CN104620109A - 膀胱癌检测组合物、试剂盒及相关的方法 - Google Patents

Abstract

本发明通过检测尿液样本中生物标志物的组合而提供了用于受试者中膀胱癌诊断、预后和监测的组合物、试剂盒和方法。

Description

膀胱癌检测组合物、试剂盒及相关的方法

技术领域

本发明涉及检测癌症的组合物、试剂盒和方法，特别地涉及用于检测膀胱癌的这种组合物、试剂盒和方法，且更特别地涉及用于无创地检测膀胱癌的这种组合物、试剂盒和方法。此外，这种组合物、试剂盒和方法在使用免疫组织化学程序的情况下可用作辅助细胞学评价。

背景技术

膀胱癌是全世界五种最常见的恶性肿瘤之一。2010年仅在美国的膀胱癌病例预计为67,160例，预计死亡13,750例(A.Jemal等,CancerStatistics,2010CA:A Cancer Journal for Clinicians 60,277-300,2010)。当早期检查到时，5年内的存活率大约为94％；因此及时的介入可以显著提高患者存活的概率。目前，超过80％的膀胱肿瘤是非浸润性的乳头瘤(pTa或pT1)，但是剩余部分在诊断期间展现出肌肉浸润并具有更不太有利的预后。

尽管肌肉浸润性疾病需要根治性手术，非肌肉浸润性肿瘤在有或没有膀胱灌注疗法的情况下，通过经尿道切除肿瘤可以更保守地治疗；然而，70％以上的患有早期阶段疾病的患者会在诊断后的前两年有复发，这使得膀胱癌成为最常见的癌症之一。如果不及时治疗，这些最初非浸润性病变可演变为肌肉浸润性病变(F.Millan-Rodriguez等,J.Urol.164,680-84,2000)。膀胱癌的复发现象意味着患者需要至少每年一次的严格监控。为了生命的质量和积极的临床结果，及时发现疾病复发和初步诊断同样重要。

目前的主要诊断方法是膀胱镜检查结合尿脱落细胞学检查(VUC)。膀胱镜检查是不舒服的侵入性操作且成本高，并可能造成感染和创伤。VUC仍然是用于非侵入性检查膀胱癌的可选择方法；然而，尽管试验具有良好的特异性，但灵敏度是次优的，尤其是对于低级和低阶段肿瘤(D.S.Kaufman等,Lancet 374,239-49,2009；D.Trivedi and E.M.Messing,BMC Urol.9,13,2009)。

许多用于尿分析的诊断蛋白标志物已被商业开发，但单一的生物标志物的试验缺乏足够的能量来替代VUC或减少重复膀胱镜检查的需求。考虑到信号通路的冗余，分子网络之间的串扰和肿瘤的寡克隆性，这不奇怪。本发明的实施方案提供了用于检测非侵入性所得材料中的膀胱癌的可选生物标志物的鉴定，这提供了理想的全基因组分析策略。

发明概要

通过举例的方式提供了用于诊断膀胱癌的组合物和方法。该方法可包括检测至少两种在体样品中结合的生物标志物的过度表达，例如，尿液样品，众所周知，其中含有源于包括尿路上皮的膀胱粘膜的基因和基因产物。该方法能把患有膀胱癌的受试者得到的生物样品与未患有癌症(例如膀胱癌)的受试者获得的样品区分出来。在一个实施方式中，该方法包括生物标志物的预选组合的检测，所述生物标志物在疾病状态下选择性地过度表达，而不是在正常组织中。

该方法也可与其它有创或无创的诊断技术结合使用，这些技术目前在本领域已知或将在未来研发。

生物标志物的过度表达可以在蛋白质或核酸水平上评估。在一些实施方式中，提供了用于实施本发明方法的试剂以及包含这些试剂的试剂盒。

本发明的教导基于当前发明者先前的实验进行改进，展示出分析尿脱落基因表达分析的可行性以鉴定膀胱癌相关的基因标签(C.J.Rosser等,Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev.18(2),444-53,Feb.2009)。这里，发现分析阶段扩大到92例，选取的候选生物标志物分别在两套独立的81个和127个尿液样品中进行验证。尿路上皮细胞mRNA的线性扩增能够分析最小样品中47,000个以上的转录，且统计分析确定了与膀胱癌相关的差异表达的一组52个基因(P<0.001)。

在验证阶段，使用定量PCR或ELISA策略对自然排出的尿液样本中获得的尿路上皮细胞监测选定的44个靶转录。许多单个的基因/蛋白质显示出有希望作为膀胱癌检测的生物标志物，以及作为多个基因/蛋白质的生物标志物成员(panel)，例如，示例性的9个和14个成员的组合物和试剂盒，实现了非常高的鉴别能力。这些生物标志物可以纳入可靠的尿分析试验设计，从而导致用于膀胱癌检测和高危患者监测的可靠、精确、无创的测试。

本发明的一个实施方式包括用于检测受试者泌尿生殖器相关癌症(包括膀胱癌)的方法，该方法包括确定受试者的生物样品中的一个或多个生物标志物的存在或存在水平，其中生物标志物选自：IL-8、MMP9、SDC1、CCL18、SERPINE1、CD44、VEGF-A、CA9和ANG，其中生物标志物的存在和/或存在水平指示出受试者中癌症的存在与否。本发明的另一个实施方式包括检测表2至表10中列举的一个或多个生物标志物，且生物标志物选自：UBC；PPIA；PGK1；GAPDH；BIRC5；TERT；KRT20；CLU；PLAU；CALR；ANG；CA9；SCG3；ATF3；TLR2；AGT；DMBT1；ERBB2；CTNNA1；ATM；FBX09；CCNE2；NUSAP1；SNAI2；PLOD2；MMP12；IL1RAP；ITGB5；DSC2；APOE；TMEM45A；SYNGR1；MMP10；IL8；VEGFA；CPA1；CCL18；CRH；MCOLN1SERPINE1MMP1；MMP9；FGF22；MXRA8；NRG3；SEMA3D；PTX3和RAB1A。本发明的另一个实施方式包括检测表4至表10中列举的一个或多个生物标记物。本发明的另一个实施方式包括检测如尿液中存在的蛋白质或mRNA转录或尿液中存在的尿路上皮细胞的生物标志物成员。

在一实施方式中，本发明包括检测尿液中存在的一个或多个生物标志物的水平(例如，蛋白质或mRNA转录的水平)或尿液中存在的尿路上皮细胞，其中生物标志物选自CCL18、CD44、VEGF-A。在一实施方式中，本发明包括检测尿液中存在的一个或多个生物标志物的水平(例如，蛋白质或mRNA转录的水平)或尿液中存在的尿路上皮细胞，其中生物标志物选自CA9、CCL18、MMP12、TMEM45A、MMP9、SEMA3D、ERBB2、CRH和MXRA8。

