CN107656007A - 组合型血清代谢标志物在制备用于诊断肝病发展进程试剂盒的用途、试剂盒及其筛选方法 - Google Patents

组合型血清代谢标志物在制备用于诊断肝病发展进程试剂盒的用途、试剂盒及其筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种组合型血清代谢标志物在制备用于诊断肝病发展进程试剂盒的用途、试剂盒及其筛选方法，涉及血清代谢标志物技术领域，所述组合型血清代谢标志物主要由甘氨鹅脱氧胆酸钠硫酸钠、甘氨鹅脱氧胆酸、甘氨脱氧胆酸、甘氨胆酸和牛磺鹅脱氧胆酸组成。本发明通过试剂盒对上述血清代谢物在血清中的含量进行组合型筛选检测，可以对肝病患者的肝病发展进程进行辅助诊断，进而有效缓解了现有肝病临床治疗中肝病发生发展监控困难的问题。

Description

组合型血清代谢标志物在制备用于诊断肝病发展进程试剂盒 的用途、试剂盒及其筛选方法
技术领域
本发明涉及血清代谢标志物技术领域，尤其是涉及一种组合型血清代谢标志物在制备用于诊断肝病发展进程试剂盒的用途、试剂盒及其筛选方法。
背景技术
目前，我国乙肝病毒携带者已超过1.2亿人，发病人数超过3000万人。然而，仅有1％的乙肝患者接受治疗。其中，慢性乙型肝炎是导致肝硬化的主要原因。肝硬化在临床中较为多见，如果不能及时有效控制，可导致腹水、上消化道出血、肝性脑病、继发感染、癌变等严重并发症，甚至危及生命。因此对患者的肝病发展进程进行判断，并对患者肝病的发生发展予以有效监控，对该病的有效治疗极为关键。
现有的临床检测肝病发展进程的检测手段一般为肝组织活检或常规的影像及临床生化检测。但这些方法也都存在一些问题，其中肝组织活检虽然为肝病发展进程检验的金标准，然而，此种方法给患者身体和心理都造成了极大的痛苦。同时，常规的影像及临床生化检测方法尚不能对早期肝硬化进行诊断和分级。
因此，研究开发一种用于诊断肝病发展进程试剂盒，该试剂盒具有检测速度快、检测成本低的优点，可以对肝病患者的肝病发展进程进行快速诊断，有效缓解了现有肝病临床治疗中肝病发生发展监控困难的问题，具有非常好的科研和商业应用前景。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种组合型血清代谢标志物在制备用于诊断肝病发展进程试剂盒的用途，由该组合型血清代谢标志物制备的试剂盒能够应用于肝病患者的肝病发展进程的诊断。
本发明的第二目的在于提供一种用于诊断肝病发展进程试剂盒，该试剂盒可以对肝病患者的肝病发展进程进行快速诊断，有效缓解了现有肝病临床治疗中肝病发生发展监控困难的问题。
本发明的第三目的在于提供一种所述的用于诊断肝病发展进程试剂盒筛选组合型血清代谢标志物的方法，该方法具有筛选速度快、筛选成本低，可以进行批量筛选的优点，能很好的对患者血清中的组合型血清代谢标志物进行筛选。
本发明提供的组合型血清代谢标志物在制备用于诊断肝病发展进程试剂盒的用途；
所述组合型血清代谢标志物主要由甘氨鹅脱氧胆酸钠硫酸钠、甘氨鹅脱氧胆酸、甘氨脱氧胆酸、甘氨胆酸和牛磺鹅脱氧胆酸组成。
本发明提供的用于诊断肝病发展进程试剂盒，所述试剂盒包括：
标准品：甘氨鹅脱氧胆酸钠硫酸钠标准品、甘氨鹅脱氧胆酸标准品、甘氨脱氧胆酸标准品、甘氨胆酸标准品和牛磺鹅脱氧胆酸标准品；
含内标提取液：浓度为0.01～1μmol/L的含有同位素内标甘氨鹅脱氧胆酸钠硫酸钠-d5的低碳醇溶液，浓度为0.01～1μmol/L的含有同位素内标甘氨胆酸-d5的低碳醇溶液，浓度为0.01～1μmol/L的含有同位素内标牛磺鹅脱氧胆酸-d5的低碳醇溶液。
进一步的，上述含内标提取液中的低碳醇溶液为甲醇溶液。
本发明提供的一种诊断肝病发展进程试剂盒筛选组合型血清代谢标志物的方法，包括以下步骤：
(a)将人体血清与含内标提取液混合，得到混合液，随后对所述混合液进行预处理得到待测样本；
(b)将所述待测样本通过液质联用检测，对人体血清中的组合型血清代谢标志物进行筛选。
