CN114235984A - 筛查不同环境样品中具有显著性差异的化合物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种筛查不同环境样品中具有显著性差异的化合物的方法，包括以下步骤：样品前处理；确定色谱参数，设定质谱参数，利用GC×GC‑HRTOFMS对待分析样品进行分析；通过ChromaTOF软件对GC×GC‑HRTOFMS分析获得的数据进行质量校准、解卷积、峰识别和峰对齐；针对多变量大数据集，利用SIMCA软件进行PCA和PLS‑DA，对不同样品生成的化学指纹数据集搜索特征，探究不同样品中有机污染物组成是否具有一定的相似性或差异性，执行OPLS‑DA筛选有机污染物组成明显不同的两组样本间具有显著性含量差异的化合物；对筛选出的差异性化合物进行鉴定。
Description
技术领域
本发明涉及环境分析领域，尤其涉及筛查识别不同环境样品中具有显著性差异的挥发及半挥发性有机污染物的方法。
背景技术
环境污染造成的生态环境和人体健康危害在较大程度上取决于环境介质中的复杂有机组分。不同环境样品(时间，地区，形态差异)引起的不同生态和健康效应则可能与各样品中的特征有机污染物有关。先前的研究多采用目标分析方法量化了环境中一些已知污染物随着时间，地区，形态等的分布差异。反之，在不同环境样品中造成重要影响的具有显著性差异的化合物尚不了解，一些会引起不利生态环境或人体健康效应的污染物可能会被忽略。由于环境样品中有机组成极其复杂且浓度较低，分离分析这些复杂混合物，并从中筛选出关键有机组分具有较大挑战。
发明内容
本发明利用具有较强峰容量，分辨率和灵敏度的全二维气相色谱-高分辨飞行时间质谱仪(GC×GC-HRTOFMS)，以及适合海量数据中关键信息挖掘的化学计量学手段提供了一种筛查不同环境样品中具有显著性差异的挥发及半挥发性有机污染物的分析方法。
本发明所提供的筛查不同环境样品中具有显著性差异的化合物的方法，包括以下步骤：
(1)样品前处理
依据分析目的采集多个不同类别环境样品，分别采用加速溶剂萃取法提取后浓缩，膜过滤去除大分子杂质，所得滤液用正己烷定容至50ul作为待分析样品，并从每个样品的滤液中取出等体积溶液混匀得到质量控制(QC)样本；
(2)仪器分析
确定色谱参数，设定质谱参数，利用GC×GC-HRTOFMS对步骤(1)制得的待分析样品进行分析；
(3)数据预处理
通过ChromaTOF软件对GC×GC-HRTOFMS分析获得的数据进行质量校准、解卷积、峰识别和峰对齐；
(4)多元统计分析
针对多变量大数据集，利用SIMCA软件进行主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)，对不同样品生成的化学指纹数据集搜索特征，探究不同样品中有机污染物组成是否具有一定的相似性或差异性，执行正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)筛选有机污染物组成明显不同的两组样本间具有显著性含量差异的化合物；
(5)差异化合物鉴定
通过谱库检索，保留指数比对，同位素峰验证，精确质量数偏差以及离子碎裂模式诊断等方法对筛选出的差异性化合物进行鉴定。
上述方法步骤(1)中，以经正己烷：二氯甲烷(1:1,v/v)为溶剂进行加速溶剂萃取；
通过旋转蒸发和稳定氮气流进行浓缩，
所述膜过滤为采用0.22μm的有机滤膜去除大分子杂质，尽可能多的保留样品中非极性和弱极性有机组分。
上述方法步骤(2)中，确定的色谱参数包括：不分流进样；进样量1μl；进样口280℃；载气1.0mL/min；色谱柱Rxi-5ms(30m×0.25mm×0.25μm)+Rxi-17Sil MS(1m×0.25mm×0.25μm)；第一柱温箱从60℃(1min)开始，以20℃/min的速率升温至100℃，维持1min，然后以2.5℃/min的速度升温至310℃，维持5min；第二柱温箱比第一柱温箱始终高10℃；调制器比第二柱温箱始终高25℃；调制周期10s；传输线310℃；离子源250℃；EI模式；电离能70eV；数据采集范围m/z 20-1000；采集速率180谱图/秒。
