JP2016505142A - 癌診断における血小板バイオマーカー - Google Patents

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Abstract

本態様は、一般的に、癌診断の分野に関する。より具体的には、態様は、癌または癌進行の診断のために、ならびに予後および治療改善のために用いられる、血小板由来バイオマーカーに関する。【選択図】図１

Description

本態様は、一般的に、癌診断の分野に関する。より具体的には、該態様は、癌診断に用いる血小板バイオマーカーに関する。
癌は、医学的には悪性新生物として知られ、制御されない細胞増殖に関与する、疾患の広い群である。癌において、細胞は調節不能に分裂し、そして増殖し、悪性腫瘍を形成し、そして体の近傍部分に浸潤する。癌はまた、リンパ系または血流を通じて、体のより遠い部分にも広がりうる。すべての腫瘍が癌性ではなく；良性腫瘍は近傍組織に浸潤せず、そして体全体に広がらない。ヒトが罹患する、２００を超える既知の癌がある。
癌は、特定の徴候および症状の存在、スクリーニング試験、または医学的画像法を含む、多くの方法で検出可能である。ありうる癌が検出されたら、通常、組織生検由来の組織試料の顕微鏡検査によって診断される。早期の癌の検出および診断は、治療転帰および生存に関しては、特に非常に悪性である腫瘍に関しては、非常に重要である。
癌腫は、当該技術分野においてしばしばまた上皮癌とも称され、ヒトにおいて生じる悪性新生物（癌）の最も一般的なタイプであり、推定上の上皮細胞由来の腫瘍組織であって、該上皮細胞のゲノムは、細胞が形質転換し、そして異常な悪性特性を示し始める度合いまで、改変されるかまたは損傷を受けている。癌腫は、細針吸引（ＦＮＡ）、コア針生検、または外科的生検を含む、生検を通じて診断可能である。細胞または組織構造特性ならびに組織特異的バイオマーカーパターンを同定するには、病理学者による顕微鏡検査が必要である。
増加する証拠によって、ありうる癌の診断生検が、腫瘍細胞播種および続いて遠位転移を誘導しうることが示されている。したがって、有害な腫瘍組織サンプル採取生検法を、腫瘍組織を傷つけて癌が広がる原因とならないが、なお早期に癌を検出しそして診断する可能性を有する診断法によって置き換える、緊急の必要性がある。したがって、癌および癌状態を、患者に優しく、単純でそしてリスクを伴わずに検出および診断する必要がある。特に、最も悪性である癌、卵巣癌、膵臓癌および結腸直腸癌に関しては、生命を救うために、早期の非侵襲性診断を実行可能であることが非常に望ましい。また、前立腺生検の採取は特に問題があるため、非侵襲法で悪性前立腺癌を診断することが可能であれば、非常に有益であろう。これらの癌はすべて、典型的には癌腫、すなわち上皮細胞起源の癌と分類される。
卵巣癌は、卵巣から生じる癌性増殖であり、推測される癌は、腹腔を調べる手術、生検および腹水中の癌細胞の検出で確認される必要がある。これらの方法は、患者にとって厄介であり、かつ危険性がある。無症候性に発展するため、卵巣癌はしばしば、進行した段階で診断され、予後は劣っている。癌および癌状態を確認可能である容易に実行される試験は、したがって、卵巣癌の診断に非常に有益であろう。
大部分の卵巣癌は、「上皮性」と分類され、そして卵巣上皮から生じる。上皮性卵巣癌（ＥＯＣ）は、婦人科悪性腫瘍すべてのうちで最も致死性であり、ＥＯＣは無症候性に発展し、そして進行した段階で検出される症例が大部分である。無症候性に増殖し、そして腹腔中に広がる悪名高い能力により、治癒的治療は達成が困難である。ＥＯＣの腫瘍マーカー（例えばＣＡ−１２５）は、今日、臨床的に使用されている。特異性が低いため、超音波および身体検査とともに、補助的な情報としてしか使用されていないが、限定された感度を提供する。ＣＡ−１２５のレベルの測定は、卵巣癌治療中の監視の際に、より大きな価値を有する。例えば、１つの研究において、ＣＡ−１２５は、骨盤内腫瘤を提示する患者の評価で用いられた。ＣＡ−１２５レベルの上昇は、卵巣癌に関して、７２％の感度および７８％の特異性（７２％の陽性予測値および７８％の陰性予測値）を有した。しかし、別の研究においては、早期段階の疾患に関する感度はわずか４０％であった（Ｓｋａｔｅｓ ＳＪら 多変量正規分布の混合物を用いて、癌抗原ＣＡ−１２５ＩＩ、ＣＡ １５−３、ＣＡ ７２−４、およびマクロファージ・コロニー刺激因子と組み合わせた際の、早期段階卵巣癌での術前感度および特異性。
術前生検および推測される癌病変の他の破裂性傷害は、ＥＯＣ蔓延の高いリスクのため、強く禁忌とされる。その代わり、専門家の婦人科超音波が、付属器腫瘤の評価において選択される方法である。しかし、多くの場合で、経験豊かな医学検査実行者であっても、決定的な答えを提供することは不可能である。
有意な進歩に到達するため、ＥＯＣの早期検出のための手段、および検出後、異なって最適化された治療のための必要条件として、良性および悪性病変を区別する手段を改善する、緊急の必要性がある。
血小板増加症は、進行性癌の患者において一般的に観察され、そして特に、非進行性ＥＯＣに関して手術した患者において、より劣った予後および早期再発と関連づけられてきている。血小板が、ホメオスタシスに関与するよりも、抗原性および免疫学的プロセスに影響を及ぼすことが可能であり、そしてそれによって、腫瘍発展に決定的に寄与しうる。
血小板のプロテオミクス分析は、抗原性因子が血小板によって隔離され、そして次いで、早期腫瘍内の活性化された内皮の部位に、特異的にこれらを放出し、そして送達しうることを示してきている。いわゆる「転移性／悪性血小板表現型」は、異なる新規診断転移性疾患の患者において観察されうる。
前立腺癌は、上皮前立腺組織において発展するタイプの癌である。今日、前立腺癌は、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）を用いて診断される。これは、単に、指標法であり、そして悪性癌に特異的ではない。この事実によって、確認診断のために、常に多数の生検が採取される。生検採取は患者にとって不快であり、そして深刻な副作用と関連すると報告されている。患者によっては、生検からの影響として、敗血症のため、同じ日に救急室で受診することすらある。性的不能はまた、さらに頻繁な副作用である。最も危険なより長期の影響は、生検中に前立腺から癌細胞が実際に漏れ出すことである。これらの癌細胞は、次いで、広がり、そして潜在的に転移を引き起こす。前立腺癌において、約７０％が悪性度が低く、そして即時または侵襲性の治療を必要としない。したがって、癌を示すことが可能であり、そしてまた低い悪性度のものから高い悪性度のものを区別可能でもある試験が非常に探し求められている。本発明の範囲内で、これらの基準を達成可能な試験を提供する。前立腺癌の世界的発生数は、年間約９０万人である。本発明の試験を用いて、これらのすべてを試験すると、年間約６０万人が、不快でそして潜在的に有害な生検を用いて試験される必要がなくなるであろう。したがって、生検の必要性を伴わずに前立腺癌を診断する方法が望ましい。
膵臓癌は、膵臓を形成する組織中に生じる形質転換細胞から派生する悪性新生物である。膵臓癌の９５％を占める、最も一般的なタイプは、膵臓の外分泌構成要素内に生じる腺癌（光学顕微鏡上で、腺状構造を示す腫瘍）である。少数は膵島細胞から生じ、そして神経内分泌腫瘍と分類される。最終的に診断を導く徴候および症状は、腫瘍の位置、サイズ、および組織タイプに応じ、そしてこれには、腹痛、腰痛、および黄疸（腫瘍が胆管を圧迫する場合）、説明できない体重減少、ならびに消化管の問題が含まれうる。膵臓癌は、米国において、癌関連死の４番目に一般的な原因であり、そして世界中では８番目である。膵臓癌は、予後が非常に劣っており：すべての病期を合わせると、１年および５年相対生存率は、それぞれ２５％および６％であり；局所疾患に関しては、５年生存率はおよそ１５％であり、一方、併せて個体の８０％以上に相当する、局所進行性疾患および転移性疾患に関しての生存中央値は、それぞれ、約１０ヶ月および６ヶ月である。しかし、個体は多様であり、あるものはすでに末期的に病気が重くなってからしか診断されず、そしてしたがって数日または数週しか残されていない。他の患者は、進行がより遅く、そして手術が可能でなかったとしても、数年生存が可能である。男性は女性よりも３０％より膵臓癌に罹患しやすい。
膵臓癌は、世界中で最も致死的な悪性腫瘍の１つであり、そしてしたがって、早期検出のための改善されたスクリーニングツールに関する緊急の要求がある。現在、早期腫瘍段階での手術の成功のみが治癒的療法であるため、早期段階での膵臓癌の診断は非常に重要である。膵臓腫瘍患者のわずか１０〜３０％が治癒的な意図で手術され、そしてこれらのうち、半数のみが実際にＲ０切除を受ける。さらなる補助化学療法を伴うＲ０切除患者の予期される５年生存率は、約４〜２６％である。
早期検出のための診断試験は、ここで、非常に求められている。課題は、体内での癌の開始および治療の開始が手遅れになる前の間に、時間ウインドウがあるかどうかを発見することである。このウィンドウが十分に大きければ、診断法は非常に価値がある。疾患が非常に悪性であり、そして浸潤性であるため、好ましくは生検を採取する有害な方法を伴わずに、膵臓癌を早期に診断する方法が発見されることが非常に望ましい。
結腸直腸癌はまた、結腸癌、直腸癌、または腸癌としても知られ、結腸または直腸（大腸の部分）、または虫垂における制御されない細胞増殖から生じる癌である。遺伝子分析によって、本質的に結腸および直腸腫瘍は、遺伝的に同じ癌であることが示されている。結腸直腸癌の症状には、ときに体重減少および排便習慣の変化を伴い、典型的には、直腸出血および貧血が含まれる。大部分の結腸直腸癌は、生活スタイルおよび加齢によって生じ、根底にある遺伝的障害に関連する症例は少数に過ぎない。典型的には、腸の裏打ちで始まり、そして未治療で放置されると、その下の筋層内に増殖し、そして次いで腸壁を通じて増殖しうる。スクリーニングは、結腸直腸癌による死の可能性を減少させる際に有効であり、そして５０歳で開始し、そして７５歳になるまで続けることが推奨される。局在腸癌は、通常、Ｓ状結腸鏡検査または大腸内視鏡検査を通じて診断される。結腸壁内に限局される癌は、しばしば、手術によって治癒可能であるが、体に広範囲に広がった癌は、通常、治癒不能であり、そして次いで、管理は化学療法を通じた患者の生命の延長および生活の質の改善に重点を置く。結腸直腸癌は、世界中で３番目に最も一般的に診断される癌であるが、発展途上国においてより一般的である。ほぼ６０％の症例が、発展途上国で診断された。２００８年、世界中で１２３万の結腸直腸癌の新規症例が臨床的に診断され、そして６０万８０００人が死亡したと概算される。
結腸癌は、最も頻繁な悪性腫瘍の中に入り、そして世界中の癌関連死の４番目の主因である。早期段階での結腸癌の検出は、治癒的治療介入のために非常に重要である：国際対癌連合（ＵＩＣＣ）病期Ｉ腫瘍に関する５年無病生存率は９０％を超えるが、この率は、ＵＩＣＣ ＩＩＩでは６３％に減少し、そしてＵＩＣＣ ＩＶ癌腫では＜５％である。それでも、現在のスクリーニングプログラムの実行にも関わらず、これらの悪性腫瘍の約５０％が進行した腫瘍段階で検出される。結腸直腸癌は、現在、大腸内視鏡検査と組み合わせた画像化技術を用いて診断される。市場で入手可能なバイオマーカー試験があるが、これらのバイオマーカー試験はいずれも、臨床診断で使用するために十分に優れてはいない。したがって、膵臓癌を早期に、好ましくは生検を採取する、危険性が高い方法を伴わずに、診断する方法を発見することがまた、非常に望ましいであろう。
したがって、患者のより有効な治療、そしてしたがってより高い生存率を可能にするであろうため、癌の早期検出を可能にする技術に関する一般的な必要性がある。さらに、該技術を用いて、癌の進行、すなわち早期または進行段階であるかを決定することが可能であれば、早期のしばしば限局性の、または進行したしばしば散在性の悪性腫瘍は、異なる治療代替法を必要とし、そして異なる予後によって特徴付けられるため、これもまた有益であろう。
ＵＳ ８，１７３，４３３は、全身血管新生活性の関連する変化を有する臨床状態、特に、癌、炎症状態、感染、ならびに妊娠および中絶に関連する事象の早期検出を記載する。
ＵＳ ８，１７３，４３３
Ｓｋａｔｅｓ ＳＪら
癌診断内で使用可能な改善された技術を提供することが一般的な目的である。特に、癌診断のために、生検の代わりとなりうる改善された技術を提供することが目的である。
これらのおよび他の目的は、本明細書に開示する態様によって達成される。
態様の側面は、被験体が良性病変または癌腫病変に罹患しているか決定する方法に関する。該方法は、被験体由来の生物学的試料における少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーを測定する工程を含む。少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーは、α−アクチニン１（ＡＣＴＮ１）、α−アクチニン４（ＡＣＴＮ４）、ｃｒｋ様タンパク質（ＣＲＫＬ）、小胞体タンパク質２９（ＥＲＰ２９）、（ＦＥＲＭ）、フィブリノーゲン・ガンマ鎖（ＦＧＧ）、フィラミンＡ（ＦＬＮＡ）、ゲルゾリン（ＧＥＬＳ）、ミトコンドリア・ストレス−７０タンパク質（ＧＲＰ７５）、ＨＰタンパク質、熱ショックタンパク質７０ｋＤａ（ＨＳＰ７０）、熱ショックタンパク質７１ｋＤａ（ＨＳＰ７１）、インテグリン・アルファ−２ｂ（ＩＴＧＡ２Ｂ）、インテグリン・ベータ−３（ＩＴＢ３）、リボヌクレアーゼ阻害剤（ＲＩＮＩ）、癌原遺伝子チロシン−プロテインキナーゼＳｒｃ（ＳＲＣ）、チューブリン（ＴＢＢ）、チューブリン・アルファ−４Ａ鎖（ＴＢＡ４Ａ）、３−メルカプトピルビン酸イオウ転移酵素（ＴＨＴＭ）、タリン−１（ＴＬＮ１）、チューブリン・ベータ−１鎖（ＴＵＢＢ１）、ビンキュリン（ＶＣＬ）およびＷＤリピート含有タンパク質１（ＷＤＲ１）からなる群より選択される。該方法はまた、該測定に基づいて、被験体が良性病変または癌腫病変に罹患しているか決定する工程も含む。
本発明の別の側面は、被験体における良性および／または癌腫病変の存在を予測する方法に関する。該方法は、被験体由来の生物学的試料における少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーを測定する工程を含む。少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーは、ジアデノシン四リン酸（ＡＰ４Ａ）、Ｆ−アクチン・キャッピング・タンパク質サブユニット・アルファ−１（ＣＡＺＡ１）、細胞質ゾル非特異的ジペプチダーゼ（ＣＮＤＰ２）、糖タンパク質ＩＸ（ＧＰＩＸ）、白血球エラスターゼ阻害剤（ＩＬＥＵ）、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ・サブユニットＲＩＩ−ベータ（ＫＡＰ３）、プロヒビチン（ＰＨＢ）、エンドフィリン−Ｂ１（ＳＨＬＢ１）、セルピンＢ６（ＳＰＢ６）およびトロポミオシン・アルファ−１（ＴＭＰ１）からなる群より選択される。該方法はまた、該測定に基づいて、被験体における良性および／または癌腫病変の存在を予測する工程も含む。
態様のさらなる側面は、被験体における結腸直腸癌または膵臓癌の存在を予測する方法に関する。該方法は、被験体由来の生物学的試料における少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーを測定する工程を含む。少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーは、ベータ−アクチン（ＡＣＴＢ）、ＡＣＴＮ１、カスパーゼ３（ＣＡＳＰ３）、コフィリン１（ＣＬＦ１）、クラスタリン（ＣＬＵ）、ファルネシルピロリン酸シンターゼ（ＦＰＰＳ）、ＧＥＬＳ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ・オメガ−１（ＧＳＴＯ１）、熱ショックタンパク質ＨＳＰ９０−ベータ（ＨＳＰ９０ＡＢ１）、ハロ酸脱ハロゲン化酵素様加水分解酵素ドメイン含有タンパク質２（ＨＤＨＤ２）、ＩＴＧＡ２Ｂ、ＩＴＢ３、インテグリン・アルファ−６（ＩＴＧＡ６）、マレクチン（ＭＬＥＣ）、プロヒビチン（ＰＨＢ）、ＲＩＮＩ、アルファ−シヌクレイン（ＳＮＣＡ）、セルピンＢ６（ＳＰＢ６）、ＴＢＡ４Ａ、ＴＬＮ１、腫瘍感受性遺伝子１０１タンパク質（ＴＳＧ）、ＴＢＢ１、ＶＣＬおよびＷＤＲ１からなる群より選択される。該方法はまた、前記測定に基づいて、被験体における結腸直腸癌または膵臓癌の存在を予測する工程も含む。
態様のさらに別の側面は、被験体における癌腫の存在を予測する方法に関する。該方法は、被験体由来の生物学的試料における少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーを測定する工程を含む。少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーは、ＡＣＴＮ１、ＧＥＬＳ、ＩＴＧＡ２Ｂ、ＩＴＢ３、ＰＨＢ、ＲＩＮＩ、ＳＰＢ６、ＴＢＡ４Ａ、ＴＬＮ１、ＴＢＢ１、ＶＣＬおよびＷＤＲ１からなる群より選択される。該方法はまた、該測定に基づいて、前記被験体における癌腫の存在を予測する工程も含む。
態様のさらなる側面は、被験体に関する癌治療レジメン（regimen）を選択する方法に関する。該方法は、上記にしたがって、被験体が良性病変または癌腫病変に罹患しているか決定するか；上記にしたがって、被験体における良性および／または癌腫病変の存在を予測するか；上記にしたがって、被験体における結腸直腸癌または膵臓癌の存在を予測するか；あるいは上記にしたがって、被験体における癌腫の存在を予測する工程を含む。該方法はまた、被験体が良性病変または癌腫病変に罹患しているかに基づいて；被験体における良性および／または癌病変の予測される存在に基づいて；被験体における結腸直腸癌または膵臓癌の前記の予測される存在に基づいて；あるいは被験体における癌腫の予測される存在に基づいて、被験体に関する治療レジメンを選択する工程も含む。
態様は、生物学的試料に基づく、患者に優しい癌予測を可能にする。例えば血液試料を用いることによって、癌状態に関する情報を得る、この患者に優しく、そして容易な方法は、生検を採取する必要を伴わない、癌診断のための優れたツールである。本態様は、個別化された癌治療を潜在的に可能にする、安全でそして正確な診断ツールを提供するであろう。したがって、生検を採取する危険な方法の代わりに、態様の非侵襲性方法が使用可能であり、例えば良性病変および早期段階の癌腫病変の間の区別を可能にし、したがって、早期段階での悪性癌の診断の実行を可能にする。
本明細書に開示するような態様を、スクリーニング、推測される癌の臨床診断および遺伝的徴候を含む、非侵襲性癌診断のための、癌治療の追跡調査のための、そして潜在的な再発の監視のための、客観的ツールとして使用可能である。態様はまた、多様な治療レジメンとともに、コンパニオン診断法としても潜在的に使用可能である。該ツールは、悪性でありうる病変の検出のため、例えば健康な被験体および良性または悪性病変を持つ被験体の間の区別のため、癌状態の予測、決定または評価、ならびに／あるいは癌進行状態の予測、決定または評価のために使用可能である。
態様は、生物学的試料に基づく、患者に優しい非侵襲性癌状態予測を可能にする。例えば血液試料を用いることによって、癌状態に関する情報を得る、この患者に優しく、そして容易な方法は、生検を採取する必要を伴わない、癌診断のための優れたツールである。本態様は、個別化された癌治療を潜在的に可能にする、安全でそして正確な診断ツールを提供するであろう。
図面の簡単な説明
本発明は、そのさらなる目的および利点とともに、付随する図と併せて解釈される以下の説明を参照することによって、最適に理解されうる：
図１は、対照に対する、広がった癌に相当する試料の研究１Ａ由来の主成分分析（ＰＣＡ）を示す。黒いドットは広がった癌の試料に相当し、そして黒い正方形は対照に相当する。 図２は、２ＤＥゲル上の血小板タンパク質の２Ｄゲル分離の研究１からの結果を示し、同定されるスポットを示す。矢印は、同定されるバイオマーカーの位置を示す。 図３は、規準化された積分スポット体積由来の内部クオート（ｑｕｏｔｅ）の計算に基づいた、研究１Ａ由来の試料の分布を示す。アルゴリズムは、癌試料および対照の間の明確な分離を提供する。 図４は、態様にしたがった診断系の模式図である。 図５は、対照に対する、広がった癌に相当する試料の研究１Ｂ由来の部分的最小二乗（ＰＬＳ）モデルを示す。黒いドットは、広がった癌試料に相当し、そして黒い正方形は対照に相当する。 図６は、２ＤＥゲル上の血小板タンパク質の２Ｄゲル分離の研究１Ｂ由来の結果を示し、同定されるスポットを示す。矢印およびスポット番号は、同定されるバイオマーカーの位置を示す。 図７は、本発明の態様の模式的な例を示す。試料調製：血液試料を採取し、そしてそこから、連続遠心分離工程を用いて、血小板を分離する。次いで最終ペレットを−８０℃で保存するか、または直接プロセシングする。次いで、このペレットに溶解緩衝液を添加し、そして溶解しなかった細胞を遠心分離によって除去する。次いで、試料を−８０℃で保存するかまたは直接アッセイに供する。アッセイは抗体に基づき（すなわちＥＬＩＳＡまたは類似のもの）、そしてそのタイプのアッセイのための存在する装置上で実行する。次いで、装置からの読み取りを標準的コンピュータ／ソフトウェアにおいて分析する。バイオマーカーパネルの特異的分析のため、専用アルゴリズムが装置ソフトウェアに取り込まれている。 ソフトウェアモジュール：データを取り込み、そして特異的アルゴリズムによって分析する。次いで、アッセイの開発中に、患者データから構築した予測モデルに、データを比較する。予測モデルは、各新規試料に関して、０〜１の間の値を提供し、ここで＞０．５の値は癌を示し、そして＜０．５の値は良性病変を示す。この方法を用いて、標準化法を用いた局所予測データベースを連続して構築し、そしてさらに、結果を他の認定された分析実験室からの対応するデータベースに比較してもよい。 図８は、研究３および４由来の、示差的に発現されるタンパク質が（番号で）示される、代表的な２Ｄゲル画像を示す。これらのタンパク質は、結腸直腸癌および膵臓癌に罹患している患者由来の血小板で同定された。すべての同一性を表７および８に記載する。 図９は、表７に記載する同定されたバイオマーカーの示差的発現レベルに基づいて、健康な対照（正方形）および結腸直腸癌（ドット）に相当する試料（オブジェクト）間の分離の研究３由来のＰＣＡ（主成分分析）を示す。番号は、分析における装填としての個々のタンパク質スポット（変数）に相当する。 図１０は、表８に記載する同定されたバイオマーカーの示差的発現レベルに基づいて、健康な対照（正方形）および膵臓癌（ドット）に相当する試料間の分離の研究４由来のＰＣＡ（主成分分析）を示す。番号は、分析における装填としての個々のタンパク質スポット（変数）に相当する。 図１１は、候補バイオマーカーの示差的発現レベルに基づいて、健康な対照（正方形）および前立腺癌（ドット）に相当する試料（オブジェクト）間の分離のＰＣＡ（主成分分析）を示す。