进一步的，上述步骤(a)预处理的步骤为：将混合液沉淀蛋白后，提取上清、冻干/氮气吹干，随后用甲醇溶液复溶后离心，取上清得到待测样本。
进一步的，上述步骤(b)具体包括如下步骤：
步骤(Ⅰ)：称取甘氨鹅脱氧胆酸钠硫酸钠、甘氨鹅脱氧胆酸、甘氨脱氧胆酸、甘氨胆酸和牛磺鹅脱氧胆酸标准品，用甲醇溶解，得到不同浓度的标准液；
步骤(Ⅱ)：将上述含内标提取液分别加入步骤(Ⅰ)得到的标准液中，50％甲醇水定容后离心，取上清液作为待测标准液；
步骤(Ⅲ)：将步骤(Ⅱ)得到的待测标准液和步骤(a)得到的待测样本通过液质联用检测，对人体血清中的组合型血清代谢标志物进行筛选。
进一步的，上述步骤(Ⅲ)液质联用检测的液相色谱条件为：
色谱柱为键合相色谱柱，进样量：5～50μL，流动相包括A和B，其中A为甲酸水溶液，B为乙腈溶液，流动相的流速为0.1～2.0mL/min；流动相的梯度(以体积百分比计)：
0min，A：90～30％、B：10～70％；
4min，A：90～50％、B：10～50％；
5min，A：1～20％、B：99～80％；
8min，A：1～20％、B：99～80％；
8.1min，A：90～60％、B：10～40％；
10min，A：90～60％、B：10～40％。
进一步的，上述键合相色谱柱为C18或C8键合相色谱柱，规格为(50～100)mm×(1.8～3)mm，(1.7～4)μm。
更进一步的，上述键合相色谱柱为C8键合相色谱柱，规格为50mm×2.1mm，1.7μm。
进一步的，上述步骤(c)中液质联用检测的质谱条件为：采用ESI离子源，正离子MRM扫描，喷雾口位置：3∶7；雾化气流速：5～10L/min，气帘气流速：5～10L/min，碰撞气流速：5～10L/min，离子源电压：2500V，离子源温度：400℃。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的一种组合型血清代谢标志物在制备用于诊断肝病发展进程试剂盒的用途，所述组合型血清代谢标志物主要由甘氨鹅脱氧胆酸钠硫酸钠、甘氨鹅脱氧胆酸、甘氨脱氧胆酸、甘氨胆酸和牛磺鹅脱氧胆酸组成。本发明根据人体的很多生理生化代谢过程在肝脏中进行，因此，肝脏疾病可导致代谢过程的变化，从而造成人体血液中某些代谢物含量也会相应的变化的原理。经过研究肝炎、肝硬化、肝癌患者的血清代谢谱发现，通过对甘氨鹅脱氧胆酸钠硫酸钠、甘氨鹅脱氧胆酸、甘氨脱氧胆酸、甘氨胆酸和牛磺鹅脱氧胆酸上述血清代谢物进行组合型检测可以对肝病患者的肝病发展进程进行辅助诊断。本发明应用上述组合型血清代谢标志物制备用于诊断肝病发展进程试剂盒，有效缓解了现有肝病临床治疗中肝病发生发展监控困难的问题。
本发明提供的一种用于诊断肝病发展进程试剂盒，该试剂盒可以对肝病患者的肝病发展进程进行快速诊断，有效缓解了现有肝病临床治疗中肝病发生发展监控困难的问题。
本发明提供的一种所述的用于诊断肝病发展进程试剂盒筛选组合型血清代谢标志物的方法，该方法采用了液相分离和质谱分析联用的检测方法，实现对组合型血清代谢标志物甘氨鹅脱氧胆酸钠硫酸钠、甘氨鹅脱氧胆酸、甘氨脱氧胆酸、甘氨胆酸和牛磺鹅脱氧胆酸的定性和定量分析，具有筛选速度快、筛选成本低，可以进行批量筛选的优点，能很好的对患者血清中的组合型血清代谢标志物进行筛选，具有较高的应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实验例1中GCDCS/GCDCA、GCDCS/TCDCA和GDCA/GCA在各实验组中的比值分析图；
图2为实验例2中GCDCS和GCA占总胆汁酸的比值图；
图3为实验例2中GCDCS/GCDCA、GCDCS/TCDCA和GDCA/GCA在各实验组中的比值分析图；
*表示与正常对照组具有显著性差异，***：p<0.001。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
根据本发明的一个方面，组合型血清代谢标志物在制备用于诊断肝病发展进程试剂盒的用途；