附图说明

参照附图对本发明的实施方式进行例示说明，其中：

图1A是说明膀胱癌的14基因分类诊断准确率的受试者工作特征(ROC)曲线；

图1B是癌症和非癌症组的14基因标签的表达分布；

图1C显示了p值和受试者工作特征曲线下的面积值(AUC)作为预测模型包含的基因数目函数的变化图；

图2A是例示膀胱癌的9基因分类诊断准确率的ROC曲线，其仅包括上调(up-regulated)的基因；

图2B是癌症和非癌症组的9基因标签的表达分布；

图2C显示了p值和AUC值相对于预测模型包含的基因数目的变化图；

图3是用于推导最佳基因生物标志物标签的示例性“留一法交叉验证”(LOOCV)流程图；

图4是16个内源对照的应用生物系统微流体卡片(MicroFluidic Card)的低密度阵列(TLDA)分析图；

图5是膀胱癌的检测方法的实施方式流程图；

图6是确定患者预后方法的流程图；

图7是癌症检测方法的流程图。

具体实施方式

下面将参照附图对本发明进行更充分地说明，其中本发明的实施方式通过说明和举例的方式展示。然而，本发明可以体现为多种形式，且不应解释为限于在此阐述的实施方式。相反，提供这些实施方式用来使本发明的公开更彻底和完整，且将本发明的范围充分地传达给本领域的技术人员。美国专利申请公开号US2010/0184049 A1在此以引证的方式并入本文。

在一实施方式中，本发明提供了用于诊断泌尿生殖器相关癌症(包括膀胱癌)的方法，其中该方法包括：

确定生物样品中的一个或多个生物标志物的存在或存在水平，其中生物标志物选自CA9(碳酸酐酶IX)，MMP9(基质金属蛋白酶9)，MMP10(基质金属蛋白酶10)，PAI-1(纤溶酶原激活物抑制剂-1，也称丝氨酸蛋白酶抑制剂E1)，ANG(血管生成素)，VEGF(血管内皮生长因子)，SYNDECAN(多配体聚糖)，A1AT(α-1抗胰蛋白酶原)，IL-8(白介素8)，APOE(载脂蛋白E)和CD44；

其中与对照组相比，所述的一个或多个生物标志物的存在或所述的一个或多个生物标志物升高水平，表明了受试者具有泌尿生殖器相关的癌症(包括膀胱癌)。

在一实施方式中，本发明用于膀胱癌的诊断。

在一实施方式中，生物样品是尿液样品。在某些实施方式中，生物样品包括膀胱组织和/或尿路上皮细胞中的活组织检查。

在一实施方式中，生物样品来自受试者人。

生物标志物的存在或存在水平可以在核酸(如mRNA)和/或蛋白水平检测。

在一实施方式中，对照物是未患有癌症的受试者所得样品中存在的生物标志物水平。在一实施方式中，对照物是未患有膀胱癌或其他癌症的受试者所得样品中存在的生物标志物水平。在一实施方式中，对照物是具有良性膀胱肿瘤但不患有膀胱癌的受试者所得样品中存在的生物标志物的水平。

在一实施方式中，表2至表10(具体是表4至表10)中列举的一个生物标志物或生物标志物的组合的存在或存在水平可用于泌尿生殖器相关癌症(如膀胱癌)的诊断。

本发明还提供了用于膀胱癌诊断的试剂盒，其包括检测膀胱癌的一个或多个生物标志物的试剂。能够检测受试者生物样品中的生物标志物的试剂是与编码生物标志物的生物标志物多肽或核酸分子相互作用或结合的那些试剂。这些试剂(在此也称为结合剂)的实例包括，但不限于，与蛋白质/多肽生物标志物结合的抗体，适体或其片段，蛋白质/多肽生物标志物的结合配体，以及与编码蛋白质/多肽生物标志物的核酸分子杂化的核酸分子。优选地，结合剂标有可检测物质(例如可检测部分)。结合剂本身可以用作标记。

在IRB的批准和知情同意情况下，尿路上皮样品和相关临床信息前瞻性地从先前没有尿路上皮癌历史的个体收集。患者接受完整的血尿检测，包括诊所膀胱镜检查和通过计算机断层的腹部和骨盆(有或没有静脉造影)的上尿路扫描成像。在一项研究中，分析了两个不同的临床组群。第一组(试验)由具有否定评价(即没有癌症迹象)的40名受试者和患有可见膀胱肿瘤的52名受试者组成，可见膀胱肿瘤通过上尿路成像和/或膀胱镜检查检测到且之后通过活组织评价证明活检为尿路上皮癌。在他们的诊所膀胱镜检查(往返吸注，barbotage)期间，通过注射50毫升盐水进入膀胱得到试验组尿脱落的采样(C.J.Rosser等,ibid.)。基本上立即抽吸(50毫升)盐溶液并收集用于随后的分析。

第二组(验证)包括37名具有否定评价的受试者和44例确诊膀胱癌患者。对于这组，在无菌的杯子中收集30-50毫升中段尿，基本上立刻在4℃下储存，并在收集的1小时内处理进行存储。清晰可见的粗血尿样品排除在分析之外。

使用MULTISTIX亲试剂条(Bayer Healthcare,埃尔克哈特,印第安纳州)处理所有样品之前，检测所有样品的尿肌酐、血、白细胞、亚硝酸盐、葡萄糖、pH值、酮、胆红素。记录形态、肿瘤分级和分期、治疗和后果的有关信息。临床资料总结在表1中。每个样品在直接实验室处理之前分配唯一的识别号码。尿路上皮细胞通过离心(600×g，4℃，5分钟)沉淀，在PBS中漂洗，再次沉淀，并通过直接应用RNeasy裂解缓冲液(Qiagen,Valencia,CA)裂解。在-80℃存储之前，使用Agilent生物分析仪2000对RNA样品进行定量和定性评价。

基因表达分析根据标准方案(Affymetrix,圣克拉拉,加利福尼亚州)在Affymetrix人类基因组阵列上进行。然而，由于从尿路上皮样品(50-200ng总的RNA)中回收的RNA缺乏，采用双扩增方案(Rosser等,ibid.；F.Wagner和U.Radelof,J.Biotechnol.129,628-34,2007)。

根据Affymetrix双周期目标标记法(Affymetrix公司)进行标记cRNA的制备。碎片的、生物素化的cRNA与Affymetrix人类基因组U133+2.0微阵列杂化。每个基因芯片实验的质量控制(QC)包括5'：3'的比例评价。这个指数不仅反映RNA完整性的原始水平，而且反映样品处理的精度(Rosser,ibid.)。任何具有5'：3'指数<1的样本从分析中删除。本文描述的92例属于通过这一标准分析的全部106病例。分位数和dChip标准化用于生成信号值。两样本的韦尔奇t-统计允许用不等方差来鉴定正常样本和肿瘤样本之间差异表达的基因。p值可用来评估每个基因的统计学显著性。上述分析使用生物导电体和Analyzelt工具进行(http://genomics3.biotech.ufl.edu/Analyzelt/Analyzelt.html)。在本研究过程中获得的所有微阵列数据可从GEO XYZ上获得。

