CN110850073A - 肝硬化阳离子标志物的筛选方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种肝硬化阳离子标志物的筛选方法，包括以下步骤：第一步，样本提取；第二步，利用LC‑MS/MS分离并采集质谱数据：用高效液相色谱分离第一步中得到的代谢混合物，将分离后的样品用质谱仪Ⅰ进行检测分析，用质谱仪Ⅱ采集样品的一级谱图和二级谱图；第三步，确定代谢物质；第四步，筛选显著性差异代谢物质。本发明首次建立了一种与肝硬化诊断相关阳离子标志物的筛选方法，筛选得到的酪胺阳离子、2‑苯乙酰胺阳离子、三乙醇胺阳离子、Val‑Ile阳离子的组合以及2‑苯乙酰胺阳离子可以作为肝硬化诊断的新的标志物，为日后的肝硬化诊断药物的研发提供新的靶点和思路，具有重要意义。

Description

肝硬化阳离子标志物的筛选方法和应用
技术领域
本发明涉及生化检测领域，尤其是涉及一种肝硬化阳离子标志物的筛选方法，还涉及筛选出的肝硬化阳离子标志物在制备肝硬化诊断药物或诊断试剂盒中的应用。
背景技术
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，即HCC），是一种高死亡率的原发性肝癌，它是一种全球范围最常见的恶性肿瘤，尤其是在亚洲、非洲和南部欧洲。全球每年新发病例数约65万，其发病率占所有恶性肿瘤的第5位，死亡数约为60万，为所有恶性肿瘤的第3位。
肝癌的发病原因多种多样，目前我国肝癌主要在乙肝肝硬化或非酒精性脂肪性肝炎所致肝硬化的基础上发展而来。即病毒性肝炎、肝硬化是肝细胞癌发生的主要病理基础。大多数的肝癌患者伴有肝硬化，从肝炎、肝硬化到肝癌，其形态改变往往是连续的。研究表明，肝细胞癌的发生大多是经历了一个从病毒性肝炎→肝硬化→肝癌的复杂过程。在肝硬化→肝癌的恶变进程中，会经历一个较长的肝癌癌前病变过程。肝癌癌前病变是良性病变向恶性病变过渡的移行阶段，是一类具有细胞不典型性和分化异常的增生性病变，持续时间较长。目前，肝硬化增生结节是一重要的癌前病变并已得到公认，因而，对肝硬化研究和认识的提高有助于早期肝癌的发现和治疗。但目前，对早期肝硬化的诊断主要依赖于超声和组织活检，超声技术的敏感性和特异性均不是很高，组织活检技术主要依赖于病理切片诊断，但其高费用、活检局限性（主要包括样本误差以及不同阅片者之间的偏倚等），促使人们开始寻找一种替代方法。
近年来，代谢组学技术作为一个新的有力工具，被广泛运用于疾病研究中。将疾病状态下异常的或者数量变大化极大的代谢小分子作为标志物，以用于诊断疾病的进程具有重要意义。液相色谱-质谱串联技术是代谢组学的主要研究手段，前列腺癌的诊断标志物肌氨酸的检测、新生儿疾病筛查时的多种氨基酸检测等均是代谢小分子在疾病诊断中应用的已有成功案例。由于多种因素可影响机体的代谢状态，导致单一代谢物容易收到扰动，因此从众多代谢物中优选出由少数代谢物组成的“联合型代谢标志物”，并以判别公式计算“判别可能性”P 值（Probability），能够显著改善代谢物对疾病诊断的灵敏度以及特异性。
发明内容
本发明提供了一种肝硬化阳离子标志物的筛选方法，还涉及筛选出的肝硬化阳离子标志物在制备肝硬化诊断药物或诊断试剂盒中的应用，为日后肝硬化以及肝癌药物的研发提供了新的靶点和思路，对肝硬化的诊断和以及肝癌的预防具有重要意义。
为实现上述目的，本发明采取下述技术方案：
本发明提供了一种肝硬化阳离子标志物的筛选方法，包括以下步骤：
第一步，样本提取：将待测样本用4℃预冷的PBS清洗2次，加入超纯水匀浆，涡旋，加入提取液，涡旋，超声破碎2次，沉淀，离心，将上清冷冻干燥后得到代谢混合物，备用；
第二步，利用LC-MS/MS分离并采集质谱数据：用高效液相色谱分离第一步中得到的代谢混合物，将分离后的样品用质谱仪Ⅰ进行检测分析，用质谱仪Ⅱ采集样品的一级谱图和二级谱图；
