CN117388495A - 用于诊断肺癌分期的代谢标志物的应用及试剂盒 - Google Patents
用于诊断肺癌分期的代谢标志物的应用及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本申请涉及生物医学技术领域，特别涉及一种用于诊断肺癌分期的代谢标志物的应用及试剂盒。所述用于诊断肺癌分期的代谢标志物包括硫酸脱氢表雄酮、4‑羟基‑1‑(3‑吡啶)‑1‑丁酮、L‑亮氨酸二肽、辛酰‑L‑肉碱、磷酯胆碱34:3e、酰基肉碱10:0、N‑甲醯甲硫胺酸、5‑甲硫腺苷、磷酯胆碱36:3e、脂肪酸22:6、氢化肉桂酸、酰基肉碱10:1、次黄嘌呤、L‑丙氨酰‑L‑天冬氨酸、亚氨基二乙酸、甜菜碱、胆碱、棕榈酰‑L‑左旋肉碱和L‑谷氨酸。通过对这些代谢标志物进行检测能一次性实现肺癌早期诊断和肺癌临床分期的有效预测。
Description
技术领域
本申请涉及生物医学技术领域，特别涉及用于诊断肺癌分期的代谢标志物的应用及试剂盒。
背景技术
肺癌是全球常见的高死亡率癌症之一，其5年生存率仅为54%。肺癌的精确诊断对于提高患者的存活率至关重要。然而，目前仅有15%的肺癌患者能够在早期阶段被发现。大多数患者在不可治愈的晚期被诊断，这也是导致多数肺癌患者死亡的原因。肺癌在不同阶段的治疗目的和方法有所不同。早期的治疗主要目的是通过手术切除肿瘤，防止癌细胞扩散和转移，同时尽可能保留正常的肺组织。中期手术机会相对减少，一般采用综合治疗，包括化疗、放疗、靶向药物治疗、免疫治疗和中医中药治疗等。对于晚期肺癌患者，治疗的主要目的是减轻症状、提高生活质量、延长生存期。因此，精确诊断肺癌的分期能够为规范和个体化的治疗提供重要参考依据，有助于提高治疗效果、改善患者的生活质量，延长生存期。
目前，肺癌筛查领域主要采用低剂量螺旋CT（LDCT）、支气管镜检查和细胞学标本检测等技术。低剂量螺旋CT主要应用于高危人群的肺癌筛查，虽然在一定程度上取得了一些成功，但其普及受到了成本高昂、假阳性率增加以及潜在的辐射暴露风险等缺陷的限制。支气管镜检查和细胞学标本、病理学检测是当前肺癌诊断的主要方法。然而，这些方法在对位于肺部边缘位置的肿瘤和隐匿性肺癌的准确诊断方面存在一些局限性。支气管镜检查有时无法完全观察到肺部边缘区域，而细胞学标本检测对于某些类型的肿瘤可能不够敏感，病理学诊断对于特殊类型的肺癌，如神经内分泌癌，诊断存在困难，需要多次活检才能确诊，增加患者痛苦、时间和成本。鉴于此，寻找更经济、准确且无创或微创的肺癌筛查方法对于肺癌精确诊断是迫切需要的。
代谢组学研究通过分析生物体在疾病或特定生理状态下产生的代谢产物的变化，揭示与代谢变化相关的生物学过程。通过分析代谢物，可以更好地选择适合患者的治疗方法。在肺癌诊断中，现有的肺癌诊断标志物如CEA（癌胚抗原）、NSE（神经元特异性烯醇化酶）、SCC（鳞癌抗原）、CA125（糖类抗原125）、CYFRA21-1（可溶性细胞角蛋白19片段）等虽然具有一定的临床应用价值，但存在局限性，这些标志物主要用于辅助诊断和监测肺癌的发展情况，并不能准确预测肺癌的分期。确诊肺癌的分期仍然需要通过病理诊断来确定。因此，临床实验室急需开发更具特异性和敏感性的肿瘤标志物，以改善肺癌的诊断和治疗。尤其是在面对肺癌分期组织学形态不典型、鉴别诊断困难等问题时，新的肿瘤标志物的开发显得尤为重要。通过引入新的肿瘤标志物，可以提高对肺癌和肺癌分期的诊断准确性，为患者提供更准确、更有效的治疗选择，并为个体化治疗提供更多可能性。对于改善肺癌患者的治疗效果和提高生存率具有重要的临床意义。
发明内容
本申请实施例的目的包括提供用于诊断肺癌分期的代谢标志物或/和其检测试剂在制备用于诊断肺癌分期的试剂盒中的应用。本申请实施例通过检测这些代谢标志物，能够一次性实现肺癌诊断和肺癌临床分期的有效预测。这些代谢标志物能够为临床提供更准确、更可靠的诊断依据，有助于医生制定更精确的治疗方案，提高肺癌的诊断准确性和治疗效果。
