123. Este descubrimiento indica que, en situaciones en las que múltiples genes se sobreexpresan respecto al tejido normal, la fiabilidad de la detección del cáncer puede ser muy elevada, haciendo que el diagnóstico de cáncer sea con mayor seguridad. Sin embargo, en algunos casos, la elevación de la expresión de un solo gen marcador es suficiente para conducir al diagnóstico de cáncer.
[0162] La comparación previa de los inventores con el marcador sérico usado más frecuentemente en la actualidad para la detección del cáncer gástrico, CEA, estaba basada en la diferencia en el rango de intensidad de los datos de matrices entre muestras tumorales y normales. Esta comparación se verificó usando datos de qPCR a los marcadores y CEA.
[0163] Las Figuras 7a-7c representan gráficas del log2 de la expresión relativa (en comparación con una preparación de ARN de referencia) de marcadores en muestras tumorales individuales y muestras no malignas, en comparación con la expresión del gen para el marcador tumoral, CEA. CEA es el marcador sérico más usado en la actualidad para controlar la progresión del cáncer gástrico. El punto cero se define que es la mediana de la expresión normal para cada marcador. Puede observarse que existe una amplia superposición entre la expresión del gen de CEA (CEACAMS) en muestras tumorales y muestras normales. Esta superposición es notablemente menor en los marcadores de cáncer gástrico ASPN, CSPG2, CST1,2,4, IGFBP7, INHBA, LOXL2, LUM, SFRP4, SPARC, Spy1, THBS2, TIMP1, adlicán, LEPRE1 y EFEMP2. Para los otros marcadores en las Figuras 7b-7c, ASAH1, SFRP2, GGH, MMP12, KLK10, TG, PRSS11 y TGFBI, la superposición entre el intervalo de expresión tumoral y el intervalo de expresión de tejido no maligno es superior que la superposición para los marcadores anteriores, pero todavía inferior a la de CEA, indicando que todos los nuevos marcadores descritos en la presente memoria son cuantitativamente mejores que CEA y, por lo tanto, pueden proporcionar un diagnóstico más fiable.
[0164] Para minimizar los efectos de una manipulación tisular variable, se calcularon los cambios en veces de tumor:normal (no maligno) usando datos de qPCR a partir de muestras de tejido tumoral y no maligno obtenidas del mismo paciente. Dicho análisis relacionado corrige las diferencias en los niveles de fondo de expresión génica en individuos diferentes, y minimiza los efectos de la manipulación del tejido sobre la calidad del ARN. Por ejemplo, si el estómago resecado estaba a temperatura ambiente durante una hora, los transcritos de las muestras normales y tumorales se degradarán en la misma medida.
[0165] La Figura 8 resume los niveles de expresión de T:N determinados por qPCR para los marcadores, pero usó datos relacionados (es decir, muestras tumorales y no malignas) del mismo individuo. La Figura 8 también incluye datos de expresión para seis genes que no se incluyeron en la Figura 3. Los genes estudiados adicionalmente son MMP2, CGR11, TGFB1, PCSK5, SERPINB5 y SERPINH1. La información de identificación y las sondas se muestran en las Figuras 1 y 2. La Figura 8 muestra la mediana del cambio en veces de T:N y el cambio en veces de
T:N máximo para 29 marcadores de cáncer gástrico en estos 40 pacientes con muestras “relacionadas”. 27 de los 29 marcadores tienen una mediana de diferencia de T:N superior a o igual al marcador de la técnica anterior, CEA. 29/29 de los marcadores tienen un mayor porcentaje de muestras relacionadas en las que la expresión en la muestra tumoral supera la expresión en la muestra normal.