上述方法步骤(3)的操作为：通过ChromaTOF软件中Reference功能将QC样本中检测出的色谱峰产生一个峰列表，作为样品间色谱峰的比对基准(reference standard)；将不同样品中的色谱峰参照此reference standard进行峰对齐和峰比对，将一维保留时间偏差在±10s，二维保留时间偏差在±0.1s，质谱相似度在500以上的色谱峰指认为同一化合物，从而获得包含保留时间，质荷比，峰强度和样品信息的数据矩阵；并依据峰响应把所有检测出的色谱峰标记为match，out of tolerance，not found和unknown四类；
上述方法步骤(3)和(4)之间还可进一步包括数据质量评价步骤，即，通过QC样本的重复多次分析，观察检出的化合物有无明显的信号漂移，表征检测方法的稳定性；
上述方法步骤(4)的操作为：将每个数据集通过对数变换和帕累托缩放进行归一化，通过无监督主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)探究不同环境样本间有机组分的聚类情况，判断不同组别样品中有机污染物的组成较为相似还是差异较大，在正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)中构建模型并利用7重交叉验证和200次置换检验表明所构建模型的稳健性可靠性和预测能力，依据方差重要性投影(VIP)>1以及p<0.05两个标准筛选出不同组别样品间具有显著性差异的化合物。
本发明与现有差异性化合物筛查方法相比具有以下优点：
1)利用比传统一维色谱具有更高分离能力，峰容量和灵敏度的GC×GC-TOF MS实现环境样品中复杂且痕量的有机污染物的同时分离，为未知物的准确定性提供保障。
2)利用各化合物在色谱中的一维保留时间，二维保留时间，以及质谱中碎片离子的精确质量数和相对丰度，对不同样品中检出的各化合物进行比对，能够更准确锁定未知化合物。
3)利用包括PCA，PLS-DA和OPLS-DA在内的多种化学计量学方法更逐级详细探究不同环境样本中有机组分的聚类情况，并筛选出不同组别之间具有显著性含量差异的化合物。
附图说明
图1为本发明利用GC×GC-HRTOFMS检测复杂大气样品中挥发及半挥发性有机化合物的总离子流色谱图。
图2为本发明利用PCA和PLS-DA进行大气气相和颗粒相样品中有机物多元统计分析得分图。
图3为本发明筛选出在气相和PM1中具有显著性差异的有机污染物。
图4为本发明筛选出在PM1和1-2.5μm大气颗粒物中具有显著性差异的有机污染物。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明公开了一种基于全二维气相色谱和化学计量学筛查不同环境样品中具有显著性差异化合物的方法，所述方法包括以下步骤：
利用加速溶剂萃取仪对复杂样品中有机组分进行提取，并通过旋转蒸发及氮气吹扫进行浓缩；
利用GC×GC-HRTOF MS建立复杂环境样品中挥发及半挥发性化合物分离分析方法；
利用ChromaTOF软件中Reference功能将不同样品中色谱峰对齐得到一个包含多信息的数据矩阵；
利用SIMCA软件进行多元统计分析筛选出不同环境样品中具有显著性含量差异的化合物；
利用谱库检索，保留指数比对，同位素峰验证，精确质量数核算和离子碎裂模式诊断技术对不同样品中具有显著性差异的化合物进行结构鉴定。
大气污染已成为全球关注的重大环境问题。环境空气中有机污染物在其不良后果中起着重要作用。考虑到环境空气中有机污染物的迁移、沉积和对人体健康的影响都与其附着的相态和粒径大小密切相关，已有研究报道了一些已知污染物的气固分配行为和粒径分布特征。然而，复杂大气组分中随着气固分配和粒径分布更有可能造成跨区域影响或进入全身血液循环并转移到人体其他部位的关键特征有机污染物可能被忽略。为了早期甄别出大气中这类可能在全球扩散或人体健康危害中起主要不利因素的污染物，在其造成更严重或更大面积不利影响前开展监控。本发明在具体实施时，选择北京地区冬季气相及不同粒径大气颗粒物样品，非靶向筛查出了气相与颗粒相样品，以及不同粒径颗粒相样品间具有显著性含量差异的污染物。
以下是对复杂环境样品(以北京地区气相及不同粒径大气颗粒物样品为例)中显著差异性有机化合物筛查识别的实例。包括以下步骤：
(1)利用大流量主动分级采样器(KS-303,Kalman System,Hungary)在北京城市生态系统研究站采集大气气相及不同粒径颗粒相样品(粒径<1,1–2.5,2.5–10,>10μm)，经正己烷：二氯甲烷(1:1，V/V)为溶剂进行ASE提取后浓缩，并经正己烷定容至50μl以待分析。从每个样品中取出5μl混匀制得QC样品。