本態様は、一般的に、癌診断の分野に関する。より具体的には、態様は、上皮癌予測および診断において用いられる血小板バイオマーカーに関する。
本態様は、したがって、選択した血小板由来タンパク質の組み合わせをバイオマーカーとして用いる。態様の血小板由来タンパク質を、効率的に信頼性を持ってそして安全な方式で、被験体、好ましくは哺乳動物被験体、およびより好ましくはヒト被験体の癌診断に用いてもよい。
したがって、おそらくすでに疾患の早期段階の、癌および癌状態の、特に癌腫または「上皮」癌に関する、単純で、患者に優しい、そしてリスクがない検出／診断を可能にすることが、態様の範囲内である。癌の早期検出は、患者のより有効な治療、そしてしたがってより高い生存率を可能にするため、望ましい。さらに、早期または進行段階であるか、癌の進行を決定可能であることも好適であり、これは早期、しばしば限局性の腫瘍、または進行性、しばしば散在性の悪性腫瘍は、異なる治療代替法を必要とし、そして異なる予後によって特徴付けられるためである。
該態様とは明らかに対照的に、背景セクションで言及した米国特許８，１７３，４３３は、癌検出のためのバイオマーカーとして、抗原性血小板タンパク質が使用可能であることを開示する。該文書に開示される抗原性タンパク質は、新規血管が、あらかじめ存在していた血管から形成されるプロセスに関与する。こうした新規血管は、一般的に、十分な栄養および酸素を、成長中の癌細胞に提供するため、腫瘍増殖に重要である。血管新生はまた、転移にも重要であり、すなわち転移性腫瘍が被験体体内の他の部位に伝播することを可能にする経路を提供する。
米国特許８，１７３，４３３に開示される方法は、典型的には、少なくとも２つの試料が２つの異なる時点で同じ被験体から採取されることを必要とする。２つの試料を分析し、そして血管新生タンパク質パターンを比較して、癌状態を決定するために、１つの時点から別の時点への変化を見る。
本態様は、癌診断に使用可能な血小板由来タンパク質の新規パネルに基づく。これらのパネル中に提示されるタンパク質は、驚くほど、そして米国特許８，１７３，４３３とは対照的に、抗原性タンパク質に限定されない。
本態様の血小板由来バイオマーカーは、血小板由来バイオマーカーの選択した組み合わせに応じて、癌診断の分野内の多様な診断目的に使用可能である。例えば、血小板由来バイオマーカーの選択したパネルを用いて、被験体における病変を、良性または悪性病変、好ましくは癌腫または上皮癌病変と分類してもよい。したがって、血小板由来バイオマーカーの選択したパネルを用いて、被験体が良性病変に罹患しているかまたは癌腫病変に罹患しているかを決定することも可能である。
さらに、態様の血小板由来バイオマーカーの別の選択したパネルを用いて、被験体が健康であるか、あるいは良性および／または悪性病変に罹患しているか、好ましくは良性および／または癌腫病変に罹患しているかを分類することも可能である。したがって、血小板由来バイオマーカーのこの選択したパネルを用いて、被験体における良性および／または癌腫病変の存在を予測することも可能である。
態様の血小板由来バイオマーカーの選択したパネルを、一般的な癌診断に関して、すなわち被験体が癌に罹患しているか決定する、特に癌腫に罹患しているか、例えば結腸直腸癌または膵臓癌に罹患しているか決定するために用いることも可能である。したがって、血小板由来バイオマーカーの選択したパネルを用いて、被験体における結腸直腸癌または膵臓癌の存在を予測することも可能である。態様の血小板由来バイオマーカーを用いて、被験体における癌腫の存在を予測するだけでなく、早期段階の癌腫の存在を予測することも可能である。
態様の血小板由来バイオマーカーの別の選択したパネルを癌診断に用いて、悪性病変が早期段階にあると分類することも可能である。したがって、血小板由来バイオマーカーのこのパネルを用いて、癌進行を監視し、そしておそらく、早期段階および後期段階の悪性病変の間を、そして特に早期または後期癌腫の間を区別することも可能である。したがって、血小板由来バイオマーカーの選択したパネルを用いて、被験体における早期段階の癌腫の存在を予測することも可能である。
開示する態様の理解を単純にするため、本明細書で用いる用語のいくつかを、以下に分類する。
用語「バイオマーカー」は、本明細書において、被験体由来の生物学的試料において、直接あるいは間接的に、例えば翻訳後修飾、例えばグリコシル化、フコシル化、メチル化および／またはアセチル化を含む、類似体、代謝産物、断片または分解産物を通じた、検出可能な任意のタンパク質を指す。対照被験体、例えば疾患を伴わない被験体または同じ被験体内の非疾患組織で見られる量に比較した際の、バイオマーカーの量の改変、例えば増加または減少は、被験体における癌などの疾患の存在またはリスクの指標である。バイオマーカーの類似体、代謝産物、断片または分解産物は、バイオマーカーの機能的活性を所持してもまたは所持しなくてもよい。本態様のバイオマーカーは、血小板由来バイオマーカーであり、そしてしたがって、被験体由来の生物学的試料における血小板から得られる。
用語「相対量」（または単に「量」）は、異なるマーカータンパク質の測定量に比較した、所定のマーカータンパク質の測定量を指す。すなわち、用語、所定のマーカータンパク質に関する「相対量」を用いて、規準化された量（標準の量に関して、または試料中のすべてのタンパク質の総量の割合として）、または多数のマーカータンパク質の所定のパネル内の他のタンパク質の量に比較して、記載する。
用語「改変された細胞」または「改変された組織」は、良性であるかまたは悪性であるかいずれかである可能性もある、病変または類似のものの存在または発生を指す。「改変された細胞／改変された組織／病変の発生」は、本明細書において、良性または悪性いずれかである細胞／組織／病変の発生を指す。こうした「改変された細胞／組織／病変」の予測は、したがって、被験体におけるこうした細胞／組織または病変の発生を指す。態様の選択した血小板由来バイオマーカーは、したがって、被験体が健康であるか、または被験体が改変された細胞／組織／病変に罹患しているか、すなわち良性および／または悪性病変に罹患しているかを予測するために使用可能である。血小板由来バイオマーカーは、したがって、健康な個体および何らかの種類の良性または悪性病変の発生を伴う個体の間を区別する。
用語「癌状態」は、本明細書において、状態を癌、すなわち悪性腫瘍組織または病変、あるいは状態を癌でない、すなわち良性組織または病変と定義することを指し、ここで、状態はまた、何らかの種類の病変を持つ患者に関して、「疾患状態」と称することも可能である。良性および悪性に分ける際、用語「腫瘍状態」を用いることも可能である。さらに、癌状態はまた、癌が早期であるかまたは進行性であるかにかかわらず、すなわち早期段階かまたは後期段階かに関わらず、癌の進行を指すことも可能である。したがって、態様は、癌を検出する、すなわち癌と癌でないものの間を区別するために使用可能である。癌でないものは、文脈に応じて、良性病変または完全に健康な個体のいずれであることも可能である。態様はまた、またはあるいは、癌が早期段階または後期段階であるか、癌の進行を決定し、したがって癌状態として癌の進行を決定するためにも使用可能である。予測される癌状態は、さらに、被験体の改善された予後および／または治療のために使用可能である。
用語「良性病変」または「良性組織」は、浸潤性増殖および転移性蔓延の能力を欠く、非形成異常細胞からなる病変または組織に関する。良性病変および組織はなお、健康への負の影響を生じる。
用語「悪性病変」または「癌」は、制御されない細胞分裂、浸潤性増殖、血管新生の活性化、天然細胞死、すなわちアポトーシスの機能不全によって特徴付けられ、未分化細胞から構築され、そして転移と称する遠位悪性腫瘍を形成する。転移性蔓延は、リンパ系、血管を通じて、そして卵巣癌中のように剥離によって、起こる。
用語「健康な対照」または「ＨＣ」は、本明細書において、進行中の感染または疾患の徴候がない健康な被験体に同等である。健康な対照は、良性または悪性病変を持たない。
用語「対照」には、本明細書において、良性病変を有する「良性対照」または「ＢＣ」が含まれる。
用語「早期段階」の癌は、それほど多くは広がっていないか、または前記の早期癌に罹患した患者にそれほどひどく影響を及ぼしていない癌を指す。癌腫、すなわち例えば卵巣癌、前立腺癌、結腸直腸癌および膵臓癌を含む上皮癌に関して、一般的に、４つ（Ｉ〜ＩＶ）の等級または段階が、癌および癌進行の段階を分類するために用いられる。早期段階の癌腫には、段階または等級ＩおよびＩＩの癌腫が含まれ、そして「後期段階」癌腫には、段階または等級ＩＩＩおよびＩＶ癌腫が含まれる。
用語「進行した」癌または「後期段階」癌は、広がっているか、または前記の進行した癌に罹患した被験体に非常に影響を及ぼす癌を指す。癌腫に関して、後期段階癌腫には、段階または等級ＩＩＩおよびＩＶ癌腫が含まれる。後期段階癌は、時にまた、「蔓延」または「播種」とも称される。
用語、上皮卵巣癌（ＥＯＣ）の「局所腫瘍」または「ＬＣ」は、しばしば、段階ＩおよびＩＩを含むＥＯＣの早期段階に同等に用いられ、そして用語、ＥＯＣの「広がった腫瘍」または「ＳＣ」は、しばしば、段階ＩＩＩおよびＩＶを含む後期段階ＥＯＣに同等に用いられる。局所癌または腫瘍は、本明細書において、一般的に、被験体の体の１つの部位に存在する癌または腫瘍を指す。この腫瘍は、好ましくは、被験体の体の他の部位に広がっていない。広がったまたは散在した癌または腫瘍は、転移の存在によって特徴付けられる。
用語「癌腫」、すなわち上皮癌は、特定の組織の表面（上皮）から生じると考えられる癌を指す。こうした癌には、卵巣癌、前立腺癌、結腸直腸癌および膵臓癌が含まれる。
用語「癌診断」、「診断する」または「診断」は、本明細書において、被験体が疾患、例えば癌、例えば卵巣癌、前立腺癌、結腸直腸癌または膵臓癌に罹患している可能性もある徴候を提供することを指す。こうした技術はいずれも完全ではなく、そしてこうした診断は、身体検査、画像法、組織試料の組織学的検査などの他の手技によって確認可能であることが認識される。診断は、本病変が良性または悪性であるかを予測することも可能である。診断はまた、癌であるかまたは癌ではない被験体を診断することも可能であり、ここで癌ではない状態は、良性病変または病変なし（健康な被験体）であってもよい。
用語「癌予測」は、試験された被験体が癌疾患を有する可能性を予測することを指す。予測は、例えば、癌または癌でない状態のいずれであってもよい。予測は、典型的には、完全には確かではないが、妥当なシナリオまたは徴候を生じる。
用語「癌治療レジメン」は、方法および投薬（療法）に関して、存在する疾患または障害に関して、患者をどのように治療するかを指す。この場合、被験体に関して、予測される癌状態が癌である場合、被験体のために抗癌治療レジメンを選択する。こうした抗癌治療レジメンの限定されない例には、化学療法、手術および／または放射線照射が含まれる。被験体に関して予測される癌状態が癌でない状態（健康または良性）を示す場合、一般的に、癌治療レジメンはまったく必要ではない。この態様において、治療レジメンの選択は、癌状態に基づいて、抗癌治療レジメンまたは非抗癌治療レジメンを選択する工程を含む。
本明細書において、用語「被験体」および「患者」は、交換可能に用いられる。本明細書において、被験体は動物、好ましくは哺乳動物、例えば非霊長類、例えばウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラット等、あるいは霊長類、例えばサル、例えばアカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）、カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）またはチンパンジー（ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅ）、およびヒト、そして最も好ましくはヒトである。
本態様のタンパク質パネルは、被験体における良性および／または悪性病変の発生を決定し、被験体における良性および悪性病変の間を区別し、そして／または被験体における悪性病変の癌段階を予測することを含めて、被験体における癌状態を予測するために使用可能である。被験体における良性および／または悪性病変の発生は、存在していてもよく、すなわち被験体が良性および／または悪性病変に罹患していてもよく、あるいは存在していなくてもよく、すなわち健康な個体であってもよい。血小板由来バイオマーカーはしたがって、健康な被験体、ならびに何らかの種類の改変された組織、良性および／または悪性病変（単数または複数）に罹患している被験体の間を区別するために使用可能である。
癌状態は、例えば、存在する改変された組織の状態を癌、すなわち悪性病変と、または状態を癌ではない、すなわち良性病変と定義することを指す。血小板由来バイオマーカーは、したがって、良性病変を伴う被験体および悪性病変（癌）に罹患している被験体の間を区別するために使用可能である。癌状態のこの予測はまた、癌診断と称されることも可能であり、したがって、被験体の病変を良性または悪性と診断する。
さらに、癌状態はまた、癌の進行を指し、ここで、ありうる状態は、早期または後期段階癌である。したがって、血小板由来バイオマーカーは、早期段階の癌を有する被験体、および後期段階の癌に罹患している被験体の間を区別するために使用可能である。これはまた、癌進行状態の予測とも称されうる。
したがって、態様は、癌を検出する、すなわち癌および良性組織（癌ではない）の間を区別するために使用可能である。該態様はまた、またはあるいは、癌が早期段階または後期段階であるか、癌の進行を決定し、したがって癌状態として癌の進行を決定するためにも使用可能である。予測される癌状態は、さらに、被験体の改善された予後および／または治療のために使用可能である。
態様の特定の利点は、非常に悪性である癌を早期に診断する、すなわち、被験体が小さいまたはよく限局された病変を有するか決定し、そしてこれを非侵襲性に行うことが可能であることである。こうした非常に悪性である癌には、卵巣癌、膵臓癌、および結腸直腸癌が含まれる。また、生検の必要性なしに前立腺癌を診断可能であることは、態様の利点である。
本態様は、癌診断において有用な、血小板中の特異的プロテオームパターンを提供する。本明細書に提示する態様は、生物学的試料、例えば血液試料または他の血小板含有生物学的試料に基づいて、癌の、患者に優しい検出、予測および診断を可能にする。生物学的試料を用いることによって、疾患に関する情報を得る、この患者に優しくそして容易な方法は、組織生検の必要性を伴わない、癌診断法のための優れたツールである。本態様は、最小限の外傷およびそれと同時に、より正確な診断法を提供するであろう。例えば、生検の代わりに血液試料を使用するとまた、癌細胞を血液系に植え付けるリスクがなく、したがって疾患進行に診断が寄与する危険性を回避し、そして患者が今日の試料収集中に経験しうる外傷を回避するという利点も有するであろう。
多様な態様を論じる前に、態様で用いられる多様な血小板由来バイオマーカーの短い考察を以下に続ける。
ＡＣＴＢ、ベータ−アクチンは、ヒトにおいて同定されてきている６つの異なるアクチン・アイソフォームの１つである。これは、２つの非筋肉細胞骨格アクチンの１つである。アクチンは、細胞運動、構造および完全性に関与する、非常に保存されたタンパク質である。
ＡＣＴＮ１、αアクチニン１は、ヒトにおいて、ＡＣＴＮ１遺伝子にコードされる。アルファ・アクチニンは、異なる細胞タイプで多数の役割を持つ、細胞骨格タンパク質およびアクチン結合タンパク質である。非筋肉細胞において、細胞骨格アイソフォームは、微小繊維束および接着型ジャンクションに沿って見られ、膜に作用する結合に関与する。
ＡＣＴＮ４、αアクチニン４、Ｑ９６ＢＧ６に関しては、ＡＣＴＮ１に関する上記のアルファ・アクチニンの一般的な情報を参照されたい。
ＡＰ４Ａ、ジアデノシン四リン酸はまた、ビス（５−ヌクレオシル）−テトラホスファターゼ、Ｐ５０５８３とも称され、推定上のアラーモンであり、天然に遍在性であり、細菌からヒトまでのすべてに共通である。アデノシンポリリン酸は、多数の生理学的影響を誘導可能である。二次メッセンジャーとしての分子の役割は、最近、ＬｙｓＲＳ−Ａｐ４Ａ−ＭＩＴＦシグナル伝達経路において発見されてきている。該分子はＡｐ４Ａを非対称に加水分解して、ＡＭＰおよびＡＴＰを生じる。ホメオスタシス維持に主要な役割を果たす（研究１Ｃに記載される）。
ＣＡＳＰ３、カスパーゼ３は、システイン−アスパラギン酸プロテアーゼ（カスパーゼ）ファミリーのメンバーである。カスパーゼの連続活性化は、細胞アポトーシスの実行期に中心的な役割を果たす。カスパーゼは不活性プロ酵素として存在し、保存されたアスパラギン酸残基でタンパク質分解的プロセシングを経て、大および小の２つのサブユニットを生じ、これらが二量体化して活性酵素を形成する。このタンパク質は、カスパーゼ６および７を切断し、そして活性化し；そして該タンパク質自体は、カスパーゼ８、９、および１０によってプロセシングされ、そして活性化される。
ＣＡＺＡ１、Ｆ−アクチン・キャッピング・タンパク質サブユニット・アルファ−１、Ｐ５２９０７は、Ｃａ２＋独立方式で、アクチンフィラメントの迅速に成長する端（反矢じり端）に結合し、それによってこれらの端でサブユニットの交換を遮断する。他のキャッピング・タンパク質、例えばゲルゾリンおよびセベリンとは異なり、これらのタンパク質は、アクチンフィラメントを切断しない。
ＣＬＦ１、コフィリン１は、広く分布する細胞内アクチン調節タンパク質であり、繊維状Ｆ−アクチンに結合し、そしてこれを脱重合させ、そしてｐＨ依存方式で単量体Ｇ−アクチンの重合を阻害する。該分子は、細胞質から核へのアクチン−コフィリン複合体の転位置に関与する。
ＣＬＵ、クラスタリンはまた、アポリポタンパク質Ｊとも称され、細胞破片のクリアランスおよびアポトーシスに関与する、７５〜８０ｋＤａのジスルフィド連結ヘテロ二量体タンパク質である。このタンパク質はいくつかの同義語を有する：二量体酸性糖タンパク質（ＤＡＧタンパク質）、テストステロン抑制前立腺メッセージ−２（ＴＲＰＭ−２）、硫酸化糖タンパク質−２（ＳＧＰ−２）および補体溶解阻害剤（ＣＬＩ）。
ＣＮＤＰ２、細胞質ゾル非特異的ジペプチダーゼ、Ｑ９６ＫＰ４は、Ｌ−カルノシンを含む多様なジペプチドを加水分解するが、Ｃｙｓ−Ｇｌｙに強い優先性を有する。アイソフォーム２は、肝細胞癌腫（ＨＣＣ）細胞における腫瘍抑制剤として役割を果たしうる。
ＣＲＫＬ、ｃｒｋ様タンパク質、Ｐ４６１０９は、細胞内シグナル伝達を仲介しうる。Ｃｒｋタンパク質の制御不全が、癌を含むヒト疾患、および病原体感染に対する感受性と関連することを示す証拠が増えてきている。
ＥＲＰ２９、小胞体常在タンパク質２９、Ｐ３００４０は、おそらく小胞体（ＥＲ）中のタンパク質のフォールディングに関与することによって、ＥＲ内の分泌性タンパク質のプロセシングに重要な役割を果たす。タンパク質ジスルフィド−イソメラーゼ・ファミリーに対する配列類似性があるが、ジスルフィド・イソメラーゼであるようではない。
ＦＥＲＭ、フェルミチン（ｆｅｒｍｉｔｉｎ）・ファミリーメンバー３はまた、ＦＥＲＭＴ３、キンドリング−３、ＭＩＧ２様タンパク質またはｕｎｃ−１１２関連タンパク質２とも称され、インテグリンに結合し、そして活性化する能力および機能を有する。フェルミチン・ファミリーメンバーは、一般的に、細胞接着、遊走、分化および増殖に役割を有する。ＦＥＲＭは、ホメオスタシスおよび血栓症の制御に重要な役割を有する。このタンパク質はまた、赤血球の膜骨格の維持を補助しうる。
ＦＩＢＧ、フィブリノーゲン・ガンマ鎖、またはＦＧＧは、二重の機能を有する：フィブリンに重合する単量体を生じ、そして血小板凝集において補因子として作用する。血液由来糖タンパク質であるフィブリノーゲンのガンマ構成要素は、非同一ポリペプチド鎖の３対の１つである。血管傷害後、フィブリノーゲンは、トロンビンによって切断されて、血餅中で最も豊富な構成要素であるフィブリンを形成する。さらに、フィブリノーゲンおよびフィブリンの多様な切断産物は、細胞接着および蔓延を制御し、血管収縮性または走化性活性を示し、そしていくつかの細胞タイプにとってはマイトジェンである。
ＦＬＮＡ、フィラミンＡはまた、フィラミン・アルファおよび作用性結合タンパク質２８０（ＡＢＰ−２８０）とも称され、細胞に構造を与え、そして形状および動きを変化させる、タンパク質フィラメントのネットワーク（細胞骨格）を構築するのを補助する。ＦＬＮＡは、アクチンと呼ばれる別のタンパク質に結合し、そしてアクチンが細胞骨格を構成するフィラメントの分岐ネットワークを形成するのを補助する。ＦＬＮＡはまた、アクチンを多くの他のタンパク質に連結し、骨格および脳発生制御、血管形成、ならびに血液凝固を含む、細胞内の多様な機能を実行する。細胞骨格のリモデリングは、細胞形状および遊走の調節の中心である。ＦＬＮＡは、インテグリン、膜貫通受容体複合体および二次メッセンジャーと相互作用することによって、アクチン細胞骨格の再構成を制御する、広く発現されるタンパク質である。態様において、ＦＬＮＡは、ＦＬＮＡタンパク質Ｃ末端の形である。
ＦＰＰＳ、ファルネシルピロリン酸シンターゼは、ジメチルアリルピロリン酸およびイソペンテニルピロリン酸をファルネシルピロリン酸に変換する酵素である。該酵素はまた、ファルネシルピロリン酸シンターゼまたはファルネシル二リン酸シンターゼとも称される。
ＧＥＬＳ、ゲルゾリンは、アクチン脱重合因子、Ｐ０６３９６とも称され、カルシウムに制御され、アクチンを調節するタンパク質であり、アクチン単量体またはフィラメントのプラス（または反矢じり）端に結合し、単量体交換を防止する（末端ブロッキングまたはキャッピング）。該分子はフィラメントへの単量体のアセンブリ（核形成）を促進するとともに、すでに形成されているフィラメントを切断しうる。ゲルゾリンは、繊毛形成において役割を果たす。
ＧＰＩＸ、糖タンパク質ＩＸ、Ｐ１４７７０。ＧＰＩｂ−Ｖ−ＩＸ複合体は、ｖＷＦ受容体として機能し、そして血管へのｖＷＦ依存性血小板接着を仲介する。動脈循環における、損傷を受けた血管表面への血小板の接着は、止血における非常に重要な開始事象である。ＧＰ−ＩＸは、ＧＰ−Ｉｂの膜挿入および配向を提供しうる（研究１Ｃに記載）。
ＧＲＰ７５、ミトコンドリア・ストレス−７０タンパク質はまた、ｍｔＨＳＰ７０およびＨＳＰＡ９とも称され、細胞増殖および細胞加齢の制御に関与する。該分子はまた、シャペロンとしても作用しうる。