在本申请的实施例提供了用于诊断肺癌分期的代谢标志物或/和其检测试剂在制备用于诊断肺癌分期的试剂盒中的应用；
所述用于诊断肺癌分期的代谢标志物包括硫酸脱氢表雄酮、4-羟基-1-(3-吡啶)-1-丁酮、L-亮氨酸二肽、辛酰-L-肉碱、磷酯胆碱34:3e、酰基肉碱10:0、N-甲醯甲硫胺酸、5-甲硫腺苷、磷酯胆碱36:3e、脂肪酸22:6、氢化肉桂酸、酰基肉碱10:1、次黄嘌呤、L-丙氨酰-L-天冬氨酸、亚氨基二乙酸、甜菜碱、胆碱、棕榈酰-L-左旋肉碱和L-谷氨酸。
可选地，所述检测试剂通过液相色谱质谱联用法检测所述用于诊断肺癌分期的代谢标志物。
可选地，所述检测试剂检测的样本种类包括血样。
可选地，所述血样包括血浆。
可选地，所述检测试剂通过液相色谱质谱联用法检测所述用于诊断肺癌分期的代谢标志物的步骤包括：
从所述血浆中分离有机相和水相；以及，
采用所述液相色谱质谱联用法分别检测所述有机相和所述水相，实现对所述用于诊断肺癌分期的代谢标志物的检测。
可选地，检测所述有机相的液相色谱条件包括：
固定相为C8色谱柱；
流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A包括含0.08%（w/v）-0.12%（w/v）乙酸和0.08%（w/v）-0.12%（w/v）乙酸铵的水溶液，所述流动相B包括0.08%（w/v）-0.12%（w/v）乙酸、0.8%（w/v）-1.2%（w/v）乙酸铵以及体积比为（6.5-7.5）：（2.5-3.5）的乙腈和异丙醇的混合液；
洗脱方式包括梯度洗脱，梯度洗脱的程序包括：
0分钟-12分钟，所述流动相B的体积占比由55%上升至89%；
12分钟-19.5分钟，所述流动相B的体积占比由89%上升为100%。
可选地，检测所述水相的液相色谱条件包括：
固定相为T3色谱柱；
流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A包括含0.08%-0.12%（w/v）甲酸的水溶液；所述流动相B包括含0.08%-0.12%（w/v）甲酸的乙腈溶液；
洗脱方式包括梯度洗脱，梯度洗脱的程序包括：
0-13分钟，所述流动相B的体积占比由1%上升至70%；
13-18分钟，所述流动相B的体积占比由70%上升至99%。
可选地，检测的质谱条件包括：
以Full MS和Full MS/dd-MS2的方式进行采集，各含正负两种模式；
Full MS模式中，分辨率为3.5万-7万，扫描范围为100m/z-1500m/z，AGC为3E+6，Maximum IT为150毫秒-250毫秒；
Full MS/dd-MS2模式中，二级质谱的分辨率为1.75万-3.5万，四极杆窗口为1.2m/z-1.6m/z，AGC为1E+5，离子最大注入时间为45ms-55ms，HCD相对碰撞能量为10eV-45eV。
可选地，从所述血浆中分离有机相和水相的步骤包括：
用溶剂1对所述血浆进行提取，制备提取液；所述溶剂1包括甲基叔丁基醚和甲醇；
用溶剂2对所述提取液进行萃取，分层后收集上层获得有机相、收集下层获得水相。
本申请的实施例还提供一种用于诊断肺癌分期的试剂盒，其包括如上定义的用于诊断肺癌分期的代谢标志物或/和其检测试剂。
相对于传统技术，本申请的有益效果包括：本申请实施例提供用于诊断肺癌分期的代谢标志物或/和其检测试剂在制备用于诊断肺癌分期的试剂盒中的应用，通过检测这些代谢标志物，能够一次性实现肺癌诊断和肺癌临床分期的有效预测。这些代谢标志物能够为临床提供更准确、更可靠的诊断依据，有助于医生制定更精确的治疗方案，提高肺癌的诊断准确性和治疗效果。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案、更完整地理解本申请及其有益效果，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对本领域技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为硫酸脱氢表雄酮的线性相关分析图；