所述组合型血清代谢标志物主要由甘氨鹅脱氧胆酸钠硫酸钠、甘氨鹅脱氧胆酸、甘氨脱氧胆酸、甘氨胆酸和牛磺鹅脱氧胆酸组成。
本发明根据人体的很多生理生化代谢过程在肝脏中进行，因此，肝脏疾病可导致代谢过程的变化，从而造成人体血液中某些代谢物含量也会相应的变化的原理。经过研究肝炎、肝硬化、肝癌患者的血清代谢谱发现，通过对甘氨鹅脱氧胆酸钠硫酸钠(GCDCS)、甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)、甘氨脱氧胆酸(GDCA)、甘氨胆酸(GCA)和牛磺鹅脱氧胆酸(TCDCA)上述血清代谢物进行组合型检测可以对肝病患者的肝病发展进程进行诊断。本发明应用上述组合型血清代谢标志物制备用于诊断肝病发展进程试剂盒，有效缓解了现有肝病临床治疗中肝病发生发展监控困难的问题。
根据本发明的一个方面，用于诊断肝病发展进程试剂盒，所述试剂盒包括：
标准品：GCDCS、GCDCA、GDCA、GCA和TCDCA标准品；
含内标提取液：含有浓度各为0.01～1μmol/L同位素内标甘氨鹅脱氧胆酸钠硫酸钠-d5、甘氨胆酸-d5、牛磺鹅脱氧胆酸-d5的低碳醇溶液。
本发明用于诊断肝病发展进程试剂盒，可以对肝病患者的肝病发展进程进行快速诊断，有效缓解了现有肝病临床治疗中肝病发生发展监控困难的问题。
在本发明的一种优选实施方式中，上述含内标提取液中的低碳醇溶液为甲醇溶液。
作为一种优选的实施方式，含内标提取液由甲醇溶液制得，具有易被色谱柱分离、不易受干扰的特点，更利于后续测量时进行定量分析。
根据本发明的一个方面，一种诊断肝病发展进程试剂盒筛选组合型血清代谢标志物的方法，包括以下步骤：
(a)将人体血清与含内标提取液混合，得到混合液，随后对所述混合液进行预处理得到待测样本；
(b)将所述待测样本通过液质联用检测，对人体血清中的组合型血清代谢标志物进行筛选。
本发明中，上述筛选组合型血清代谢标志物的方法采用了液相分离和质谱分析联用的检测方法，实现对组合型血清代谢标志物GCDCS、GCDCA、GDCA、GCA和TCDCA的定性和定量分析，具有筛选速度快、筛选成本低，可以进行批量筛选的优点，能很好的对患者血清中的组合型血清代谢标志物进行筛选，具有较高的应用价值。
在本发明的一种优选实施方式中，上述步骤(a)预处理的步骤为：将混合液沉淀蛋白后，取上清并干燥，随后用甲醇溶液复溶后离心，取上清得到待测样本。
优选的，上述步骤(a)预处理的步骤为：将混合液沉淀蛋白后，涡旋1～3min，之后10000～18000rpm离心10min后取上清，冻干/氮气吹干，加入50～300μL 10～80％甲醇水复溶，涡旋，10000～18000rpm离心10min后取上清得到待测样本。
在本发明的一种优选实施方式中，上述步骤(b)具体包括如下步骤：
步骤(Ⅰ)：称取GCDCS、GCDCA、GDCA、GCA和TCDCA标准品，用甲醇溶解，得到不同浓度的标准液；
步骤(Ⅱ)：将上述含内标提取液分别加入步骤(Ⅰ)得到的标准液中，超纯水定容后离心，取上清液作为待测标准液；
步骤(Ⅲ)：将步骤(Ⅱ)得到的待测标准液和步骤(a)得到的待测样本通过液质联用检测，对人体血清中的组合型血清代谢标志物进行筛选。
作为一种优选的实施方式，本发明采用内标法对血清中的组合型血清代谢标志物进行检测。在检测过程中，配置待测标准液和检测液，使用液相分离-质谱联用检测仪进行检测，以各血清代谢标志物的峰面积与血清代谢标志物同位素内标的峰面积之比对血清中各血清代谢标志物的浓度进行线性回归，从而对血清中的本发明各血清代谢标志物进行定量检测。
在上述优选实施方式中，上述步骤(Ⅲ)液质联用检测的液相色谱条件为：
色谱柱为键合相色谱柱，进样量：5～50μL，流动相包括A和B，其中A为甲酸水溶液，B为乙腈溶液，流动相的流速为0.1～2.0mL/min；流动相的梯度(以体积百分比计)：
0min，A：90～30％、B：10～70％；
4min，A：90～50％、B：10～50％；