为从微阵列数据中获得诊断最优的多基因诊断标签，应用了标志(LoGo)特征选择算法(Y.Sun等,IEEE Trans.Pattern Anal.Mach.Intell.23(9),1610-26,2010；Y.Sun和S.Goodison,Prostate 69,119-27,2009)。为避免计算模型与训练数据可能的过度拟合，使用留一法交叉验证(LOOCV)方法来估计分类参数和预测性能(S.Goodison等,Bioanalysis2(5),855-62,2010,5)。通过改变判定阈值获得受试者工作特征(ROC)曲线(L.F.Wessels等,Bioinformatics 21,3755-62,2005)用于提供预测模型如何在不同的灵敏度和特异性水平上实施的直接观察。这里，特异性定义为未患有膀胱癌的患者分配到正常组的概率，灵敏度是患有膀胱癌的患者分配到疾病组的概率。创建散点图来说明相对预测分数且使用t检验法评价组之间的显著性。

对于定量PCR分析，用于RNA提取的中段尿液样本的采集和处理如上述执行用于微阵列分析的方法。在-80℃存储之前，使用Agilent生物分析仪2000对纯化RNA样品进行定量和定性评价。根据可用性，使用大容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems,福斯特市,加利福尼亚州)，按照制造商的说明书，用随机引物在20μl总反应体积由20ng-500ng的总RNA合成互补的DNA。

内源参照对照物的选择通过使用每个样品cDNA的等分试样在15个内源参照靶标物的多重PCR预扩增反应中完成，15个内源参照靶标物为GAPDH；ACTB；B2M；GUSB；HMBS；HPRT1；IPO8；PGK1；POLR2A；PPIA；RPLP0；TBP；TFRC；UBC；YWHAZ。15个TaqMan基因表达分析在0.2X最终浓度汇集在一起。随后，12.5μl汇集测定的混合物(0.2X)与4μl的每个cDNA样品和25μl的预扩增主混合液(2X)混合成50μl的最终体积。热循环条件如下：初始保持在95℃下10分钟；10个95℃下15秒和60℃下4分钟的预扩增循环。预扩增产物在使用内源对照阵列(Applied Biosystems)，一种包含上述列出的15个基因加18S RNA的384孔微流体卡板，进行单重反应扩增之前用TE缓冲液1：5稀释。反应在7900HT快速实时定量PCR系统中(AB)进行。所有81种验证样本(UBC；PPIA；PGK1；GAPDH)中最少变量表达的基因使用GeNorm软件(Integromics,格拉纳达,西班牙)鉴定，随后选择用于48靶标定制TLDA构建。

定制阵列预扩增和扩增反应通过应用生物系统(AB)构造的低密度阵列(TLDA)实施，其使用了预先设计的探针跨越外显子交界的分析。包括的靶标物有：UBC；PPIA；PGK1；GAPDH(4个内源对照物)；BIRC5；TERT；KRT20；CLU；PLAU；CALR；ANG；CA9；SCG3；ATF3；TLR2；AGT；DMBT1；ERBB2；CTNNA1；ATM；FBX09；CCNE2；NUSAP1；SNAI2；PLOD2；MMP12；IL1RAP；ITGB5；DSC2；APOE；TMEM45A；SYNGR1；MMP10；IL8；VEGFA；CPA1；CCL18；CRH；MCOLN1SERPINE1MMP1；MMP9；FGF22；MXRA8；NRG3；SEMA3D；PTX3；RAB1A(44个生物标志物的靶标物)。使用汇集的48个基因表达分析进行多重PCR预扩增的反应。在0.2X最终浓度的分析试剂与7.5μl的每个cDNA样品和15μl的预扩增主混合液(2X)组合成30μl的最终体积。热循环条件如下：初始保持在95℃下10分钟；14个95℃下15秒和60℃下4分钟的预扩增循环，最终保持在99.9℃下10分钟。按照生产商的说明书，10微升未稀释的预扩增产物与50μl的2x通用PCR主混合液(AB)混合成100μl最终的容积，用于随后的单重扩增反应。人类通用参照的总cDNA(Clontech)的一个样本作为校准物包括在每个微流体卡板中。反应在7900HT快速实时定量PCR系统中(AB)运行。

用RQ管理(AB)和StatMiner(Integromics)软件包对实时PCR扩增结果处理。对于每个靶标物，基线的正确性是手动检查的且为所有板上的每个靶标物设定了0.2的Ct阈值。48个靶标物中扩增<10％的一个样本从分析中去除，且因为扩增曲线分析揭示了非特异性产物的扩增，一个靶标物(PTX3)从所有随后的分析中去除。△△CT值通过使用4种内源参考靶标物(UBC，PPIA，PGK1和GAPDH)的几何平均值作为标准物和人类通用参照的总cDNA(Clontech)作为校准物进行计算。在膀胱癌和非癌症样品之间差异表达的基因通过t检验比较(P<0.01)来确定。

最佳诊断分子标签的推导通过使用L1调节逻辑回归建立预测模型，即，预测作为癌症或对照的给定的样品的实际状态来完成。用于L1调节学习算法的策略的详情，最优方案参数和快速实施方法的应用将在下文呈现。因为样本尺寸小，采用留一法交叉检验(LOOCV)方法来估计预测性能(Wessels等,ibid.)。在每次迭代中，一个样品留存(held out)用于测试，而其余样品用于训练。正则化参数λ首先通过使用训练数据的10倍交叉验证来估计，且然后预测模型使用估计参数来训练并盲性施加到留存的样品上。

实验重复进行直到所有样品都进行了测试。然后ROC曲线绘制成将预测模型在不同灵敏度和特异性水平如何实行可视化，并反映受试者工作特征曲线(AUC)的底部面积。为验证数据，还进行排列检验以估计预测性能的p值。排列检验重复1000次。在每次迭代中，类别标签被随机洗牌，且执行上述实验方案并记录得到的ROC曲线下面积。p值按照迭代的发生频率来计算，其中得到的AUC优于使用原始类别标签得到的AUC。P值<0.01被认为是统计学显著。统计学分析通过SPSS13.0和MedCalc8.0版本执行(MedCalc Software,Mariakerke,比利时)。

基因表达分析通过从用于分子谱分析(试验组)92名患者的尿液得到的分离上皮细胞样本来完成。在这些病例中，52例活组织检查确诊了早期疾病(Ta，T1或T2阶段)尿路上皮癌，40例无癌症的迹象。病人组群特征在表1中汇总。从尿路上皮样品中回收的RNA的量在总的RNA中20至250纳克的范围；所以采用两个周期的扩增策略以产生足够的标记的cRNA用于与Affymetrix U133Plus 2.0阵列杂交，其能够分析超过47,000的转录本。数据分析鉴定了447个基因组具有与疾病状态(p值<0.01)相关的表达模式，其中52个基因p值≤0.001(见表2)。属于居首(≤0.0001)的与膀胱癌相关的过度表达的转录本有MMP12和MMP10，组织重塑酶的金属蛋白酶家族成员。