图2为4-羟基-1-(3-吡啶)-1-丁酮的线性相关分析图；
图3为L-亮氨酸二肽的线性相关分析图；
图4为辛酰-L-肉碱的线性相关分析图；
图5为磷酯胆碱34:3e的线性相关分析图；
图6为酰基肉碱10:0的线性相关分析图；
图7为N-甲醯甲硫胺酸的线性相关分析图；
图8为5-甲硫腺苷的线性相关分析图；
图9为磷酯胆碱36:3e的线性相关分析图；
图10为脂肪酸22:6的线性相关分析图；
图11为氢化肉桂酸的线性相关分析图；
图12为酰基肉碱10:1的线性相关分析图；
图13为次黄嘌呤的线性相关分析图；
图14为L-丙氨酰-L-天冬氨酸的线性相关分析图；
图15为亚氨基二乙酸的线性相关分析图；
图16为甜菜碱的线性相关分析图；
图17为胆碱的线性相关分析图；
图18为棕榈酰-L-左旋肉碱的线性相关分析图；
图19为L-谷氨酸的线性相关分析图；
图20为基于19个代谢标志物的肺癌诊断模型ROC评估结果图；
图21为19个代谢标志物，在肺癌分期训练集多分类ROC曲线分析结果图；
图22为19个代谢标志物，在肺癌分期测试集多分类ROC曲线分析结果图；
图23为19个代谢标志物，在肺癌诊断验证组ROC曲线分析结果图；
图24为19个代谢标志物，在肺癌分期验证组多分类ROC曲线分析结果图。
具体实施方式
本申请一个或者多个实施例的目标是通过代谢标志物诊断肺癌以及预测临床分期，对肺癌的预防策略和治疗方案提供更有针对性的指导参考，从而降低肺癌的致死率，为改善患者生活质量、降低医疗成本以及降低肺癌的影响做出积极贡献。早期（early stage）的肺癌诊断能够在肿瘤尚未进一步扩散或恶化之前采取针对性的治疗措施。本申请实施例所探寻的肺癌代谢标志物，能够一次性实现肺癌诊断和临床分期预测。与传统技术方案相比，本申请一个或者多个实施例提供的技术方案具有如下优势效果：本申请实施例筛选出的肺癌代谢标志物具有无创性、较高的预测精度、快速获取检测结果以及早期诊断、临床分期预测优势；有助于监测肿瘤的生长和治疗效果的变化，提高早期诊断机会，减少晚期预后带来的死亡风险。本申请一些实施例的优势体现在：（1）样本数量多，增加了数据的丰富性和可靠性。（2）本申请预测AUCROC最高值为0.968，能够显示出很好的预测性能和准确性。（3）本申请的代谢标志物的筛选来源流程更为规范可靠，筛选流程明确，所筛选出的代谢标志物步骤清楚，可进行一次性的肺癌诊断和临床分期预测。（4）所筛选出的代谢标志物在统计学上呈现显著性。本申请实施例所筛选出的代谢标志物P值显著，意味着本申请实施例所选代谢标志物的变化在肺癌患者与健康个体之间的差异性明显，能够为肺癌诊断和预测提供更为准确和可靠的信息。（5）本申请实施例进行了多分类ROC分析，更为全面地探究了代谢标志物在肺癌分期预测中的潜力，具有明显优势。
本申请实施例的第一方面
本申请实施例提供了用于诊断肺癌分期的代谢标志物或/和其检测试剂在制备用于诊断肺癌分期的试剂盒中的应用；
所述用于诊断肺癌分期的代谢标志物包括硫酸脱氢表雄酮、4-羟基-1-(3-吡啶)-1-丁酮、L-亮氨酸二肽、辛酰-L-肉碱、磷酯胆碱34:3e、酰基肉碱10:0、N-甲醯甲硫胺酸、5-甲硫腺苷、磷酯胆碱36:3e、脂肪酸22:6、氢化肉桂酸、酰基肉碱10:1、次黄嘌呤、L-丙氨酰-L-天冬氨酸、亚氨基二乙酸、甜菜碱、胆碱、棕榈酰-L-左旋肉碱和L-谷氨酸。
本申请对检测试剂不做特别限定，可选地，所述检测试剂通过液相色谱质谱联用法检测所述用于诊断肺癌分期的代谢标志物。
在一些实施方式，所述检测试剂检测的样本种类包括血样。可选地，所述血样包括血浆、血清。本申请对血样的样本形式不做特别限定，例如可以是干血片。
在一些实施方式，所述检测试剂通过液相色谱质谱联用法检测所述用于诊断肺癌分期的代谢标志物的步骤包括：
从所述血浆中分离有机相和水相；以及，