5min，A：1～20％、B：99～80％；
8min，A：1～20％、B：99～80％；
10min，A：90～60％、B：10～40％；
10min，A：90～60％、B：10～40％。
在本发明的一种优选实施方式中，上述键合相色谱柱为C18或C8键合相色谱柱，规格为(50～100)mm×(1.8～3)mm，(1.7～4)μm。
在上述优选实施方式中，上述键合相色谱柱为C8键合相色谱柱，规格为50mm×2.1mm，1.7μm。
在本发明的一种优选实施方式中，所述步骤(c)中液质联用检测的质谱条件为：采用ESI离子源，正离子MRM扫描，喷雾口位置：3∶7；雾化气流速：5～10L/min，气帘气流速：5～10L/min，碰撞气流速：5～10L/min，离子源电压：2500V，离子源温度：400℃。
以下结合实施例对本发明的血液中激素的检测方法作进一步的详细描述。
实施例1
(一)仪器和材料：
美国AB Sciex 5500串联质谱仪；
Angilent 1290液相色谱仪；
Agilent C18柱(2.1×50mm，1.7μm)。
(二)药品与试剂：
标准物质：GCDCS、GCDCA、GDCA、GCA、TCDCA购买自Sigma公司；
以上胆汁酸的同位素内标甘氨鹅脱氧胆酸钠硫酸钠-d4(GCDCS-d4)、甘氨胆酸-d4(Glycocholic acid-d4,GCA-d4)、牛磺鹅脱氧胆酸-d4(TCDCA-d4)均购买自美国Cerilliant公司；
甲酸：色谱纯(MERCK公司)；
乙腈：色谱纯(MERCK公司)；
碳酸氢铵：分析纯购买自国药集团(上海)；
双蒸水：Thermo公司。
(三)检测用溶液
对照品储备液：GCDCS、GCDCA、GDCA、GCA和TCDCA5种药品先分别配成100～1000μmol/L的甲醇溶液，再混合成各药品浓度为5～20μmol/L混合储备液。
内标液：取适量同位素内标用甲醇溶解并稀释为5～80μg/mL的储备液，再用甲醇稀释至含量为0.01～1μg/mL的内标工作溶液。
待测标准液：分别精取一定体积的混合储备液，分别加入20μL内标液，用50％甲醇水稀释至浓度为1、2、5、10、20、25、50ng/mL的待测标准液，
(四)待测样本的制备
直接取10～200μL血清，加入含有浓度为0.01～1μmol/L同位素内标的甲醇混合液沉淀蛋白，涡旋1～3min，之后10000～18000rpm离心10min后取上清干燥，加入50～300μL10～80％甲醇水复溶，涡旋，10000～18000rpm离心10min后取上清得到待测样本。
(五)液质联用检测
将制得的待测标准液和待测样本进样至液相色谱-质联用仪中进行检测。其中，液相色谱的条件为：
流动相：A相为含有10～50％甲酸水溶液，B相为乙腈或甲醇的溶液；流速：0.1～2mL/min。
梯度(以体积百分比计)：
0min，A：90％～30％、B：10％～70％；
4min，A：90％～50％、B：10％～50％；
5min，A：1～20％、B：99～80％；
8min，A：1～20％、B：99～80％；
8.1min，A：90％～60％、B：10％～40％；
10min，A：90％～60％、B：10％～40％。
色谱柱：Agilent C8柱(2.1×50mm，1.7μm)；进样量：10μL。
其中，质谱的条件为：
采用ESI离子源，正离子MRM扫描，喷雾口位置：3∶7，
雾化气流速：5～10L/min，
气帘气流速：5～10L/min，
碰撞气流速：5～10L/min，
离子源电压：2500V，
离子源温度：400℃。
(六)结果检测
将待测标准液中检测到的组合型血清代谢标志物的峰面积与内标峰面积之比对标准液中各血清代谢标志物的浓度进行线性回归，得到组合型血清代谢标志物的线性方程，进而对本发明组合型血清代谢标志物在血清中的含量进行定量检测
实验例1
为表明本发明用于诊断肝病发展进程试剂盒筛选组合型血清代谢标志物的方法，具有筛选速度快、筛选成本低，可以进行批量筛选的优点，能很好的对患者血清中的组合型血清代谢标志物进行筛选，进而有效缓解了现有肝病临床治疗中肝病发生发展监控困难的问题。