从只用p值排名的基因列表不能清楚与手头的分类任务最相关的基因，在这种情况下，对癌症与非癌症病例分层。

一旦p值不断变小，人们不能确保居首的基因是单独地至关重要的，或它们将最佳地作为多个生物标志物标签执行用于膀胱癌的分类。为了从微阵列数据中确定出最准确的诊断的标签，应用特征选择算法，其先前被推导出并应用于乳腺癌和前列腺癌(C.J.Rosser等,ibid.；Y.Sun和S.Goodison,ibid.；S.Goodison等,ibid.；Y.Sun等,2007,ibid.)的最佳疾病分类推导。算法在高维数据上执行多变量数据分析，且不对基础数据的分布做任何假设。这种方法鉴定了在预测类型标签表现最佳的43个基因的模型(表3)，在留一法交叉验证期间ROC曲线下面积达到0.821。这个模型辅助直系同源技术验证的基因的选择。

为了验证并优化膀胱癌诊断分子标签，候选生物标志物的选择成员在天然脱落的尿液样品的独立验证样品组中进行测试，其包括37个非癌症对照物和44个癌症病例(表1)。使用定量实时RT-PCR测量了尿路上皮细胞RNA样品中的靶转录。低密度阵列(TLDA)构造成包括44个候选生物标志物加上4选定的内源对照物，其通过在全组群的样品中筛选15个常用的内源性对照物的水平(如上下文所述)选定。生物标志物的靶标物主要从p值排名和上文所述的分子标签模型中选取，但是若干假定的生物标志物也包括在文献(TERT、KRT20、CLU、PLAU、CALR、CA9、ANG)中。当其他的选择标准相同时，选取编码完整的膜蛋白或分泌蛋白的基因，因为这些类别作为尿分析的生物标志物具有特别的发展潜力。尽管这些并不旨在限制，但本领域技术人员将理解能够构想到其他基因的组合，所选靶标物的示例性组列在表4中。

*PTX3-Hs01073991_m1从分析中排除。产生非特异性扩增。

差异表达值通过标准化计算，使用参考靶标物(NUC、PPIA、PGK1、和GAPDH)和人类通用参照基因总cDNA(Clontech公司)作为每块板的校准物。11个测试基因(表4)显示出膀胱癌和非癌症样本之间的差异表达(p<0.01)，排前五的基因p值<0.001。使用L1调节的逻辑回归推导出一种预测模型，即识别分子标签，它能够最好地预测给定样本的状态为癌症或对照物。绘制ROC曲线以直观地了解每一个预测模型在不同的敏感性和特异性水平上如何执行。从47个靶TLDA分析得出的最佳标签由14个基因组成，如表5所示，从中可以观察到，一些基因(例如，DMBT1和ERBB2)具有大的p值，因此单独评估时，不会是有价值的，但是，当与生物标志物成员相组合时，这些靶标物可提供重要的信息。标签性能的散点图表明，癌症和非癌症病例之间数值的显著(p值<0.0001)扩展(图1A)，ROC曲线显示出非常高的灵敏度和特异性值(图1B)。在高达90％的灵敏度时，14个基因标签实现了100％的特异性。ROC曲线(AUC)下面积为0.982。通过绘制标签p值对AUC值的变化，能够显示出9个排名第一的基因对14个基因标签性能的贡献最大，然而，增加更多的基因产生防错误的更强大的标签(图1C)。

*基因按平均预测权重的降序排序。负的前缀表示一种癌症病例中的基因下调。

**由学生T检验比较癌症与非癌症病例样本的基因表达水平分布获得各基因的p值。

最佳的14个基因模型由7个上调肿瘤样本的基因转录和7个下调的基因转录组成。考虑潜在生物标志物测定法的发展，其中上调基因也许更适用于精确的检测，如下面的数据所示，使用L1调节的逻辑回归模型计算由PCR数据导出的标签性能，PCR数据仅由上调基因组成。考虑有限的选择，9个基因标签(表6)表现得非常好，达到0.925(图2A和2B)的AUC。在80％的灵敏度时，9个基因标签实现98％的特异性。绘制的p值变化和AUC值表明，排前二的基因对9个基因标签的贡献最大(图2C)。

*基因按平均预测权重的降序排序。

**由学生T检验比较癌症与非癌症病例样本的基因表达水平分布获得各基因的p值。

进行鉴别分析以评估对膀胱癌的诊断基因标签的预测值。具体来说，由于其处理高维数据的能力，使用L1正规化逻辑回归建立预测模型((A.Y.Ng,Proc.21^st Intl.Conf.on Machine Learning,pp 78-86,2004)。比较分析前，从TLAD探针获得的单个信号强度值是使用2作为基数的log转换，并在研究中包括的所有个体样本之间归一化。给定样本和基因探针，对第几个样本基因的表达谱与相应的临床状态进行表示(-1用于非癌症和1用于癌症)。L1正规化的逻辑回归寻求最佳的解决方案，以解决以下优化问题：

$\underset{w,b}{\min }\frac{1}{N}\underset{n=1}{\overset{N}{\mathrm{\&Sigma;}}}\log (1+\exp (-y_n\left(w{x}_n-b\right)))+\mathrm{\&lambda;}{\left|\right|w\left|\right|}_1$

其中λ是调节参数，它控制溶液的稀疏性，W＝[W1，W2，.......，W_J]是预测的权重向量，b是判断阈值。用在下面描述的交叉验证方法调谐调节参数λ。w的每个元素的大小可以被解释为相应基因的预测值。在该分析中，组织样本以便正权重表示相应基因的上调，负权重为下调基因。构造该预测模型之后，给定一种新的基因表达谱x，预测分数计算为w*x,表示膀胱癌的预后结果。最佳阈值b*决定正常和癌症患者谱之间的判定边界。当评估预测模型的性能时，经常使用受试者工作特征(ROC)曲线并且可以通过改变阈值b以产生不同的特异性和灵敏度水平来获得。

为了评估上调基因的预测能力，使用下列逻辑回归的限制性形式:

$\underset{w\&GreaterEqual;0,b}{\min }\frac{1}{N}\underset{n=1}{\overset{N}{\mathrm{\&Sigma;}}}\log (1+\exp (-y_n\left(w^T{x}_n-b\right)))+\mathrm{\&lambda;}{\left|\right|w\left|\right|}_1$

两个优化问题使用Y.Cai等人(Proc.10th SIAM Intl.Conf.on DataMining,pp 862-71.2010)描述的方法可以轻松解决。

由于样本量小，采用留一法交叉验证法(LOOCV)估算预测性能。在每次迭代中，一个样本留存用于测试，而其余的样本用于训练。通过使用训练数据十倍交叉验证首次估算调节参数λ，然后使用所估算的参数训练预测模型，并盲性地施加到留存的样本。该实验重复进行，直到所有样本都进行了测试。测试样本不包括在训练过程中的任何阶段(详细参见图3)。然后绘制ROC曲线以直观地了解每一个预测模型在不同的敏感性和特异性水平上如何执行，并报道受试者工作特征曲线下面积。