采用所述液相色谱质谱联用法分别检测所述有机相和所述水相，实现对所述用于诊断肺癌分期的代谢标志物的检测。
在一些实施方式，检测所述有机相的液相色谱条件包括：
固定相为C8色谱柱；
流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A包括含0.08%（w/v）-0.12%（w/v）（例如为0.08%、0.09%、0.1%、0.11%、0.12%）乙酸和0.08%（w/v）-0.12%（w/v）（例如为0.08%、0.09%、0.1%、0.11%、0.12%）乙酸铵的水溶液，所述流动相B包括0.08%（w/v）-0.12%（w/v）（例如为0.08%、0.09%、0.1%、0.11%、0.12%）乙酸、0.8%（w/v）-1.2%（w/v）（例如为0.8%、0.9%、1%、1.1%、1.2%）乙酸铵以及体积比为（6.5-7.5）：（2.5-3.5）（例如6.5：2.5、6.5：3、6.5：3.5、7：2.5、7：3、7：3.5、7.5：2.5、7.5：3、7.5：3.5）的乙腈和异丙醇的混合液；
洗脱方式包括梯度洗脱，梯度洗脱的程序包括：
0分钟-12分钟，所述流动相B的体积占比由55%上升至89%；
12分钟-19.5分钟，所述流动相B的体积占比由89%上升为100%。
在一些实施方式，检测所述水相的液相色谱条件包括：
固定相为T3色谱柱；
流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A包括含0.08%-0.12%（w/v）甲酸的水溶液；所述流动相B包括含0.08%-0.12%（w/v）甲酸的乙腈溶液；
洗脱方式包括梯度洗脱，梯度洗脱的程序包括：
0-13分钟，所述流动相B的体积占比由1%上升至70%；
13-18分钟，所述流动相B的体积占比由70%上升至99%。
在本申请的一些具体实施方式中，检测的质谱条件包括：
以Full MS和Full MS/dd-MS2的方式进行采集，各含正负两种模式；
Full MS模式中，分辨率为3.5万-7万，扫描范围为100m/z-1500m/z，AGC为3E+6，Maximum IT为150毫秒-250毫秒；
Full MS/dd-MS2模式中，二级质谱的分辨率为1.75万-3.5万，四极杆窗口为1.2m/z-1.6m/z，AGC为1E+5，离子最大注入时间为45ms-55ms，HCD相对碰撞能量为10eV-45eV。
在一些实施方式，从所述血浆中分离有机相和水相的步骤包括：
用溶剂1对所述血浆进行提取，制备提取液；所述溶剂1包括甲基叔丁基醚和甲醇；
用溶剂2对所述提取液进行萃取，分层后收集上层获得有机相、收集下层获得水相；所述溶剂2包括甲醇和水。
在一些实施方式，提取的步骤满足如下条件中的一个或者多个：
（1）提取的方式包括：涡旋；
（2）每100μL所述血浆对应的所述溶剂1的用量为800μL-1200μL（例如位800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200μL）；
（3）所述溶剂1中，甲基叔丁基醚和甲醇的体积比包括（2.5-3.5）：1（2.5：1、2.6：1、2.7：1、2.8：1、2.9：1、3.0：1、3.1：1、3.2：1、3.3：1、3.4：1、3.5：1）。
在一些实施方式，萃取的步骤满足如下条件中的一个或者多个：
1）所述溶剂2中，甲醇和水的体积比为（2.5-3.5）：1；
2）萃取的方式步骤包括：超声，静置，涡旋。
在本申请实施例的第二方面
本申请的实施例提供一种用于诊断肺癌分期的试剂盒，其包括如上第一方面中定义的用于诊断肺癌分期的代谢标志物或/和其检测试剂。
在本申请实施例的第三方面
本申请实施例提供一种肺癌的分期诊断方法，其包括如下步骤：
检测分离自受试者的样本中的第一方面中定义的用于诊断肺癌分期的代谢标志物的水平，以及根据所得检测结果确定所述受试者患有肺癌的情况。