高效液相色谱检测条件为：流动相流速为300 nL/min，流动相由A、B两相组成，流动相A是含25 mM氨水和25 mM乙酸铵的水溶液，流动相B是乙腈；采用梯度洗脱的方式进行洗脱，洗脱程序为：0～0.5 min，95%流动相 B；0.5～7min，95%～65%流动相B；7～8 min，65%～40%流动相B；8～9 min，40%流动相B；9～9.1 min，40%～95%流动相B；9.1～12 min，95%流动相B;
第三步，确定代谢物质：将第二步得到的质谱数据转化为.mzXML格式，然后采用lc-msspectra annotation进行峰对齐、保留时间校正以及峰面积的提取，采用精确质量数匹配<25ppm和二级谱图匹配的方式确定每种代谢物质；
第四步，筛选显著性差异代谢物质：用多变量统计（OPLS-DA）对第三步确定的每种代谢物质进行初步筛选；初筛出肝硬化样本与正常样本之间的差异代谢物质（变量权重值>1，且差异倍数>1.5或<0.75）后，用单变量统计对初筛得到的差异代谢物质再次筛选，筛选出肝硬化样本与正常样本之间的显著性差异代谢物质（P<0.05）即为肝硬化阳离子标志物。
优选地，所述第二步中质谱仪Ⅰ的ESI源设置参数为：所述第二步中质谱仪Ⅰ的ESI源设置参数为：气体温度为250℃，干气体流速为16 L/min，鞘气温度为400℃，鞘气流速为12 L/min，Nozzle喷嘴电压为175 V，喷雾器为20 psig，Vcap升压电容正极为3000 V，质量范围为50～1200道尔顿，数据采集速率为4 HZ，每个循环的时间为50ms；
质谱仪Ⅱ的ESI源设置参数为：离子源温度：650℃，离子源气体1：40，离子源气体2：80，离子源温度：650℃，气帘气：30，离子喷嘴电压：+5000 V，正离子模式；二级谱图采用高灵敏度模式进行采集，分布势能：±60 V，正离子模式，碰撞能量：35±15 eV，IDA的参数设置如下：排除同位素的质量范围：4 道尔顿，每个周期监测的候选离子：10，按照质核比范围进行分段采集：50～300m/z，290～600 m/z，590～900 m/z，890～1200 m/z。
优选地，所述第一步中的提取液为体积比=1:1的甲醇和乙腈混合液。
优选地，所述第四步得到的显著性差异代谢物质包括酪胺阳离子、2-苯乙酰胺阳离子、三乙醇胺阳离子和Val-Ile阳离子。
优选地，本发明还提供了2-苯乙酰胺阳离子作为肝硬化阳离子标志物在制备肝硬化诊断试剂盒或诊断药物中的应用。
优选地，本发明还提供了酪胺阳离子、2-苯乙酰胺阳离子、三乙醇胺阳离子和Val-Ile阳离子的组合物作为肝硬化阳离子标志物在制备肝硬化诊断试剂盒或诊断药物中的应用。
单变量分析方法是最简单常用的实验数据分析方法。在进行两组样本间的差异代谢物分析时，常用的单变量分析方法包括变异倍数分析（Fold Change Analysis，FCAnalysis）、T检验，以及综合前两种分析方法的火山图（Volcano Plot）。利用单变量分析可以直观地显示两样本间代谢物变化的显著性，从而帮助我们筛选潜在的标志代谢物。筛选出FC > 1.5且P value < 0.05的代谢物，即单变量统计分析筛选的差异代谢物。
同时研究发现很多动植物及微生物的生理和病理变化通常伴随着代谢过程的异常改变，但是这些生理病理的变化通常只与部分代谢物的表达水平变化特异相关。因此，从海量的代谢组学数据中筛选标志代谢物并建立准确的判别模型，对于疾病的早期诊断和预后、以及生理过程的类型和时期的判别等具有重要意义。利用多变量统计分析方法建模，可以更好的筛选出差异代谢物。
正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）是一种有监督的判别分析统计方法，是多变量统计分析方法之一，其采用偏最小二乘回归建立代谢产物的表达量与样品组别之间的关系模型，以达到对样品组别预测的目的。在OPLS-DA评分图上，有两种主成分（预测主成分和正交主成分），一般预测主成分只有1个，即t1，而正交主成分可以同时有多个，OPLS-DA分析可以将组间的差异最大程度地反映在t1上，因此根据t1可以直接区分组间的变异，而正交主成分则可以很好地反映组内的变异。该方法是基于PLS-DA分析方法的基础上进行修正得来，滤除了与分类信息无关的噪音，显著提高了模型的有效性和解析能力。