[0166] Las Figuras 9a-9d describen representaciones de dispersiones de puntos de datos de tejido tumoral y normal de los mismos individuos. Cada punto representa el cambio en veces, dentro de un paciente, en la expresión de los marcadores en tejido tumoral respecto a la expresión en tejido no maligno. Todos los marcadores estudiados tienen una mejor discriminación del tejido tumoral del tejido no tumoral que el CEA. Tres marcadores, CST1,2,4, ASPN y SFRP4 mostraban una discriminación del 100% entre las muestras tumorales y normales relacionadas. Es decir, para esos marcadores, cada tejido tumoral tenía una expresión mayor de la que tenía el tejido no tumoral correspondiente del mismo individuo. Muchos otros marcadores, por ejemplo, Adlicán, CSPG2, EFEMP2, IGFBP7, INHBA, LOXL2, LUM, SERPINH1, SPARC, SPP1, TGFbl, THBS2 y TIMP1, tenían cada uno sólo 2 ó 3 puntos individuales para los que la expresión en tejido tumoral era inferior que la del tejido no tumoral. Por lo tanto, para esos marcadores, la probabilidad de que cualquier pareja de tejido tumoral y no tumoral produjese un falso negativo es relativamente reducida (por ejemplo, 3 de 40 ó 7,5%; 2 de 40 ó 5%, 1 de 40 ó 2,5%). Por lo tanto, incluso si se usaron los otros marcadores enumerados inmediatamente anteriormente, el uso de múltiples muestras de un paciente individual produciría una información de diagnóstico fiable.
[0167] Las secuencias génicas de estos marcadores y la localización de los cebadores y sondas usados para detectarlos se han mostrado anteriormente en la presente memoria.
[0168] Para determinar si la sobreexpresión de los genes marcadores es independiente de la fase de los tumores gástricos, los log2 del cambio en veces de T:N relacionados se representaron frente a la fase tumoral (Figuras 10a10ad). No se observó dependencia de fase de la expresión en fase tumoral para 26 de los marcadores enumerados en la Figura 8. Estos marcadores se sobreexpresaban de forma similar en tumores en fase temprana así como en fase tardía. Sin embargo, KLK10 mostraba una sobreexpresión más uniforme en tumores en fase 1 y fase 2, y PCSK5 y SERPINB5 mostraban una sobreexpresión más uniforme en tumores en fase 4. Por lo tanto, puede usarse
KLK10, PCSK5 y SERPINB5 en la determinación de la fase de los tumores gástricos.
[0169] En un análisis similar, se representaron los log2 del cambio en veces de T:N relacionadas frente a la clasificación de Lauren del tumor (de tipo difuso o de tipo intestinal). Las Figuras 11a-11ad muestran que cada uno de los 29 GTM discriminaban entre tejido tumoral y no tumoral, independientemente de que el tipo de tumor fuera intestinal (I) o difuso (D).
Ejemplo 4: Uso de múltiples marcadores
[0170] Como se ha descrito anteriormente, ciertos marcadores presentan la capacidad de discriminar tejido tumoral de no tumoral en el 100% de las muestras. Otros marcadores, también descritos anteriormente, pueden usarse en combinación para conseguir grados muy altos de discriminación de tejido tumoral de tejido no tumoral. La Figura 12 describe una representación tridimensional de la expresión de 3 marcadores, SERPINH1, CST1,2,4 e INHBA, expresada como log2 del cambio en veces de T:N para una serie de muestras de tumor gástrico y muestras gástricas no malignas. Existe una separación completa entre los dos grupos de muestras.
[0171] La fiabilidad de la discriminación con éxito de muestras tumorales y no tumorales usando combinaciones de marcadores se ilustra adicionalmente mediante un análisis estadístico resumido en la Figura 13. Este análisis que comparaba las distribuciones normales de datos generadas usando la expresión génica por qPCR de muestras tumorales y no malignas relacionadas, muestra el efecto de aumentar el número de marcadores usados para discriminar entre muestras tumorales y no malignas sobre la sensibilidad del ensayo (con una especificidad fija del 95%). Aunque pocos de los 29 marcadores (como se muestra en la Figura 8) tienen una sensibilidad superior al 90, 95 ó 99% cuando se usan en solitario en este análisis, la combinación de dos o tres marcadores permitía que se alcanzase una alta sensibilidad con grandes cantidades de combinaciones. Por ejemplo, 50 combinaciones de tres marcadores discriminarían entre muestras tumorales y no malignas con una sensibilidad de 9% y una especificidad de 5%.
