CN108362804B

CN108362804B - 一种检测血液样品中dha含量的方法及试剂盒

Info

Publication number: CN108362804B
Application number: CN201810164622.6A
Authority: CN
Inventors: 冯振; 景叶松; 弭兆元
Original assignee: Shandong Yingsheng Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Shandong Yingsheng Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2018-02-27
Filing date: 2018-02-27
Publication date: 2019-01-29
Anticipated expiration: 2038-02-27
Also published as: CN108362804A

Abstract

本发明属于不饱和脂肪酸的检测领域，具体涉及一种检测血液样品中的DHA含量的方法及试剂盒。本发明方法采用HPLC‑MS/MS检测血液样品中DHA含量，包括以下步骤：(1)血液样品预处理；(2)标准工作液的配制；(3)HPLC‑MS/MS检测。本发明首次实现了应用HPLC‑MS/MS技术对血清样本中的DHA精确检测的目的，降低了基质效应，该方法操作简便快速，通量高成本低，有效监测人体内DHA水平，对DHA的合理、安全补充具有指导意义，易于临床推广及普及。

Description

一种检测血液样品中DHA含量的方法及试剂盒

技术领域

本发明属于不饱和脂肪酸的检测领域，具体涉及一种检测血液样品中的DHA含量的方法及试剂盒。

背景技术

DHA(Docosahexaenoic acid,22:6△4.7.10.13.16.19，全名二十二碳六烯酸)是一种重要的长链多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，简称PUFA)，是人脑神经和视网膜细胞膜中主要的脂质成分。在视网膜的棒状外侧部分的细胞中，DHA可达细胞总脂的60％以上，在人脑组织的细胞中，DHA占总脂的10％左右。然而人类自身并不能合成DHA，必须通过食物摄取。妇女在怀孕期间，如果饮食中缺少DHA，将导致胎儿DHA补充不足，以致其脑细胞生长与发育不正常，产生弱智；严重缺乏DHA可能导致胎儿无法正常进行由自身中枢神经系统控制的代谢。而出生后到1岁是婴儿智力、视力发展至关重要阶段，如果DHA缺乏将会对迅速发育的中枢神经系统造成损害。由美国儿童健康及人类发展协会资助的贝氏婴儿智力测试(Bayley Scales of Infant Development)表明，DHA能显著提高儿童智力发育水平。DHA补充组的儿童记忆力、解决简单问题的能力及语言能力都明显高于对照组儿童。2002年美国《临床营养学杂志》报道，食品中补充DHA的婴儿在进食52个星期后，视觉明显比同组中未进食DHA的健康婴儿灵敏。临床实验也证实，处于怀孕及哺乳期的妇女，如果提高DHA的摄取量，可降低产后抑郁症的发生。此外，DHA有降血压的功能，并且可以调节人体内血脂和脂蛋白的正常代谢，降低血液黏稠度和血液中胆固醇水平，增加高密度脂蛋白含量，有效抑制血栓的形成，起到防止心血管疾病发生的作用。DHA能明显抑制肿瘤的发生、生长和转移速度，对防治前列腺癌、乳腺癌、结肠癌和子宫癌等有积极作用。有研究表明，DHA能促进T淋巴细胞的增殖，提高细胞因子TNF-2、IL-1β和IL-6的转录，而这些细胞因子表达的提高可以促进免疫系统的功能，从而提高免疫系统对肿瘤细胞的杀伤力。

因此，基于以上特殊的生理功效，自1978年研究发现爱斯基摩人尽管摄入大量的海洋脂类物质但冠心病、心肌梗塞、血栓病等疾病发病率却很低的现象以来，DHA补剂市场在全球范围内迅速扩张，至2011年全球市场容量已攀升至近250亿美元。随着国际市场对国内市场的不断冲击以及人民群众的保健意识不断增强，我国DHA相关补剂销量也在逐年攀升，尤其是孕产妇、儿童和中老年人群。但是虽然DHA对于人体健康具有重要意义，却并不是补充的越多越好，大量摄入DHA会产生出血倾向，为此有凝血功能障碍和严重高血压的患者及患自身免疫性疾病的患者必须慎用。DHA是高度不饱和脂肪酸，易受体内活性自由基攻击而引发过氧化链式反应，即脂质过氧化作用，从而对细胞膜有损伤。而免疫细胞的功能高度依赖于正常的膜结构和功能。因此，脂质过氧化作用对免疫细胞膜结构和功能的损害将对免疫功能造成不利影响。另外，过氧化物能破坏人体中的DHA而引起癌变，而氧化产物尤其是丙二醛能使蛋白质交联而使肌肉失去弹性，黑色素增多，出现老人斑，这是人体老化的重要因素。过量的脂类氧化物还能使心血管粥状化损坏血管内壁使之变脆，易导致高血压和脑溢血。因此，每个人都需要了解自身情况，从而在专业人士的指导下制定个性化的合理补充方案，而检测血液中DHA的含量是评估自身以及科学指导的唯一依据。