对在每次迭代中了解的预测权重向量进行记录和归一化，使：

Σ_j|w_j|＝1

整个LOOCV过程结束后，各个基因的平均权重分别计算，以降序排序。通过同时使用上调和下调基因，发现14个基因有显著预测强度，预测强度定义为：

|w_j|＞0.01

通过使用上调基因，发现只有四个基因具有：

|w_j|＞0.01

且9个基因具有非零权重。因此记录所有的9个基因，尽管事实证明，只有前两个基因在决策中起了显著作用。

由于数据量小，可能预测模型的结果是由于一些研究者不感兴趣的随机混杂因素。因此，进行排列检验以估计预测性能的p值。为了本文的计算原因，重复1000次排列检验。在每次迭代中，分类标签进行随机排列，执行上述实验方案，记录得到的ROC曲线下面积。p值计算为迭代的发生频率，其中所得的AUC优于使用原始分类标签获得的AUC。p值<0.05通常被认为具有统计学显著性。

对来自验证组群的81个样本中的cDNA等分试样(总20μl样本中的4μl)进行预扩增，并在应用生物系统微液体卡板(Applied BiosystemsPN 4367563)上进行分析。GeNorm用来估计对照基因与所有试验的其他对照基因的成对变化(对数转换的表达比率的标准差)。通过该基因稳定性测量，M计算为平均成对变化。具有最低M值的基因有最稳定的表达。图4示出了内源性对照UBC；PPIA；PGK1；GAPDH是在验证样品组中最小可变的基因。这四个靶标物纳入48个靶标物定制TLDA中。

在另一个病例对照研究中，我们检查了来自127个病患的废尿：64个肿瘤携带受试者，63个对照物。下列蛋白质的尿浓度通过酶联免疫吸附测定(ELISA)进行测定：趋化因子(C-C基序)配体18(CCL18，也称为MIP-4)；纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI-1)；分化抗原簇44(CD44)；血管内皮生长因子(VEGF)；碳酸酐酶IX(CA9)；基质金属蛋白酶9(MMP9)；白介素-8(IL-8)；多配体聚糖-1(SDC1)和血管生成素(ANG)。完整的识别细节列于表7中。

表7 研究的蛋白标记物的完整ID

在患膀胱癌(BCa)的受试者中，VEGF、CCL18、PAI-1、ANG、CA9、IL-8和MMP9的尿浓度均显著升高(表8)。

表8 癌症和非癌症组之间蛋白质标志物的尿浓度比较

使用威尔科克森秩和检验来测试每个生物标志物和BCa之间的关联(p值)。生成非参数受试者工作特征(ROC)曲线以可视化和对比定量数据，其中灵敏度值相对假阳性率(1-特异性)绘制。计算使灵敏度和特异性之和最大化的ROC下面积(AUC)值和截止值用来比较。相对于在127个样本组群中的BCA检测，表9为每个生物标志物列出了AUC、截止值、灵敏度、特异性、阳性预测值(PPV)、阴性预测值(NPV)和总准确度(平均灵敏度和特异性)。在这项研究中的统计学显著性被设定为p<0.05，所有报道的p值为双面的。所有的分析均采用SAS软件版本9.1.3。所有数据均归一化为尿肌酐值，以考虑到膀胱中的尿量和时间。来自用市售基于ELISA的BCa检测法执行的分析的数据包含在表8和表9中进行比较。

表9 每个生物标志物的生物标志物性能数据

为评估生物标志物和BCa之间的独立相关性，用作为响应变量的BCa状态(有相对没有)和作为解释变量的蛋白生物标志物的浓度进行逻辑回归分析。向后消除模型用于对所有组合计算出性能参数(表10)。

表10通过来自127个受试者组群所获尿液的ELISA分析由多变量分析数据获得的生物标志物成员的性能

组合的全部9个生物标志物测定的性能是高度准确的(表10a)。64个癌症病例中，只有2个贴错标签(97％灵敏度)，所有非癌症病例认定正确(100％特异性)。我们还计算出包含更少生物标志物的多种组合物的性能。3个生物标志物分析(CCL18，CD44和VEGF)表现非常好(灵敏度90.6％，特异性98.4％)(表10b)。减至2个生物标志物(CCL18和VEGF)(表10c)仍优于(97％灵敏度，86％特异性)现有的诊断测试，包括我们研究的BTA-Trak(80％灵敏度，84％特异性)。

本发明的一个方面涉及用于检测和诊断膀胱癌和其他泌尿生殖相关癌症的材料和方法。通过表2-9中列出的核苷酸编码的核酸分子(例如，DNA或mRNA)或多肽可作为膀胱癌的分子标志物。

癌症生物标志物(也成为肿瘤标志物)是分子，如激素、酶和免疫球蛋白，其在与癌症相关联的体内发现，且其测量或识别在患者的诊断或临床管理中是有用的。它们本身可以是癌细胞的产物或应答于癌症或其他病症的身体产物。大多数癌症的生物标志物是蛋白质。一些癌症的生物标志物被认为只在单一类型的癌症中，而其它生物标志物可以在多种类型的癌症中检测到。对于其它的癌症生物标志物，本文所述的生物标志物可以用于各种目的，例如：筛查健康人群或高危人群的膀胱癌；做出膀胱癌的诊断或膀胱癌的特异性类型的诊断；确定受试者的预后；和对病情缓解中或同时接受手术、放疗、化疗或其他癌症治疗的受试者中监测过程。因此，这些生物标志物的尿液水平可以用于检测和/或监测整个病程中膀胱癌的存在，并可以用于预测治疗和预后效果。例如，本发明的生物标志物可以用于帮助证实预防性化疗药物的疗效，这些药物给药用来治疗、预防或延缓疾病的发作。

本发明的一个方面涉及一种用于检测或诊断受试者中膀胱癌或其他泌尿生殖器相关癌症的方法，包括检测在样本中表2-9中列出的至少一个生物标志物的存在和/或定量测定在样本中表2-9中列出的至少一个生物标志物的水平，例如来自受试者的尿样，其中，生物标志物的存在或高于预定阈值的生物标志物的水平(例如，浓度)表明受试者中有膀胱癌或其他泌尿生殖器相关癌症。

在本发明的方法100(图5)的实施方式中，检测包括：(a)使生物样品与结合剂(或多个结合剂)接触，其结合生物标志物核酸或蛋白质(或生物标志物的组合)以形成复合物(或络合物)(方框102)；(b)检测复合物(方框103)；和(c)将检测到的复合物关联到样本中生物标志物的量(方框104)，其中一个或多个生物标志物的存在或水平升高的生物标志物(多个)的存在表明有膀胱癌(方框105)。在具体的实施方式中，用于检测步骤(b)的结合剂还包括连接或结合到试剂(方框101)的标签。在一个实施方式中，检测包括使用基于ELISA的免疫酶检测。

任选地，本发明的方法还包括在对样品进行本发明的生物标志物检测之前，之中和之后，从相同受试者中获得的相同尿液样本中、不同尿液样本中，或者相同或不同的生物样本(例如血清、血浆、全血、组织(例如活检组织)，脱落尿路上皮细胞或膀胱癌细胞)中，检测和/或定量膀胱癌或其他泌尿生殖器癌症的一个或多个另外的生物标志物，和/或不同癌症类型的一个或多个另外的生物标志物。以这种方式，本发明的一个或多个生物标志物可以用作一组生物标志物的部分，其用于检测膀胱癌或其他泌尿生殖器癌症以及任选的其他癌症的监测方案中。例如，少至2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13个或多达14个或更多的一组标志物可以利用。