ＧＳＴＯ１、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ・オメガ−１は、ヒトにおいてＧＳＴＯ１遺伝子によってコードされる酵素である。この遺伝子は、シータ・クラスのグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ様（ＧＳＴＴＬ）タンパク質ファミリーのメンバーをコードする。マウスにおいて、コードされるタンパク質は、小分子ストレス反応タンパク質として作用し、おそらく細胞レドックス・ホメオスタシスに関与する。このタンパク質は、デヒドロアスコルビン酸レダクターゼ活性を有し、そして酸化防止代謝の一部として、グルタチオン−アスコルビン酸サイクルにおいて機能しうる。
ＨＤＨＤ２、ハロ酸脱ハロゲン酵素様加水分解酵素ドメイン含有タンパク質２は、ヒトにおいて、ＨＤＨＤ２遺伝子によってコードされる酵素である。
ＨＰタンパク質、Ｑ６ＮＳＢ４は、ペプチダーゼＳ１ファミリーに属する。配列長は、２８１ＡＡであり、そしてＨＰタンパク質中のＡＡ３４〜２８１は、ハプトグロビン（Ｐ００７３８）中のＡＡ １５９〜４０６に対応する。
ＨＳＰ７０、熱ショック７０ｋＤａタンパク質、Ｑ５３ＨＦ２は、ＡＴＰ結合機能を有する。熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）またはストレスタンパク質は、すべての生物およびすべての生物のすべての細胞において、非常に保存され、そして存在する。選択したＨＳＰはまた、シャペロンとしても知られ、タンパク質のフォールディング／アンフォールディング、多タンパク質複合体のアセンブリ、タンパク質の正しい細胞内区画への輸送／ソーティング、細胞周期調節およびシグナル伝達、ならびにストレス／アポトーシスに対する細胞の保護において、必須の役割を果たす。
ＨＳＰ７１、熱ショックタンパク質７１ｋＤａタンパク質。
ＨＳＰ９０ＡＢ１、熱ショックタンパク質ＨＳＰ９０−ベータは、ヒトにおいて、ＨＳＰ９０ＡＢ１遺伝子によってコードされるタンパク質である。
ＩＬＥＵ、白血球エラスターゼ阻害剤はまた、ＬＥＩ、Ｐ３０７４０とも称され、好中球プロテアーゼ・エラスターゼ、カテプシンＧ、プロテイナーゼ−３、キマーゼ、キモトリプシン、およびカリクレイン−３の活性を制御する。該分子はまた、グランザイムＨの強力な細胞内阻害剤としても機能する。
ＩＴＧＡ２Ｂ（またはＩＴＡ２Ｂ）、インテグリン・アルファ−ＩＩｂはまた、ＩＴＧＡ２Ｂ、血小板糖タンパク質ＩＩｂ（ＧＰＩＩｂ）またはＣＤ４１、Ｐ０８５１４とも称され、ヒトにおいてＩＴＧＡ２Ｂ遺伝子によってコードされる。インテグリンは、アルファ鎖およびベータ鎖で構成される、ヘテロ二量体膜内在性タンパク質である。インテグリン・アルファ−ＩＩｂ／ベータ−３は、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、プラスミノーゲン、プロトロンビン、トロンボスポンジンおよびビトロネクチンの受容体である。活性化後、インテグリン・アルファ−ＩＩｂ・ベータ−３は、可溶性フィブリノーゲンの結合を通じて、血小板／血小板相互作用を引き起こす。この工程は、迅速な血小板凝集を導き、これは、破裂した内皮細胞表面を物理的に塞ぐ。
ＩＴＢ３、インテグリン・ベータ−３はまた、血小板糖タンパク質ＩＩＩａ（ＧＰＩＩＩａ）またはＣＤ６１、Ｐ０５１０６とも称される。インテグリンは、アルファ鎖およびベータ鎖で構成されるヘテロ二量体膜内在性タンパク質である。インテグリン・アルファ−Ｖ／ベータ−３は、サイトタクチン、フィブロネクチン、ラミニン、マトリックス・メタロプロテイナーゼ−２，オステオポンチン、オステオモジュリン、プロトロンビン、トロンボスポンジン、ビトロネクチンおよびフォン・ウィルブランド因子の受容体である。インテグリン・アルファ−ＩＩｂ／ベータ−３は、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、プラスミノーゲン、プロトロンビン、トロンボスポンジンおよびビトロネクチンの受容体である。活性化後、インテグリン・アルファ−ＩＩｂ／ベータ−３は、可溶性フィブリノーゲンの結合を通じて血小板／血小板相互作用を引き起こす。この工程は、迅速な血小板凝集を導き、これは、破裂した内皮表面を物理的に塞ぐ。
ＩＴＧＡ６、インテグリン・アルファ−６。インテグリンのさらなる情報に関しては、上記のＩＴＧＡ２ＢおよびＩＴＢ３を参照されたい。
ＫＡＰ３、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ・サブユニットＲＩＩ−ベータ、Ｐ３１３２３は、細胞において、ｃＡＭＰシグナル伝達に関与するｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼの制御サブユニットである。ＩＩ型制御鎖は、ＭＡＰ２キナーゼを含む係留タンパク質に結合することによって、膜会合を仲介する。
ＭＬＥＣ、マレクチンは、小胞体の炭水化物結合タンパク質であり、そしてタンパク質Ｎ−グリコシル化の初期段階の作用因子候補である。
ＰＨＢ、プロヒビチン、Ｑ６ＰＵＪ７は、ヒトにおいて、ＰＨＢ遺伝子によってコードされるタンパク質である。プロヒビチンは、それぞれ、酵母ＰＨＢ１およびＰＨＢ２に対する類似性に基づいて、Ｉ型およびＩＩ型プロヒビチンと称される２つのクラスに分けられる。各生物は、プロヒビチン遺伝子の各タイプの少なくとも１コピーを有する。ＰＨＢは、細胞増殖の負の制御因子と考えられ、そして腫瘍抑制因子でありうる。
ＲＩＮＩ、リボヌクレアーゼ阻害剤、Ｐ１３４８９は、ＲＮＡＳＥ１、ＲＮＡＳＥ２およびＡＮＧを阻害する。該分子は、レドックス・ホメオスタシスにおいて役割を果たしうる。
ＳＨＬＢ１、エンドフィリン−Ｂ１アイソフォーム１、Ｑ９Ｙ３７１は、正常ミトコンドリア外膜ダイナミクスに必要とされうる。該分子は、特定の細胞において、コートマー仲介逆行性輸送に必要とされる。該分子は、非常に湾曲した膜に他のタンパク質を補充しうる。ＳＨＬＢ１は、膜融合を促進しうる。コードされるタンパク質は、Ｂｃｌ−２ファミリーのアポトーシス促進性メンバー、Ｂｃｌ−２会合Ｘタンパク質（Ｂａｘ）と相互作用し、そしてアポトーシス・シグナル伝達経路の制御に関与しうる。このタンパク質はまた、ミトコンドリア形態の維持にも関与しうる。
ＳＮＣＡ、アルファ−シヌクレインは、リン脂質およびタンパク質と相互作用する。シナプス前終末は、シナプス小胞として知られる区画から、神経伝達物質と呼ばれる化学メッセンジャーを放出する。神経伝達物質の放出は、ニューロン間のシグナルをリレーし、そして正常な脳機能に非常に重要である。該分子は、シナプス前終末におけるシナプス小胞の供給の維持に重要な役割を果たす。該分子はまた、随意および不随意運動の開始および停止の制御に非常に重要であるタイプの神経伝達分子であるドーパミン放出の制御も補助しうる。
ＳＰＢ６、セルピンＢ６は、ヒトにおいてＳＥＲＰＩＮＢ６遺伝子によってコードされるタンパク質である。該分子は、脳に存在するかまたは血液に由来するセリンプロテイナーゼの制御に関与しうる。該分子は、カテプシンＧ、カリクレイン−８およびトロンビンの阻害剤である。ＳＰＢ６は、ストレス中のリソソーム内容物の漏洩に対する防御に、内耳中で重要な役割を果たす可能性もあり、そしてこの防御の喪失は、細胞死および感音性難聴を生じる。
ＳＲＣ、癌原遺伝子チロシンプロテインキナーゼＳｒｃ、Ｐ１２９３１は、遺伝子転写、免疫反応、細胞接着、細胞周期進行、アポトーシス、遊走、および形質転換を含む、多様な範囲の生物学的活性を制御する、シグナル伝達経路に関与する。
ＴＢＡ、チューブリン・アルファ遍在性鎖に非常に類似であるチューブリン、Ｂ３ＫＰＳ３。チューブリンは、球状タンパク質の小さいファミリーのいくつかのメンバーの１つである。チューブリン・スーパーファミリーには、５つの別個のファミリー、アルファ、ベータ、ガンマ、デルタ、およびイプシロン−チューブリンが含まれる。チューブリンファミリーの最も一般的なメンバーは、微小管を構成するタンパク質である、α−チューブリンおよびβ−チューブリンである。各々は、およそ５５キロダルトンの分子量を有する。微小管は、αおよびβ−チューブリンの二量体から組み立てられる。これらのサブユニットは、わずかに酸性であり、等電点は５．２〜５．８の間である。微小管を形成するため、αおよびβ−チューブリンの二量体は、ＧＴＰに結合し、そしてＧＴＰ結合状態の間に、微小管の（＋）端上で組み立てられる［４］。β−チューブリン・サブユニットは、微小管のプラス端上で曝露される一方、α−チューブリン・サブユニットは、微小管のマイナス端上で曝露される。二量体が微小管内に取り込まれた後、β−チューブリン・サブユニットに結合したＧＴＰの分子は、微小管原繊維に沿った二量体間接触を通じて、最終的にＧＤＰに加水分解される。チューブリン二量体のβ−チューブリン・メンバーがＧＴＰまたはＧＤＰに結合するかどうかは、微小管における二量体の安定性に影響を及ぼす。ＧＴＰに結合した二量体は、微小管に組み立てられる傾向がある一方、ＧＤＰに結合したＧＤＰはばらばらになる傾向があり；したがって、このＧＴＰサイクルは、微小管の動的不安定性に関して本質的である。
ＴＢＡ４Ａ、チューブリン・アルファ−４Ａ鎖、Ｐ６８３３６、上記ＴＢＡを参照されたい。
ＴＨＴＭ、３−メルカプトピルビン酸イオウ転移酵素はまた、ＭＰＳＴ、ＴＳＴ２、およびロダネーゼ、Ｐ５３２５とも称され、シアニドまたは他のチオール化合物に硫黄イオンをトランスファーする。該分子はまた、弱いロダネーゼ活性も有する。ＴＨＴＭはシアニドを解毒し、そしてチオ硫酸生合成に必要とされる。該分子は酸化防止剤として作用する。システイン・アミノトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）と組み合わせて、システインの異化に寄与し、そして脳、網膜および血管内皮細胞における硫化水素の重要な産生因子である。硫化水素Ｈ２Ｓは、重要なシナプス調節剤、シグナル伝達分子、平滑筋収縮因子および神経保護因子である。３ＭＳＴ／ＣＡＴ経路によるその産生は、カルシウムイオンによって制御される。
ＴＬＮ１、タリン１、Ｑ９Ｙ４９０は、おそらく、形質膜への主要細胞骨格構造の連結に関与する。該分子は、細胞基層接触領域で、そしてリンパ球において細胞−細胞接触部で、濃縮される高分子量細胞骨格タンパク質である。
ＴＰＭ１、トロポミオシン・アルファ−１、Ｆ５Ｈ７Ｓ３。トロポミオシンは、広く分布するアクチン結合タンパク質である。
ＴＳＧ、腫瘍感受性遺伝子１０１タンパク質は、ユビキチン・コンジュゲート化酵素の見かけ上不活性な相同体の群に属する。該タンパク質は、腫瘍発生に関与する細胞質ゾル・リンタンパク質であるスタスミンと相互作用するコイルドコイル・ドメインを含有する。該タンパク質は、細胞増殖および分化に役割を果たし、そして負の増殖制御因子として作用する可能性もある。
ＴＵＢＢ１チューブリン・ベータ１はまた、クラスＶＩおよびクラスＶＩベータ−チューブリン、ＱＨ４Ｂ７とも称され、ヒトにおいてＴＵＢＢ１遺伝子によってコードされる。β−チューブリンは、ヘテロ二量体化し、そして集合して微小管を形成する２つのコアタンパク質ファミリーの１つである。微小管は、有糸分裂、形態形成、血小板形成、ならびに繊毛および鞭毛の可動性を含む、非常に多様な細胞プロセスに関与する。このタンパク質は、特異的に、血小板および巨核球において発現され、そして血小板前駆細胞産生および血小板放出に関与する可能性もある。
ＶＣＬ、ビンキュリンは、ヒトにおいて、ＶＣＬ遺伝子によってコードされる。ＶＣＬは、細胞−細胞および細胞−マトリックス接合部と会合する細胞骨格タンパク質であり、そして細胞形態および自発運動において、重要な役割を果たしうる。
ＷＤＲ１、ＷＤリピート含有タンパク質１は、ヒトにおいて、ＷＤＲ１遺伝子によってコードされる。ＷＤＲ１は、一般的に、９つのＷＤリピートを含有する。こうしたＷＤリピートは、いくつかの保存された残基を含有する、およそ３０〜４０のアミノ酸ドメインである。ＷＤドメインは、一般的に、タンパク質−タンパク質相互作用に関与する。ＷＤＲ１は、アクチン・フィラメントの分解誘導を補助しうる。
態様の側面は、被験体が、良性病変または癌腫病変に罹患しているか決定する方法に関する。該方法は、被験体由来の生物学的試料における少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーを測定する工程を含む。この側面において、少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーは、ＡＣＴＮ１、ＡＣＴＮ４、ＣＲＫＬ、ＥＲＰ２９、ＦＥＲＭ、ＦＩＢＧ、ＦＬＮＡ、ＧＥＬＳ、ＧＲＰ７５、ＨＰタンパク質、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ７１、ＩＴＧＡ２Ｂ、ＩＴＢ３、ＲＩＮＩ、ＳＲＣ、ＴＢＡ、ＴＢＡ４Ａ、ＴＨＴＭ、ＴＬＮ１、ＴＵＢＢ１、ＶＣＬおよびＷＤＲ１からなる群より選択される。該方法はまた、測定に基づいて、良性病変または癌腫病変に罹患しているか決定する工程も含む。
したがって、上記に提示する群またはパネルに列挙する血小板由来バイオマーカーを用いて、被験体が良性病変または癌腫病変に罹患しているか区別することも可能である。これは、病変が良性である、すなわち一般的により有害でないか、または癌腫である、すなわち悪性であるか検証するかまたは少なくとも予測するため、病変、すなわち改変された細胞または組織を有する被験体に関して、これらの血小板由来バイオマーカーを使用可能であることを意味する。
１つの態様において、方法は、測定に基づいて、被験体が良性病変あるいは卵巣癌または前立腺癌病変に罹患しているか決定する工程を含む。
この態様において、上記に提示する血小板由来バイオマーカーの群またはパネルは、癌腫病変の好ましい例として、卵巣癌または前立腺癌病変を診断する際に使用するために特に適している。
本明細書において、さらに開示するように、実験データによって、列挙する血小板由来バイオマーカーのいくつかは、病変タイプ、すなわち良性対癌腫または悪性の決定において、他の血小板由来バイオマーカーよりも重要でありうる。６つの最も重要な、こうした血小板由来バイオマーカーには、ＥＲＰ２９、ＡＣＴＮ４、ＨＰタンパク質、ＴＬＮ１、ＳＲＣおよびＴＨＴＭが含まれる。こうした態様において、方法は好ましくは、生物学的試料において、ＥＲＰ２９、ＡＣＴＮ４、ＨＰタンパク質、ＴＬＮ１、ＳＲＣおよびＴＨＴＭからなる群より選択される少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーを測定する工程を含む。
したがって、特に、病変を良性または癌腫と分類することに関して、最も重要な情報を提供するのが、この限定される群由来の血小板由来バイオマーカーである。
別のアプローチにおいて、方法において測定される各血小板由来バイオマーカーは、診断において、その特定の血小板由来バイオマーカーの重要性に基づいて決定され、そしてこうした重要性を示す、関連する加重値を有しうる。こうした加重は、以下にさらに記載するこれらの血小板由来バイオマーカーに関して列挙されるＶＩＰ（重要性変数）ランクに基づいて決定可能である。
１つの態様において、方法は、少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーのそれぞれの量を測定する工程を含む。該方法はまた、それぞれの量を、対照被験体由来の生物学的試料におけるそれぞれの血小板由来バイオマーカーの量に相当するそれぞれの対照量と比較する工程も含む。該方法は、比較に基づいて、被験体が良性病変または癌腫病変に罹患しているか決定する工程をさらに含む。
したがって、この態様において、それぞれの対照量は、好ましくは、測定しようとする各血小板由来バイオマーカーに関して決定される。対照被験体は、良性病変に罹患しているが、いかなる癌腫病変も欠くと診断される被験体であってもよい。あるいは、対照被験体は、癌腫病変に罹患しているが、いかなる良性病変も欠くと診断される被験体であってもよい。次いで、プロファイルが対照プロファイルと一致するか決定するため、被験体由来の生物学的試料において測定される血小板由来バイオマーカーのプロファイルを、対照被験体の対照プロファイルに比較する。次いで、こうした比較を用いて、被験体におけるいかなる病変も分類することも可能である。
特定の態様において、方法は、測定に基づいて、被験体が良性病変または早期段階の癌種病変に罹患しているか決定する工程を含む。
したがって、好ましい態様において、方法を用いて、相対的に有害でない良性病変および早期段階の癌腫病変の間を区別することも可能である。一般的に、先行技術分野の技術では、良性病変および早期段階の癌腫病変、すなわち何らかの転移の形成または癌腫の少なくとも有意な蔓延の前に、区別を行うことは非常に困難である。したがって、態様は、すでに転移の前に、癌腫病変から比較的無害の良性病変を区別する、早期癌検出における価値あるツールであろう。
態様の別の側面は、被験体における良性および／または癌腫病変の存在を予測する方法に関する。該方法は、被験体由来の生物学的試料における少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーを測定する工程を含む。この側面において、少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーは、ＡＰ４Ａ、ＣＡＺＡ１、ＣＮＤＰ２、ＧＰＩＸ、ＩＬＥＵ、ＫＡＰ３、ＰＨＢ、ＳＨＬＢ１、ＳＰＢ６およびＴＭＰ１からなる群より選択される。該方法はまた、測定に基づいて、被験体における良性および／または癌腫病変の存在を予測する工程も含む。
この第二の群またはパネルにおいて、血小板由来バイオマーカーは、健康な被験体、すなわちいかなる良性または癌腫、すなわち悪性病変も欠く被験体、および良性病変、癌腫病変または良性および癌腫病変の両方を有する被験体の間を区別するために適している。
この方法は、好適には、いかなる病変も検出する最初のスクリーニングとして使用可能であり、そして次いで、任意の検出された病変が良性または癌腫であるか分類する、先に記載する側面によって補完することも可能である。
１つの態様において、方法は、測定に基づいて、被験体における良性、および／または卵巣癌または前立腺癌病変の存在を予測する工程を含む。したがって、この方法および列挙する血小板由来バイオマーカーは、癌腫の例として卵巣癌または前立腺癌と関連した使用に特に適している。
１つの態様において、方法は、生物学的試料における少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーのそれぞれの量を測定する工程を含む。該方法はまた、それぞれの量を、対照被験体由来の生物学的試料におけるそれぞれの血小板由来バイオマーカーの量に相当するそれぞれの対照量と比較する工程も含む。該方法は、比較に基づいて、被験体における良性および／または癌腫病変の存在を予測する工程をさらに含む。
この態様において、対照被験体は、好ましくは、健康な被験体、すなわちいかなる良性または癌腫病変も欠く被験体である。比較は、好ましくは、血小板由来バイオマーカーのプロファイルの比較を用いる前記に論じているものと同様に行われる。
態様のさらなる側面は、被験体における結腸直腸癌または膵臓癌の存在を予測する方法に関する。該方法は、被験体由来の生物学的試料における少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーを測定する工程を含む。この側面において、少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーは、ＣＴＢ、ＡＣＴＮ１、ＣＡＳＰ３、ＣＬＦ１、ＣＬＵ、ＦＰＰＳ、ＧＥＬＳ、ＧＳＴＯ１、ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＨＤＨＤ２、ＩＴＧＡ２Ｂ、ＩＴＢ３、ＩＴＧＡ６、ＭＬＥＣ、ＰＨＢ、ＲＩＮＩ、ＳＮＣＡ、ＳＰＢ６、ＴＢＡ４Ａ、ＴＬＮ１、ＴＳＧ、ＴＢＢ１、ＶＣＬおよびＷＤＲ１からなる群より選択される。該方法はまた、前記測定に基づいて、被験体における結腸直腸癌または膵臓癌の存在を予測する方法も含む。
したがって、この方法および列挙する血小板由来バイオマーカーを用いて、被験体が、癌腫の好ましい例として結腸直腸癌または膵臓癌に罹患していると診断することも可能である。したがって、血小板由来バイオマーカーを用いて、健康な被験体、すなわち良性または癌腫病変を伴わない被験体、および良性病変を伴う被験体を、結腸直腸癌または膵臓癌に罹患している被験体から区別することも可能である。
１つの態様において、方法は、生物学的試料において、ＡＣＴＢ、ＡＣＴＮ１、ＣＡＰＳ３、ＣＦＬ１、ＣＬＵ、ＦＰＰＳ、ＧＥＬＳ、ＧＳＴＯ１、ＨＤＨＤ２、ＩＴＧＡ２Ｂ、ＩＴＢ３、ＩＴＧＡ６、ＭＬＥＣ、ＰＨＢ、ＲＩＮＩ、ＳＮＣＡ、ＳＰＢ６、ＴＢＡ４Ａ、ＴＬＮ１、ＴＳＧ、ＴＵＢＢ１、ＶＣＬおよびＷＤＲ１からなる群より選択される少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーを測定する工程を含む。該方法はまた、測定に基づいて、被験体における結腸直腸癌の存在を予測する工程も含む。
別の態様において、方法は、生物学的試料において、ＡＣＴＢ、ＡＣＴＮ１、ＣＡＰＳ３、ＣＦＬ１、ＣＬＵ、ＦＰＰＳ、ＧＥＬＳ、ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＨＤＨＤ２、ＩＴＧＡ２Ｂ、ＩＴＢ３、ＩＴＧＡ６、ＭＬＥＣ、ＰＨＢ、ＲＩＮＩ、ＳＮＣＡ、ＳＰＢ６、ＴＢＡ４Ａ、ＴＬＮ１、ＴＳＧ、ＴＵＢＢ１、ＶＣＬおよびＷＤＲ１からなる群より選択される少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーを測定する工程を含む。該方法はまた、測定に基づいて、被験体における膵臓癌の存在を予測する工程も含む。
したがって、血小板由来バイオマーカーの本態様で使用可能な先に列挙する群のうち、２２が、結腸直腸癌および膵臓癌の両方に共通である。さらに、血小板由来バイオマーカーＨＳＰ９０ＡＢ１は、膵臓癌にユニークであるようであり、一方、ＧＳＴＯ１は結腸直腸癌にユニークであるようである。
１つの態様において、方法は、生物学的試料における少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーのそれぞれの量を測定する工程を含む。該方法はまた、それぞれの量を、対照被験体由来の生物学的試料におけるそれぞれの血小板由来バイオマーカーの量に相当するそれぞれの対照量と比較する工程も含む。該方法は、比較に基づいて、被験体における結腸直腸癌または膵臓癌の存在を予測する工程をさらに含む。
この態様において、対照被験体は、好ましくは健康な被験体、すなわちいかなる良性または癌腫病変も欠く被験体、または良性病変を有するが、いかなる癌腫病変も欠く被験体である。あるいは、対照被験体は、結腸直腸癌または膵臓癌に罹患していると診断される被験体であってもよい。比較は、好ましくは、血小板由来バイオマーカーのプロファイルの比較を用いて、前述に論じているものと同様に行われる。