本发明利用OPLS-DA分析法对质谱数据进行初筛，得到差异性小分子；再用单变量分析方法对初筛得到的差异性小分子再次筛选，得到显著性差异小分子，即为肝硬化阳离子标志物。
本发明首次建立了一种与肝硬化诊断相关阳离子标志物的筛选方法，具体利用LC-MS/MS质谱分析方法检测待测样本，通过大量的临床样本进行质谱分析后，通过肝硬化组织与健康组织中相应分子含量的差异倍数（大于1.5或小于0.75）筛选出了四个代谢分子具有良好的差异性在阳离子：酪胺阳离子、2-苯乙酰胺阳离子、三乙醇胺阳离子、Val-Ile阳离子的组合以及2-苯乙酰胺阳离子可以作为肝硬化诊断的新的标志物，为日后的肝硬化诊断药物的研发提供新的靶点和思路，具有重要意义。
附图说明
图1是酪胺阳离子的信号响应强度的ROC曲线。
图2是肝硬化样本与健康样本中酪胺阳离子的信号强度比较。
图3是2-苯乙酰胺阳离子的信号响应强度的ROC曲线。
图4是肝硬化样本与健康样本中2-苯乙酰胺阳离子的信号强度比较。
图5是三乙醇胺阳离子的信号响应强度的ROC曲线。
图6是肝硬化样本与健康样本中三乙醇胺阳离子的信号强度比较。
图7是Val-Ile阳离子的信号响应强度的ROC曲线。
图8是肝硬化样本与健康样本中Val-Ile阳离子的信号强度比较。
图9是酪胺阳离子、2-苯乙酰胺阳离子、三乙醇胺阳离子和Val-Ile阳离子的组合物的信号响应强度的ROC曲线。
图10是肝硬化样本与健康样本中酪胺阳离子、2-苯乙酰胺阳离子、三乙醇胺阳离子和Val-Ile阳离子的组合物的信号强度比较。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语 “包含”和/或 “包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
现有技术中还未有关代谢小分子阳离子作为肝硬化标志物的相关报道。因而，本发明提出了一种肝硬化阳离子标志物的筛选方法，包括以下步骤：
第一步，提取样本：提取待检（包括肝硬化样本（即肝硬化组织）和健康样本（正常组织））中的代谢混合物，具体方法为：将样本组织用4℃的PBS溶液清洗两次后，加入超纯水用匀浆机（美国MP匀浆仪FastPrep）匀浆，涡旋，加入提取液（提取液由甲醇与乙腈按照1:1体积比配制而成），涡旋，低温超声破碎，重复超声两次，沉淀，离心，冷冻干燥得到代谢混合物，将代谢混合物于-80℃下冷冻冻存，备用；
第二步，将第一步冷冻冻存的各样本的代谢混合物分别用1.00 m L 0.2%甲酸来保证充分溶解，经过0.22μm PTFE 滤膜过滤；
用超高效液相色谱及三重四极杆-飞行时间质谱仪（即LC-MS/MS）分离并采集质谱数据：用超高效液相色谱分离第一步中得到的代谢混合物，将分离后的样品用质谱仪Ⅰ进行检测分析，用质谱仪Ⅱ采集样品的一级谱图和二级谱图；
超高效液相色谱检测条件为：超高效液相色谱系统为安捷伦1290 Infinity LC超高效液相色谱系统（UHPLC），色谱柱为HILIC色谱柱（Waters Acquity UPLC BEH Amide 1.7μm，2.1*100mm），柱温为25℃，流动相流速为300nL/min，流动相由A、B两相组成，流动相A是含25mM氨水和25 mM乙酸铵的水溶液，流动相B是乙腈；采用梯度洗脱的方式进行洗脱，洗脱程序为：0～0.5 min，95%流动相 B；0.5～7min，95%～65%流动相B；7～8 min，65%～40%流动相B；8～9 min，40%流动相B；9～9.1 min，40%～95%流动相B；9.1～12 min，95%流动相B；