Ejemplo 5: Detección de proteínas marcadoras de tumor gástrico
[0172] Pueden detectarse proteínas GTM como base para el diagnóstico. En ciertas situaciones, la concentración de ARNm en una muestra particular, tal como una muestra que no contiene células, puede ser difícil usar métodos de micromatrices o qPCR para detectar elevaciones en la expresión génica. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, la detección de proteínas GTM puede efectuarse usando anticuerpos dirigidos contra la proteína completa, un fragmento de la proteína (péptido) o el núcleo proteico. Se conocen en la técnica métodos para detectar y cuantificar la expresión de proteínas y péptidos y pueden incluir métodos que dependan de anticuerpos específicos generados contra la proteína o péptido. Pueden generarse anticuerpos monoclonales y antisueros policlonales usando métodos que son bien conocidos en la técnica y que no es necesario describir adicionalmente en la presente memoria.
[0173] Para demostrar que pueden usarse proteínas GTM para discriminar tejido tumoral de no tumoral, se obtuvieron anticuerpos comerciales contra SPARC (R&D Systems; nº cat. AF941), THBS2 (Santa Cruz Biotechnology Inc; nº cat. sc-7655), CSPG2 (Calbiochem; nº cat. 428060) e IGFBP7 (R&D Systems; nº cat. AF1334). Se generó un anticuerpo policlonal adicional en conejos (Alpha Diagnostic International Inc; San Antonio) contra la secuencia peptídica de cistatina SN 50-66 (C) FAISEYNKATKDDYYRR. SEC ID Nº: 108.
[0174] Estos anticuerpos se usaron en inmunohistoquímica o análisis de Western de tejido gástrico tumoral y no maligno. Cada uno de estos marcadores mostraba fuertes diferencias de tumoral:normal a nivel proteico. Esto confirmó que las sobreexpresión observada a nivel de ARN para estos genes también se producía a nivel de proteína.
[0175] La Figura 14 muestra análisis de transferencia de Western de proteína total extraída de dos parejas de tejidos tumorales y no malignos usando anticuerpos contra las proteínas codificadas por SPARC, CST1 (cistatina SN), IGFBP7 y THBS2. Para cada marcador, la señal es significativamente superior en las muestras tumorales que en las muestras no malignas.
[0176] El anticuerpo generado contra cistatina SN detectaba tres bandas principales, correspondientes a pesos moleculares de aproximadamente 34, 45 y 65 kDa respectivamente. La banda de menor peso molecular se muestra en la Figura 14. Las especies proteicas eran de mayor tamaño que la proteína cistatina SN de control, sugiriendo que la proteína producida por los tumores ha experimentado modificaciones post-traduccionales o multimerización. Independientemente del mecanismo responsable de las diferencias en pesos moleculares de las proteínas CST, la Figura 14 demostraba que la expresión de CST era reducida en el tejido no tumoral, pero se observaba fácilmente en transferencias de proteínas derivadas de tumores.
[0177] La Figura 14 también demostró que la proteína SPARC se expresa sustancialmente en mayor grado en tejido tumoral que en tejido no tumoral. La proteína SPARC tenía una movilidad en gel más lenta que la forma de esta proteína que se detectaba en suero (Figura 15), indicando también la aparición de diferentes modificaciones post-traduccionales en proteínas producidas por células gástricas malignas. Independientemente del mecanismo o mecanismos responsables de cualquier modificación de este tipo, el descubrimiento de que SPARC se sobreexpresa en tejido tumoral respecto a tejido no maligno indica que SPARC es un marcador proteico útil. De forma similar, IGFBP7 y THBS2 muestran la sobreexpresión en tejido tumoral respecto a tejido no maligno.