本申请实施例中，根据所得检测结果确定所述受试者患有肺癌的情况，包括：确定所述受试者是否患有肺癌，以及，如果患有肺癌，确定肺癌的阶段。
第三方面中，“样本”，检测所采用的“检测试剂”的定义同第一方面。
下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本申请中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以按照制造厂商所建议的条件，或者参考本领域已知的实验方法。
下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。
实施例1：健康组和肺癌组血浆差异代谢物的筛选
1. 检测对象和方法
（1）所有受试者在接受研究前均获得书面知情同意。
（2）健康组和肺癌组以及分期入组标准：
a. 健康组选用三个条件（1）根据调查问卷，排除了常见慢性病（高血压、糖尿病、冠心病）、肿瘤治疗史和重大手术史受试者；（2）自述无明显临床症状；（3）体检结果处于正常值范围、未见明显异常的；检查结果超出正常值范围或存异常但经医生判断无临床意义的。（体检项目包含：LDCT、腹部彩超、肿瘤标志物4项、血压等，如图所示的体检项目）。同时满足上述三个条件的受试者为健康组。
b. 肺癌入组选用以下条件：肺癌组织学分类采用了世界卫生组织第四版的肺、胸膜、胸腺及心脏肿瘤分类（2015年出版）的标准。肺癌分期标准采用AJCC第八版标准，根据TNM 分期系统。通过组织病理检查作为金标准，同时依赖资深临床医生的专业性进行最终诊断。
排除标准：不满18岁；怀孕；样本重复，未确诊，质检不合格。
（3）试剂：色谱级别纯度（HPLC）的甲酸、乙酸、甲醇、乙酸铵、乙腈和异丙醇购于美国Sigma-Aldrich公司；去离子水利用美国密理博（Millipore）公司的超纯水系统制备。
（4）样品制备：
取100μL的血浆，置于预冷（甲基叔丁基醚:甲醇，体积比3:1）溶液1000μL，涡旋混匀提取的血液样品，获得的样品提取液；向样品提取液中加入（甲醇:水，体积比3:1）溶液500μL，超声、静置，涡旋并离心分层；
- 有机相（Organic phase）：样品分层后，取上层500μL至离心管中，为有机相；有机相干燥后，加入（乙腈:异丙醇，体积比3:1）200μL，并在室温下孵化15分钟；孵化后，将离心管涡旋混匀，超声辅助处理5分钟，再将离心管在室温下离心5分钟（12000rpm）；从离心管中取180µl上清液至2mL玻璃进样小瓶中，为有机相物质，上机（LC-MS）检测；
- 水相(Aqueous phase)：样品分层后，取下层400μL水相至离心管中，并向其中加入冰甲醇1100μL，沉淀蛋白质；离心管中蛋白质沉淀后，将离心管离心，取上清液1000μL转移至新离心管中，并干燥过夜；向干燥后的离心管中加入200μL水，并在室温下孵化15分钟；孵化后，将离心管涡旋混匀，超声辅助处理5分钟，再将离心管在室温下离心5分钟（12000rpm）；从离心管中取180μL上清液至2mL玻璃进样小瓶中，为水相物质，上机（LC-MS）检测。
（5）小分子代谢物检测：
有机相物质检测使用Waters ACQUTTY UPLC®BEH C8 1.7µm 2.1*100mm column柱子，水相物质检测使用Waters ACQUTTY UPLC®HSS T3 1.8µm 2.1*100mm column柱子，进行小分子分离；液相色谱和质谱仪均使用ACQUITYUPLC I-Class液相色谱系统（沃特世）和Q-Exactive质谱系统（赛默飞世尔科技）；
有机相物质和水相物质对应的流动相参数如下：
有机相物质：流动相A为含0.1%（w/v）乙酸和0.1%（w/v）乙酸铵的水溶液；流动相B为含0.1%（w/v）乙酸和1%（w/v）乙酸铵的乙腈-异丙醇（7:3v/v）溶液，分离洗脱梯度如下：0-12分钟为55%-89%（v/v）流动相B，12-19.5分钟为100%（v/v）流动相B；