质谱仪Ⅰ（安捷伦6550质谱仪）在正离子模式下进行检测分析，其ESI源设置参数为：气体温度为250℃，干气体（Drying gas）流速为16 L/min，鞘气温度为400℃，鞘气流速为12L/min，Nozzle喷嘴电压为175 V，Nebulizer喷雾器为20 psig，Vcap升压电容正极为3000V，质量范围为50～1200道尔顿，Acquisition rate（数据采集速率）为4 HZ，每个循环的时间为50ms；
用质谱仪Ⅱ（AB Triple TOF 6600质谱仪）采集每个代谢物质的一级谱图和二级谱图，其ESI源设置参数为：source temperature（离子源温度）：650℃，Ion Source Gas1（离子源气体1）：40，Ion Source Gas2（离子源气体2）：80，source temperature（离子源温度）：650℃，Curtaingas（气帘气）：30，Ion Sapary Voltage Floating（离子喷嘴电压）：+5000 V，正离子模式；二级谱图采用高灵敏度模式进行采集，Declustering potential（分布势能）：±60 V，正离子模式，Collision Energy（碰撞能量）：35±15 eV，IDA的参数设置如下：Exclude isotopes within（排除同位素的质量范围）：4 道尔顿，Candidate ions tomonitor per cycle（每个周期监测的候选离子）：10，按照质核比范围进行分段采集：50～300m/z，290～600 m/z，590～900 m/z，890～1200 m/z，以扩大二级谱图的采集率；
第三步，确定代谢物质：将第二步得到的质谱数据经ProteoWizard转化为.mzXML格式，然后采用lc-ms spectra annotation进行峰对齐、保留时间校正以及峰面积的提取，采用精确质量数匹配<25ppm和二级谱图匹配的方式确定代谢混合物中的每种代谢物质；
第四步，筛选显著性差异代谢物质：以变量权重值>1为筛选标准，用OPLS-DA对第三步确定的每种代谢物质进行初步筛选，变量权重值>1，且差异倍数>1.5或<0.75的代谢物质即为肝硬化样本与正常样本之间的差异代谢物质；用单变量统计对初筛得到的差异代谢物质再次筛选，筛选出P值<0.05的显著性差异代谢物质即为肝硬化阳离子标志物。
本发明采用ROC曲线验证分析每个显著性代谢物质，AUC为ROC曲线下的面积，是最常用的评价ROC曲线特征的参数，是重要的试验准确度指标。若AUC在0.7以下，则表示诊断的准确率较低；AUC在0.7以上，则可以满足临床诊断的要求。采用灵敏度和特异性之和最大时的阈值标准作为判断肝硬化与否的阈值标准（倍数大于1.5者认为大于阈值为肝硬化检测阳性，倍数小于0.75者认定小于阈值者为肝硬化检测阳性），从而得到合适的约登指数。
采用本发明的筛选方法，筛选得到了四个差异性代谢小分子：酪胺（Tyramine）阳离子、2-苯乙酰胺（2-Phenylacetamide）阳离子、三乙醇胺（Triethanolamine）阳离子和Val-Ile阳离子。
本发明还提供了2-苯乙酰胺阳离子作为肝硬化阳离子标志物在制备肝硬化诊断试剂盒或诊断药物中的应用，即本发明提供了一种肝硬化诊断药物或诊断试剂盒，包括2-苯乙酰胺阳离子。
本发明还提供了酪胺阳离子、2-苯乙酰胺阳离子、三乙醇胺阳离子和Val-Ile阳离子的组合物作为肝硬化阳离子标志物在制备肝硬化诊断试剂盒或诊断药物中的应用，即本发明提供了一种肝硬化诊断药物或诊断试剂盒，包括酪胺阳离子、2-苯乙酰胺阳离子、三乙醇胺阳离子和Val-Ile阳离子的组合物。
通过对上述标志物进行检测，可以实现对肝硬化的诊断。
为了使本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作更加详细的说明。本发明实施例中用到的所有试剂和设备均为现有市售产品。
实施例1 本发明所述肝硬化阳离子标志物的筛选方法，包括以下具体步骤：