さらに、態様の別の側面は、被験体における癌腫の存在を予測する方法に関する。該方法は、被験体由来の生物学的試料における少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーを測定する工程を含む。この側面において、少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーは、ＡＣＴＮ１、ＧＥＬＳ、ＩＴＧＡ２Ｂ、ＩＴＢ３、ＰＨＢ、ＲＩＮＩ、ＳＰＢ６、ＴＢＡ４Ａ、ＴＬＮ１、ＴＢＢ１、ＶＣＬおよびＷＤＲ１からなる群より選択される。該方法はまた、測定に基づいて、被験体における癌腫の存在を予測する工程も含む。
したがって、上記に列挙する血小板由来バイオマーカーのパネルまたは群は、被験体において、早期段階の癌腫を検出する、すなわち非常に早期の段階（病期ＩまたはＩＩ）で、そして転移前に、いかなるこうした癌腫瘍も検出するために使用可能である。こうした例において、方法は、測定に基づいて、被験体における早期段階の癌腫の存在を予測する工程を含む。
癌腫の早期段階のこうした検出は、態様にしたがって特に好適である。したがって、この方法を用いて、広範な転移の前に、そして癌が好ましくは単一の部位になお限定される際に、被験体において癌腫を検出することが可能である。この理由は、後期段階の癌を治療するのに比較して、早期段階の癌に対して治療を開始した際、癌治療がはるかにより成功するためである。
特定の態様において、方法は、測定に基づいて、被験体における上皮癌の存在を予測する、好ましくは、測定に基づいて、被験体における早期段階の上皮癌の存在を予測する工程を含む。
こうした癌腫および上皮癌の現在好ましい例には、卵巣癌、前立腺癌、結腸直腸癌および膵臓癌が含まれる。
態様において、方法は、生物学的試料における前記の少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーのそれぞれの量を測定する工程を含む。該方法はまた、それぞれの量を、対照被験体由来の生物学的試料におけるそれぞれの血小板由来バイオマーカーの量に相当するそれぞれの対照量と比較する工程も含む。該方法は、比較に基づいて、被験体における癌腫の存在を予測する工程をさらに含む。
対照被験体は、好ましくは、健康な被験体または良性病変に罹患している被験体である。比較は、好ましくは、血小板由来バイオマーカープロファイルの比較を用いる前記に論じているものと同様に行われる。
少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーを測定する生物学的試料は、血小板を含むいかなる生物学的試料であってもよい。本明細書において、生物学的試料は、本明細書に記載する試験の単数または複数のターゲット化合物を所持しうる被験体の体から採取したいかなる物質も指し、組織試料および生物学的液体の両方、例えば血液試料、唾液試料、尿試料等も含まれる。代表的な態様において、生物学的試料は、血液試料、抽出血小板試料等である。血液試料は、本明細書において、検出可能なレベルの血小板由来バイオマーカーを含有しうる、全血または任意のその分画（例えば血漿、血清）を指し（バイオマーカーが、前記分画を得る全血中に存在する場合）、そして特定の態様において、血漿試料または血小板試料を指す。
特定の例の態様において、方法は以下の：
ａ）被験体の生物学的試料、好ましくは血液試料から血小板を単離し；
ｂ）ａ）で単離した血小板から血小板タンパク質を抽出し；
ｃ）ｂ）で抽出した血小板タンパク質を、二次元ゲル電気泳動（２−ＤＥ）ゲル上で分離し；
ｄ）２−ＤＥゲル上で少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーを同定し；そして
ｅ）２−ＤＥゲル上、ｄ）で同定した少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーの量を測定する
工程を含む。
特定の態様において、単離工程ａ）は、１またはそれより多い、典型的には３の遠心分離工程を含む。第一の遠心分離工程において、血液試料を遠心分離して、赤血球のペレットおよび血漿を形成する。生物学的試料が血漿試料である場合、この遠心分離工程は省略可能である。第二の遠心分離において、血漿を遠心分離して、ペレット、および血小板をほとんど含まない血漿を形成する。場合による態様において、血小板が豊富であるペレットを再懸濁し、そして洗浄し、そして第三の遠心分離工程に供して、純粋な血小板が豊富なペレット、および廃棄する上清を形成する。
工程ｂ）における血小板からの血小板タンパク質の抽出を、周知の溶解および抽出法にしたがって、典型的には溶解緩衝液を用いて、実行することも可能である。生じた血小板タンパク質溶解物を、好ましくは遠心分離工程に供して、血小板タンパク質を含む上清および廃棄物ペレットを形成する。
工程ｃ）は、好ましくは等電点および質量に基づいて血小板タンパク質を分離する２−ＤＥを行う。したがって、第一の分離工程は、等電点電気泳動であり、ここで血小板タンパク質は等電点に基づいて分離される。第二の分離工程は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分子量または質量に基づいて、血小板タンパク質を分離する。
２−ＤＥゲル上の血小板タンパク質は、工程ｄ）において、適切な血小板由来バイオマーカー（単数または複数）の同定を可能にするようマークされ、そして続いて、工程ｅ）において血小板由来バイオマーカー（単数または複数）の量が測定される。多様なタンパク質マーキングプロトコルおよび方法、例えば銀染色が使用可能である。こうした場合、銀染色は、好ましくは、質量分析適合染色プロトコルを用いて行われる。次いで、染色された血小板由来バイオマーカーをスキャンして、そして少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーのそれぞれの量を、工程ｅ）において染色された２−ＤＥゲルの画像から決定してもよい。
方法工程ａ）からｅ）の変形が可能であり、そして態様の範囲内である。例えば、適切なバイオマーカー（単数または複数）を同定し、そして定量化するために、それぞれの少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーに特異的に結合する抗体を使用してもよい。酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、質量分析、パネル試験（例えば多重化Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）微小球体試験）および多重反応監視（ＭＲＭ）が、２−ＤＥの代わりにまたは２−ＤＥを補完するものとして使用可能な別のまたはさらなる技術の例である。１つのこうした代替態様を以下に記載する。
特定の例の態様において、方法は、以下の：
ａ）被験体の生物学的試料、好ましくは血液試料から血小板を単離し；
ｂ）ａ）で単離した血小板から血小板タンパク質を抽出し；
ｃ）ｂ）由来の抽出血小板タンパク質を、抗体に基づくアッセイプラットフォームに適用し、前記アッセイプラットホームには、少なくとも２つのバイオマーカーに対して向けられる抗体が含まれ；
ｄ）ｃ）由来のアッセイからシグナルを測定し；診断装置において、アルゴリズムを用いて測定されたシグナルを分析し、そして診断評価に関する転帰を提示する
工程を含む。
特定の態様において、単離工程ａ）は、１またはそれより多い、典型的には３の遠心分離工程を含む。第一の遠心分離工程において、血液試料を遠心分離して、赤血球のペレットおよび血漿を形成する。生物学的試料が血漿試料である場合、この遠心分離工程は省略可能である。第二の遠心分離において、血漿を遠心分離して、ペレット、および血小板をほとんど含まない血漿を形成する。場合による態様において、血小板が豊富であるペレットを再懸濁し、そして洗浄し、そして第三の遠心分離工程に供して、純粋な血小板が豊富なペレット、および廃棄する上清を形成する。
工程ｂ）における血小板からの血小板タンパク質の抽出を、周知の溶解および抽出法にしたがって、典型的には溶解緩衝液を用いて、実行することも可能である。生じた血小板タンパク質溶解物を、好ましくは遠心分離工程に供して、血小板タンパク質を含む上清および廃棄物ペレットを形成する。
工程ｃ）は、好ましくは、選択したアッセイタイプに適合した特異的パネルにおいて用いられるバイオマーカーに対して特異的に作製されている抗体に基づいて、多重化アッセイ型ＥＬＩＳＡ（またはＬｕｍｉｎｅｘ）を実行する。パネルは、選択した少なくとも２つのバイオマーカーに向けられる抗体からならなければならない。
工程ｄ）において、抗体およびｂ）由来の血小板タンパク質内のバイオマーカーの間の結合相互作用からのシグナルの定量的読み取りが、装置中で行われる。シグナルは、生じた蛍光シグナル、酵素反応に基づく発色、または他の生物学的リポート系由来であってもよい。次いで、シグナルを装置中でプロセシングして、そしてより具体的には、これは、選択したバイオマーカーパネルに関して特定されるようなアルゴリズムを用いたソフトウェアである。次いで、プロセシングしたシグナルの結果を、０〜１の間の値として示す。次いで、値を、特定の癌診断および癌の特定のタイプの診断で用いられる各バイオマーカーパネルに関して決定される値レベルに基づいて、判断する。所定のＰＬＳモデルによってアルゴリズムを生成し（適切な多変量ソフトウェア、例えばＳＩＭＣＡ Ｐ ｖ１３、Ｕｍｅｔｒｉｃｓ ＡＢを用いる）、そして該アルゴリズムは、ＰＬＳモデリングの技術分野における科学者に周知である方法にしたがって、０〜１の予測スコアを提供するであろう（例えば：Ｏｔｔｅｒｖａｌｄ Ｊ．ら， 多発性硬化症：新規ＣＳＦバイオマーカーの同定および臨床的評価 Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ． ２０１０． Ａｐｒｉｌ １８：７３（６）：１１１７−１１３２を参照されたい）。予測モデルは、各新規試料に関して、０〜１の間の値を提供し、ここで、＞０．５の値は癌を示し、そして、＜０．５の値は良性病変を示す。
パネル試験または多変量アッセイは、何らかの方式で関連する個々の実験室試験の群を指し、何らかの方式には、限定されるわけではないが、検出しようと設計される医学的状態（例えば癌）、標本タイプ（例えば血液）、および試験が使用する方法論（例えば、単数または複数のバイオマーカータンパク質の改変されたレベル）が含まれる。
特定の例において、方法の態様は、以下の：
ａ）被験体の生物学的試料、好ましくは血液試料から血小板を単離し；
ｂ）ａ）で単離した血小板から血小板タンパク質を抽出し；
ｃ）少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーのそれぞれの血小板由来バイオマーカーに特異的に結合するそれぞれの抗体を用いて、少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーの量を測定する
工程を含む。
本態様は、非侵襲性癌診断に、推測される癌および遺伝性徴候の臨床診断に、癌治療の経過観察に、そして潜在的な再発の監視に、そしてスクリーニングに使用する、客観的ツールとして使用可能である。診断法はまた、現在および将来の治療レジメンとともに、コンパニオン診断法として、そして早期スクリーニングのためにも、潜在的に使用可能である。ツールは、癌状態の予測／決定／評価、および／または癌進行状態の予測／決定／評価のため、悪性でありうる病変の検出に使用可能である（健康な被験体および良性または悪性病変を持つ被験体の間を区別する）。
被験体において、癌状態を予測可能である、すなわち転移が測定可能である前に、癌の早期診断が可能であり、そして良性病変を排除することが、態様の特定の利点である。
態様のさらなる利点は、被験体において、ありうる悪性病変の発生を検出するかまたは予測することである。別の利点は、ありうる悪性病変が発生した被験体において、癌（腫瘍）状態／疾患状態（良性または悪性病変）を予測することである。さらにさらなる利点は、癌進行の形で、癌状態を予測して、悪性癌を持つ被験体が疾患の早期段階または後期段階であるかを決定することである。特定の態様において、病変は被験体に存在するが、非常に小さいかまたはよく限局されているため、良性病変または早期悪性病変（腫瘍）として区別することが困難である。生検を採取する有害な方法の代わりに、態様の非侵襲性の方法を用いて、良性病変および早期悪性病変（腫瘍）の間の区別を可能にし、したがって、早期段階で悪性癌の診断を実行することも可能である。
態様の特定の利点は、診断がより後期の段階であれば、多かれ少なかれ治療不能である、非常に悪性である癌、例えば卵巣癌、膵臓癌および結腸直腸癌を早期段階で診断することが可能であることである。さらなる利点は、こうした診断を、侵襲性の方法、例えば生検採取の必要を伴わずに実行することである。特に、卵巣癌、前立腺癌、結腸直腸癌および膵臓癌を含む上皮癌が診断される。血小板由来バイオマーカーのパネルがその代わりに用いられ、そしてこれらのマーカーの２つまたはそれより多くの発現を分析することによって、病変の悪性度を予測する／診断することも可能である。
特定の利点は、早期に、非常に悪性である癌を診断する、すなわち小さいまたはよく限局された病変を有する被験体が、良性病変または早期悪性病変を有するか決定し、そしてこれを非侵襲性に行うことが可能であることである。こうした非常に悪性である癌には、卵巣癌、膵臓癌および結腸直腸癌が含まれる。また、生検の必要なしに前立腺癌を診断可能であることは、本態様の利点である。
本態様は、良性または悪性細胞／組織／病変の発生の検出、癌状態予測、癌の診断、ならびに早期癌および進行した癌の間の区別に有用な、血小板における特定のプロテオームパターンを提供する。本明細書に提示する態様は、血液試料または他の血小板含有生物学的試料に基づいて、癌の、患者に優しい検出、予測および診断を可能にする。生物学的試料、例えば血液試料を用いることによって、疾患に関する情報を得る、この患者に優しくそして容易な方法は、組織生検の必要性を伴わない、癌診断法のための優れたツールである。本態様は、最小限の外傷およびそれと同時に、より正確な診断法を提供するであろう。例えば、生検の代わりに血液試料を使用するとまた、癌細胞を血液系に植え付けるリスクがなく、したがって疾患進行に診断が寄与する危険性を回避し、そして患者が今日の試料収集中に経験しうる外傷を回避するという利点も有するであろう。
態様の少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーは、好ましくは、生物学的試料中に存在する血小板から得られる少なくとも２つのタンパク質である。特定の態様において、少なくとも２つのタンパク質は、血小板に由来する、すなわち血小板から得られうる、非血管新生性タンパク質である。特定の態様において、血小板由来バイオマーカーは、以下のタンパク質、ＡＣＴＢ、ＡＣＴＮ１、ＡＣＴＮ４、ＡＰ４Ａ、ＣＡＳＰ３、ＣＡＺＡ１、ＣＦＬ１、ＣＬＵ、ＣＮＤＰ２、ＣＲＫＬ、ＥＲＰ２９、ＦＥＲＭ、ＦＩＢＧ、ＦＬＮＡ、ＦＰＰＳ、ＧＥＬＳ、ＧＰＩＸ、ＧＲＰ７５、ＧＳＴＯ１、ＨＤＨＤ２、ＨＰタンパク質、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ７１、ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＩＬＥＵ、ＩＴＧＡ２Ｂ、ＩＴＢ３、ＩＴＧＡ６、ＫＡＰ３、ＭＬＥＣ、ＰＨＢ、ＲＩＮＩ、ＳＨＬＢ１、ＳＮＣＡ、ＳＰＢ６、ＳＲＣ、ＴＢＡ、ＴＢＡ４Ａ、ＴＨＴＭ、ＴＬＮ１、ＴＭＰ１、ＴＳＧ、ＴＵＢＢ１、ＶＣＬおよびＷＤＲ１からなるパネルまたは群より選択される。
卵巣癌および前立腺癌において潜在的に悪性でありうる、改変された細胞／組織／病変、すなわち良性および／または悪性、特に癌腫、病変の発生を予測する際、少なくとも２つのバイオマーカーは、ＡＰ４Ａ、ＣＡＺＡ１、ＣＮＤＰ２、ＧＰＩＸ、ＩＬＥＵ、ＫＡＰ３、ＰＨＢ、ＳＨＬＢ１、ＳＰＢ６およびＴＭＰ１からなる群より選択されるべきである。
癌発生に関連する癌状態を予測する際、すなわち、現在の病変が良性または悪性であるか決定する際、あるいは癌進行に関連する癌状態を予測する（癌腫が早期または進行した段階であるか決定する）際、すなわち卵巣癌または前立腺癌を診断する際、少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーは、以下のタンパク質からなる群より選択される：ＡＣＴＮ１、ＡＣＴＮ４、ＣＲＫＬ、ＥＲＰ２９、ＦＥＲＭ、ＦＩＢＧ、ＦＬＮＡ、ＧＥＬＳ、ＧＲＰ７５、ＨＰタンパク質、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ７１、ＩＴＧＡ２Ｂ、ＩＴＢ３、ＲＩＮＩ、ＳＲＣ、ＴＢＡ、ＴＢＡ４Ａ、ＴＨＴＭ、ＴＬＮ１、ＴＵＢＢ１、ＶＣＬおよびＷＤＲ１。
膵臓癌、癌または癌でない状態（健康）を診断する際、少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーは、以下のタンパク質、ＡＣＴＢ、ＡＣＴＮ１、ＣＡＳＰ３、ＣＦＬ１、ＣＬＵ、ＦＰＰＳ、ＧＥＬＳ、ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＨＤＨＤ２、ＩＴＧＡ２Ｂ、ＩＴＢ３、ＩＴＧＡ６、ＭＬＥＣ、ＰＨＢ、ＲＩＮＩ、ＳＮＣＡ、ＳＰＢ６、ＴＢＡ４Ａ、ＴＬＮ１、ＴＳＧ、ＴＵＢＢ１、ＶＣＬおよびＷＤＲ１からなる群より選択される。
結腸直腸癌、癌または癌でない状態（健康）を診断する際、少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーは、以下のタンパク質、ＡＣＴＢ、ＡＣＴＮ１、ＣＡＳＰ３、ＣＦＬ１、ＣＬＵ、ＦＰＰＳ、ＧＥＬＳ、ＧＳＴＯ１、ＨＤＨＤ２、ＩＴＡ２Ｂ、ＩＴＢ３、ＩＴＧＡ６、ＭＬＥＣ、ＰＨＢ、ＲＩＮＩ、ＳＮＣＡ、ＳＰＢ６、ＴＢＡ４Ａ、ＴＬＮ１、ＴＳＧ、ＴＵＢＢ１、ＶＣＬおよびＷＤＲ１からなる群より選択される。
また、診断しようとする癌に関係なく使用可能な、１２の血小板由来バイオマーカーのパネルがある。したがって、ＡＣＴＮ１、ＧＥＬＳ、ＩＴＧＡ２Ｂ、ＩＴＢ３、ＰＨＢ、ＲＩＮＩ、ＳＰＢ６、ＴＢＡ４Ａ、ＴＬＮ１、ＴＵＢＢ１、ＶＣＬおよびＷＤＲ１からなる前記パネルを用いて、結腸直腸癌、卵巣癌、膵臓癌、および前立腺癌を診断可能である。膵臓癌および／または結腸直腸癌を診断する際、２２のマーカーのパネルが同一であることが見出されてきており、一方、２つの膵臓特異的マーカーおよび２つの結腸直腸特異的マーカーもまた見出されてきている。結腸直腸癌および膵臓癌両方を診断するのに適したマーカーのパネルは、ＡＣＴＢ、ＡＣＴＮ１、ＣＡＳＰ３、ＣＦＬ１、ＣＬＵ、ＦＰＰＳ、ＧＥＬＳ、ＨＤＨＤ２、ＩＴＧＡ２Ｂ、ＩＴＢ３、ＩＴＧＡ６、ＭＬＥＣ、ＰＨＢ、ＲＩＮＩ、ＳＮＣＡ、ＳＰＢ６、ＴＢＡ４Ａ、ＴＬＮ１、ＴＳＧ、ＴＵＢＢ１、ＶＣＬおよびＷＤＲ１である。膵臓癌のみを診断する場合、ＡＣＴＢ、ＡＣＴＮ１、ＣＡＳＰ３、ＣＦＬ１、ＣＬＵ、ＦＰＰＳ、ＧＥＬＳ、ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＨＤＨＤ２、ＩＴＧＡ２Ｂ、ＩＴＢ３、ＩＴＧＡ６、ＭＬＥＣ、ＰＨＢ、ＲＩＮＩ、ＳＮＣＡ、ＳＰＢ６、ＴＢＡ４Ａ、ＴＬＮ１、ＴＳＧ、ＴＵＢＢ１、ＶＣＬおよびＷＤＲ１からなる２３のバイオマーカーのパネルを用いてもよい。結腸直腸癌のみを診断する場合、ＡＣＴＢ、ＡＣＴＮ１、ＣＡＳＰ３、ＣＦＬ１、ＣＬＵ、ＦＰＰＳ、ＧＥＬＳ、ＧＳＴＯ１、ＨＤＨＤ２、ＩＴＧＡ２Ｂ、ＩＴＢ３、ＩＴＧＡ６、ＭＬＥＣ、ＰＨＢ、ＲＩＮＩ、ＳＮＣＡ、ＳＰＢ６、ＴＢＡ４Ａ、ＴＬＮ１、ＴＳＧ、ＴＵＢＢ１、ＶＣＬおよびＷＤＲ１からなる２３のバイオマーカーのパネルを用いてもよい。
したがって、態様の範囲において、いくつかのバイオマーカーパネルがある。１２のバイオマーカーの１つのバイオマーカーパネルが、癌のタイプに関わらず、癌状態を決定するために適用可能である。このパネルは、ＡＣＴＮ１、ＧＥＬＳ、ＩＴＧＡ２Ｂ、ＩＴＢ３、ＰＨＢ、ＲＩＮＩ、ＳＰＢ６、ＴＢＡ４Ａ、ＴＬＮ１、ＴＵＢＢ１、ＶＣＬおよびＷＤＲ１からなる。１０のバイオマーカーの別のバイオマーカーパネルは、健康な被験体、ならびに卵巣癌および／または前立腺癌における病変（良性または悪性）を持つ被験体の間を区別し、そしてＡＰ４Ａ、ＣＡＺＡ１、ＣＮＤＰ２、ＧＰＩＸ、ＩＬＥＵ、ＫＡＰ３、ＰＨＢ、ＳＨＬＢ１、ＳＰＢ６およびＴＭＰ１からなる。卵巣癌または前立腺癌における癌状態（良性対悪性、または早期対進行）を予測するための２３のバイオマーカーのさらなるバイオマーカーパネルは、ＡＣＴＮ１、ＡＣＴＮ４、ＣＲＫＬ、ＥＲＰ２９、ＦＥＲＭ、ＦＩＢＧ、ＦＬＮＡ、ＧＥＬＳ、ＧＲＰ７５、ＨＰタンパク質、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ７１、ＩＴＧＡ２Ｂ、ＩＴＢ３、ＲＩＮＩ、ＳＲＣ、ＴＢＡ、ＴＢＡ４Ａ、ＴＨＴＭ、ＴＬＮ１、ＴＵＢＢ１、ＶＣＬおよびＷＤＲ１からなる。２２のバイオマーカーのさらなるパネルは、結腸直腸癌および／または膵臓癌状態を予測するために使用可能であり、そしてＡＣＴＢ、ＡＣＴＮ１、ＣＡＳＰ３、ＣＦＬ１、ＣＬＵ、ＦＰＰＳ、ＧＥＬＳ、ＨＤＨＤ２、ＩＴＧＡ２Ｂ、ＩＴＢ３、ＩＴＧＡ６、ＭＬＥＣ、ＰＨＢ、ＲＩＮＩ、ＳＮＣＡ、ＳＰＢ６、ＴＢＡ４Ａ、ＴＬＮ１、ＴＳＧ、ＴＵＢＢ１、ＶＣＬおよびＷＤＲ１からなる。結腸直腸癌状態のみを予測するため、上述の２２のバイオマーカーに、バイオマーカーＧＳＴＯ１を補ったパネルである、２３のバイオマーカーのパネルが使用可能であり、そして膵臓癌状態のみを予測するため、上述の２２のバイオマーカーに、バイオマーカーＨＳＰ９０ＡＢ１を補ったパネルである、２３のバイオマーカーのパネルが使用可能である。
１つの態様において、それぞれの群またはパネルの２つの血小板由来バイオマーカーが、それぞれの方法において測定される。他の態様において、それぞれの群の血小板由来バイオマーカーのすべてまたは少なくとも大部分を含む、２より多い血小板由来バイオマーカー、例えば３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２３（それぞれの群中の血小板由来バイオマーカーの数に応じる）の血小板由来バイオマーカーを測定する。
被験体における、良性および／または癌腫、例えば卵巣癌または前立腺癌病変の発生を予測するため、測定する血小板由来バイオマーカーの数は、ＡＰ４Ａ、ＣＡＺＡ１、ＣＮＤＰ２、ＧＰＩＸ、ＩＬＥＵ、ＫＡＰ３、ＰＨＢ、ＳＨＬＢ１、ＳＰＢ６およびＴＭＰ１のうちの少なくとも２から少なくとも１０バイオマーカーの範囲の任意の数、例えば２、３、４、５、６、７、８、９または１０バイオマーカーであってもよい。
卵巣癌または前立腺癌に罹患している被験体における癌状態を予測するため、測定する血小板由来バイオマーカーの数は、ＡＣＴＮ１、ＡＣＴＮ４、ＣＲＫＬ、ＥＲＰ２９、ＦＥＲＭ、ＦＩＢＧ、ＦＬＮＡ、ＧＥＬＳ、ＧＲＰ７５、ＨＰタンパク質、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ７１、ＩＴＧＡ２Ｂ、ＩＴＢ３、ＲＩＮＩ、ＳＲＣ、ＴＢＡ、ＴＢＡ４Ａ、ＴＨＴＭ、ＴＬＮ１、ＴＵＢＢ１、ＶＣＬおよびＷＤＲ１のうちの少なくとも２から少なくとも２３バイオマーカーの範囲の任意の数、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３バイオマーカーであってもよい。