[0178] El análisis inmunohistoquímico de tejido tumoral y no maligno se llevó a cabo usando anticuerpos contra las proteínas codificadas por CSPG2 (versicán) y CST1 (cistatina SN). El análisis inmunohistoquímico de tejido con anticuerpos contra versicán identificó una fuerte tinción en la matriz extracelular de tejido tumoral, pero no en tejido no maligno. Con los anticuerpos anti-cistatina SN, se observó una fuerte tinción en el área alrededor de la parte externa de las células tumorales. En células no malignas, la tinción con este anticuerpo era más débil, y se observaba solamente en la superficie de la mucosa del tejido y el revestimiento de las foveolas gástricas. Esto demostró que en células no malignas, la proteína cistatina SN se dirige fuera de la célula sobre la superficie de la mucosa y no hacia el interior de los espacios extracelulares. Por lo tanto, no sólo la proteína cistatina SN se está produciendo en mayores cantidades en tejido tumoral que en tejido no maligno, sino que, a diferencia de la proteína producida por el tejido no maligno, la cistatina SN tumoral está en contacto directo con los vasos sanguíneos tisulares. Para ampliar estas observaciones, la cistatina SN se inmunoprecipitó a partir del sobrenadante de la línea celular de cáncer gástrico AGS con un anticuerpo monoclonal (R&D Systems; nº cat. MAB 1285) (Figura 16). Se detectaron grandes cantidades de cistatina SN en sobrenadante, confirmando que esta proteína se produce por y se secreta a partir de células epiteliales gástricas.
Ejemplo 6: Análisis de marcadores tumorales en suero
[0179] Para que un marcador sea útil para una exploración rápida, es deseable que el marcador esté presente en el suero en niveles suficientes para su detección. Ciertas proteínas descritas en la Figura 8 pueden secretarse en la sangre a niveles detectables a partir de cánceres gástricos. Un marcador que se sabe que se secreta a partir de tumores gástricos hacia la sangre en niveles detectables es TIMP1. Sin embargo, si una proteína se secreta o se desprende de cualquier superficie de una célula distinta de una superficie de la mucosa, tendrá que contactar con el líquido intersticial. A partir de ahí, puede pasar directamente hacia el suministro sanguíneo a través de un capilar o a través del sistema linfático. Por lo tanto, cualquier GTM desprendido estará presente en sangre. Se ha descrito previamente que la osteopontina, tiroglobulina y miembros de las familias de MMP y calicreína están elevados en el suero de pacientes con una variedad de cánceres epiteliales, pero no cáncer gástrico. Sin embargo, se ha observado previamente que TIMP1 está elevado en el suero de pacientes con cáncer gástrico. Estos descubrimientos sugieren que los criterios de selección para marcadores en este estudio, en concreto la sobreexpresión de proteínas secretadas en tejido tumoral pero no en tejido no maligno, puede usarse eficazmente para detectar marcadores en el suero y, por lo tanto, puede ser de utilidad importante clínicamente, sin la necesidad de biopsias de tejidos un órganos.
[0180] A partir de la Figura 15 es evidente que el SPARC sérico tiene un peso molecular diferente (representado en la presente memoria en la transferencia de Western), teniendo el SPARC tumoral un menor peso molecular que el SPARC producido por células sanguíneas. Por lo tanto, aún cuando el SPARC se produce por células sanguíneas tumorales y no tumorales, la presencia de SPARC tumoral puede determinarse usando el tamaño molecular, tal como determinarse usando análisis de Western, o con un anticuerpo específico para la proteína glicosilada producida por las células tumorales.
[0181] En otro estudio, los inventores detectaron la cistatina SN en el sobrenadante de una línea celular de cáncer gástrico, AGS. La Figura 16 representa un análisis de Western de medio solamente o de un sobrenadante de células AGS en cultivo. El carril a la derecha de la Figura 16 muestra una banda densa que corresponde a la proteína cistatina SN.