第一步，提取样本：称取30mg样本组织（包括40个正常肝组织样本（即正常样本）和40个肝硬化样本，），用4℃预冷的PBS溶液清洗两次，再向每个样本中分别加入200μL超纯水，用匀浆机匀浆，涡旋60s，加入800μL甲醇和乙腈混合液（V/V=1:1），涡旋60s，低温（4℃）超声破碎30min，重复超声两次，-20℃孵育60min使样本液中的蛋白质沉淀下来，用离心机在4℃、14000rcf下离心分离20min，取上清液冷冻干燥得到粉状代谢混合物（冻干粉），将粉状代谢混合物于-80℃下冷冻冻存，备用；
第二步，将第一步冷冻冻存的各样本的粉状代谢混合物分别用1.00 m L 0.2%甲酸来保证充分溶解，过滤，经过0.22μm PTFE 滤膜；
用超高效液相色谱及三重四极杆-飞行时间质谱（即LC-MS/MS）分离并采集质谱数据：用超高效液相色谱分离第一步中得到的代谢混合物，将分离后的样品用质谱仪Ⅰ进行检测分析，用质谱仪Ⅱ采集样品的一级谱图和二级谱图；
超高效液相色谱检测条件为：超高效液相色谱系统为安捷伦1290 Infinity LC超高效液相色谱系统（UHPLC），色谱柱为HILIC色谱柱（Waters Acquity UPLC BEH Amide 1.7μm，2.1*100mm），柱温为25℃，进样量为2μL，流动相流速为300nL/min，流动相由A、B两相组成，流动相A是含25 mM氨水和25 mM乙酸铵的水溶液，流动相B是乙腈；采用梯度洗脱的方式进行洗脱，洗脱程序为：0～0.5 min，95%流动相 B；0.5～7min，95%～65%流动相B；7～8 min，65%～40%流动相B；8～9 min，40%流动相B；9～9.1 min，40%～95%流动相B；9.1～12 min，95%流动相B；为保证小分子代谢物的稳定性，整个检测过程中小分子代谢物的温度稳定在4℃；
质谱仪Ⅰ（安捷伦6550质谱仪）在正离子模式下进行检测分析，其ESI源设置参数为：气体温度为250℃，干气体流速为16 L/min，鞘气温度为400℃，Sheath gas鞘气流速为12 L/min，Nozzle喷嘴电压为175 V，Nebulizer喷雾器为20 psig，Vcap升压电容正极为3000 V，质量范围为50～1200道尔顿，Acquisition rate（数据采集速率）为4 HZ，每个循环的时间为50ms；
用质谱仪Ⅱ（AB Triple TOF 6600质谱仪）采集每个代谢物质的一级谱图和二级谱图，其ESI源设置参数为：source temperature（离子源温度）：650℃，Ion Source Gas1（离子源气体1）：40，Ion Source Gas2（离子源气体2）：80，source temperature（离子源温度）：650℃，Curtaingas（气帘气）：30，Ion Sapary Voltage Floating（离子喷嘴电压）：+5000 V，正离子模式；二级谱图采用高灵敏度模式进行采集，Declustering potential（分布势能）：±60 V，正离子模式，Collision Energy（碰撞能量）：35±15 eV，IDA的参数设置如下：Exclude isotopes within（排除同位素的质量范围）：4 道尔顿，Candidate ions tomonitor per cycle（每个周期监测的候选离子）：10，按照质核比范围进行分段采集：50～300m/z，290～600 m/z，590～900 m/z，890～1200 m/z，以扩大二级谱图的采集率；
第三步，确定代谢物质：将第二步得到的质谱数据经ProteoWizard转化为.mzXML格式，然后采用lc-ms spectra annotation进行峰对齐、保留时间校正以及峰面积的提取，采用精确质量数匹配<25ppm和二级谱图匹配的方式确定代谢混合物中的每种代谢物质；