目前常用的检测方法主要有毛细管电泳法(CE)、薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱质谱联用法(GC-MS)。CE虽非常适合测定脂肪酸，却价格昂贵，不易大面积推广；TLC具有设备简单、操作方便、显色容易和展开速率快等优点，同时TLC受湿度、温度、溶剂平衡等影响较大，而且没有自动化体系，需要全手动进行操作，故重现性、灵敏度并不高；HPLC是一项具有高分离效率、高选择性、高灵敏度、应用范围最广泛的色谱分离技术，但由于不饱和脂肪酸不具有紫外吸收性能或紫外吸收较弱，常用的紫外检测器并不适用于DHA的定量分析；GC-MS能够很好的分离轻微结构差异的被检测物如同分异构体，进样体积要求非常少，是检测DHA的经典方法，但是缺点也很明显，比如检测时间较长，一般需要30分钟或更长时间，且样品衍生化处理非常复杂，衍生化试剂毒性很强，对操作人员和操作环境造成极大的伤害和污染。

高效液相色谱质谱联用法(HPLC-MS/MS)样品预处理过程较简单、样品需要量少，可以一次性定量测定多种物质，灵敏度高、特异性强、无交叉污染，同时自动化程度较高、分析时间较短，并且不需要结合物水解及化学衍生化，是临床常规检测的理想选择方法。但是血液样本中成分复杂，简单的蛋白沉淀处理并不能完全去除杂质，在进行定量分析时，杂质的存在严重影响检测结果的准确性。而过于复杂的提取方法如固相萃取技术则成本过高，并不适合市场化大规模推广。与此同时，用于不饱和脂肪酸色谱分离的流动相多数采用乙腈。众所周知，乙腈是剧毒化合物，频繁接触乙腈对于操作人员是极大的危害，实验废液排放亦不符合当前的环保理念。

发明内容

本发明的目的就是为了解决上述问题，提供一种检测血液样品中DHA的方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明目的之一，提供一种检测样品中DHA含量的方法，采用HPLC-MS/MS检测血液样品中DHA含量，包括以下步骤：

(1)血液样品预处理；

(2)标准工作液的配制；

(3)HPLC-MS/MS检测。

进一步地，所述HPLC-MS/MS的条件为：

色谱条件：流动相A：含0.05％甲酸pH值为3的HPLC级水；流动相B：含0.05％甲酸且pH值为3的甲醇；梯度洗脱；质谱条件：负离子电喷雾离子化的多离子反应监测。

更进一步地，所述梯度洗脱条件为：0～3min，70％B，3～4min，90％B，4～6min，90％B，6～9min，100％B，9～13min，70％B，流速250μL/min，进样量，20μL；所述质谱条件为：采用负离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式，雾化气：60kPa，加热气：50kPa，气帘气：20kPa，喷雾电压：4.5kV，去溶剂温度：450℃。

进一步地，所述血液样品是血浆或血清；所述血液样品前处理方法为：向200μl血清样本中加入1ml乙腈/37％盐酸体积比为4:1的溶液，涡旋震荡后在90℃中孵育2h，随后冷却至室温，加入2ml正己烷并涡旋振荡20s，室温下静置5min后离心，3000rpm，1min。取溶液最上层部分至样品瓶中，氮气吹干，将样品复溶于200μl180：20v/v的甲醇水溶液中，0.2μm滤膜过滤，获得待测样本。

进一步地，所述标准工作液的配制方法为：以水配制100μg/mL标准品储备液，然后用牛血清白蛋白甲醇溶液制备7个梯度，分别为100，200，500，1000，5000，10000，20000，50000ng/ml；标准溶液分装于1.5mL棕色瓶中，-20℃保存备用。

进一步地，上述方法中包含质控品：含有三个水平的低、中、高浓度质控血清，质控品由人工血清添加DHA标准物质制得，其浓度分别与标准溶液八个梯度中第一、第四和第七个梯度浓度相一致，并通过检测确定靶值。

更进一步地，所述牛血清蛋白甲醇溶液浓度为5％m/v。

本发明目的之二，提供一种试剂盒，包括不同浓度的标准溶液，甲醇，乙腈，己烷，体积比为180:20的甲醇水溶液，乙腈/37％盐酸体积比为4:1溶液，含0.05％甲酸的甲醇溶液，含0.05％甲酸的水溶液以及质控品。

本发明目的之三，提供所述试剂盒在检测DHA含量中的应用。

进一步地，所述的试剂盒在检测血液样品中DHA含量中的应用。

进一步地，所述血液样品为血清。

本发明通过对样本前处理方法和超高效液相色谱-质谱条件的优化，建立了一种检测血液样品中DHA的方法。本发明中使用前处理方法，37％的盐酸使待测样品中的DHA性状更加稳定，正己烷提取DHA更加高效，且操作简便基本消除机制效应。