[0182] Por lo tanto, los inventores concluyen a partir de la Figura 10 que los GTM de esta descripción son adecuados para diagnosticar cánceres gástricos en las fases temprana, media o tardía de progresión de la enfermedad.
[0183] Aunque ciertas proteínas marcadores pueden estar glicosiladas, las variaciones en el patrón de glicosilación pueden conducir en determinadas circunstancias a una detección errónea de formas de GTM que carezcan de los patrones de glicosilación habituales. Por lo tanto, en ciertas realizaciones de esta invención, los inmunógenos GTM pueden incluir GTM desglicosilados o fragmentos de GTM desglicosilados. La desglicosilación puede efectuarse usando una o más glicosidasas conocidas en la técnica. Como alternativa, puede expresarse ADNc de GTM en líneas celulares de glicosilación deficiente, tales como líneas celulares procariotas, incluyendo E. coli, produciendo de este modo proteínas o péptidos no glicosilados. También puede apreciarse que el nivel y la calidad de la glicosilación pueden ser sensibles a la presencia de precursores esenciales para cadenas laterales de azúcares. Por lo tanto, en ausencia de un azúcar esencial puede no producirse una glicosilación “normal”, sino que en su lugar pueden encontrarse azúcares de cadena lateral más cortos o ausentes. Dichas “variantes de glicosilación” pueden usarse como inmunógenos para producir anticuerpos específicos para diferentes tipos de genes marcadores.
[0184] Además, ciertos GTM pueden formar homo-o heterodímeros u otros tipos de formas multiméricas. Por ejemplo, la inhibina betas A es una proteína de 47 kDa que puede formar homodímeros de peso molecular de 97 kDa (activina A) y heterodímeros de 92 kDa con la proteína inhibina beta B de 45 kDa (los heterodímeros se conocen como activina AB). Por lo tanto, puede apreciarse que el análisis de Western u otro tipo de ensayo que proporcione el peso molecular no tiene que limitarse solamente a la detección de una forma monomérica de un GTM. En su lugar, se puede apreciar fácilmente que puede detectarse cualquier forma de un GTM independientemente del peso molecular. Por lo tanto, la detección de una forma multimérica de un GTM puede usarse fácilmente para diagnosticar la presencia de cáncer gástrico. Además, para los GTM que son selectivos de fase (1-4) o de tipo de tumor gástrico (difuso o intestinal) la detección de una forma multimérica puede proporcionar una diana adecuada para evaluar la fase o el tipo de cáncer gástrico.
[0185] Una vez que se produce un anticuerpo o antisuero contra un GTM, dichas preparaciones de anticuerpo pueden usarse en una diversidad de formas. En primer lugar, pueden usarse métodos de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) o radioinmunoensayo (RIA) para cuantificar las proteínas o péptidos GTM. La inmunodetección puede efectuarse en muestras de tejidos usando inmunohistoquímica. Estos métodos son bien conocidos en la técnica y no es necesario describirlos adicionalmente en la presente memoria.
Ejemplo 7: Vectores que contienen oligonucleótidos de GTM
[0186] Otras realizaciones de esta descripción incluyen vectores útiles para la expresión in vitro de genes marcadores o porciones de los mismos (“péptidos marcadores”) o fragmentos de productos de genes marcadores. Por ejemplo, pueden generarse vectores que tengan oligonucleótidos para codificar GTM en los mismos. Muchos de dichos vectores pueden estar basados en vectores convencionales conocidos en la técnica. Esta invención también incluyen vectores que pueden usarse para transfectar una diversidad de líneas celulares para preparar líneas celulares productoras de GTM, que pueden usarse para producir las cantidades deseadas de GTM para el desarrollo de anticuerpos específicos u otros reactivos para la detección de GTM o para ensayos desarrollados de normalización para GTM.