第四步，筛选显著性差异代谢物质：以变量权重值>1为筛选标准，用OPLS-DA对第三步确定的每种代谢物质进行初步筛选，变量权重值>1，且差异倍数>1.5或<0.75的代谢物质即为肝硬化样本与正常样本之间的差异代谢物质；用单变量统计对初筛得到的差异代谢物质再次筛选，筛选出P值<0.05的显著性差异代谢物质即为肝硬化阳离子标志物。
将肝硬化样本（即肝硬化组织）和健康样本（即正常组织）的质谱数据进行筛选分析后，得到四个差异性代谢小分子：酪胺（Tyramine）阳离子、2-苯乙酰胺（2-Phenylacetamide）阳离子、三乙醇胺（Triethanolamine）阳离子和Val-Ile阳离子。研究发现，2-苯乙酰胺阳离子可以单独作为标志物用于诊断肝硬化，酪胺阳离子、2-苯乙酰胺阳离子、三乙醇胺阳离子和Val-Ile阳离子的组合也可作为标志物用于诊断肝硬化，具体如下：
1、酪胺阳离子通过样品LC-MS/MS质谱分析方法检测到在正常肝组织与肝硬化组织中存在显著性统计学差异。经对比，酪胺阳离子在正常肝样本显著性下调了0.71倍，P值为0.00162＜0 .05。
为评价酪胺阳离子的信号响应强度对肝硬化的诊断效能，本发明采用了ROC曲线分析，AUC为ROC曲线下的面积，是最常用的评价ROC曲线特征的参数，是重要的试验准确度指标。如果AUC在0.7以下，则表示诊断的准确率较低；如果AUC在0.7以上，则可以满足临床诊断的要求。
酪胺阳离子信号响应强度的ROC曲线如图1所示。ROC分析显示，酪胺阳离子的AUC为0.699＜0.7，说明诊断效果不佳。
酪胺阳离子信号响应强度为54839.8761时，灵敏度为60％，特异度为77.5％。当进行个体检测时，信号响应强度小于54839.8761时，被判为肝硬化患者，否则判断为正常（假阳性率为22 .5％）。
肝硬化组织和正常肝组织（即健康样本）中酪胺阳离子信号响应强度比较结果见图2。由图2可以看出，肝硬化组织样本主要分布在检测阈值（图2中实线）以下，正常肝组织主要分布在检测阈值以上，说明肝硬化组织和正常肝组织的信号响应强度相差甚大，该检测阈值检测效果良好。
总之，酪胺阳离子不可以作为肝硬化的诊断标志物。
2、2-苯乙酰胺阳离子经样品LC-MS/MS质谱分析方法检测到在肝硬化组织与正常肝组织（即健康样本）中存在显著统计学差异。经对比，2-苯乙酰胺阳离子在正常肝样本显著性下调了0.66倍，P值为0.000512＜0 .05。
为评价2-苯乙酰胺阳离子的信号响应强度对肝硬化的诊断效能，本发明采用了ROC曲线分析，AUC为ROC曲线下的面积，是最常用的评价ROC曲线特征的参数，是重要的试验准确度指标。如果AUC在0.7以下，则表示诊断的准确率较低；若AUC在0.7以上，则可以满足临床诊断的要求。
2-苯乙酰胺阳离子信号响应强度的ROC曲线如图3所示。ROC分析显示2-苯乙酰胺阳离子的AUC为0.724＞0.7，说明具有较好的诊断效果，即2-苯乙酰胺阳离子可以作为肝硬化的诊断标志物。
2-苯乙酰胺阳离子信号响应强度为30034.5526时，灵敏度为62.5％，特异度为72.5％。当进行个体检测时，信号响应强度小于30034.5526时，被判为肝硬化患者，否则判断为正常（假阳性率为27 .5％）。
肝硬化组织和正常肝组织中2-苯乙酰胺阳离子信号响应强度比较结果见图4。由图4可以看出，肝硬化组织样本主要分布在检测阈值（图4中实线）以下，正常肝组织主要分布在检测阈值以上，说明正常肝组织和肝硬化组织的信号响应强度相差甚大，该检测阈值检测效果良好。
鉴于上述结果，2-苯乙酰胺阳离子可以作为肝硬化的诊断标志物。
3、三乙醇胺阳离子通过样品LC-MS/MS质谱分析方法检测到在正常肝组织与肝硬化组织中存在显著统计学差异。经对比，三乙醇胺阳离子在正常肝样本显著性上调了1.53倍，P值为0.0195＜0 .05。
为评价三乙醇胺阳离子的信号响应强度对肝硬化的诊断效能，本发明采用了ROC曲线分析，AUC为ROC曲线下的面积，是最常用的评价ROC曲线特征的参数，是重要的试验准确度指标。如果AUC在0.7以下，则表示诊断的准确率较低；如果AUC在0.7以上，则可以满足临床诊断的要求。