水相物质：流动相A为含0.1%（w/v）甲酸的水溶液；流动相B为含0.1%（w/v）甲酸的乙腈溶液。分离洗脱梯度如下：0-13分钟为1%-70%（v/v）流动相B，13-18分钟为99%（v/v）流动相B；
质谱参数如下：
质谱数据以Full MS和Full MS/dd-MS2的方式（各含正负两种模式）进行采集，QExactive 所用参数如下：Full MS模式分辨率为7万，扫描范围为100-1500m/z，AGC为3E+6，Maximum IT为200毫秒；Full MS/dd-MS2模式中，二级质谱的分辨率为1.75万，四极杆窗口为1.5m/z，AGC为1E+5，离子最大注入时间为50ms，HCD相对碰撞能量为30eV。
本申请实施例在代谢物提取方面具有显著优势：
本实施例能从仅有100μL血浆中提取代谢物，这一过程包括对有机相和水相物质的处理，采用高效的分层技术，同时将这两种物质分离并分别进行测试，最终获得有机相和水相所有代谢物的检测数据。本申请实施例将这一独特的过程称之为“多合一提取”，这也是本申请实施例在代谢物提取方面的显著特点之一。相对于传统的两次提取方法，这种方法具有高效性和便捷性，为代谢物分析提供了更便捷的途径。此外，它还能在一定程度上提高检测结果的稳定性，确保数据的可靠性。
（6）代谢组学数据处理：首先从所有质谱数据中提取检测峰，然后应用基线校正去除噪音，保留原始信号峰值；原始数据转换为中心离散数据；然后，在单个样品中的峰值与色谱中的保留时间比对，进行匹配；数据集，进一步去除同位素峰后，得到最终的质谱矩阵数据；为了减小样品间代谢物浓度的差异，使数据分布更加对称，利用NormalizationAutoencoder（NormAE）进行均一化处理。
（7）代谢产物的鉴定：利用人类代谢物数据库（HMDB；www.hmdb.ca）、代谢组学数据库（Metlin；https://metlin.scripps.edu）、质谱数据库（http://www.massbank.jp/），等公共数据库，以及标准品在同款色谱柱下分离的一级、二级色谱、质谱谱图；保留时间在0.2min差异内，以及质荷比小于10ppm的条件下，与数据库和标准物匹配鉴定。
（8）在代谢组学数据分析中，本实施例进行了以下五个步骤：
第一步，首先把来自两个中心的数据分类为建模组（表1）和验证组（表2）。建模组与验证组的所用样本均为我们自己采集到的实际样本，且建模组样本与验证组样本是不同样本。
第二步，本实施例通过建模组样本，筛选出在健康组（HC）与肺癌组（LC）之间存在显著差异的代谢物，用于构建肺癌诊断模型，并鉴定出潜在的肺癌诊断代谢标志物；
第三步，根据肺癌的分期，把肺癌患者分为早期（0+I+II）和晚期（III+IV）（表1）；
表1、建模组健康与肺癌分组信息
然后，利用上述代谢标志物进行线性相关分析，计算Pearson相关系数，以评估这两个变量之间的线性相关密切程度；
第四步，本实施例选择Pearson相关系数|R|大于0.3的代谢物，进行多变量多分类ROC分析，以评估其在分类肺癌分期方面的性能表现。
第五步，使用验证组数据（表2），针对上述代谢标志物在肺癌诊断和临床分期预测进行独立验证。
表2、验证组健康与肺癌分组信息
2. 结果分析
（1）筛选代谢标志物（HC vs LC）
通过与数据库和标准品进行匹配，本实施例成功鉴定出了总计404个代谢物。为从这404个代谢物中，筛选出能够有效区分建模组的健康组（HC）和肺癌组（LC）的重要代谢物，采用了ROC曲线分析的方法。
ROC曲线是一种研究模型灵敏度和特异性之间相互关系的方法，以灵敏度（sensitivity）为纵坐标，1-特异性（1-specificity）为横坐标，ROC曲线下的面积（AUC）可以作为判断代谢物区分能力的指标。AUC值反映了模型区分正例和负例样本的能力，范围在0到1之间。AUC值越接近1，表示模型在分类任务中的性能越优秀，能够更好地区分正例和负例；而当AUC值接近或小于0.5时，则表明模型的性能接近于随机猜测，说明模型的区分能力较差，准确性不佳。