膵臓癌に罹患している被験体における癌状態を予測するため、測定する血小板由来バイオマーカーの数は、ＡＣＴＢ、ＡＣＴＮ１、ＣＡＳＰ３、ＣＦＬ１、ＣＬＵ、ＦＰＰＳ、ＧＥＬＳ、ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＨＤＨＤ２、ＩＴＧＡ２Ｂ、ＩＴＢ３、ＩＴＧＡ６、ＭＬＥＣ、ＰＨＢ、ＲＩＮＩ、ＳＮＣＡ、ＳＰＢ６、ＴＢＡ４Ａ、ＴＬＮ１、ＴＳＧ、ＴＵＢＢ１、ＶＣＬおよびＷＤＲ１のうちの少なくとも２から少なくとも２３バイオマーカーの範囲の任意の数、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３バイオマーカーであってもよい。
結腸直腸癌に罹患している被験体における癌状態を予測するため、測定する血小板由来バイオマーカーの数は、ＡＣＴＢ、ＡＣＴＮ１、ＣＡＳＰ３、ＣＦＬ１、ＣＬＵ、ＦＰＰＳ、ＧＥＬＳ、ＧＳＴＯ１、ＨＤＨＤ２、ＩＴＧＡ２Ｂ、ＩＴＢ３、ＩＴＧＡ６、ＭＬＥＣ、ＰＨＢ、ＲＩＮＩ、ＳＮＣＡ、ＳＰＢ６、ＴＢＡ４Ａ、ＴＬＮ１、ＴＳＧ、ＴＵＢＢ１、ＶＣＬおよびＷＤＲ１のうちの少なくとも２から少なくとも２３バイオマーカーの範囲の任意の数、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３バイオマーカーであってもよい。
膵臓癌、卵巣癌、結腸直腸癌または前立腺癌に罹患している被験体における癌状態を予測するため、測定する血小板由来バイオマーカーの数は、ＡＣＴＮ１、ＧＥＬＳ、ＩＴＧＡ２Ｂ、ＩＴＢ３、ＰＨＢ、ＲＩＮＩ、ＳＰＢ６、ＴＢＡ４Ａ、ＴＬＮ１、ＴＵＢＢ１、ＶＣＬおよびＷＤＲ１のうちの少なくとも２から少なくとも１２バイオマーカーの範囲の任意の数、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２バイオマーカーであってもよい。
これらの態様のいずれを、少なくとも１つの他のバイオマーカー、好ましくは少なくとも１つの他の血小板由来バイオマーカーの測定と組み合わせてもよい。次いで、癌状態の予測は、好ましくは、態様の少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーの測定した量、および少なくとも１つの他のバイオマーカーの測定した量（単数または複数）に基づく。
本態様は、特に癌腫に適用可能である。したがって、癌は、好適には、癌腫または上皮癌である。態様を適用可能な癌タイプの好ましい例には、卵巣癌および／または前立腺癌が含まれる。こうした場合、癌状態は、卵巣癌（または前立腺癌）の存在対卵巣癌の非存在（または前立腺癌の非存在）、すなわち良性病変のみ、あるいは進行した卵巣癌（または進行した前立腺癌）対早期卵巣癌（または早期前立腺癌）であってもよい。また、被験体における改変された細胞／組織（病変）の存在が予測可能であり、被験体を健康な個体または改変された細胞／組織（良性または悪性病変）と分類する。態様はまた、膵臓癌または結腸直腸癌にも適用可能であり、癌および非癌、良性または悪性病変／腫瘍の間を区別する。
本発明の方法は、本発明記載のバイオマーカーパネルから、１またはいくつかのバイオマーカーを測定する工程を含む。好ましくは、少なくとも２つ、またはそれより多いバイオマーカーを測定する。バイオマーカーは、示差的に貢献する可能性もあり、そして列挙する際、ＶＩＰ値を用いてもよい。最高のＶＩＰランキングを持つものは、最大に貢献し、そして次いで下降する。予測に用いられる量に応じて、予測の信頼性は増大する。したがって、用いるマーカーの数は、予測の望ましい信頼性に基づいて選択可能である。
態様の別の側面は、被験体または患者、好ましくは哺乳動物被験体、そしてより好ましくはヒト被験体のための癌治療レジメンを選択する方法に関する。該方法は、上記にしたがって、被験体が良性病変または癌腫病変に罹患しているか決定するか；上記にしたがって、前記被験体における良性および／または癌腫病変の存在を予測するか；上記にしたがって、前記被験体における結腸直腸癌または膵臓癌の存在を予測するか；あるいは上記にしたがって、前記被験体における癌腫の存在を予測する工程を含む。該方法はまた、被験体が良性病変または癌腫病変に罹患しているかに基づいて；被験体における良性および／または癌腫病変の予測される存在に基づいて；被験体における前記結腸直腸癌または膵臓癌の予測される存在に基づいて；あるいは被験体における癌腫の予測される存在に基づいて、被験体のための治療レジメンを選択する工程も含む。
したがって、態様にしたがって、少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーに基づいて決定されるかまたは予測される癌状態／疾患状態を用いて、被験体に適した治療レジメンを同定することも可能である。
例えば、被験体に関して予測される癌状態／疾患状態は、癌または癌ではない（悪性または良性）のいずれかである。被験体に関して予測される癌状態が癌である場合、被験体のために抗癌治療レジメンを選択する。こうした抗癌治療レジメンの限定されない例には、化学療法、手術および／または放射線照射が含まれる。被験体に関して予測される癌状態／疾患状態が癌でないことを示す場合、一般的には癌治療レジメンは必要ではない。
この態様において、治療レジメンの選択は、癌状態／疾患状態に基づいて、抗癌治療レジメンまたは非抗癌治療レジメンを選択する工程を含む。
別の例において、被験体に関して予測される癌状態は、早期癌または進行性癌のいずれかである。こうした場合、抗癌治療レジメンを、特定の癌状態に関して、すなわち早期または進行性に関して、最も効率的であるように選択してもよい。例えば、早期癌には、場合によってホルモン療法などの穏やかな薬剤療法で補った、手術が、適切な治療レジメンでありうる。進行した癌に適した治療レジメンは、場合によって手術およびアジュバント療法で補った、典型的には全身療法、例えば化学療法および／または放射線照射である。
この態様において、治療レジメンの選択は、癌状態に基づいて、早期癌または進行性癌のいずれかのための治療レジメンを選択する工程を含む。
さらなる例において、被験体に関して予測される癌状態／疾患状態は、良性病変または悪性腫瘍のいずれかである。こうした場合、抗癌治療レジメンを、特定の癌状態／疾患状態、すなわち良性または悪性に関して、最も効率的であるように選択してもよい。例えば、手術または実際に治療をまったく行わないことが、良性病変に適した治療レジメンでありうる。悪性腫瘍に適した治療レジメンは、場合によって手術およびアジュバント療法で補った、典型的には全身療法、例えば化学療法および／または放射線照射である。
この態様において、治療レジメンの選択は、癌状態／疾患状態に基づいて、良性病変または悪性腫瘍のいずれかのための治療レジメンを選択する工程を含む。
態様のさらなる側面は、癌に罹患している被験体を治療する方法に関する。態様において、該方法は、被験体由来の生物学的試料における、ＩＴＧＡ２Ｂ、ＷＤＲ１、ＡＣＴＮ１、ＦＬＮＡ、ＦＥＲＭＴ３、ＴＵＢＢ１およびＶＣＬ、または上記に定義される任意の他のバイオマーカーパネルからなる群より選択される各血小板由来バイオマーカーのそれぞれの量を測定する工程を含む。ＦＥＲＭＴ３がまた、本明細書において、ＦＥＲＭとも示されることに注目されたい。方法はまた、量に基づく状態値を計算する工程も含む。該方法はさらに、状態値が定義するカットオフ値を超す場合、抗癌治療レジメンで被験体を治療する工程を含む。
研究１Ａにしたがった特定の態様において、状態値を計算する工程は、上記の等式（１）にしたがって、状態値を計算する工程を含む。被験体の治療は、次いで、好ましくは、状態値が０．２５〜０．３０の範囲内、好ましくは０．２９のカットオフ値を超える場合、抗癌治療レジメンで被験体を治療する工程を含む。
研究１Ａにしたがった別の態様において、癌に罹患している被験体を治療する方法は、被験体由来の生物学的試料において、ＩＴＧＡ２Ｂ、ＷＤＲ１、ＡＣＴＮ１、ＦＬＮＡ、ＦＥＲＭＴ３、ＴＵＢＢ１およびＶＣＬ、または上に定義するバイオマーカーパネルの任意の他のものからなる群より選択される少なくとも２つ、好ましくは各々の血小板由来バイオマーカーのそれぞれの量を測定する工程を含む。該方法はまた、それぞれの参照量と、少なくとも２つ、好ましくは各々の血小板由来バイオマーカーのそれぞれの量を比較する工程も含む。該方法は、ＦＥＲＭＴ３、ＴＵＢＢ１、ＶＣＬおよび塩基性ＩＴＧＡ２Ｂのそれぞれの量の少なくとも１つが、ＦＥＲＭＴ３、ＴＵＢＢ１、ＶＣＬおよび塩基性ＩＴＧＡ２Ｂのそれぞれの参照量を超えている、そして／またはＷＤＲ１、ＦＬＮＡ、ＡＣＴＮ１および酸性ＩＴＧＡ２Ｂのそれぞれの量の少なくとも１つが、ＷＤＲ１、ＦＬＮＡ、ＡＣＴＮ１および酸性ＩＴＧＡ２Ｂのそれぞれの参照量未満である場合、被験体を抗癌治療レジメンで治療する工程をさらに含む。
研究１Ａにしたがった特定の態様において、被験体の治療は、ＦＥＲＭＴ３、ＴＵＢＢ１、ＶＣＬおよび塩基性ＩＴＧＡ２Ｂのそれぞれの量が、ＦＥＲＭＴ３、ＴＵＢＢ１、ＶＣＬおよび塩基性ＩＴＧＡ２Ｂのそれぞれの参照量を超える場合、そしてＷＤＲ１、ＦＬＮＡ、ＡＣＴＮ１および酸性ＩＴＧＡ２Ｂのそれぞれの量が、ＷＤＲ１、ＦＬＮＡ、ＡＣＴＮ１および酸性ＩＴＧＡ２Ｂのそれぞれの参照量未満である場合、抗癌治療レジメンで被験体を治療する工程を含む。
本明細書に先に論じるように、対照群から、または被験体自体からあらかじめ、それぞれの参照量を決定することも可能である。
態様のさらなる側面は、上に提示する群のいずれかから選択した少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーを支持するよう設定された固体支持体を含むキットである。キットはまた、被験体由来の生物学的試料から得られる少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーを測定するため、固体支持体を用いるための使用説明書も含む。キットは、被験体が良性病変または癌種病変に罹患しているか決定するため；被験体における良性および／または癌腫病変の存在を予測するため；被験体における結腸直腸癌または膵臓癌の存在を予測するため；または用いる血小板由来バイオマーカーの特定の群に応じて、被験体における癌腫の存在を予測するための使用説明書をさらに含む。
特定の態様において、キットの固体支持体は、２−ＤＥゲルである。固体支持体を用いるための使用説明書は、好ましくは、２Ｄゲル電気泳動を行って、等電点および質量に基づいて、生物学的試料から血小板タンパク質を分離するための使用説明書を含む。
固体支持体を用いるための使用説明書は、好ましくは、固体支持体を用いて、生物学的試料由来の群における各血小板由来バイオマーカーのそれぞれの量を測定するための使用説明書を含む。
態様において、癌状態／疾患状態を予測するための使用説明書は、上記の等式（１）に基づく状態値を計算するための使用説明書を含んでもよい。癌状態／疾患状態を予測するための使用説明書はまた、好ましくは、状態値および定義するカットオフ値の比較に基づいて、癌状態／疾患状態を予測するための使用説明書も含む。定義するカットオフ値は、好ましくは、０．２５〜０．３０の範囲内、より好ましくは０．２９に等しい。
上に定義するキットを適応させて、前述で論じた方法側面のいずれにしたがって用いてもよい。こうした場合、癌状態／疾患状態を予測するための使用説明書は、典型的には、測定に基づいて、被験体における良性または悪性病変／腫瘍の存在を検出するかまたは予測するための使用説明書、被験体における癌状態／疾患状態と測定を相関させるための使用説明書、測定に基づいて、被験体を診断するための使用説明書、測定に基づいて、被験体における癌の存在を検出するための使用説明書、測定に基づいて、被験体の癌が早期であるかまたは進行しているか決定するための使用説明書、あるいは測定に基づいて、被験体の病変／腫瘍が良性または悪性であるか決定するための使用説明書によって置き換えられる。あるいは、キットは、癌状態／疾患状態を予測するための使用説明書に加えて、癌状態／疾患状態に基づいて、被験体のための治療レジメンを選択するための使用説明書もまた含む。
態様の関連する側面は、ＡＣＴＢ、ＡＣＴＮ１、ＡＣＴＮ４、ＡＰ４Ａ、ＣＡＳＰ３、ＣＡＺＡ１、ＣＦＬ１、ＣＬＵ、ＣＮＤＰ２、ＣＲＫＬ、ＥＲＰ２９、ＦＥＲＭ、ＦＩＢＧ、ＦＬＮＡ、ＦＰＰＳ、ＧＥＬＳ、ＧＰＩＸ、ＧＲＰ７５、ＧＳＴＯ１、ＨＤＨＤ２、ＨＰタンパク質、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ７１、ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＩＬＥＵ，ＩＴＧＡ２Ｂ、ＩＴＢ３、ＩＴＧＡ６、ＫＡＰ３、ＭＬＥＣ、ＰＨＢ、ＲＩＮＩ、ＳＨＬＢ１、ＳＮＣＡ、ＳＰＢ６、ＳＲＣ、ＴＢＡ、ＴＢＡ４Ａ、ＴＨＴＭ、ＴＬＮ１、ＴＭＰ１、ＴＳＧ、ＴＵＢＢ１、ＶＣＬおよびＷＤＲ１からなる群より選択される血小板由来バイオマーカーを支持するよう設定された固体支持体を含むキットを定義する。
該キットはまた、固体支持体を用いて被験体由来の生物学的試料における群中の各血小板由来バイオマーカーのそれぞれの量を測定するための使用説明書も含む。該キットはまた、量に基づいて状態値を計算するための使用説明書、および状態値が例えば定義するカットオフ値を超える場合、抗癌治療レジメンで被験体を治療するための使用説明書も含む。
別の態様において、キットは、被験体由来の生物学的試料において、ＡＣＴＢ、ＡＣＴＮ１、ＡＣＴＮ４、ＡＰ４Ａ、ＣＡＳＰ３、ＣＡＺＡ１、ＣＦＬ１、ＣＬＵ、ＣＮＤＰ２、ＣＲＫＬ、ＥＲＰ２９、ＦＥＲＭ、ＦＩＢＧ、ＦＬＮＡ、ＦＰＰＳ、ＧＥＬＳ ＧＰＩＸ、ＧＲＰ７５、ＧＳＴＯ１、ＨＤＨＤ２、ＨＰタンパク質、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ７１、ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＩＬＥＵ、ＩＴＧＡ２Ｂ、ＩＴＢ３、ＩＴＧＡ６、ＫＡＰ３、ＭＬＥＣ、ＰＨＢ、ＲＩＮＩ、ＳＮＣＡ、ＳＰＢ６、ＳＲＣ、ＳＨＬＢ１、ＴＢＡ、ＴＢＡ４Ａ、ＴＨＴＭ、ＴＬＮ１、ＴＭＰ１、ＴＳＧ、ＴＵＢＢ１、ＶＣＬおよびＷＤＲ１からなる群より選択される血小板由来バイオマーカーを支持するよう設定された固体支持体を含む。該キットはまた、少なくとも２つ、好ましくは各々の血小板由来バイオマーカーのそれぞれの量を、それぞれの参照量と比較するための使用説明書も含む。
特定の態様において、被験体を治療するための使用説明書は、ＦＥＲＭＴ３、ＴＵＢＢ１、ＶＣＬおよび塩基性ＩＴＧＡ２Ｂのそれぞれの量が、ＦＥＲＭＴ３、ＴＵＢＢ１、ＶＣＬおよび塩基性ＩＴＧＡ２Ｂのそれぞれの参照量を超えており、そしてＷＤＲ１、ＦＬＮＡ、ＡＣＴＮ１および酸性ＩＴＧＡ２Ｂのそれぞれの量が、ＷＤＲ１、ＦＬＮＡ、ＡＣＴＮ１および酸性ＩＴＧＡ２Ｂのそれぞれの参照量未満である場合、被験体を抗癌治療レジメンで治療するための使用説明書を含む。
態様のさらなる側面は、診断系１を定義する。図４を参照されたい。診断系１は、ＡＣＴＢ、ＡＣＴＮ１、ＡＣＴＮ４、ＡＰ４Ａ、ＣＡＳＰ３、ＣＡＺＡ１、ＣＦＬ１、ＣＬＵ、ＣＮＤＰ２、ＣＲＫＬ、ＥＲＰ２９、ＦＥＲＭ、ＦＩＢＧ、ＦＬＮＡ、ＦＰＰＳ、ＧＥＬＳ、ＧＰＩＸ、ＧＲＰ７５、ＧＳＴＯ１、ＨＤＨＤ２、ＨＰタンパク質、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ７１、ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＩＬＥＵ、ＩＴＧＡ２Ｂ、ＩＴＢ３、ＩＴＧＡ６、ＫＡＰ３、ＭＬＥＣ、ＰＨＢ、ＲＩＮＩ、ＳＨＬＢ１、ＳＮＣＡ、ＳＰＢ６、ＳＲＣ、ＴＢＡ、ＴＢＡ４Ａ、ＴＨＴＭ，ＴＬＮ１、ＴＭＰ１、ＴＳＧ、ＴＵＢＢ１、ＶＣＬおよびＷＤＲ１からなる群より選択される少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーを支持するよう設定された固体支持体２を含む。診断系１はまた、固体支持体２上で、被験体由来の生物学的試料から少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーを検出するよう設定された検出装置３も含む。検出装置３はまた、少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーの量のそれぞれの推定を生じるように設定されている。検出装置３は、好ましくは、診断系１のプロセッサ４に連結されている。プロセッサ４は、量のそれぞれの推定をプロセシングするように設定される。プロセッサ４はまた、被験体が良性病変または癌腫病変に罹患しているかの推定；被験体における良性および／または癌腫病変の存在の予測；被験体における結腸直腸癌または膵臓癌の存在の予測；あるいは用いる血小板由来バイオマーカーの特定の群に応じて、被験体における癌腫の存在の予測を生じるように設定される。
特定の態様において、固体支持体２は、等電点（等電点電気泳動）および質量（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に基づいて、生物学的試料から血小板タンパク質を分離するように設定された２−ＤＥゲル２である。
特定の態様において、検出装置３は、固体支持体２上で、生物学的試料から、群中の各血小板由来バイオマーカーを検出し、そして各血小板由来バイオマーカーの量のそれぞれの推定を生じるよう設定される。
検出装置３は、固体支持体２の画像を採取するよう設定された任意の検出装置であってもよい。態様にしたがって使用可能である検出装置３の限定されない例は、１６ビット解像度を持つＥｐｓｏｎ画像スキャナである。目的に適した任意の高解像度画像スキャナが、本発明で使用するために適用可能でありうる。
参照量は、プロセッサ４に連結されたメモリ５に保存されていてもよい。これらの参照量は、特定の被験体に関してあらかじめ決定され、そして次いでメモリ５に入力されていてもよい。あるいは、参照量は、あらかじめ、診断系１を用いて、対照群に関して決定されていてもよい。さらなる代替法は、参照量が適切なユーザー入力、例えばキーボード（未提示）またはタッチセンサー式ディスプレイ６を用いて、診断系１およびメモリ５に入力されているものである。
代替態様において、プロセッサ４は、血小板由来バイオマーカーのそれぞれの量に基づいて、上記等式（１）にしたがって、状態値を計算するよう設定されている。上述のメモリ５は、次いで、定義したカットオフ値を保存するよう設定されている。次いで、プロセッサ４は、定義したカットオフ値と状態値を比較して、そして比較に基づいて、被験体における癌状態の予測を生じるように設定されている。
予測される癌状態／疾患状態は、好ましくは、診断系１に連結されたディスプレイ６上でユーザーにディスプレイされる。ディスプレイされる癌状態／疾患状態は、癌対癌でない状態、早期癌対進行性癌または良性腫瘍対悪性腫瘍であることも可能である。
プロセッサ４は、前述に開示するプロセッサ操作を実行するよう設定されたハードウェアおよび／またはソフトウェア手段を有する、任意のコンピュータまたは処理端末であってもよい。プロセッサ４の限定されない例には、ソフトウェアＳａｍｅＳｐｏｔｓを含むコンピュータが含まれる。
態様のさらなる側面は、被験体における癌状態／疾患状態を予測するよう設定されたコンピュータプログラム製品に関する。コンピュータプログラム製品は、コンピュータにおいて具現化するコンピュータ読み取り可能プログラムコードを有するコンピュータ読み取り可能媒体を含む。コンピュータ読み取り可能プログラムコードは、被験体由来の生物学的試料において、態様にしたがった少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーを測定するよう設定されるコンピュータ読み取り可能プログラムコードを含む。コンピュータ読み取り可能プログラムコードはまた、被験体が良性病変または癌腫病変に罹患しているかの推定；被験体における良性および／または癌腫病変の存在の予測；被験体における結腸直腸癌または膵臓癌の存在の予測；あるいは用いた血小板由来バイオマーカーの特定の群に応じて、被験体における癌腫の存在の予測を生じるよう設定されたコンピュータ読み取り可能プログラムコードも含む。
本明細書において、診断するまたは診断は、被験体が疾患、例えば癌、例えば卵巣癌、前立腺癌、結腸直腸癌または膵臓癌に影響を受けている可能性がある指標を提供することを意味する。こうした技術はいずれも完全ではなく、そしてこうした診断は、他の方法、例えば身体検査、画像法、組織試料の組織学的検査等の他の方法によって確認されうることが認識されるであろう。
個別化癌治療に関するブレークスルーは、（１）完全に健康であるかまたは何らかの細胞／組織改変がある（良性または悪性病変が存在する）ならびに／あるいは（２）癌でない状態（良性）および癌（悪性）、ならびに／あるいは（２）早期（しばしば局所）および進行性（しばしば散在または転移）腫瘍疾患の間を区別することを可能にする、血液試験であろう。試験は、正常な健康な個体、および改変された細胞／組織（例えば病変／腫瘍）を有する個体の間を区別する、すなわち健康な被験体および何らかの種類の細胞または組織改変、例えば良性または悪性病変を有する被験体の間を区別する可能性を持たなければならない。試験はさらに、改変された細胞／組織（病変／腫瘍）を有する被験体が、良性病変または悪性腫瘍（癌）を有するかどうかを決定する、すなわち良性病変および悪性腫瘍の間を区別することが可能でなければならない。試験はまた、悪性新生物疾患（癌、悪性腫瘍）を有する被験体が、疾患の早期または進行段階にあるか決定する／区別する、すなわち、早期および進行性癌の間を区別することも可能でなければならない。
また、限定されるわけではないが、生検を実行し、スキャンを実行し（Ｘ線、ＭＲＩ、ＰＥＴ、ＣＴ等）、そして疾患の可能性の他のバイオマーカーまたは他の指標に関してスクリーニングする工程を含む、他の診断法と組み合わせて、診断または治療レジメンの発展のために、癌を検出する開示する方法を使用することもまた可能である。当業者は、診断またはスクリーニングのため、疾患を検出する他の方法のこの列挙が、いかなる意味でも包括的ではなく、そして卵巣癌、前立腺癌、結腸直腸癌および／または膵臓癌などの癌の診断目的のため、開示する方法と容易に組み合わせ可能である他の可能な診断法の小規模なサンプリングであることを認識するであろう。