在一些实施方式中，癌症治疗之前，之中，或之后，可以在几个时间点或时间间隔进行检测，以作为受试者的监测部分(方框107)。

任选地，本发明的方法还包括比较在尿液中或其它生物样本中的一个或多个膀胱癌生物标志物的水平与存在于正常对照样本中的生物标志物的水平，其中，与正常对照样本中的水平相比，较高水平的生物标志物表明癌症的存在。

在一些实施方式中，在实施膀胱癌生物标志物的检测时，受试者可能没有表现出癌症症状。在其它实施方式中，在实施膀胱癌生物标志物的检测时，受试者表现出一个或多个癌症症状，例如膀胱癌。例如，对于膀胱癌，一个或多个膀胱癌症状包括但不限于，尿液中可见血液、血尿(尿液中微观红细胞的存在)、尿痛、尿急(经常感觉到无果的排尿需要)、尿频和骨盆或侧腹部疼痛。

本发明的主题还涉及用于具有或怀疑具有癌症例如膀胱癌的受试者预后评估的方法200(图6)，包括：(a)确定本发明的一个或多个癌症标志物的水平(方框201)(例如，表2-9列出的从受试者获得的生物样本中的一个生物标志物)；(b)将步骤(a)中确定的水平与不具有癌症的正常受试者获得的生物样本中已知存在的一个或多个癌症标志物的水平或范围进行比较(方框202)；及(c)基于步骤(b)的比较，确定受试者的预后(方框203)，其中，步骤(a)中一个或多个癌症标志物的高水平表明更严重的癌症形式，以及因此的预后不良。在一个实施方式中，生物标志物包括由这种核酸编码的选自表2-9的一个或多个核苷酸或多肽。

术语“检测(detecting)”或者“检测(detect)”包括测定或确立靶标膀胱癌生物标志物、其亚单元或试剂结合靶标的组合物等存在或不存在，或者测定、询问、探知、建立或确定膀胱癌、转移、阶段或类似病症的一个或多个实际特性。术语包括但不意在限制于表2-9列出的一个或多个膀胱癌生物标志物的诊断、预后和监测应用，以及任选的其他癌症生物标志物。术语可包括定量，半定量和定性检测方法。

核酸测定

核酸，包括天然存在的核酸，寡核苷酸，反义寡核苷酸和合成的寡核苷酸，其与编码本发明的生物标志物多肽的核酸杂交，可用作试剂以检测本发明的生物标志物的存在，生物标志物在癌症患者或有患膀胱癌风险的受试者的生物样本中，优选地在膀胱癌患者或有患膀胱癌风险的受试者的尿液中。本发明考虑核酸序列的使用，其对应于本发明生物标志物的编码序列，和其互补序列，以及互补生物标志物转录序列的序列，该序列进一步地发生在编码序列的上游或下游(例如，序列中包含的，或延伸到5'和3'非编码区)，其用作试剂，检测本发明的癌症患者或有患癌风险受试者生物样本中的生物标志物的表达，优选地检测膀胱癌患者或有患膀胱癌风险受试者尿液中的生物标志物的表达。

用于检测生物样本中本发明的生物标志物存在的优选寡核苷酸是那些与至少一部分编码生物标志物的cDNA序列互补的核酸。这些互补序列也已知作为本领域的“反义”序列。这些寡核苷酸可以是核糖核苷酸或寡脱氧核糖核苷酸。此外，寡核苷酸可以是由生物显著核苷酸组成的天然低聚物，即，A(腺嘌呤)，dA(脱氧腺苷)，G(鸟嘌呤)，dG(脱氧鸟嘌呤)，C(胞嘧啶)，dC(脱氧胞苷)，T(胸腺嘧啶)和U(尿嘧啶)，或改性的寡核苷酸种类，取代，例如，在间核苷酸磷酸二酯键的磷酸氧的甲基或硫原子。另外，这些核苷酸本身，和/或核糖基部分，可被改性。

使用任何本领域已知的化学寡核苷酸合成方法，可以化学合成寡核苷酸。例如，通过使用任何商购的、自动化的核酸合成仪可以制备寡核苷酸。可替代地，通过标准重组DNA技术来可以创造寡核苷酸，例如，非编码链的诱导转录。编码生物标志物的DNA序列可以在重组DNA系统中被反转，例如，插在合适的启动子的反向方向，以便转录非编码链。

虽然任何长度的寡核苷酸可用于杂交编码生物标志物多肽的核酸，通常在8-100个核苷酸的范围内的寡核苷酸是优选的。用于检测尿液样本中的生物标志物的最优选的寡核苷酸是那些在15-50个核苷酸范围内的。

为杂化生物标志物核酸分子选择的寡核苷酸，不论化学合成或通过重组DNA技术合成，随后用标准技术分离和纯化，然后优选使用标准标记方案标记(例如，用35S或32P)。

本发明还考虑在聚合酶链反应(PCR)中使用寡核苷酸对，以检测生物样本中的生物标志物的表达。寡核苷酸对包括正向引物和反向引物。

来自患者的样本中生物标志物的存在可以通过核酸杂交来确定，例如，但不限于，Northern印迹分析，斑点印迹，Southern印迹分析，荧光原位杂交(FISH)和PCR。色谱，优选高效液相色谱法，和其他已知的测定法也可以用于确定样本中生物标志物的信使RNA水平。

编码本发明生物标志物的核酸分子可以在生物标志物阳性癌细胞中的生物流体中发现，生物标志物阳性癌细胞从正在受调查的流体或生物样本中流出或释放，例如，尿液。编码生物标志物的核酸也可以直接在流体或生物样本中发现(即，无细胞)。

在一个方面，本发明考虑核酸的使用，作为检测本发明的患者生物样本中的生物标志物的试剂，其中核酸被标记。核酸试剂可以标记有放射性标签，荧光标签，酶，化学发光标记，比色标记或其他上文已经讨论过的或本领域已知的标签或标记。

蛋白质结合试验

在本发明的涉及一个或多个多肽(相对于编码多肽的核酸分子)的检测实施方式中，检测方法可以是，例如基于ELISA的方法。如本文所使用的，术语“ELISA”包括酶联免疫吸附测定，该测定采用抗体或抗原，其结合于固相和酶-抗原或酶-抗体缀合物以检测和定量测定存在于样本中的抗原(例如，本发明的生物标志物)或抗体的数量。ELISA技术的描述可以在洛斯阿尔托斯的兰格医学刊物出版的D.P.Sites等人的第四版《基本和临床免疫学》的第22章和在美国专利3,654,090；3,850,752和4,016,043中找到，它们的全部公开内容在此以引用的方式并入本文。ELISA是可用于定量样本中关注的抗原、蛋白质或其他分子的试验法。