现特选取374例血清样本，包括了234例正常人样本，67例急性肝炎样本，73例肝癌样本利用本发明的筛选方法对各血清样本中的组合型血清代谢标志物进行筛选，其筛选方法同实施例1。
通过实施例1的方法对上述血清样本中的GCDCS、GCDCA、GDCA、GCA和TCDCA在正常对照组(Health)、急性肝炎组(hepatitis)、肝癌组(Hepatocellular caicinoma)中的含量进行测定，并对GCDCS/GCDCA、GCDCS/TUDCA和GDCA/GCA的比值进行分析，其结果如图1所示：
图1中，GCDCS/GCDCA的比值在肝炎情况下，可能由于肝细胞功能的丧失，GCDCS/GCDCA显著下降；而在肝癌中，可能由于癌细胞的自我保护机制，GCDCS/GCDCA显著上升；
GDCA/GCA的比值在有肝病情况下与正常对照组相比，其比值显著降低，表明肝肠循环或肠道菌群功能受损，但肝炎和肝癌没有显著性差异。
实验例2
为表明本发明用于诊断肝病发展进程试剂盒筛选组合型血清代谢标志物的方法，能很好的对患者血清中的组合型血清代谢标志物进行筛选，进而有效缓解了现有肝病临床治疗中肝病发生发展监控困难的问题。
现特选取135例样本，其中45例为正常样本，42例慢性肝炎样本，25例肝硬化样本和23例肝癌样本，分别对应为正常对照组(Health)、肝炎组(hepatitis)、肝硬化组(Cirrhosis)和肝癌组(Hepatocellular caicinoma)，利用本发明的筛选方法对上述各组血清样本中的组合型血清代谢标志物进行筛选，其筛选方法同实施例1。同时，采用酶比色法检测各血清样本中的总胆汁酸含量进行测定。
1、将上述各组中血清样本的总胆汁酸含量除以上述血清样本中的GCDCS和GCA的含量，得到GCDCS和GCA占总胆汁酸的比值，其结果如图2所示：
由图2可知，GCDCS在总胆汁酸中的百分含量在正常对照组(Health)、肝炎组(hepatitis)和肝硬化组(Cirrhosis)三组之间没有显著性差异，而在肝癌组(Hepatocellular caicinoma)中，肝癌病人血清中有明显升高，并与前三者具有显著性差异。GCA占总胆汁酸的比值在正常对照组(Health)中最小，在肝病状态下，即在肝炎组(hepatitis)和肝硬化组(Cirrhosis)和肝癌组(Hepatocellular caicinoma)中显著上调，且不同肝病之间没有显著性差异。
2、本实验例还对GCDCA/TCDCA、GCDCS/GCDCA以及GDCA/GCA在正常对照组(Health)、肝炎组(hepatitis)、肝硬化组(Cirrhosis)和肝癌组(Hepatocellularcaicinoma)中的分布进行了分析，结果如图3所示。
由图3可知，GCDCS/GCDCA的比值与正常对照组(Health)相比，在肝炎组(hepatitis)和肝癌组(Hepatocellular caicinoma)中均有升高，在肝硬化组(Cirrhosis)中有下降趋势。
GCDCA/TCDCA的比值在有肝病情况下与正常对照组相比，其比值显著降低。随着病情从正常人、肝炎、肝硬化到肝癌的肝病发展过程中，该比值出现逐渐下调趋势，但该比值在肝硬化和肝癌之间差异不显著。
GDCA/GCA的比值在肝炎组(hepatitis)和肝硬化组(Cirrhosis)中有明显的下调，而肝癌组(Hepatocellular caicinoma)和正常对照组(Health)没有显著差异。
综合上述实验例1和实验例2可知，GCA、GCDCS占总胆汁酸的比值分别是良好的肝病及肝癌的标志物；GCDCA/TCDCA、GCDCS/GCDCA以及GDCA/GCA等比值对区分肝病的发展进程具有良好的预示作用。因此，本发明可以对肝病患者的肝病发展进程进行诊断，进而有效缓解了现有肝病临床治疗中肝病发生发展监控困难的问题。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.组合型血清代谢标志物在制备用于诊断肝病发展进程试剂盒的用途；