本明細書に記載するような被験体には、ヒト被験体および患者、ならびに獣医または研究設定の他の哺乳動物が含まれ、マウスが含まれる。被験体は、男性または女性であってもよく、そしていかなる人種または民族であってもよく、限定されるわけではないが、コーカソイド、アフリカ系アメリカ人、アフリカ人、アジア人、ラテンアメリカ系、インド人等が含まれる。被験体は、いかなる年齢であってもよく、新生児、乳児、幼児、小児、青年、成人、および老人が含まれる。被験体にはまた、獣医学的薬剤または薬学的剤の開発目的のためにスクリーニングされる、動物被験体、特に哺乳動物被験体、例えばイヌ、ネコ、ウマ、マウス、ラット等も含まれうる。被験体には、限定されるわけではないが、癌に関する１またはそれより多いリスク要因を有するか、所持するか、これらに曝露されているか、またはこれらに罹患していると以前診断されている可能性があるものが含まれる。リスク要因には、年齢、性別、人種、喫煙、食餌、肥満、糖尿病、職業上の曝露、家族歴、アルコールおよび薬剤使用等が含まれる。これらのリスク要因を、診断またはスクリーニングのため、癌を検出する開示する方法と組み合わせて考慮してもよい。
本発明者らは、いくつかの実験研究を行ってきており、これによって、癌予測および診断に有用な血小板由来バイオマーカーパネルが明らかになってきている。研究１は、卵巣癌に関するマーカーを明らかにした。研究１Ａは、癌状態および進行を決定するために有用な７マーカーを明らかにした。研究１Ｂは、２１マーカー、さらなる１６マーカー（５つが重複）を明らかにし、卵巣癌を予測するかまたは診断するために有用な総数２３のマーカーを明らかにし、そして研究１Ｃは、健康な被験体および何らかの種類の病変（良性または悪性病変）を有する被験体の間を区別するために有用な１０マーカーを明らかにした。前立腺癌に関する研究２は、研究１由来の２３マーカーがまた、前立腺癌にも適用されることを示した。研究３および４は、膵臓癌および／または結腸直腸癌に関する２３マーカーを同定し、ここで、２２が両方の癌に適用可能であり、そして１つが膵臓癌特異的であり、そして１つが結腸直腸癌特異的であった。すべての癌において同一であることが示されている１２マーカーのパネルは、したがって、どの癌が診断されているかに関わらず、診断に用いることが可能である。総合して、すべての研究は、癌および癌状態を診断し、そして予測するために有用な４５のユニークなバイオマーカーを明らかにした。上方制御されていることが示されるマーカーもあり、そして下方制御されていることが示されているマーカーもあった。しかし、バイオマーカーを評価するために用いた方法に応じて、これは変化する可能性もあった。したがって、特定の閾値を超える、バイオマーカープロファイル（所定のパネルに関するもの）の相対量の改変は、以下により詳細に定義するように、これが増加または減少であるかに関わらず、本発明に記載するような、癌および／または癌状態および／または病変（改変された組織）の発生を予測する／診断する際に、等しく興味深いと見なされる。
研究１Ａ
研究１Ａからの実験データは、本明細書にさらに提示するように、本明細書に開示する７つの血小板由来バイオマーカーが、１つの態様において、癌でない被験体（良性）に対して癌を有する被験体由来の血小板によって発現されるまたは血小板に少なくとも存在するバイオマーカーの量の変化または改変に関して、２つの群に分割可能であり、そして早期癌を有する被験体の診断を可能にすることを示してきている。
マーカーは、用いる検出法および分析法に応じて、増加するかまたは減少することも可能であることに注目することが重要である。にもかかわらず、研究１Ａにおける血小板由来バイオマーカーの第一の群は、重度の癌状態に関するバイオマーカーの相対量の増加を示した。したがって、癌を有する被験体あるいは進行した癌または早期癌を有する被験体は、一般的に、癌でない被験体または良性病変を有する被験体に比較した際、これらのバイオマーカーのより高く改変された（より高い）相対量を有する。この第一の群は、ＦＥＲＭＴ３、ＴＵＢＢ１、ＶＣＬおよび塩基性ＩＴＧＡ２Ｂからなる。塩基性ＩＴＧＡ２Ｂは、二次元電気泳動ゲルの塩基性部分上に見られる、すなわち６より高いｐＨで等電点を有し、そしてしたがって中性ｐＨで負に荷電している、ＩＴＧＡ２Ｂアイソフォームを示す。
研究１Ａにおける血小板由来バイオマーカーの第二の群は、重症癌状態に関するバイオマーカーの相対量の減少を示した。したがって、癌を有する被験体または進行した癌を有する被験体は、一般的に、癌を持たない被験体または良性病変を有する被験体と比較した際、これらのバイオマーカーのより低い相対量を有する。この第二の群は、ＷＤＲ１、ＦＬＮＡ、ＡＣＴＮ１および酸性ＩＴＧＡ２Ｂからなる。酸性ＩＴＧＡ２Ｂは、二次元電気泳動ゲルの酸性部分上に見られる、すなわち６より低いｐＨで等電点を有し、そしてしたがって中性ｐＨで正に荷電している、ＩＴＧＡ２Ｂアイソフォームを示す。
１つの態様において、少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーは、上述の第一の群から選択される。こうした場合、被験体における癌状態の予測は、少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーの量が増加する、好ましくは参照量より高く増加するかに基づくことも可能である。
別の態様において、少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーは、第二の群より選択される。こうした場合、被験体における癌状態の予測は、少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーの量が減少する、好ましくは参照量より低く減少するかに基づくことも可能である。
少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーのそれぞれの量を（個々に）比較するそれぞれの参照量は、対照群の相当する血小板由来バイオマーカーに関して決定された参照量であることも可能である。例えば、予測が、改変された組織の存在または改変されていない組織（病変）の存在のいずれかである場合、対照群は、検出可能な改変された組織（病変）を持たない健康な被験体の群であることも可能である。次いで、少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーの量を対照群に関して測定し、そして参照量をこの対照群から決定し、例えば対照群中の健康な被験体に関して決定される量の平均または中央値を決定する。卵巣癌および前立腺癌に関して、病変を有する被験体から健康な被験体を区別するため、測定／検出する少なくとも２つのバイオマーカーを、ＡＰ４Ａ、ＣＡＺＡ１、ＣＮＤＰ２、ＧＰＩＸ、ＩＬＥＵ、ＫＡＰ３、ＰＨＢ、ＳＨＬＢ１、ＳＰＢ６およびＴＭＰ１からなる特異的血小板バイオマーカーから選択しなければならない。
同様に、改変された組織（病変）が被験体に存在し、そして予測が癌の存在または癌の非存在（良性）いずれかの癌状態である場合、対照群は、良性対象の群、すなわち良性病変のみが存在すると診断される被験体の群であることも可能である。同様に、少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーの量を、次いで、対照群に関して測定し、そしてこの対照群から参照量を決定し、例えば対照群中の健康な被験体に関して決定される量の平均または中央値を決定する。この方法はまた、癌状態が、早期癌または腫瘍に対して、進行性癌または腫瘍である場合にも適用可能である。次いで、対照群は、好適に早期癌と診断される被験体であってもよい。
代替アプローチにおいて、疾患発展前に、すなわちいかなる癌よりも前に、あるいは被験体が早期癌または良性病変（単数または複数）のみを有する期間中に、被験体自身から参照量を決定してもよい。
生物学的試料におけるバイオマーカーの量は、生物学的試料におけるバイオマーカーの量または濃度、生物学的試料におけるバイオマーカーの検出された量に基づくスコア、患者集団に基づくパーセンタイル、生物学的試料におけるバイオマーカーの定量的量または半定量的量、あるいは検出されたバイオマーカーに基づく他の適切な量であってもよい。
本明細書において、血小板由来バイオマーカーの量における増加または減少は、対照における血小板タンパク質の相対参照量に比較した際、被験体から除去されたかまたは得られた生物学的試料中で、またはこうした試料を通じて検出可能な血小板タンパク質の相対量における増加した相対量または減少した相対量を指す。対照試料には、癌（例えば卵巣癌、前立腺癌）に罹患していない対応する被験体由来の生物学的試料、あるいは同じ被験体由来の非疾患組織または組織の非疾患部分由来の生物学的試料、あるいは疾患発展前の、同じ被験体由来の生物学的試料が含まれる。血小板由来バイオマーカーの検出可能量の存在または非存在はまた、増加または減少と見なすことも可能である。
本明細書において、血小板由来バイオマーカーの量の増加または減少は、例えば、対照の血小板タンパク質の参照量に比較した際、被験体から除去したまたは得た生物学的試料中で、または該試料を介して検出可能である、血小板タンパク質の量における増加した量（例えば１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、１００％の増加、またはそれより多い増加）または減少した量（例えば１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、１００％の減少、またはそれより多い減少）を指すことも可能である。
卵巣癌に関して、卵巣癌の病期決定の国際的システムは、診断時点での蔓延を同定する。初期診断の瞬間での正しい病期決定は、治療決定に影響を及ぼす。病期決定システムは、ＦＩＧＯシステムと称され、これは、著者ら、世界婦人科癌専門医連盟にちなむ。２０１３ ＦＩＧＯ病期決定システムにしたがって、卵巣癌に関して、
病期１は、単数または複数の卵巣または卵管（単数または複数）に限定された腫瘍によって特徴付けられ、
病期２−腫瘍は一方または両方の卵巣または卵管に影響を及ぼし、骨盤への拡大（骨盤上口の下）または原発性腹腔癌を伴い、
病期３−腫瘍は一方または両方の卵巣または卵管に影響を及ぼし、あるいは骨盤および腹腔の両方を含む腹膜面への確証された（細胞学的にまたは組織学的に）蔓延および／または腹膜後リンパ節への転移を伴う、原発性腹腔癌であり、
病期４−腹腔を超えた遠位転移（実質肝／脾臓転移および腹部外転移を伴う）。
さらなる態様において、方法は、生物学的試料において、研究１Ａ由来の第一の群由来の少なくとも１つの血小板由来バイオマーカーのそれぞれの量を測定し、そして生物学的試料において、第二の群由来の少なくとも１つの血小板由来バイオマーカーのそれぞれの量を測定する工程を含む。したがって、この態様において、測定される血小板由来バイオマーカーの少なくとも１つは、重度の癌状態に関して増加することが予期され、一方、測定される血小板由来バイオマーカーの少なくとも別の１つは、重度の癌状態に関して減少することが予期される。
こうした場合において、状態値を、２つの決定される量に基づいて、好ましくは２つの決定される量の間の商として、被験体に関して計算してもよい。こうした商は、第一の群由来の血小板由来バイオマーカーの量を第二の群由来の血小板由来バイオマーカーの量で割ったものであってもよい。こうした商は、次いで、癌を持たない被験体に比較した際、癌に罹患している被験体に関して有意により高く、局所癌を有する被験体に比較した際、広がった癌を有する被験体に関して有意により高く、そして良性腫瘍を有する被験体に比較した際、悪性腫瘍を有する被験体に関して有意により高いであろう。代替法は、第二の群由来の血小板由来バイオマーカーの量を、第一の群由来の血小板由来バイオマーカーの量によって割った商を計算することである。こうした場合、商は、癌を持たない被験体に比較した際、癌に罹患している被験体に関して有意により低く、局所癌を有する被験体に比較した際、広がった癌を有する被験体に関して有意により低く、そして良性腫瘍を有する被験体に比較した際、悪性腫瘍を有する被験体に関して有意により低いであろう。
１より多い血小板由来バイオマーカーが第一の群および／または第二の群に関して測定される場合、好ましくは、第一の群由来の血小板由来バイオマーカーの量の合計を、第二の群由来の血小板由来バイオマーカーの量の合計で割るか、またはその逆を行う。
本発明の方法論は、示す多様な癌の診断に関するアッセイとして使用可能であることに加えて、組み合わせて用いてもよい。多重化プラットフォーム（すなわちＬｕｍｉｎｅｘまたはその他）で実行する場合、徴候に関するすべてのバイオマーカーおよび共通の群を１つの分析において実行する。このアッセイから、多様な異なる診断結果を、別個にフィルタリングすることも可能である。卵巣、前立腺、膵臓、結腸直腸および共通群の任意の組み合わせを、対で、またはより大きな群でともに組み合わせ可能であるように、アッセイの組み合わせを設計することも可能である。これは、癌の分析を可能にし、または特定の癌との組み合わせではない。
研究１Ａ由来の態様
特定の態様において、好ましくは、態様の各血小板由来バイオマーカー、すなわち、ＩＴＧＡ２Ｂ、ＷＤＲ１、ＡＣＴＮ１、ＦＬＮＡ、ＦＥＲＭＴ３、ＴＵＢＢ１およびＶＣＬのそれぞれの量を、生物学的試料において測定する。
こうした場合、被験体における癌状態の予測は、好ましくはそれぞれの参照量に比較して、ＦＥＲＭＴ３、ＴＵＢＢ１、ＶＣＬおよび塩基性ＩＴＧＡ２Ｂのそれぞれの量のいかなる増加、ならびにＷＤＲ１、ＦＬＮＡ、ＡＣＴＮ１および酸性ＩＴＧＡ２Ｂのそれぞれの量のいかなる減少に基づいてもよい。
特定の態様において、態様の血小板由来バイオマーカーの測定された量に基づいて、状態値を計算する。１つの態様において、第一の群、すなわちＦＥＲＭＴ３、ＴＵＢＢ１、ＶＣＬおよび塩基性ＩＴＧＡ２Ｂ由来の血小板由来バイオマーカーのそれぞれの量の第一の合計に基づいて、そして第二の群、すなわちＷＤＲ１、ＦＬＮＡ、ＡＣＴＮ１および酸性ＩＴＧＡ２Ｂ由来の血小板由来バイオマーカーのそれぞれの量の第二の合計に基づいて、状態値を計算する。
態様において、第一の合計および第二の合計の間の商に基づいて、状態値を計算する。したがって、特定の態様において、状態値を：
（［ＦＥＲＭＴ３］＋［ＴＵＢＢ１］＋［ＶＣＬ］＋［ＩＴＧＡ２Ｂ］塩基性）／（［ＷＤＲ１］＋［ＦＬＮＡ］＋［ＡＣＴＮ１］＋［ＩＴＧＡ２Ｂ］酸性）（１）
式中、［ＩＴＧＡ２Ｂ］塩基性は、負に荷電したＩＴＧＡ２Ｂの量に相当し、［ＩＴＧＡ２Ｂ］酸性は、正に荷電したＩＴＧＡ２Ｂの量に相当し、そして［Ｘ］は、相当する血小板由来バイオマーカーの量に相当し、Ｘ＝ＦＥＲＭＴ３、ＴＵＢＢ１、ＶＣＬ、ＷＤＲ１、ＦＬＮＡまたはＡＣＴＮ１である
として計算する。
測定した血小板由来バイオマーカーの量に基づいて状態値を計算する、上に開示する態様において、この状態値を、好ましくは、定義したカットオフ値に比較する。したがって、こうした態様において、癌状態の予測は、好ましくは、状態値を、定義したカットオフ値に比較し、そして該比較に基づいて、すなわち状態値がカットオフ値より高いかまたは低いかに基づいて、被験体における癌状態を予測する工程を含む。
等式（１）に定義するアルゴリズムは、非癌性または良性生物学的試料に関して低い値を生じ、局所癌に関して中間の値を生じ、そして悪性または散在／進行性癌に関して高い値を生じる。
癌被験体群および健康な被験体の対照群に関し、広がった癌を有する被験体群および早期癌を有する対照群に関し、または悪性腫瘍を有する被験体群および良性病変を有する被験体の対照群に関し、状態値を計算することによって、カットオフ値を決定してもよい。こうした場合、カットオフ値は、２つの群由来の状態値の比較に基づいて定義されてもよい。特定の態様において、カットオフ値は：
［（癌平均値−１ ＳＤＥＶ）＋（対照平均値＋１ ＳＤＥＶ）］×１／２ （２）
式中、癌平均値は、進行した癌を有する被験体群に関して、または悪性腫瘍を有する被験体群に関して、癌被験体群から得られる平均状態値に相当し、ＳＤＥＶは、標準偏差に相当し、そして対照平均値は、対照群から得られる平均状態値に相当する
として計算される。
カットオフ値の適切な値は、典型的には、癌状態、すなわち癌対癌でない状態、進行した癌対早期癌、または悪性腫瘍対良性病変に応じる。適切な癌タイプおよび癌状態に関して、等式（１）および（２）を用いて上に明記するように、カットオフ値を決定してもよい。
１つの態様において、カットオフ値は、好適に、０．２５〜０．３０の範囲内であり、そして好ましくは０．２９に等しい。このカットオフ値は、以下にさらに開示するように、悪性卵巣癌に罹患している被験体群および良性病変、例えば子宮筋腫または良性嚢腺腫を有する対照群に関して決定されてきている。
特定の態様において、０．２５〜０．３０の範囲内、好ましくは０．２９に等しいカットオフ値が、癌および癌でない状態の間を区別するために用いられる。いかなる癌にも罹患していない被験体は、典型的には、０．０５〜０．２５の範囲内の、等式（１）を用いて計算されるような状態値を有する。それに応じて、癌に罹患している被験体は、典型的には、０．３０〜０．６０の範囲内の、等式（１）を用いて計算されるような状態値を有する。
進行した癌および早期癌の間を区別するために適したカットオフ値は、少なくとも卵巣癌に関して、典型的には、０．２５〜０．６０の範囲内、例えば０．３０〜０．６０の範囲内であろう。それに応じて、悪性腫瘍および良性腫瘍の間を区別するのに適したカットオフ値は、０．２５〜０．６０の範囲内、例えば０．３０〜０．６０の範囲内であってもよい。
研究１Ｂ
研究１Ａおよびその一般的に正の転帰にしたがって、バイオマーカーをさらに検証するため、より広い研究を開始した。本研究において、通常の生物学的可変性ならびに癌自体の生物学的蔓延をカバーするために十分な患者を得るため、患者のより大きいコホートを用いた。結果の統計分析に基づき、ＰＬＳを伴う、より進歩した評価戦略もまた用いた。研究１Ｂには、１６人の良性対照（ＢＣ）および腹部まで広がった定義される進行性卵巣癌（ＳＣ）を有する２０人の女性が含まれた。対照は、良性病変、例えば子宮筋腫または良性嚢腺腫を有する女性であった。すべての患者は、ソールナにあるカロリンスカ大学病院産婦人科で診断され、そして治療された。患者は、地域倫理委員会Ｄｎｒ．２０１０／５０４−３１の認可にしたがって、研究のために血液を提供した。記載する標準化法（実施例１および２）にしたがって、血小板を調製しそして分析した。２Ｄゲル分離したタンパク質を画像分析した後、すべての試料に相当するデータを、多変量統計（部分的最小二乗判別分析、ＰＬＳ）によってさらに分析した。２つの成分を含むＰＬＳモデルは、最適の結果を示した（図５を参照されたい）。最適化および交差検証モデルに関して、９０％の感度および９４％の特異性を得た。ＶＩＰ（重要性変数）パラメータを用いて、予測への寄与にしたがって変数をランク付けした。次いで、上位にランキングされた変数（最高ＶＩＰ値に相当するタンパク質スポット）を質量分析による同定のために選択した。総合して、上位１６にランキングされるタンパク質の＞７５％、そして上位５０にランキングされるタンパク質の＞５０％を同定した。成功した同定を表４に列挙し、検証がより実行不能と見なされたため、いくつかの同定を排除した。以下のバイオマーカー候補を選択し、ＶＩＰランクにしたがってソーティングした（括弧内に［ＶＩＰランク］を示す）：ＥＲＰ２９［１］、ＡＣＴＮ４［３］、ＨＰ［４、８］、ＴＬＮ１［６、１０、１１、１２、２７、５０］、ＳＲＣ［６］、ＩＴＢ３［１３］、ＨＳＰ７１［１６］、ＴＢＡ４Ａ［１９］、ＩＴＡ２Ｂ［２４］、ＴＢＡ［２５］、ＣＲＫＬ［２６］、ＧＲＰ７５［３２］、ＧＥＬＳ［３４、７９］、ＴＵＢＢ１［３７］、ＨＳＰ７０［３９］、ＦＩＢＧ［４０］、およびＩＴＡ２Ｂ［４５］。１つのさらなるバイオマーカー候補（ＲＩＮＩ）を、データセットのＡＮＯＶＡ分析によって見出した（ｐ＜０．０５）。詳細に関しては、表４および表（要約）を参照されたい。
モデルを評価するため、１１のＳＣおよび８つのＬＣ試料の独立の試験セットを用いた。モデル最適化法から選択したモデルパラメータを含むトレーニングセットを用いて、予測モデルを構築した。結果は、１１のＳＣ試料のうち９つ、および８つのＬＣ試料すべてが、正しく分類されたことを示し、これは、分類モデルに関する８９％感度に相当する。
したがって、本発明者らは、卵巣癌、結腸直腸癌または膵臓癌、または前立腺癌などの非常に悪性の癌に罹患している被験体における癌状態の非侵襲性診断または予測のために使用可能な、新規血小板由来バイオマーカーパネルを初めて示したと考える。今日、癌状態を決定するためには、病理学者による顕微鏡検査が必要であり、これは病理学者に依存して多様な結果を生じる可能性もある。本態様は、今日用いられているよりも、癌のより客観的な診断および予後を提供する。本態様によって、生検の必要を伴わない癌の診断、治療および予後が可能になる。健康な被験体（癌不含、病変不含）、良性対照（癌不含、良性病変）および癌試料の間の分離のため、ならびに、これらの２つの群からの早期、しばしば局所、非散在癌、および進行癌の分離のために、血小板由来バイオマーカーの組み合わせを設計し、これは続いて、治療戦略の選択に有意な影響を有するであろう。
実施例１−研究１Ａ
患者および試料調製
研究には１１人の対照および腹部に広がった定義された卵巣癌を有する６人の女性が含まれた。対照は、４２〜７０歳の間（平均年齢６５歳）であった。対照は、良性病変、例えば子宮筋腫または良性嚢腺腫を有する女性であった。癌患者は、４９〜７４歳（平均年齢６７歳）であった。すべての患者は、スウェーデン・ソールナにあるカロリンスカ大学病院産婦人科で診断され、そして治療された。以下の表１を参照されたい。
表１、対照および癌患者
単離法（研究１Ｂおよび１Ｃにおいて同じ方法を用いる）
３つの遠心分離工程によって、血小板単離を行った。エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含有するバキュテナー試験管中に血液を得て、凝血を防止し、３０分以内にプロセシングして、そして室温に維持した。患者情報を収集し、そして各試料にユニークな同定コードを与えた。
第一の遠心分離を１５００ｇ、＋４℃で１０分間行った。血漿を収集し、そして赤血球を廃棄した。次いで、収集した血漿を３７００ｇ、＋４℃で１０分間遠心分離した。血小板をほとんど含まない血漿（ＰＰＰ）をエッペンドルフ試験管５ｘ１ｍＬに収集し、そしてさらなる分析のため、−７０℃で保存した。残りのペレット（単離血小板分画）を再懸濁し、そして５００μＬの０．９％ＮａＣｌ中で洗浄し、エッペンドルフ遠心管中、５６００ｇ、＋６℃で１０分間遠心分離した。上清を廃棄し、そしてペレット重量を記録した。血小板ペレットの代表的な試料を調製し、そして血小板単離物の品質および純度を顕微鏡によって確認した。
血小板分画を抽出し、そしてさらに完全に乾燥するまで凍結乾燥して、そして９Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、１Ｍ ＥＤＴＡ、２５ｍＭ ３−８（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、プロテアーゼ阻害剤およびキャリアー両性電解質を含有する溶解緩衝液中に再懸濁した。