优选地，在本发明的各种实施方式中，检测方法输出(即读出或发信号)了关于来自受试者尿液样本中膀胱癌生物标志物存在、不存在或存在数量的信息。例如，输出可以是定性的(例如“阳性”或“阴性”)或定量的(例如其浓度为每毫升的纳克数)。

本发明方法300的一些实施方式(图7)包括(a)使生物样本，例如来自受试者的尿液样本，与一种或多种特异于直接或间接用酶标记的生物标志物或生物标志物多肽的抗体接触(方框301)；(b)添加酶的底物，其中选择底物以便底物，或酶和底物的反应产物形成荧光复合物(方框302)；(c)通过测量荧光复合物的荧光，定量样本中的生物标志物(方框303)；和(d)比较量化水平与标准的量化水平(方框304)。在一个实施方式中，从表2-9列出的一个或多个生物标志物中选出的生物标志物，包括一个或多个多肽和/或编码多肽的核酸。

本发明还考虑本文描述的方法、设备和试剂盒与用于癌症的一个或多个附加生物标志物联合使用。进行本发明的一个或多个膀胱癌生物标志物的检测之前，之中和/或之后，进行一个或多个附加标志物的检测。本文所述的方法，设备和试剂盒可以通过包含试剂进行修改，以检测附加的生物标志物或编码标志物的核酸。本发明的方法，设备和试剂盒可以用于检测相对于非紊乱(non-disorder)状态或与紊乱状态(例如，膀胱癌)或朝紊乱状态发展的相关改性的膀胱癌生物标志物存在(例如，小于全长)的一个或多个癌症生物标志物的过度或缺少。本文所述的方法也可用于评估恶性或恶变前细胞存在的概率。这样的方法可以用于检测肿瘤，定量它们的生长，并协助如膀胱癌的泌尿生殖器癌症的诊断和预后。该方法也可用于检测癌转移的存在，以及验证手术，癌症化疗和/或放射治疗后所有肿瘤组织的缺失或移除。它们可以进一步用于监测癌症化疗和肿瘤再现。

本发明的方法，设备和试剂盒可用于早期膀胱癌(例如，当受试者的诊断中无症状时)的诊断，以及用于监测和评估膀胱癌进展的预后和死亡率。根据本发明特定的膀胱癌生物标志物，相比于标准，尿液样本中待检的生物标志物的增加或减少水平可表明疾病晚期阶段、大的残余肿瘤和/或疾病进展的高风险和死亡率。

术语“样本”，“生物样本”等是指一种已知的，或怀疑表达有或包含有癌症生物标志物的材料，例如尿液。测试样本可以从来源获得后直接使用或进行预处理以改变样本的特征。样本可以来自任何生物源，例如组织或提取物，包括细胞(例如，肿瘤细胞)和生理性液体，实例如全血，血浆，血清，腹膜液，腹水等。样本可来自动物，优选哺乳动物，最优选人中获得。样本可以通过任何方法进行预处理和/或以任何方便的不干扰测定的介质来制备。样本可在使用前预处理，例如由血液制备血浆、稀释粘性流体，向样本如尿液等中施加一种或多种蛋白酶抑制剂等。样本处理可包括过滤、蒸馏、萃取，浓缩、干扰组分的灭活、试剂的添加等。

本发明的膀胱癌生物标志物包括所有同源物，天然存在的等位基因变体，亚型和人或非人类分子的前体。在一般情况下，人类生物标志物的天然存在的等位基因变体将与其他序列具有显著的序列同源性(70-90％)。等位基因变体可以含有保守氨基酸取代或可以含有一种来自同源物对应位置氨基酸的取代。

术语“受试者”和“患者”可以在本文可互换使用，指温血动物，例如哺乳动物，其可能受癌症的折磨，如膀胱癌。受试者可以是男性或女性。该术语包括小鼠，大鼠，狗，猫和马。该术语还包括灵长类如猿，黑猩猩，猴子和人类。

检测受试者尿液中本发明的膀胱癌生物标志物的试剂是与核酸或核酸编码的多肽分子相互作用或结合的那些试剂。这种试剂(在此也称为结合剂)的实例包括但不限于，抗体或其结合多肽的片段、多肽的结合配体以及与编码多肽的核酸分子杂化的核酸分子。优选地，结合剂标记有可检物质(例如可检部分)。结合剂本身可以作为标签。

本发明还考虑生物标志物抗体的检测。因此，本发明受试者尿液中的生物标志物抗体的检测可帮助膀胱癌的诊断，并且构想在本发明的范围内。

抗体，与表2-9列出的生物标志物特异性反应，例如酶缀合物或标记衍生物，可用于检测各种生物样本中的生物标志物。例如，它们可以在任何已知的免疫测定法中使用，免疫测定法依赖于蛋白质的抗原决定簇和抗体间的结合相互作用。该类测定的实例是放射免疫测定，酶免疫测定法(例如，ELISA)，免疫荧光，免疫沉淀，乳胶凝集法，红细胞凝集，和组织化学测试。

本发明的生物标志物的特异抗体可标记有可检物质并基于可检测物质的存在定位于例如尿液的生物样本中。可检物质的实例包括，但不限制于下面的放射性同位素(例如，³H、¹⁴C、³⁵S、¹²⁵I、¹³¹I)、荧光标记(例如，FITC，罗丹明，镧系磷光体)、发光标记如鲁米诺；酶标记(例如，辣根过氧化物酶，β-半乳糖苷酶，萤光素酶，碱性磷酸酶，乙酰胆碱酯酶)、生物素基团(其可以通过标记的抗生物素蛋白检测，例如包含荧光标记或酶促活性的链霉亲和素可通过光学或量热法来检测)、由次级报告基因识别的预先确定的多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、二次抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)。间接方法也可以采用，其中初级抗原抗体反应通过对生物标志物的抗体有特异性的第二抗体的引入被扩增。例如，如果有对生物标志物的特异性的抗体是兔IgG抗体，第二抗体可以是标记有可检测物质的山羊抗兔γ-球蛋白。

虽然通过例举呈现的方式针对本文选定的实施方式进行了描述，但根据上述教导，本领域的技术人员显然明白还有许多变化和修改。因此可以理解的是，在本说明书所附和支持的权利要求的保护范围内，本发明可以不同于具体描述的方式进行。

Claims (45)

1.一种用于诊断受试者中泌尿生殖器相关癌症的方法，其中所述方法包括：

确定生物样本中一个或多个生物标志物的存在或存在水平，其中所述生物标志物选自CA9（碳酸酐酶IX）、MMP9（基质金属蛋白酶9）、MMP10（基质金属蛋白酶10）、PAI-1（纤溶酶原激活物抑制剂-1，也称为丝氨酸蛋白酶抑制剂El）、AG（血管生成素）、VEGF（血管内皮生长因子）、多配体聚糖（配体蛋白聚糖）、A1AT（α-1抗胰蛋白酶原）、IL-8（白介素8）、载脂蛋白E（载脂蛋白E）和CD44；