本实施例针对404个代谢物中的每一个，分别进行了单变量ROC曲线分析。在分析的结果中，选择保留AUC值大于0.70的24个代谢物，24个代谢物健康组（HC）和肺癌患者(LC)之间T检验的P值均小于0.05。
（2）筛选肺癌分期代谢标志物
根据肺癌的分期，本实施例重新将建模组癌症患者分为早期（0+I+II）和晚期（Ⅲ+Ⅳ）（表1），然后将肺癌诊断用24个显著差异代谢标志物，进行线性相关(linearcorrelation)分析，包括健康、肺癌早期和肺癌晚期的相关性。经过分析，选出相关系数|R|>0.3的19个肺癌代谢物标志物（图1至图19和表3）。图1至图19分别对应表3中的编号1至编号19的代谢标志物。
（3）肺癌诊断和肺癌分期ROC分析
与单独考虑单个代谢物性能不同，多变量ROC分析考虑了多个代谢物之间的相互关系，从而提供了更全面和准确的肺癌检测能力评估。这种方法充分利用了代谢物之间的关联性，可以更有效地捕捉到与疾病相关的生物标志物的组合。
本实施例使用机器学习支持向量机（support vector machine, SVM）算法学习二维矩阵数据，随机将建模组的健康组和肺癌组样本数据的3/4作为训练集，剩余1/4作为测试集进行学习，并SVM随机循环迭戈2000次，通过统计最终模型准确度的平均值的方法，构建了基于19个显著差异代谢标志物的肺癌诊断模型；基于挑选出的19个显著差异代谢物，本实施例使用测试集进行多变量ROC分析，评估这些代谢物的联合作用在肺癌诊断中的效果，分类模型评估指标为AUCROC（曲线面积）。结果显示，ROC多变量分析的AUC值为0.968（图20），表明本实施例选择的代谢物在肺癌诊断任务中具有较高的准确性和区分能力。
随后，根据肺癌的分期，进行了多变量多分类的ROC曲线分析。通过多变量ROC分析以及机器学习，训练集结果为AUC=0.96（图21），测试集结果得到AUC=0.844（图22），说明本实施例筛出来的代谢标志物，能够高效率一次性实现肺癌早期诊断和癌症临床分期预测。
（4）使用验证组数据进行独立验证
使用验证组数据进行 HC vs LC 以及 HC 和 LC 0+I+II、LC III+IV 的诊断，结果显示， HC vs LC 的 ROC AUC 为 0.97（图23），对于 HC 和 LC 0+I+II、LC III+IV，多分类 ROC AUC 为 0.87（图24）。这些结果表明模型在不同分类情况下均具有很高的性能，为肺癌早期诊断和肺癌临床分期预测提供了潜在的临床应用价值。
表3、肺癌19个代谢标志物线性相关性R的绝对值与P值
整体上，本实施例筛选出的肺癌代谢标志物具有多重优势，包括无创性、较高的预测准确性、快速获取检测结果以及在早期诊断和临床分期预测方面具有一定的优势。这些优势有助于监测肿瘤的生长和治疗效果的变化，提高早期诊断机会，减少晚期预后带来的死亡风险。
以上所述实施方式和实施例的各技术特征可以进行任意合适方式的组合，为使描述简洁，未对上述实施方式和实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为在本说明书记载的范围中。
以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，便于具体和详细地理解本申请的技术方案，但并不能因此而理解为对申请专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。此外应理解，在阅读了本申请的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本申请作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。还应当理解，本领域技术人员在本申请提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本申请所附权利要求的保护范围内。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。