血小板タンパク質溶解物を、室温で３時間振盪した後、１２０００ＲＰＭで１５分間遠心分離した。上清を収集し、そしてＢｒａｄｆｏｒｄタンパク質分析プロトコル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのＱｕｉｃｋ ＳｔａｒｔＴＭ）を用いて、タンパク質濃度を測定した。
タンパク質分離
二次元ゲル電気泳動（２−ＤＥ）分析前に、タンパク質溶解物を、各試料に関して、７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、６５ｍＭ ＣＨＡＰＳ、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ１００、０．５％ｖ／ｖ固定ｐＨ勾配（ＩＰＧ）緩衝液ｐＨ４〜７および１８ｍＭジチオスレイトールを含有する３００μＬの再水和緩衝液中、７５．０μｇ総タンパク質の濃度に希釈した。
第一の分離工程は、等電点電気泳動（ＩＥＦ）であり、等電点に関してタンパク質を分離し、そして２２．５時間、泳動した。長さ１７ｃｍ、ｐＨ４〜７のＩＰＧストリップ（ＢｉｏＲａｄ）を用いた。
第二の次元、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）は、分子量に関して、タンパク質を分離する。２−ＤＥゲルは、架橋剤としてピペラジンジアクリルアミド（ＰＤＡ）を用い、１０〜１３％アクリルアミド勾配であり、２００ｘ２５０ｘ１．５ｍｍのサイズであった。試料タンパク質を、１００ボルト、１２℃でおよそ２０時間分離した。
質量分析適合染色プロトコルを用いて、ＳＤＳゲルを銀染色し、そしてＥｐｓｏｎ画像スキャナＩＩＩ、１６ビット解像度でスキャンした。ソフトウェアＰｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ＳａｍｅＳｐｏｔｓ（Ｎｏｎｌｉｎｅｒａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ）を用いて、画像をさらに分析した。
質量分析によるタンパク質の同定
銀染色バンドをゲルから切り出し、ゲル内消化のため処理し、そして本質的に先に記載されるように、Ｌｕｄｗｉｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ウプサラで分析した（Ｈｅｌｌｍａｎ， Ｕ．（２０００）Ｓａｍｐｌｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｂｙ ＳＤＳ／ＰＡＧＥ ａｎｄ ｉｎ−ｇｅｌ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ． ＥＸＳ ８８，４３−５４．）。簡潔には、Ｆａｒｍｅｒ試薬を用いて、銀を脱染色し、そしてトリプシン（ブタ、修飾、配列等級、Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）を乾燥ゲル片に導入した。一晩トリプシン消化した後、ペプチドをＣ１８ Ｚｉｐ Ｔｉｐカラムに結合させ、洗浄し、そして次いで、直接、ターゲットプレート上にあるマトリックス（アルファ−シアノ４−ヒドロキシ桂皮酸）を含有するアセトニトリルで溶出した。Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ、ドイツ・ブレーメンのＵｌｔｒａｆｌｅｘ ＩＩＩ ＴＯＦ／ＴＯＦ上のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって、質量リストを生成した。検索エンジンＭＡＳＣＯＴ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ、英国ロンドン）を用いて、ＮＣＢＩ ｎｒ配列データベースの現在のバージョンをスキャンすることによって、同一性に関する検索を行った。自己分解トリプシンペプチドを用いて、スペクトルを内部較正し、そして許容性を０．０２Ｄａに設定した。メチオニン酸化を可能にした。検索エンジンのスコアリングシステムから、同一性の有意性を判定した。
結果および考察
対照および広がった卵巣癌を有する患者を比較した際、３５の増加したまたは減少したタンパク質スポットが見出された（図１）。広がった卵巣癌において、全体で、１９のスポットが減少し、そして１７のスポットが増加した。
タンパク質の同定
総合すると、３５のタンパク質スポットを切り出し、そして質量分析によって分析した。本発明者らは１５の成功した同定を得て；対照に比較して、８つのタンパク質スポットは癌群において減少し、そして７のタンパク質スポットは増加した（表２）。
表２、バイオマーカーの同定
１−スポット番号
２−観察された等電点（ｐＩ）および分子量（Ｍｒ）
３−矢印は増加または減少を示す
４−インテグリン・アルファ２ｂは、７つの異なるタンパク質スポットによって示され、４つのタンパク質スポットは癌において減少し、そして残りの３つのタンパク質スポットは増加した。
インテグリン、アルファ２ｂは、同定する１５タンパク質スポットのうち７つによって示された。本発明者らは、位置を見て、このうち４つがゲルの酸性部分および１００ｋＤａより上に位置し、そして減少することを観察した（図２）。インテグリン、アルファ２ｂのリン酸化アイソフォームの減少したレベルは、癌における機能喪失と関連した。他の２つの同定されたインテグリンは、２−ＤＥゲルの右、１００ｋＤａより上に位置し、そしてこれらは増加する。インテグリンは、少なくとも１３のリン酸化部位を有し、これはおそらく、タンパク質スポットの「列構造（ｔｒａｉｎ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」を生じ、そして多くの異なる翻訳後修飾を生じうる。
診断アルゴリズム
バイオマーカーの相対量を、以下の診断アルゴリズムにしたがって計算した：
（［ＦＥＲＭＴ３＋ＴＵＢＢ１＋ＶＣＬ］＋［ＩＴＧＡ２Ｂ（塩基性）］）／（［ＷＤＲ１＋ＦＬＮＡ＋ＡＣＴＮ１］＋［ＩＴＧＡ２Ｂ（酸性）］）（３）
癌を癌でない状態から区別するカットオフ値を、以下のように定義した：
［（癌平均値−１ ＳＤＥＶ）＋（対照平均値＋１ ＳＤＥＶ）］×１／２ （４）
ここで、癌平均値は、６人の癌患者に適用した上記診断アルゴリズム（３）を用いて得た平均値に相当し、ＳＤＥＶは標準偏差に相当し、そして対照平均値は、１１人の対照に適用した上記診断アルゴリズム（３）を用いて得た平均値に相当する。
図３は、１７の試料に関して、上記診断アルゴリズム（３）の出力値を例示する。上記等式（４）から得たカットオフ値は０．２９であった。
実施例２−研究１Ｂ
研究２には、１６人の良性対照（ＢＣ）および腹部まで広がった定義される進行性卵巣癌（ＳＣ）を有する２０人の女性が含まれた。対照は、良性病変、例えば子宮筋腫または良性嚢腺腫を有する女性であった。すべての癌患者はカロリンスカ大学病院婦人科超音波部で診断された。記載する標準化法（実施例１および２）にしたがって、血小板を調製しそして分析した。２Ｄゲル分離したタンパク質を画像分析した後、すべての試料に相当するデータを、多変量統計（部分的最小二乗判別分析、ＰＬＳ）によってさらに分析した。２つの成分を含むＰＬＳモデルは、最適の結果を示した（図５を参照されたい）。最適化および交差検証モデルに関して、９０％の感度および９４％の特異性を得た。
ＶＩＰ（重要性変数）パラメータを用いて、予測への寄与にしたがって変数をランク付けした。次いで、上位にランキングされた変数（最高ＶＩＰ値に相当するタンパク質スポット）を質量分析による同定のために選択した。総合して、上位１６にランキングされるタンパク質の＞７５％、そして上位５０にランキングされるタンパク質の＞５０％を同定した。成功した同定を表４に列挙し、検証がより実行不能と見なされたため、いくつかの同定を排除した。以下のバイオマーカー候補を選択し、ＶＩＰランクにしたがってソーティングした（括弧内に［ＶＩＰランク］を示す）：ＥＲＰ２９［１］、ＡＣＴＮ４［３］、ＨＰ［４、８］、ＴＬＮ１［６、１０、１１、１２、２７、５０］、ＳＲＣ［６］、ＩＴＢ３［１３］、ＨＳＰ７１［１６］、ＴＢＡ４Ａ［１９］、ＩＴＡ２Ｂ［２４］、ＴＢＡ［２５］、ＣＲＫＬ［２６］、ＧＲＰ７５［３２］、ＧＥＬＳ［３４、７９］、ＴＵＢＢ１［３７］、ＨＳＰ７０［３９］、ＦＩＢＧ［４０］、およびＩＴＡ２Ｂ［４５］。１つのさらなるバイオマーカー候補（ＲＩＮＩ）を、データセットのＡＮＯＶＡ分析によって見出した（ｐ＜０．０５）。詳細に関しては、表４および表（要約）を参照されたい。
モデルを評価するため、１１のＳＣおよび８のＬＣ試料の独立の試験セットを用いた。モデル最適化法から選択したモデルパラメータを含むトレーニングセットを用いて、予測モデルを構築した。結果は、１１のＳＣ試料のうち９つおよび８つのＬＣ試料すべてが、正しく分類されたことを示し、これは、分類モデルに関する８９％感度に相当する。
患者および試料調製
研究には１６人の対照および腹部に広がった定義された卵巣癌を有する３１人の女性が含まれた。対照は、６２±１４（ｓｄｅｖ）歳の平均年齢を有し、そしてこれらはソールナにあるカロリンスカ大学病院産婦人科で収集された。対照は、良性病変、例えば子宮筋腫または良性嚢腺腫を有する女性であった。癌患者は、６５±１２（ｓｄｅｖ）歳の平均年齢を有した。癌患者は、カロリンスカ大学病院婦人科超音波部で診断された。以下の表３を参照されたい。
表３、対照および癌患者−研究１Ｂ
試料単離および調製のため、上記実施例１Ａにおけるものと同じ方法を用いた。
データ分析
部分的最小二乗（ＰＬＳ）を用いて、データをモデリングした（ＰＬＳ回帰：計量化学の基本的ツール Ｃｈｅｍｏｍｅｔｒｉｃｓ ａｎｄ Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｓｙｓｔｅｍｓ Ｗｏｌｄ Ｓ， Ｓｊｏｅｓｔｒｏｅｍ Ｍ， Ｅｒｉｋｓｓｏｎ， Ｌ， ２００１， ５８， １０９−１３０）。該方法は、予測因子マトリックス（Ｘ）と応答マトリックス（Ｙ）の共分散を最大化し、対応する次元（ＰＬＳ成分／潜在性変数）を維持することを通じて、データ中の次元を還元させる回帰法である。ＸおよびＹの間の関係に重要である変数を同定することが可能である。１つのこうした変数重要性測定値が、射影における変数重要性（ＶＩＰ）パラメータである。ＶＩＰは、ＰＬＳ加重の平方の加重合計であり、モデル中の各ＰＬＳ成分のＹ変数の量から、加重を計算する。ここで、予測因子マトリックスは２ＤＥデータであり、そして反応はクラスメンバーシップを示す二値ベクトルであり、この場合、ゼロは対照（ＢＣ）クラスに相当し、そして１は癌（ＳＣ）クラスに相当する（表３）。モデルで予測される新規試料に関するクラスメンバーシップを決定するため、予測されるｙ値がカットオフ未満である場合、予測されるクラスメンバーシップがこの場合のＢＣであるように、そして予測されるｙ値がカットオフより上である場合、予測されるクラスメンバーシップがＳＣであるように、ｙに関するカットオフを設定する。本発明者らは、カットオフ＝０．５を選択した。ＰＬＳモデル形成をＳＩＭＣＡ Ｐ ｖ１３．０（Ｕｍｅｔｒｉｃｓ ＡＢ、スウェーデン）で行った。
あるいは、画像分析ソフトウェアＳａｍｅＳｐｏｔｓ（Ｎｏｎｌｉｎｅｒａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）によって、提供される統計ツール（ＡＮＯＶＡ）を用いて、変数（タンパク質スポット）を選択した。
質量分析によるタンパク質の同定
銀染色タンパク質スポットをゲルから切り出し、ゲル内消化のため処理し、そして本質的に先に記載されるように、Ｌｕｄｗｉｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ウプサラで分析した（Ｈｅｌｌｍａｎ， Ｕ．（２０００）Ｓａｍｐｌｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｂｙ ＳＤＳ／ＰＡＧＥ ａｎｄ ｉｎ−ｇｅｌ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ． ＥＸＳ ８８，４３−５４．）。簡潔には、Ｆａｒｍｅｒ試薬を用いて、銀を脱染色し、そしてトリプシン（ブタ、修飾、配列等級、Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）を乾燥ゲル片に導入した。一晩トリプシン消化した後、ペプチドをＣ１８ Ｚｉｐ Ｔｉｐカラムに結合させ、洗浄し、そして次いで、直接、ターゲットプレート上にあるマトリックス（アルファ−シアノ４−ヒドロキシ桂皮酸）を含有するアセトニトリルで溶出した。Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ、ドイツ・ブレーメンのＵｌｔｒａｆｌｅｘ ＩＩＩ ＴＯＦ／ＴＯＦ上のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって、質量リストを生成した。検索エンジンＭＡＳＣＯＴ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ、英国ロンドン）を用いて、ＮＣＢＩ ｎｒ配列データベースの現在のバージョンをスキャンすることによって、同一性に関する検索を行った。自己分解トリプシンペプチドを用いて、スペクトルを内部較正し、そして許容性を０．０２Ｄａに設定した。メチオニン酸化を可能にした。検索エンジンのスコアリングシステムから、同一性の有意性を判定した。
結果
２Ｄゲルの画像分析は、完全データセットに相当する、１２８３の検出され、マッチし、選択され、そして分析されるタンパク質スポット（変数）を生じた（患者群を表３に記載する）。
２Ｄゲル分離タンパク質の画像分析後、多変量統計（部分的最小二乗判別分析、ＰＬＳ）によって、すべての試料に相当するデータをさらに分析した。すべてのデータを分析前に規準化し、そして多変量モデル形成前に、データをまた、プレプロセシングした（ｌｏｇ２変換）。２つの成分を持つＰＬＳモデルは最適な結果を示した（図５）。最適化および交差検証モデルに関して、９０％の感度および９４％の特異性を得た。
ＶＩＰパラメータを用いて、予測への寄与にしたがって変数をランク付けした。次いで、上位にランキングされた変数（タンパク質スポット）を質量分析による同定のために選択した。成功した同定を以下の表４に列挙する。
表４、研究１Ｂにおけるバイオマーカーの同定−ＰＬＳモデルに基づく
（１）−質量分析データに基づく一次ＥＭＢＬ寄託番号
（２）−対応するＵＮＩＰＲＯＴ寄託番号
（３）−ＳａｍｅＳｐｏｔソフトウェアによって提供されるスポット番号、２Ｄ参照マップ上の位置に関しては、図６を参照されたい
（＊）−これらのバイオマーカー候補はまた、ＡＮＯＶＡ検定にしたがって、有意に改変された（Ｐ＜０．０５）
（＄）−これらのバイオマーカー候補はまた、研究１にも記載された（実施例１）
（□）−これらのバイオマーカー候補はまた、研究１にも見られた
ＡＮＯＶＡによって分析される完全データセット（選択基準：ｐ＜０．０５、ｑ＜０．０５、倍変化＞１．５ｘ）は、相補的結果を生じた。
モデルを評価するため、１１のＳＣおよび８のＬＣ試料の独立の試験セットを用いた。モデル最適化法から選択したモデルパラメータを用いて、トレーニングセット上でモデルを構築した。本発明者らは、カットオフ＝０．５を選択した。１１のＳＣ試料のうち９つおよび８つのＬＣ試料すべてが正しく分類され、これは分類モデルに関する８９％の感受性に相当する。
実施例３−研究１Ｃ
研究１ａおよび１Ｂにおける主な目的は、早期段階で骨盤内腫瘤を悪性と診断するために使用可能なバイオマーカーパネルを記載することであった。しかし、ここで、研究１Ｃにおいて、本発明者らは、正常な健康状態からの逸脱を示すさらなるパネルを記載する。次いで、この逸脱は、良性の性質または癌であってもよく、そして研究１Ａおよび１Ｂに記載するパネルは、したがって、以下の癌診断に必要であろう。
すべての材料および方法は、研究１Ａおよび１Ｂにおいて記載されるものと同じであった。健康な対照（ＨＣ）に対応する患者試料を表３に記載する。１０のマーカーは、ＨＣおよびＢＣおよび／または癌（ＳＣ／ＬＣ）由来の試料間で有意に（Ｐ＜０．０１）異なるレベルを示した：ＫＡＰ３、ＣＮＤＰ２、ＩＬＥＵ、ＳＰＢ６、ＳＨＬＢ１、ＣＡＺＡ１、ＰＨＢ、ＴＭＰ１、ＧＰＩＸおよびＡＰ４Ａ。すべてのマーカーを以下の表５に記載する。
バイオマーカー候補のこのパネルは、健康な被験体、ならびにありうる卵巣起源の良性および／または悪性骨盤内腫瘤を患う被験体の間の発現に有意な（ｐ＜０．０１）相違を示す。
表５、健康な被験体由来の病変を区別する研究１Ｃ由来のバイオマーカー
実施例４−研究２
前立腺癌の診断は、今日、患者に非常に厳しい。一般的に用いられるバイオマーカーＰＳＡは、唯一の指標測定値である。これは、ＰＳＡの増加したレベルが、生検の必要性を生じるという事実を導く。これは非常に厄介であり、そして副作用は非常に大きい。第一に、最大５％の患者が敗血症の治療を受けるために、１日以内に救急治療室に行く必要がある。次いでまた、性機能の喪失に伴う問題がある。最悪の副作用は、生検処置の結果として、生存癌細胞を蔓延させる潜在的なリスクがあることである。これらの事実に基づいて、前立腺癌の診断のための改善された、そしてより信頼性があるツールの緊急の必要性がある。
本発明者らは、卵巣癌プロジェクトに関するのと同じプロトコルを用いて、血液試料を収集した（研究１）。総合すると、４９人の男性患者由来の試料を、カロリンスカ大学病院泌尿器外来から収集した。すべての患者は、高いＰＳＡ（前立腺特異的抗原）スコアを示し、そして診断は、ＴＮＭ分類にしたがって、Ｔ１〜Ｔ３に等級付けされた。最も高齢の患者は１９３６年に生まれ、そして癌診断時に７６歳であった。最も若い患者は１９６０年に生まれ、そして診断時に５３歳であった。
健康な対照から試料を収集した（１０人の男性志願者）。すべての被験体は「ストックホルム２研究」（ダンデリード病院）に含まれ、ここで、患者は前立腺バイオバンキングおよびスクリーニングプロジェクトのため、生検材料を提供した。すべての対照は、低いＰＳＡレベルを示し、そして健康であると宣言された。この群の最高齢は１９４２年に生まれ、そして最年少は１９５７年に生まれ；それぞれ、血液収集時に７０歳および５６歳であった。
研究２に関して、本発明者らは、１０人の健康な被験体、病期Ｔ３（進行した癌に対応する）の１０人の患者、病期Ｔ２の９人の患者、および病期１の２人の患者を含めた。Ｔ１およびＴ２群は、早期癌と見なされた。先に記載するように、すべての試料を調製し、そして分析した（研究１）。
予備的データによって、バイオマーカープロファイルが研究１（卵巣癌）由来の結果に非常に類似であることが示される。ＰＣＡ分析は、健康な対照および進行した癌の間の分離を示す。本研究で同定されるタンパク質バイオマーカー候補は、卵巣癌から同定されるマーカーとの有意な重複を示す。しかし、まだ同定されていない多くのバイオマーカー候補は、前立腺癌および卵巣癌の間の示差的発現を示す。
卵巣癌および前立腺癌に関して、研究１および研究２で同定されるバイオマーカーを、以下の表６に要約する。
表６、研究１−２に記載するバイオマーカー候補、卵巣癌および前立腺癌
実施例５−研究３および４
膵臓癌および結腸直腸癌は、世界中で最も致死性の悪性腫瘍のうちのいくつかであり、そしてしたがって、早期検出のための改善されたスクリーニングツールに対する緊急の必要性がある。さらに、現在のスクリーニングプログラムの実行にも関わらず、これらの悪性腫瘍のうちの約５０％は進行した腫瘍段階で検出される。
臨床的および前臨床的研究に基づいて、顕著な進歩が達成されてきているが、これらは、臨床で等しく価値ある改善であるとは解釈されてこなかった。現在の臨床実施において、膵臓癌および結腸直腸癌のスクリーニングは、最新技術の画像撮影、またはさらに侵襲性診断法に基づく。診断様式は、超音波内視鏡検査（ＥＵＳ）、試験腹腔鏡検査／開腹、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、および磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を含む。
健康なドナー由来の血小板のプロテオームが、結腸および膵臓の癌腫を有する患者由来のものとは異なる可能性があることに基づいて、本研究の目的は、血小板が、別個の群におけるタンパク質発現に関して異なる可能性があるか、二次元ゲル電気泳動（２−ＤＥ）を用いて分析することであった。総合すると、本発明者らは、膵臓癌患者由来の１２の試料、結腸直腸癌患者由来の１２の試料、および１２の健康な被験体を、２−ＤＥおよび質量分析によってスクリーニングして、血小板の癌関連タンパク質レパートリーおよび対応する腫瘍関連タンパク質を同定した。
材料および方法
患者
研究は地域倫理委員会によって認可された。研究に含まれるすべての患者は、書面のインフォームドコンセントにサインした。患者は健康な対照（ｎ＝１２）、ならびに膵臓癌腫（ｎ＝１２）および結腸直腸癌腫（ｎ＝１２）を有する患者に分けられた。血小板単離のための試料試験管に血液試料を得て、そして収集した。
血小板単離
ＥＤＴＡを含有する９ｍｌモノベットにヒト血液を収集し、そして２００ｘｇ、室温で２０分間、標準的実験室遠心分離装置中で遠心分離した。続いて、バフィーコートを含まない血漿を、注意深く、新規２．０ｍｌ反応試験管内に移し、そして１，３００μｌ ＰＢＳ緩衝液で希釈した。８００ｘｇ、室温で１０分間の第二の遠心分離工程後、上清を取り除き、そして−８０℃で保存するため、溶解緩衝液中に血小板を再懸濁した。
二次元ゲル電気泳動（２−ＤＥ）
ＥＺＱタンパク質定量化キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、タンパク質定量化を行った。各試料のタンパク質および内部標準を蛍光色素（ＮＨ ＤｙｅＡＧＮＯＳＴＩＣ）で標識した後、ゲルあたり１５０μｇタンパク質（２ｘ５０μｇ試料に加えて５０μｇ内部標準）を、４５０μＬ再水和試料緩衝液（７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、２％ＣＨＡＰＳ、２％両性電解質（ｐＨ４〜７、Ｓｅｒｖａ）、０．３％ＤＴＴ、および少量のブロモフェノールブルー）に溶解した。最初の次元は、固定ｐＨ勾配（ＩＰＧ）ストリップ４〜７、２４ｃｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で達成され、そして第二の次元は、１２．５％プレキャストゲル（Ｓｅｒｖａ）上でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって達成された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にＴｙｐｈｏｏｎ ＦＬＡ ９０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いることによって、ゲル画像をスキャンした。ソフトウェアＰｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ＳａｍｅＳｐｏｔｓ（ｖ４．１、Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いることによるゲル内分析から、群間のタンパク質発現レベルの倍変化を得た。
マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）
マトリックス支援レーザー脱離イオン化時間飛行（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析のため、有意なスポットを自動的に切り取り、そして複数回洗浄して、染色色素および他の阻害性化学薬品を除去した。乾燥ゲルスポットを、１０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３中、１２．５ｎｇ／μＬ配列決定等級トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）の氷冷溶液中で再水和した。タンパク質をゲル内で、３７℃で４時間消化した。１０μＬの０．１％ＴＦＡでペプチドを３０分間抽出し、そして製造者の指示にしたがって、ＭＡＬＤＩ−プレスポットＡｎｃｈｏｒＣｈｉｐターゲット（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｋｓ）に直接適用した。
続いて、試料を時間飛行Ｕｌｔｒａｆｌｅｘ−Ｔｏｆ／Ｔｏｆ質量分析（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｋｓ）で分析した。獲得した質量スペクトルを自動的に較正し、Ｃｏｍｐａｓｓ １．３ソフトウェア（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｋｓ）を用いて注釈を付けて、そして各個々のスポットからの結果を用いて、以下の設定：酵素「トリプシン」、種「ヒト」、固定修飾「カルバミドメチル」、場合による修飾「メチオニン酸化」および切断見逃し（ｍｉｓｓｅｄ ｃｌｅａｖａｇｅ）「１」を考慮して、Ｍａｓｃｏｔ検索エンジン（バージョン２．２、Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ）を用いたＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ（Ｓｐｒｏｔ＿５７．８、２０４０１タンパク質エントリー）非冗長データベースのヒトサブセットを検索した。質量許容を５０ｐｐｍに設定した。これらの設定を用いて、７０より大きいマスコットスコアを有意と解釈した（ｐ＜０．０１）。
結果
研究に含まれる３６人の患者すべてのタンパク質抽出物を含有する混合内部標準とともに、腫瘍（膵臓および結腸）の血小板および正常試料の間で、２−ＤＥ多重化蛍光技術（ＮＨ ＤｙｅＡＧＮＯＳＴＩＣ）を用いて、タンパク質発現を比較した。２−ＤＥ後、ＳａｍｅＳｐｏｔｓソフトウェアを用いたＣｙ２、Ｃｙ３、およびＣｙ５ゲル画像の分析によって、膵臓腫瘍および正常スポット体積比の間に統計的有意性を持つ３５のタンパク質、ならびに結腸腫瘍および正常スポット体積比の間に統計的有意性を持つ３６のタンパク質の存在量の変化が明らかになった（ｐ＜０．０５）。すべてのタンパク質をゲルから切り出し、そして質量分析によってさらに分析した。
要約すると、これらの研究によって、先に報告された血清バイオマーカーよりも高い特異性および感受性の癌腫を診断する潜在能力を持つユニークなタンパク質の新規の個々のパターンが明らかになった。図８〜１０、およ表７〜８を参照されたい。
表７、研究３に記載するバイオマーカー候補、結腸直腸癌
表８、研究４に記載するバイオマーカー候補、膵臓癌
実施例６
卵巣癌の早期検出は非常に困難であるが、療法の早期開始および生存には非常に重要である。
臨床的標準法によって患者から血液試料を得て、そして実施例１に記載する方法にしたがって血小板分画を調製する。血小板溶解物を調製し、そしてタンパク質を分離し、バイオマーカー（表２および図２に明記する）を検出し、そして実施例１に記載する方法にしたがって定量化する。
診断アルゴリズム（３）にしたがって、マーカーの相対量を計算する。次いで、診断アルゴリズムからの出力値を、定義したカットオフ値、好ましくは０．２９に比較する。次いで、０．２９を超える出力値は、卵巣癌に関する高リスクを示し、そしてしたがって、さらなる検査およびそれに続く療法を可能な限り早く開始すべきであることを示す。
実施例７
実施例１〜２、または４〜５に記載する、患者に関して得られる結果を用いて、患者の予後改善のため、適切な治療レジメンを選択する。癌と同定された患者に関して、推奨されるケアプログラムにしたがって、遅延なしに治療を開始する。
実施例８
抗体に基づく定量的技術を用いた、卵巣癌の血小板に基づく診断
実際的な臨床的設定において、上述のバイオマーカーを測定する方法を用いて、そして抗体に基づく技術を用いて、診断を行う必要がある場合、以下のシナリオが適用可能である：
（１）２０人の良性対照および２０人の進行した卵巣癌を有する患者由来の血小板の調製物を用いて、定量的ウェスタンブロット（あるいはＥＬＩＳＡまたはＬｕｍｉｎｅｘに基づく技術）によって、上述のバイオマーカーパネルを分析する。次いで、各バイオマーカーの定量的シグナルを、適切な選択した内部標準の定量的シグナルに対して規準化する（例えばＧＡＰＤＨまたはガンマ１４−３−３、Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒ Ｒら Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｌｏｗ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ， ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｔｏ ＧＡＰＤＨ， ａｃｔｉｎ ａｎｄ ｔｕｂｕｌｉｎ， ａｓ ｔｏｏｌｓ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ． Ｊ． Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ， ２０１３（９４）５４０−５１）。
（２）次いで、実施例２に記載するように、適切な多変量ソフトウェア（例えばＳＩＭＣＡ Ｐ ｖ１３、Ｕｍｅｔｒｉｃｓ ＡＢ）によって、データを分析する。この方法は、新規の未知の試料の診断のための予測ツールとして用いられる予測モデルを生じる。予測モデルは、各新規試料に関して、０〜１の間の値を提供し、ここで＞０．５の値は癌を示し、そして＜０．５の値は良性病変を示す。この方法を用いて、標準化法を用いた局所予測データベースを構築し、そしてさらに、結果を他の認定された分析実験室からの対応するデータベースに比較してもよい
（３）以前には未知であった試料に対応する外科的組織試料の組織病理学的検査に基づいて得た最終診断後、情報（診断およびバイオマーカーレベル）を局所予測データベース（上記１を参照されたい）に加えた。この相互作用プロセスを通じて、感度および特異性増加を達成するため、予測モデルは次第にアップグレードされる。
要約すると、本発明に記載するような早期非侵襲性癌診断で使用するため、個々の研究は、併せて、４５のユニークなタンパク質マーカーを検出した。すべてのこれらのマーカー、および同定された研究を以下の表９に記載する。
表９、要約表、研究１〜４のいずれかに記載するバイオマーカー候補（ｎ＝４５）
研究によって、記載する４種類の癌すべての診断に適用可能な、１２バイオマーカーのパネルが明らかになった。表１０を参照されたい。
表１０、研究１〜４すべてに共通のバイオマーカー候補
上述の態様は、本発明のいくつかの例示的実施例と理解されるものとする。当業者には、多様な修飾、組み合わせおよび変化を行って、本発明の範囲から逸脱することなく、態様を作製することも可能であることが理解されるであろう。特に、異なる態様における異なる部分的解決を、技術的に可能である場合、他の配置と組み合わせてもよい。しかし、本発明の範囲は、付随する請求項によって定義される。

Claims (19)

  1. 被験体が良性病変または癌腫病変に罹患しているか決定する方法であって：
    前記被験体由来の生物学的試料における少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーを測定し、ここで前記の少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーは、α−アクチニン１（ＡＣＴＮ１）、α−アクチニン４（ＡＣＴＮ４）、ｃｒｋ様タンパク質（ＣＲＫＬ）、小胞体タンパク質２９（ＥＲＰ２９）、（ＦＥＲＭ）、フィブリノーゲン・ガンマ鎖（ＦＩＢＧ）、フィラミンＡ（ＦＬＮＡ）、ゲルゾリン（ＧＥＬＳ）、ミトコンドリア・ストレス−７０タンパク質（ＧＲＰ７５）、ＨＰタンパク質、熱ショックタンパク質７０ｋＤａ（ＨＳＰ７０）、熱ショックタンパク質７１ｋＤａ（ＨＳＰ７１）、インテグリン・アルファ−２ｂ（ＩＴＧＡ２Ｂ）、インテグリン・ベータ−３（ＩＴＢ３）、リボヌクレアーゼ阻害剤（ＲＩＮＩ）、癌原遺伝子チロシン−プロテインキナーゼＳｒｃ（ＳＲＣ）、チューブリン（ＴＢＡ）、チューブリン・アルファ−４Ａ鎖（ＴＢＡ４Ａ）、３−メルカプトピルビン酸イオウ転移酵素（ＴＨＴＭ）、タリン−１（ＴＬＮ１）、チューブリン・ベータ−１鎖（ＴＵＢＢ１）、ビンキュリン（ＶＣＬ）およびＷＤリピート含有タンパク質１（ＷＤＲ１）からなる群より選択され；そして
    前記測定に基づいて、前記被験体が前記良性病変または前記癌腫病変に罹患しているか決定する
    工程を含む、前記方法。
  2. 前記被験体が前記良性病変または前記癌腫病変に罹患しているか決定する工程が、前記測定に基づいて、前記被験体が前記良性病変または卵巣癌もしくは前立腺癌病変に罹患しているか決定する工程を含む、請求項１記載の方法。
  3. 前記の少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーを測定する工程が、前記生物学的試料において、ＥＲＰ２９、ＡＣＴＮ４、ＨＰタンパク質、ＴＬＮ１、ＳＲＣおよびＴＨＴＭからなる群より選択される少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーを測定する工程を含む、請求項１または２記載の方法。
  4. 前記の少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーを測定する工程が、前記生物学的試料において、前記の少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーのそれぞれの量を測定する工程を含み、さらに：
    前記のそれぞれの量を、対照被験体由来の生物学的試料における前記のそれぞれの血小板由来バイオマーカーの量を表す、それぞれの対照量と比較する工程を含む、ここで
    前記被験体が前記良性病変または前記癌腫病変に罹患しているか決定する工程が、前記比較に基づいて、前記被験体が前記良性病変または前記癌腫に罹患しているか決定する工程を含む
    請求項１〜３のいずれか記載の方法。
  5. 請求項１〜４のいずれか記載の方法であって、前記被験体が前記良性病変または前記癌腫病変に罹患しているか決定する工程が、前記測定に基づいて、前記被験体が前記良性病変または初期段階癌腫病変に罹患しているか決定する工程を含む、前記方法。
  6. 被験体における良性および／または癌腫病変の存在を予測する方法であって：
    前記被験体由来の生物学的試料における少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーを測定し、ここで前記の少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーは、ジアデノシン四リン酸（ＡＰ４Ａ）、Ｆ−アクチン・キャッピング・タンパク質サブユニット・アルファ−１（ＣＡＺＡ１）、細胞質ゾル非特異的ジペプチダーゼ（ＣＮＤＰ２）、糖タンパク質ＩＸ（ＧＰＩＸ）、白血球エラスターゼ阻害剤（ＩＬＥＵ）、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ・サブユニットＲＩＩ−ベータ（ＫＡＰ３）、プロヒビチン（ＰＨＢ）、エンドフィリン−Ｂ１（ＳＨＬＢ１）、セルピンＢ６（ＳＰＢ６）およびトロポミオシン・アルファ−１（ＴＭＰ１）からなる群より選択され；そして
    前記測定に基づいて、前記被験体における良性および／または癌腫病変の存在を予測する
    工程を含む、前記方法。
  7. 前記の良性および／または癌腫病変の存在を予測する工程が、前記測定に基づいて、前記被験体における良性および／または卵巣癌もしくは前立腺癌病変の存在を予測する工程を含む、請求項６の方法。
  8. 前記の少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーを測定する工程が、前記生物学的試料において、前記の少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーのそれぞれの量を測定する工程を含み、さらに：
    前記のそれぞれの量を、対照被験体由来の生物学的試料における前記のそれぞれの血小板由来バイオマーカーの量を表す、それぞれの対照量と比較する工程を含む、ここで
    良性および／または癌腫病変の存在を予測する工程が、前記比較に基づいて、前記被験体における前記の良性および／または癌性病変の存在を予測する工程を含む
    請求項６または７記載の方法。
  9. 被験体における結腸直腸癌または膵臓癌の存在を予測する方法であって：
    前記被験体由来の生物学的試料における少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーを測定し、ここで前記の少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーは、ベータ−アクチン（ＡＣＴＢ）、α−アクチニン１（ＡＣＴＮ１）、カスパーゼ３（ＣＡＳＰ３）、コフィリン１（ＣＬＦ１）、クラスタリン（ＣＬＵ）、ファルネシルピロリン酸シンターゼ（ＦＰＰＳ）、ゲルゾリン（ＧＥＬＳ）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ・オメガ−１（ＧＳＴＯ１）、熱ショックタンパク質ＨＳＰ９０−ベータ（ＨＳＰ９０ＡＢ１）、ハロ酸脱ハロゲン化酵素様加水分解酵素ドメイン含有タンパク質２（ＨＤＨＤ２）、インテグリン・アルファ−２ｂ（ＩＴＧＡ２Ｂ）、インテグリン・ベータ−３（ＩＴＢ３）、インテグリン・アルファ−６（ＩＴＧＡ６）、マレクチン（ＭＬＥＣ）、プロヒビチン（ＰＨＢ）、リボヌクレアーゼ阻害剤（ＲＩＮＩ）、アルファ−シヌクレイン（ＳＮＣＡ）、セルピンＢ６（ＳＰＢ６）、チューブリン・アルファ−４Ａ鎖（ＴＢＡ４Ａ）、タリン−１（ＴＬＮ１）、腫瘍感受性遺伝子１０１タンパク質（ＴＳＧ）、チューブリン・ベータ−１鎖（ＴＢＢ１）、ビンキュリン（ＶＣＬ）およびＷＤリピート含有タンパク質（ＷＤＲ１）からなる群より選択され；そして
    前記測定に基づいて、前記被験体における前記結腸直腸癌または膵臓癌の存在を予測する
    工程を含む、前記方法。
  10. 前記の少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーを測定する工程が、前記生物学的試料において、ＡＣＴＢ、ＡＣＴＮ１、ＣＡＳＰ３、ＣＦＬ１、ＣＬＵ、ＦＰＰＳ、ＧＥＬＳ、ＧＳＴＯ１、ＨＤＨＤ２、ＩＴＧＡ２Ｂ、ＩＴＢ３、ＩＴＧＡ６、ＭＬＥＣ、ＰＨＢ、ＲＩＮＩ、ＳＮＣＡ、ＳＰＢ６、ＴＢＡ４Ａ、ＴＬＮ１、ＴＳＧ、ＴＵＢＢ１、ＶＣＬおよびＷＤＲ１からなる群より選択される前記の少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーを測定する工程を含み；そして
    前記結腸直腸癌または膵臓癌の存在を予測する工程が、前記測定に基づいて、前記被験体における前記結腸直腸癌の存在を予測する工程を含む
    請求項９記載の方法。
  11. 前記の少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーを測定する工程が、前記生物学的試料において、ＡＣＴＢ、ＡＣＴＮ１、ＣＡＳＰ３、ＣＦＬ１、ＣＬＵ、ＦＰＰＳ、ＧＥＬＳ、ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＨＤＨＤ２、ＩＴＧＡ２Ｂ、ＩＴＢ３、ＩＴＧＡ６、ＭＬＥＣ、ＰＨＢ、ＲＩＮＩ、ＳＮＣＡ、ＳＰＢ６、ＴＢＡ４Ａ、ＴＬＮ１、ＴＳＧ、ＴＵＢＢ１、ＶＣＬおよびＷＤＲ１からなる群より選択される前記の少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーを測定する工程を含み；そして
    前記結腸直腸癌または膵臓癌の存在を予測する工程が、前記測定に基づいて、前記被験体における前記膵臓癌の存在を予測する工程を含む
    請求項９記載の方法。
  12. 前記の少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーを測定する工程が、前記生物学的試料において、前記の少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーのそれぞれの量を測定する工程を含み、さらに：
    前記のそれぞれの量を、対照被験体由来の生物学的試料における前記のそれぞれの血小板由来バイオマーカーの量を表す、それぞれの対照量と比較する工程を含む、ここで
    前記結腸直腸癌または膵臓癌の存在を予測する工程が、前記比較に基づいて、前記被験体における前記結腸直腸癌または膵臓癌の存在を予測する工程を含む
    請求項９〜１１いずれか記載の方法。
  13. 被験体における癌腫の存在を予測する方法であって：
    前記被験体由来の生物学的試料における少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーを測定し、ここで前記の少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーは、α−アクチニン１（ＡＣＴＮ１）、ゲルゾリン（ＧＥＬＳ）、インテグリン・アルファ−２ｂ（ＩＴＧＡ２Ｂ）、インテグリン・ベータ−３（ＩＴＢ３）、プロヒビチン（ＰＨＢ）、リボヌクレアーゼ阻害剤（ＲＩＮＩ）、セルピンＢ６（ＳＰＢ６）、チューブリン・アルファ−４Ａ鎖（ＴＢＡ４Ａ）、タリン−１（ＴＬＮ１）、チューブリン・ベータ−１鎖（ＴＢＢ１）、ビンキュリン（ＶＣＬ）およびＷＤリピート含有タンパク質（ＷＤＲ１）からなる群より選択され；そして
    前記測定に基づいて、前記被験体における前記癌腫の存在を予測する
    工程を含む、前記方法。
  14. 前記癌腫の前記存在を予測する工程が、前記測定に基づいて、前記被験体における早期段階の癌腫の存在を予測する工程を含む、請求項１３記載の方法。
  15. 前記癌腫の前記存在を予測する工程が、前記測定に基づいて、前記被験体における上皮癌の存在を予測する工程を含む、請求項１３または１４記載の方法。
  16. 前記の少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーを測定する工程が、前記生物学的試料において、前記の少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーのそれぞれの量を測定する工程を含み、さらに：
    前記のそれぞれの量を、対照被験体由来の生物学的試料における前記のそれぞれの血小板由来バイオマーカーの量を表す、それぞれの対照量と比較する工程を含む、ここで
    前記癌腫の存在を予測する工程が、前記比較に基づいて、前記被験体における前記癌腫の存在を予測する工程を含む
    請求項１３〜１５いずれか記載の方法。
  17. 前記の少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーを測定する工程が：
    前記被験体の血液試料から血小板を単離し；
    前記の単離された血小板から血小板タンパク質を抽出し；
    前記の少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーのそれぞれの血小板由来バイオマーカーに特異的に結合するそれぞれの抗体を用いて、前記の少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーの量を測定する
    工程を含む、請求項１〜１６のいずれか記載の方法。
  18. 前記の少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーを測定する工程が：
    前記被験体の血液試料から血小板を単離し；
    前記の単離された血小板から血小板タンパク質を抽出し；
    前記の抽出された血小板タンパク質を、二次元ゲル電気泳動ゲル上で分離し；
    前記の少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーを、前記二次元ゲル電気泳動ゲル上で同定し；そして
    前記二次元ゲル電気泳動ゲル上で、前記の同定された少なくとも２つの血小板由来バイオマーカーの量を測定する
    工程を含む、請求項１〜１６のいずれか記載の方法。
  19. 被験体に関する癌治療レジメンを選択する方法であって：
    請求項１〜５、１７、１８のいずれかにしたがって、前記被験体が良性病変または癌腫病変に罹患しているか決定するか；請求項６〜８、１７、１８のいずれかにしたがって、前記被験体における良性および／または癌腫病変の存在を予測するか；請求項９〜１２、１７、１８のいずれかにしたがって、前記被験体における結腸直腸癌または膵臓癌の存在を予測するか；あるいは請求項１３〜１８のいずれかにしたがって、前記被験体における癌腫の存在を予測し；そして
    前記被験体が前記良性病変または前記癌腫病変に罹患しているかに基づいて；前記被験体における前記良性および／または癌腫病変の前記の予測される存在に基づいて；前記被験体における前記結腸直腸癌または膵臓癌の前記の予測される存在に基づいて；あるいは前記被験体における前記癌腫の前記の予測される存在に基づいて、前記被験体に関する治療レジメンを選択する
    工程を含む、前記方法。
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