其中生物样本中所述一个或多个生物标志物的存在，或与对照样本相比所述一个或多个生物标志物的升高水平，表明受试者具有泌尿生殖器相关的癌症。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述泌尿生殖器相关的癌症为膀胱癌。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物样本是尿液。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者是人。

5.根据权利要求1所述的方法，其中生物样本中的一个或多个生物标志物的存在或存在水平由蛋白质水平决定。

6.根据权利要求3所述的方法，包括：

（a） 使生物样本与结合所述生物标记物蛋白质的结合剂接触以形成复合物；

（b）检测所述复合物；和

（c）使检测到的复合物与所述样本中的生物标志物蛋白质的用量相关联。

7.根据权利要求3所述的方法，其中结合剂固定在载体上。

8.根据权利要求3所述的方法，其中所述结合剂是单克隆抗体或多克隆抗体。

9.根据权利要求3所述的方法，其中步骤（b）中的检测还包括连接或结合标签到结合剂上。

10.根据权利要求3所述的方法，其中通过酶联免疫吸附试验（ELISA）测定所述生物标志物蛋白质的水平。

11.根据权利要求1所述的方法，还包括至少一个检测和定量生物样本中或不同的生物样本中泌尿生殖器相关癌症类型的至少一个附加的生物标志物。

12.根据权利要求1所述的方法，还包括至少一个检测和定量生物样本中或不同生物样本中不同癌症类型的至少一个附加的生物标志物。

13.根据权利要求1所述的方法，其中在癌症治疗之前，之中和之后的至少一个，作为受试者监测的一部分，在多个时间点或时间间隔进行检测和测量中的至少一个。

14.根据权利要求1所述的方法，还包括将生物样本中的一个或多个生物标志物的水平与正常对照样本中存在的至少一个生物标志物的水平比较，其中与正常对照样本中的水平相比，样本中有更高水平的生物标志物表示了癌症的存在。

15.根据权利要求1所述的方法，其中在检测泌尿生殖器相关癌症的生物标志物的时候，受试者不表现出癌症的症状。

16.根据权利要求1所述的方法，其中在检测泌尿生殖器相关癌症的生物标志物的时候，受试者表现出一个或多个癌症的症状。

17.根据权利要求1所述的方法，其中生物样本中一个或多个生物标志物的存在或存在水平以核酸水平确定。

18.根据权利要求15所述的方法，其中生物标志物的存在或存在水平通过使生物样本与核酸接触确定，所述核酸杂交编码蛋白质生物标志物或其部分的核酸分子。

19.根据权利要求16所述的方法，其中所述结合剂标记有放射性标记、荧光标记、酶、化学发光标记或比色标记中的至少一个。

20.根据权利要求16所述的方法，其中核酸杂交是Northern印迹分析、斑点印迹、Southern印迹分析、荧光原位杂化（FISH）和聚合酶链式反应（PCR）分析中的至少一个。

21.根据权利要求18所述的方法，其中PCR是逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和定量PCR中的至少一个。

22.根据权利要求1所述的方法，还包括治疗癌症。

23.根据权利要求1所述的方法，还包括确定所述受试者的预后。

24.根据权利要求23所述的方法，其中一个或多个癌症生物标志物的高水平表明了癌症的更恶劣的或更转移性的形式。

25.根据权利要求24所述的方法，还包括治疗癌症的形式。

26.一种用于监测、检测或诊断泌尿生殖器系统相关癌症的试剂盒，所述试剂盒包括在一个或多个容器中的用于检测或定量表4-10中列出的生物标志物存在的一种或多种试剂。

27.根据权利要求26所述的试剂盒，其中所述生物标志物选自CA9（碳酸酐酶IX）、MMP9（基质金属蛋白酶9）、MMP10（基质金属蛋白酶10）、PAI-1（纤溶酶原激活物抑制剂-1，也称为丝氨酸E1）、ANG（血管生成素）、VEGF（血管内皮生长因子）、多配体聚糖（配体蛋白聚糖）、A1AT（α-抗胰蛋白酶原）、IL-8（白介素8）、载脂蛋白E（载脂蛋白E）和CD44。

28.根据权利要求26所述的试剂盒，还包括用于从受试者收集生物样本的容器。

29.根据权利要求26所述的试剂盒，用于检测膀胱癌。

30.一种用于检测受试者中膀胱癌的方法，所述方法包括确定受试者生物样本中的生物标志物（表4-10）存在和测量其中多个组生物标志物的浓度水平中的至少一个，其中生物标志物的存在和生物标志物的浓度水平中的至少一个表明了受试者中癌症的存在与否。

31.根据权利要求28所述的方法，其中确定和测量步骤中的至少一个包括：（a）使生物样本与结合到生物标志物的结合剂接触，以形成复合物；（b）检测所述复合物和（c）使检测到的复合物与样本中的生物标志物用量相关联。

32.根据权利要求29所述的方法，其中复合物检测步骤包括：提供连接到或结合到结合剂或生物标志物上的标签或使用基于ELISA的免疫酶检测。

33.根据权利要求28所述的方法，还包括将生物样本中一个或多个生物标志物的水平与正常对照样品中存在的至少一个生物标志物的水平进行比较，其中与正常对照样本中的水平相比，样本中有高水平的生物标志物表明了癌症的存在。

34.根据权利要求28所述的方法，还包括提供用于生物样本的尿液。

35.根据权利要求28所述的方法，还包括治疗癌症。

36.一种用于监测、检测或诊断膀胱癌的试剂盒，所述试剂盒包括在一个或多个容器中的用于检测或定量生物标志物存在的一种或多种试剂。

37.根据权利要求34所述的试剂盒，还包括用于从受试者收集生物样本的容器。

38.一种用于检测受试者中膀胱癌的方法，所述方法包括确定受试者生物样本中的生物标志物（表4-10）存在和测量其中生物标记物的浓度水平中的至少一个，其中生物标志物的存在和生物标志物的浓度水平中的至少一个表明了受试者中癌症的存在与否。

39.根据权利要求36所述的方法，其中确定和测量步骤中的至少一个包括：（a）使生物样本与结合到生物标志物的结合剂接触，以形成复合物；（b）检测所述复合物和（c）使检测到的复合物与样本中的生物标志物用量相关联。

40.根据权利要求37所述的方法，复合物检测步骤包括：提供连接到或结合到结合剂或生物标志物上的标签或使用基于ELISA的免疫酶检测。

41.根据权利要求36所述的方法，还包括将生物样本中一个或多个生物标志物的水平与正常对照样品中存在的至少一个生物标志物的水平进行比较，其中与正常对照样本中的水平相比，样本中有更高水平的生物标志物表明了癌症的存在。

42.根据权利要求36所述的方法，还包括提供用于生物样本的尿液。

43.根据权利要求36所述的方法，还包括治疗癌症。

44.一种用于监测、检测或诊断膀胱癌的试剂盒，所述试剂盒包括在一个或多个容器中的用于检测或定量表4-10中列出的生物标志物存在的一种或多种试剂。

45.根据权利要求42所述的试剂盒，还包括用于从受试者收集生物样本的容器。