三乙醇胺阳离子信号响应强度的ROC曲线如图5所示。ROC分析显示三乙醇胺阳离子的AUC为0.653＜0.7，说明诊断效能较差。
三乙醇胺阳离子信号响应强度为17457.7277时，灵敏度为80％，特异度为52.5％。当进行个体检测时，信号响应强度小于17457.7277 时，被判为肝硬化患者，否则判断为正常（假阳性率为47 .5％）。
肝硬化组织和正常肝组织中三乙醇胺阳离子信号响应强度比较结果见图6。由图6可以看出，肝硬化组织样本主要分布在检测阈值（图6中实线）以上，正常肝组织主要分布在检测阈值以下，说明正常肝组织和肝硬化组织的信号响应强度相差甚大，该检测阈值检测效果良好。
鉴于上述结果，三乙醇胺阳离子不可以作为肝硬化的诊断标志物。
4、Val-Ile阳离子通过样品LC-MS/MS质谱分析方法检测到在正常肝组织与肝硬化组织中存在显著统计学差异。经对比，Val-Ile阳离子在正常肝样本显著性下调了0.63倍，P值0.00569＜0 .05。
为评价Val-Ile阳离子的信号响应强度对肝硬化的诊断效能，本发明采用了ROC曲线分析，AUC为ROC曲线下的面积，是最常用的评价ROC曲线特征的参数，是重要的试验准确度指标。如果AUC在0.7以下，则表示诊断的准确率较低；如果AUC在0.7以上，则可以满足临床诊断的要求。
Val-Ile阳离子信号响应强度的ROC曲线如图7所示。ROC分析显示Val-Ile阳离子的AUC为0.624＜0.7，说明诊断效能较差。
Val-Ile阳离子信号响应强度为21603.1468时，灵敏度为42.5％，特异度为85％。当进行个体检测时，信号响应强度小于21603.1468时，被判为肝硬化患者，否则判断为正常（假阳性率为15％）。
肝硬化组织和正常肝组织中Val-Ile阳离子信号响应强度比较结果见图8。由图8可以看出，肝硬化组织样本主要分布在检测阈值（图8中实线）以下，正常肝组织主要分布在检测阈值以上，说明正常肝组织和肝硬化组织的信号响应强度相差甚大，该检测阈值检测效果良好。
鉴于上述结果，Val-Ile阳离子不可以作为肝硬化的诊断标志物。
5、酪胺阳离子、2-苯乙酰胺阳离子、三乙醇胺阳离子和Val-Ile阳离子的组合作为诊断方式，检测到在肝硬化组织与肝硬化组织中存在显著统计学差异。本发明采用二元逻辑回归分析计算P（肝硬化概率），SPSS软件二元逻辑回归后得到的公式为：
P=（1+e-（0.053122494004-0.000048382631a+0.00016110468b-0.000171050341c+0.000025652114d）），
其中a、b、c、d分别代表酪胺、2-苯乙酰胺、三乙醇胺、Val-Ile这四种阳离子信号响应强度。若检测P＞0.2870则判断为肝硬化患者，否则判断为正常人群。
为评价组合阳离子代谢物对肝硬化的诊断效能的评测，本发明采用了ROC曲线分析，AUC为ROC曲线下的面积，是最常用的评价ROC曲线特征的参数，是重要的试验准确度指标。若AUC在0.7以下，则表示诊断的准确率较低；AUC在0.7以上，则可以满足临床诊断的要求。
酪胺阳离子、2-苯乙酰胺阳离子、三乙醇胺阳离子、三乙醇胺阳离子和Val-Ile阳离子的组合代谢物的信号强度的ROC曲线如图9所示。ROC分析显示代谢物诊断的AUC为0.888>0.7，说明具有较好的诊断效果，即上述组合代谢物诊断具有良好的诊断效果。
在cut off值0. 2870时，灵敏度为70％，特异度为97.5％。当进行个体检测时，P（肝硬化概率）小于0.2870，被判为肝硬化患者，否则判断为正常（假阳性率为2.5）。
癌组织和肝硬化组织中酪胺阳离子、2-苯乙酰胺阳离子、三乙醇胺阳离子和Val-Ile阳离子的组合代谢物信号强度的比较结果见图10。由图10可以看出，肝硬化组织样本主要分布在检测阈值（图10中实线）以下，正常肝组织主要分布在检测阈值以上，说明肝硬化组织和肝硬化组织的P（肝硬化概率）相差甚大，该检测阈值检测效果良好。