[0187] Debe entenderse que para fabricar dichos vectores, un oligonucleótido que contiene la fase de lectura abierta completa o una porción de dicha fase de lectura abierta que codifica una porción de la proteína que se va a expresar puede insertarse en un vector que contiene una región promotora, una o más regiones potenciadoras unidas operativamente a la secuencia oligonucleotídica, con un codón de inicio, una fase de lectura abierta y un codón de terminación. Se conocen en la técnica métodos para producir vectores de expresión y no es necesario repetirlos en la presente memoria.
[0188] También puede apreciarse que uno o más marcadores de selección pueden insertarse en un vector de expresión para permitir la expansión de líneas celulares seleccionadas para contener el vector de expresión de interés. Además, también pueden insertarse secuencias líder conocidas en la técnica, en fase de lectura, para dirigir la secreción, el almacenamiento interno o la inserción en membrana de la proteína o fragmento proteico en la célula que lo expresa.
Ejemplo 8: Células transfectadas con vectores que contienen GTM
[0189] Se proporcionan células que pueden expresar GTM, fragmentos de GTM o marcadores peptídicos. Pueden usarse de este modo células tanto procariotas como eucariotas. Por ejemplo, puede usarse E. coli (una célula procariota) para producir grandes cantidades de GTM que carecen de una glicosilación madura (si el GTM particular está glicosilado normalmente). Pueden usarse células COS, células 293 y una diversidad de otras células eucariotas para producir GTM que estén glicosilados o que tengan un plegamiento apropiado y, por lo tanto, una estructura tridimensional de la forma nativa de la proteína GTM. Se conocen en la técnica métodos para transfectar dichas células y no es necesario describirlos adicionalmente en la presente memoria.
Ejemplo 9: Kits
[0190] Basándose en los descubrimientos de esta descripción pueden producirse varios tipos de kits de ensayo. En primer lugar, pueden generarse kits que tengan un dispositivo de detección precargado con una molécula de detección (o “reactivo de captura”). Para la detección de ARNm de GTM dichos dispositivos pueden comprender un sustrato (por ejemplo, vidrio, silicio, cuarzo, metal, etc.) sobre el que hay oligonucleótidos como reactivos de captura que hibridan con el ARNm a detectar. La detección directa de ARNm puede efectuarse por hibridación de ARNm (marcado con cy3, cy5, radiomarcador u otro marcador) con los oligonucleótidos en el sustrato. La detección de ARNm puede efectuarse generando primer el ADN complementario (ADNc) para el ARNm deseado. Después, el ADNc marcado puede hibridarse con los oligonucleótidos en el sustrato y detectarse.
[0191] Independientemente del método de detección empleado, es deseable la comparación de la expresión de GTM de ensayo con una medida patrón de expresión. Por ejemplo, la expresión de ARN puede normalizarse respecto al ADN celular total, respecto a la expresión de ARN expresados de forma constitutiva (por ejemplo, ARN ribosómico) o respecto a otros marcadores relativamente constantes.
[0192] También pueden usarse anticuerpos en kits como reactivos de captura. En algunas realizaciones, un sustrato (por ejemplo, una placa multipocillo) puede tener un reactivo de captura de GTM específico unido al mismo. En algunas realizaciones, un kit puede tener un reactivo de bloqueo incluido. Los reactivos de bloqueo pueden usarse para reducir la unión inespecífica. Por ejemplo, la unión de oligonucleótidos inespecífica puede reducirse usando ADN en exceso de cualquier fuente conveniente que no contenga oligonucleótidos de GTM, tal como ADN de esperma de salmón. La unión de anticuerpos inespecífica puede reducirse usando un exceso de una proteína de bloqueo tal como albúmina sérica. Puede apreciarse que se conocen en la técnica numerosos métodos para detectar oligonucleótidos y proteínas, y puede usarse cualquier estrategia que pueda detectar específicamente moléculas asociadas a GTM.
[0193] Dependiendo de la detección de anticuerpo, las proteínas o péptidos GTM pueden expresarse por célula o en base a proteína celular, tisular o en fluido, volumen de fluido, masa tisular (peso). Además, los GTM en suero pueden expresarse en base a una proteína sérica relativamente abundante tal como albúmina.