所述组合型血清代谢标志物主要由甘氨鹅脱氧胆酸钠硫酸钠、甘氨鹅脱氧胆酸、甘氨脱氧胆酸、甘氨胆酸和牛磺鹅脱氧胆酸组成。
2.一种用于诊断肝病发展进程的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
标准品：甘氨鹅脱氧胆酸钠硫酸钠标准品、甘氨鹅脱氧胆酸标准品、甘氨脱氧胆酸标准品、甘氨胆酸标准品和牛磺鹅脱氧胆酸标准品；
含内标提取液：浓度为0.01～1μmol/L的含有同位素内标甘氨鹅脱氧胆酸钠硫酸钠-d5的低碳醇溶液，浓度为0.01～1μmol/L的含有同位素内标甘氨胆酸-d5的低碳醇溶液，浓度为0.01～1μmol/L的含有同位素内标牛磺鹅脱氧胆酸-d5的低碳醇溶液。
3.根据权利要求2所述的用于诊断肝病发展进程试剂盒，其特征在于，所述含内标提取液中的低碳醇溶液为甲醇溶液。
4.一种根据权利要求2或3所述的用于诊断肝病发展进程试剂盒筛选组合型血清代谢标志物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)将人体血清与含内标提取液混合，得到混合液，随后对所述混合液进行预处理得到待测样本；
(b)将所述待测样本通过液质联用检测，对人体血清中的组合型血清代谢标志物进行筛选。
5.根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤(a)预处理的步骤为：将混合液沉淀蛋白后，提取上清并干燥，随后用甲醇溶液复溶后离心，取上清得到待测样本。
6.根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤(b)具体包括如下步骤：
步骤(Ⅰ)：称取甘氨鹅脱氧胆酸钠硫酸钠、甘氨鹅脱氧胆酸、甘氨脱氧胆酸、甘氨胆酸和牛磺鹅脱氧胆酸标准品，用甲醇溶解，得到不同浓度的标准液；
步骤(Ⅱ)：将权利要求2中含内标提取液分别加入步骤(Ⅰ)得到的标准液中，定容后离心，取上清液作为待测标准液；
步骤(Ⅲ)：将步骤(Ⅱ)得到的待测标准液和权利要求4中步骤(a)得到的待测样本通过液质联用检测，对人体血清中的组合型血清代谢标志物进行筛选。
7.根据权利要求6所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤(c)液质联用检测的液相色谱条件为：
色谱柱为键合相色谱柱，进样量：5～50μL，流动相包括A和B，其中A为甲酸水溶液，B为乙腈溶液，流动相的流速为0.1～2.0mL/min；流动相的梯度(以体积百分比计)：
0min，A：90～30％、B：10～70％；
4min，A：90～50％、B：10～50％；
5min，A：1～20％、B：99～80％；
8min，A：1～20％、B：99～80％；
8.1min，A：90～60％、B：10～40％；
10min，A：90～60％、B：10～40％。
8.根据权利要求7所述的筛选方法，其特征在于，所述键合相色谱柱为C18或C8键合相色谱柱，规格为(50～100)mm×(1.8～3)mm，(1.7～4)μm。
9.根据权利要求8所述的筛选方法，其特征在于，所述键合相色谱柱为C8键合相色谱柱，规格为50mm×2.1mm，1.7μm。
10.根据权利要求6所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤(c)中液质联用检测的质谱条件为：采用ESI离子源，正离子MRM扫描，喷雾口位置：3∶7；雾化气流速：5～10L/min，气帘气流速：5～10L/min，碰撞气流速：5～10L/min，离子源电压：2500V，离子源温度：400℃。
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