所以，酪胺阳离子、2-苯乙酰胺阳离子、三乙醇胺阳离子和Val-Ile阳离子的组合代谢物可以作为肝硬化的诊断标志物，并且可以获得很好的检验效能。由此可知，本发明筛选得到的酪胺阳离子、三乙醇胺阳离子、Val-Ile阳离子虽然不可单独作为肝硬化的诊断标志物，但该三种阳离子与2-苯乙酰胺阳离子的组合可以作为肝硬化的诊断标志物。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种肝硬化阳离子标志物的筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：
第一步，样本提取：将待测样本用4℃预冷的PBS清洗2次，加入超纯水匀浆，涡旋，加入提取液，涡旋，超声破碎2次，沉淀，离心，将上清冷冻干燥后得到代谢混合物，备用；
第二步，利用LC-MS/MS分离并采集质谱数据：用高效液相色谱分离第一步中得到的代谢混合物，将分离后的样品用质谱仪Ⅰ进行检测分析，用质谱仪Ⅱ采集样品的一级谱图和二级谱图；
高效液相色谱检测条件为：流动相流速为300nL/min，流动相由A、B两相组成，流动相A是含25 mM氨水和25 mM乙酸铵的水溶液，流动相B是乙腈；采用梯度洗脱的方式进行洗脱，洗脱程序为：0～0.5 min，95%流动相 B；0.5～7min，95%～65%流动相B；7～8 min，65%～40%流动相B；8～9 min，40%流动相B；9～9.1 min，40%～95%流动相B；9.1～12 min，95%流动相B；
第三步，确定代谢物质：将第二步得到的质谱数据转化为.mzXML格式，然后采用lc-msspectra annotation进行峰对齐、保留时间校正以及峰面积的提取，采用精确质量数匹配<25ppm和二级谱图匹配的方式确定每种代谢物质；
第四步，筛选显著性差异代谢物质：用多变量统计对第三步确定的每种代谢物质进行初步筛选；初筛出肝硬化样本与正常样本之间的差异代谢物质后，用单变量统计对初筛得到的差异代谢物质再次筛选，筛选出肝硬化样本与正常样本之间的显著性差异代谢物质即为肝硬化阳离子标志物。
2.根据权利要求1所述的肝硬化阳离子标志物的筛选方法，其特征在于：所述第二步中质谱仪Ⅰ的ESI源设置参数为：气体温度为250℃，干气体流速为16 L/min，鞘气温度为400℃，鞘气流速为12 L/min，Nozzle喷嘴电压为175 V，喷雾器为20 psig，Vcap升压电容正极为3000 V，质量范围为50～1200道尔顿，数据采集速率为4 HZ，每个循环的时间为50ms；
质谱仪Ⅱ的ESI源设置参数为：离子源温度：650℃，离子源气体1：40，离子源气体2：80,离子源温度：650℃，气帘气：30，离子喷嘴电压：+5000 V，正离子模式；二级谱图采用高灵敏度模式进行采集，分布势能：±60 V，正离子模式，碰撞能量：35±15 eV，IDA的参数设置如下：排除同位素的质量范围：4 道尔顿，每个周期监测的候选离子：10，按照质核比范围进行分段采集：50～300m/z，290～600 m/z，590～900 m/z，890～1200 m/z。
3.根据权利要求1所述的肝硬化阳离子标志物的筛选方法，其特征在于：所述第一步中的提取液为体积比=1:1的甲醇和乙腈混合液。
4.根据权利要求1所述的肝硬化阳离子标志物的筛选方法，其特征在于：所述第四步得到的显著性差异代谢物质包括酪胺阳离子、2-苯乙酰胺阳离子、三乙醇胺阳离子和Val-Ile阳离子。
5.2-苯乙酰胺阳离子作为肝硬化阳离子标志物在制备肝硬化诊断试剂盒或诊断药物中的应用。
6.酪胺阳离子、2-苯乙酰胺阳离子、三乙醇胺阳离子和Val-Ile阳离子的组合物作为肝硬化阳离子标志物在制备肝硬化诊断试剂盒或诊断药物中的应用。
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