Claims (10)
1.用于诊断肺癌分期的代谢标志物或/和其检测试剂在制备用于诊断肺癌分期的试剂盒中的应用；
所述用于诊断肺癌分期的代谢标志物包括硫酸脱氢表雄酮、4-羟基-1-(3-吡啶)-1-丁酮、L-亮氨酸二肽、辛酰-L-肉碱、磷酯胆碱34:3e、酰基肉碱10:0、N-甲醯甲硫胺酸、5-甲硫腺苷、磷酯胆碱36:3e、脂肪酸22:6、氢化肉桂酸、酰基肉碱10:1、次黄嘌呤、L-丙氨酰-L-天冬氨酸、亚氨基二乙酸、甜菜碱、胆碱、棕榈酰-L-左旋肉碱和L-谷氨酸。
2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述检测试剂通过液相色谱质谱联用法检测所述用于诊断肺癌分期的代谢标志物。
3.根据权利要求2所述的应用，其中，所述检测试剂检测的样本种类包括血样。
4.根据权利要求3所述的应用，其中，所述血样包括血浆或者血清。
5.根据权利要求4所述的应用，其中，所述检测试剂通过液相色谱质谱联用法检测所述用于诊断肺癌分期的代谢标志物的步骤包括：
从所述血浆中分离有机相和水相；以及，
采用所述液相色谱质谱联用法分别检测所述有机相和所述水相，实现对所述用于诊断肺癌分期的代谢标志物的检测。
6.根据权利要求5所述的应用，其中，检测所述有机相的液相色谱条件包括：
固定相为C8色谱柱；
流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A包括含0.08%（w/v）-0.12%（w/v）乙酸和0.08%（w/v）-0.12%（w/v）乙酸铵的水溶液，所述流动相B包括0.08%（w/v）-0.12%（w/v）乙酸、0.8%（w/v）-1.2%（w/v）乙酸铵以及体积比为（6.5-7.5）：（2.5-3.5）的乙腈和异丙醇的混合液；
洗脱方式包括梯度洗脱，梯度洗脱的程序包括：
0分钟-12分钟，所述流动相B的体积占比由55%上升至89%；
12分钟-19.5分钟，所述流动相B的体积占比由89%上升为100%。
7.根据权利要求5所述的应用，其中，检测所述水相的液相色谱条件包括：
固定相为T3色谱柱；
流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A包括含0.08%-0.12%（w/v）甲酸的水溶液；所述流动相B包括含0.08%-0.12%（w/v）甲酸的乙腈溶液；
洗脱方式包括梯度洗脱，梯度洗脱的程序包括：
0-13分钟，所述流动相B的体积占比由1%上升至70%；
13-18分钟，所述流动相B的体积占比由70%上升至99%。
8.根据权利要求5所述的应用，其中，检测的质谱条件包括：
以Full MS和Full MS/dd-MS2的方式进行采集，各含正负两种模式；
Full MS模式中，分辨率为3.5万-7万，扫描范围为100m/z-1500m/z，AGC为3E+6，Maximum IT为150毫秒-250毫秒；
Full MS/dd-MS2模式中，二级质谱的分辨率为1.75万-3.5万，四极杆窗口为1.2m/z-1.6m/z，AGC为1E+5，离子最大注入时间为45ms-55ms，HCD相对碰撞能量为10eV-45eV。
9.根据权利要求5至8中任一项所述的应用，其中，从所述血浆中分离有机相和水相的步骤包括：
用溶剂1对所述血浆进行提取，制备提取液；所述溶剂1包括甲基叔丁基醚和甲醇；
用溶剂2对所述提取液进行萃取，分层后收集上层获得有机相、收集下层获得水相；所述溶剂2包括甲醇和水。
10.用于诊断肺癌分期的试剂盒，其包括权利要求1至9中任一项中定义的用于诊断肺癌分期的代谢标志物或/和其检测试剂。
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