超高效液相色谱-质谱结果快速准确客观易于分析，可对孕产妇等DHA检测目标人群进行实时监测并对其DHA补充进行科学指导提供有效依据。

本发明的方法分别选择一对定性离子(327.1>59.1)和一对定量离子(327.1>283.2)，以其的相对保留时间和定性离子对作为定性依据，以标准品制作标准曲线定量。同时，本方法应用三个水平的质控品考察方法的准确性、有效性，避免检测结果失真。

本发明首次实现了应用HPLC-MS/MS技术对血清样本中的DHA精确检测的目的，用两对离子分别进行定量和定性保证了检测物的特异性，降低了干扰物影响，该方法操作简便快速，通量高成本低，有效实时监测人体内DHA水平，对DHA的合理、安全补充具有指导意义，易于临床推广及普及。

附图说明

图1为本发明实施例的DHA色谱图

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、部件和/或它们的组合。

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例

(1)血液样品预处理

向200μl血清样本中加入1ml乙腈/37％盐酸(4:1,v/v)溶液，涡旋震荡后在90℃中孵育2h，随后冷却至室温，加入2ml己烷并涡旋振荡20s，室温下静置5min后离心，3000rpm，1min。取溶液最上层部分至样品瓶中，氮气吹干，将样品复溶于200μl甲醇水溶液(180：20，v/v)中，0.2μm滤膜过滤，获得待测样本；

(2)标准工作液的配制：以水配制100μg/mL标准品储备液，然后用5％牛血清白蛋白甲醇溶液(m/v)制备7个梯度，分别为100，200，500，1000，5000，10000，20000，50000ng/ml。标准溶液分装于1.5mL棕色瓶中，-20℃保存备用；

(3)HPLC-MS/MS检测

色谱柱：C18柱(Waters ACQUITY HPLC CSH C18 150mm×2.1mm，1.7μm)；

柱温：40℃；

流动相：流动相A：含0.05％甲酸的HPLC级水(v/v)；流动相B：含0.05％甲酸的甲醇(v/v)；

梯度洗脱条件(如表1)：0～3min，70％B，3～4min，90％B，4～6min，90％B，6～9min，100％B，9～13min，70％B，流速250μL/min，进样量，20μL。

表1梯度洗脱条件

时间(min)	A相比例(％)	B相比例(％)
			0	30	70
3	10	90
			4	10	90
6	0	100
			9	30	70
13	stop	stop

质谱条件：采用负离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式；

雾化气：60kPa，加热气：50kPa，气帘气：20kPa，喷雾电压：4.5kV，去溶剂温度：450℃。

MRM质谱参数如表2：

表2MRM质谱参数

(4)计算结果

应用标准品制作标准曲线，以标准溶液浓度为X轴，标准品峰面积为Y轴；进行线性回归分析得回归方程。将相应峰面积代入标准曲线方程，计算血清样品中DHA的浓度。

如图1，用本发明方法测定100～50000ng/mL的标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好，通过方程可知该样本DHA含量为31.33μg/mL。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims

1.一种检测样品中DHA含量的方法，其特征在于，采用HPLC-MS/MS检测血液样品中DHA含量，包括以下步骤：

(1)血液样品预处理；

(2)标准工作液的配制；

(3)HPLC-MS/MS检测；

所述血液样品是血浆或血清；所述血液样品前处理方法为：向200μl血清样本中加入1ml乙腈/37％盐酸体积比为4:1的溶液，涡旋震荡后在90℃中孵育2h，随后冷却至室温，加入2ml正己烷并涡旋振荡20s，室温下静置5min后离心，3000rpm，1min；取溶液最上层部分至样品瓶中，氮气吹干，将样品复溶于200μl体积比为180：20的甲醇水溶液中，0.2μm滤膜过滤，获得待测样本。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述HPLC-MS/MS的条件为：色谱条件：流动相A：含0.05％甲酸pH值为3的HPLC级水；流动相B：含0.05％甲酸且pH值为3的甲醇；梯度洗脱；质谱条件：负离子电喷雾离子化的多离子反应监测。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱条件为：0～3min，70％B，3～4min，90％B，4～6min，90％B，6～9min，100％B，9～13min，70％B，流速250μL/min，进样量，20μL；所述质谱条件为：采用负离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式，雾化气：60kPa，加热气：50kPa，气帘气：20kPa，喷雾电压：4.5kV，去溶剂温度：450℃。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标准工作液的配制方法为：以水配制100μg/mL标准品储备液，然后用牛血清白蛋白甲醇溶液制备7个梯度，分别为100，200，500，1000，5000，10000，20000，50000ng/ml；标准溶液分装于1.5mL棕色瓶中，-20℃保存备用。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述牛血清蛋白甲醇溶液浓度为5％m/v。

6.一种试剂盒，其特征在于，包括不同浓度的标准溶液，甲醇，乙腈，己烷，体积比为180:20的甲醇水溶液，乙腈/37％盐酸体积比为4:1溶液，含0.05％甲酸的甲醇溶液，含0.05％甲酸的水溶液以及质控品。

7.根据权利要求6所述的试剂盒在检测DHA含量中的应用。

8.根据权利要求6所述的试剂盒在检测血液样品中DHA含量中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述血液样品为血清。