[0194] Además de un sustrato, un kit de ensayo puede comprender reactivos de captura (tales como sondas), soluciones de lavado (por ejemplo, SSC, otras sales, tampones, detergentes y similares), así como restos de detección (por ejemplo, cy3, cy5, radiomarcadores y similares). Los kits también pueden incluir instrucciones para su uso y un envase.
APLICABILIDAD INDUSTRIAL
[0195] Los métodos para detectar miembros de la familia de GTM incluyen la detección de ácidos nucleicos usando métodos de micromatrices y/o PCR a tiempo real y la detección de proteínas y péptidos. Las composiciones y métodos de esta descripción son útiles en la fabricación de dispositivos y kits de diagnóstico, el diagnóstico de enfermedades, la evaluación de la eficacia de la terapia y para producir reactivos adecuados para medir la expresión de miembros de la familia de GTM en muestras biológicas.
LISTA DE SECUENCIAS
<110> Pacific Edge Biotechnology Ltd.
Guilford, parry J.
Holyoake, Andrew J.
<120> Marcadores para la detección del cáncer gástrico
<130> PEBL-10064w00
<150> US 60/487.906
<151>
<160> 108
<170> Patentln versión 3.2
<210> 1
<211> 26
<212> ADN
<213> homo sapiens
<400> 1
aaatacaaaa ggacacattc aaagga 26
<210> 2
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<210> 11
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- <400> 50 cttgccagag tgactctgga ggccc
- 25
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- 30
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- 36
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- 33
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- 30
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- 33
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- 28
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- 22
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- 22
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- 31
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- 27
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- 25
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<213> Homo sapiens
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- <211>
- 1840 5 <212> ADN
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- <211>
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<213> Homo sapiens
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- <211>
- 1280 5 <212> ADN
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- 2820 5 <212> ADN
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- <211>
- 2480 5 <212> ADN
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- <211>
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- <211>
- 1443 5 <212> ADN
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- <211>
- 3178 5 <212> ADN
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- <211>
- 2691 5 <212> ADN
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- <211>
- 1757 5 <212> ADN
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- 1804 5 <212> ADN
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- <211>
- 3290 5 <212> ADN
82 83
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- <211>
- 2503 5 <212> ADN
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- <211>
- 2341 5 <212> ADN
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- <211>
- 2039 5 <212> ADN
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- 1387 5 <212> ADN
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- <211>
- 1077 5 <212> ADN
<213> Homo sapiens
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- <211>
- 4229 5 <212> ADN
<213> Homo sapiens
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- <211>
- 5826 5 <212> ADN
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- <211>
- 9645 5 <212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 95
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<213> Homo sapiens
<400> 96
<210> 97
<211> 782
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<213> Homo sapiens 15
<400> 97 <212> ADN
<213> homo sapiens
<400> 98
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- <211>
- 8448 5 <212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 99
<210> 100
- <211>
- 5025 5 <212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 100
<210> 101
<211> 2208
5 <212> ADN 137
<213> Homo sapiens
<400> 101
<210> 102
- <211>
- 2566 5 <212> ADN
<213> Homo sapiens
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- 2974 5 <212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 103
<210> 104
- <211>
- 3069 5 <212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 104
<210> 105
- <211>
- 3299 5 <212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 105
<210> 106
- <211>
- 1664 5 <212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 106
<210> 107
- <211>
- 3383 5 <212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 107
<210> 108
- <211>
- 17 5 <212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 108
Claims (11)
- REIVINDICACIONES1. Un método para detectar cáncer gástrico, que comprende:(a) proporcionar un muestra biológica; y(b) detectar la sobreexpresión de un miembro de la familia GTM en dicha muestra, caracterizado porque el miembro de la familia GTM es un inhibidor de la serina o cisteína proteinasa clado H (“SERPINH1)
-
- 2.
- Un método de la reivindicación 1, que comprende la etapa adicional de comparar la cantidad de GTM presente en dicha muestra de ensayo con un valor obtenido a partir de una muestra de control de un sujeto que no tiene cáncer gástrico.
-
- 3.
- El método de la reivindicación 1, que comprende detectar la sobreexpresión de al menos un miembro de la familia de GTM adicional seleccionado del grupo que consiste en carboxipeptidasa N, polipéptido 2, cadena de 83 kDa (CPN2), metaloproteinasa de la matriz 12 (MMP12), inhibina (“INHBA”), factor de crecimiento de tipo insulina 7 (“IGFBP7”), gamma-glutamil hidrolasa (“GGH”), proteoglicano enriquecido con leucina-prolina (“LEPRE1”), cistatina S (“CST4”), proteína relacionada con Frizzled secretada 4 (“SFRP4”), asporina (“ASPN”), regulador de crecimiento celular con dominio de mano EF 1 (“CGREF1”), calicreína 10 (KLK10), inhibidor tisular de metaloproteinasa 1 (“TIMP1”), proteína ácida secretada rica en cisteína (“SPARC”), factor de crecimiento transformante, -inducido (“TGFBI”), proteína de la matriz extracelular de tipo fibulina que contiene EGF 2 (“EFEMP2”), lumicán (“LUM”), estanina (“SNN”), fosfoproteína secretada 1 (“SPP1”), proteoglicano de sulfato de condroitina 2 (“CSPG2”), Nacilesfingosina amidohidrolasa (“ASAH1”), serina proteasa 11 (“PRSS11”), proteína relacionada con Frizzled secretada 2 (“SFRP2”), fosfolipasa A2, grupo XIIB (“PLA2G12B”), espondina 2, proteína de la matriz extracelular (“SPON2”), olfactomedina 1 (“OLFM1”), trombospondina que contiene repeticiones 1 (“TSRC1”), trombospondina 2 (“THBS2”), adlicán, cistatina SA (“CST2”), enzima de tipo lisil oxidasa 2 (“LOXL2”), tiroglobulina (“TG”), factor de crecimiento transformante betal (“TGFB1”), inhibidor de serina o cisteína proteinasa, clado B (“SERPINB5”), metaloproteinasa de la matriz 2 (“MMP2”), proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 5 (“PCSK5”) y proteína ligada a glicoproteína de hialuronano 4 (“HAPLN4”).
-
- 4.
- El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la etapa de detección se lleva a cabo detectando la sobreexpresión del mRNA de GTM, cDNA o usando un oligonucleótido complementario a al menos una porción de dicho cDNA de GTM.
-
- 5.
- El método de la reivindicación 4, caracterizado porque la etapa de detección se lleva a cabo usando un método qPCR utilizando un cebador directo y un cebador inverso.
-
- 6.
- El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la etapa de detección se lleva a cabo detectando la sobreexpresión de una proteína o péptido de GTM.
-
- 7.
- El método de la reivindicación 6, caracterizado porque la etapa de detección se lleva a cabo usando un anticuerpo dirigido contra dicho GTM.
-
- 8.
- El método de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 7, caracterizado porque la etapa de detección se lleva a cabo usando un método de inmunoensayo de tipo sándwich.
-
- 9.
- El método de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 8, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal o un antisuero policlonal.
-
- 10.
- El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, 5 ó 6, caracterizado porque la etapa de medición usa un ensayo ELISA.
-
- 11.
- El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque la muestra de ensayo se obtiene de tejido, orina, fluido gástrico, suero, heces, sangre o plasma.
REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓNEsta lista de referencias citadas por el solicitante es únicamente para la comodidad del lector. No forma parte del documento de la patente europea. A pesar del cuidado tenido en la recopilación de las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO niega toda responsabilidad en este sentido.Documentos de patentes citados en la descripciónLiteratura diferente de patentes citadas en la descripción
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