(2)利用GC×GC-HRTOFMS(LECO,St.Joseph,MI,USA)优化后的色谱质谱条件对处理后的大气样品进行分析。操作时采用的具体色谱质谱条件包括：不分流进样；进样量1μl；进样口温度280℃；载气流速1.0mL/min；色谱柱组合Rxi-5ms(30m×0.25mm×0.25μm)+Rxi-17Sil MS(1m×0.25mm×0.25μm)；第一柱温箱从60℃(1min)开始，以20℃/min的速率升温至100℃，维持1min，然后以2.5℃/min的速度升温至310℃，维持5min；第二柱温箱比第一柱温箱始终高10℃；调制器比第二柱温箱高25℃；调制周期10s；传输线温度310℃；离子源为EI模式；电离能70eV；离子源温度250℃；数据采集范围m/z 20-1000；采集速率180谱图/秒。(对于不同的样品如大气气相、dae<1、1–2.5,2.5–10,>10μm的颗粒相样品，GC×GC-HRTOFMS的操作条件均相同)，如图1所示，在一次进样中实现了成千上万个挥发及半挥发性有机污染物的同时有效分离。
(3)利用ChromaTOF软件(LECO,St.Joseph,MI,USA)对检测出的数据进行质量校正，解卷积和积分，查找出信噪比大于100的色谱峰。并通过Reference功能以QC样品为参照进行峰对齐，得到了一个包含8832个化合物的数据矩阵。
(4)利用SIMCA软件(version 14.0,Umetrics,Umea,Sweden)以每个化合物在不同大气样品中的响应为依据，进行多元统计分析。通过PCA对空气样本进行聚类分析，发现大气气相和不同粒径颗粒物中有机污染物组成种类和含量呈现较大差异，而同粒径范围颗粒物中有机污染物分布表现出一定相似性。根据气相和不同粒径颗粒相分组后进行PLS-DA，进一步表明气相，PM1和大于1μm颗粒物中挥发及半挥发有机物呈现出不同分布趋势(图2)。
(5)执行OPLS-DA筛选出1217个在气相和PM1中具有显著性含量差异的污染物。通过保留指数匹配和质谱相似度鉴定出39个化合物，仅通过质谱初步识别出51个化合物，10个化合物经标准品进行了确证(图3)。在之前的研究中，90种化学物质中有9种没有在空气中被报道过，63种化合物没有被研究过气固分配行为。聚类热力图分析也表明筛查出的化合物具有明显的气固分配特征。气相中主要分布有氰化物、硝基化合物和酚类化合物，而氮杂环化合物、酰胺类、酮类和邻苯二甲酸酯类物质主要分布在PM1中。这些化合物的气固分配比也在其他测试组空气样品中得到了验证。将这些化合物的实测气固分配系数与基于过冷饱和蒸气压的平衡分配模型计算出的理论值进行比较，发现57种化合物的实测与预估分配系数相差高达3-10个数量级，这些意料之外的结果提醒我们需要更加关注这些特征污染物的环境行为。
(6)执行OPLS-DA筛查出51个在PM1和大于1-2.5μm颗粒物中具有显著性含量差异的污染物(图4)。发现9H-Fluoren-9-one,2-oxobicyclo-nona-3,6-dien-1-ylbenzoate,4,5-dimethoxy-2-hydroxyacetophenone,phthalic acid,bis(2-pentyl)ester,2-ethylhexanal ethylene glycol acetal,1-methyl-2,5-dipropyldecahydroquinoline和4-nonylphenol(0.15-,0.2-,0.2-,0.2-,0.2-,0.21-和0.21-差异倍数,p<0.05)明显分布在PM1中。利用有机物毒性效应预测体系，预估了这些化合物在心脏损伤，肝毒性，呼吸毒性，致癌性，雄激素受体，雌激素受体，芳香烃受体，氧化应激8个方面的生物毒性，并结合半定量分析结果计算各自毒性当量以进行优先级排序，发现了一些比常规监测的PAHs具有更强生物毒性的新污染物。
环境中有机污染物种类复杂多样，但并不是所有物质都值得监测。通过该发明，有助于我们高效分离环境样品中复杂有机组分，并从海量数据中快速提取和过滤出关键信息，尽早筛查出在环境行为或人体健康危害方面会造成重要影响的特征污染物，尤其是先前被忽略的新污染物，从而为环境污染优先重点防控提供数据支持。
以上所述的具体实例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种筛查不同环境样品中具有显著性差异的化合物的方法，包括以下步骤：
(1)样品前处理
依据分析目的采集多个不同类别环境样品，分别采用加速溶剂萃取法提取后浓缩，膜过滤去除大分子杂质，所得滤液用正己烷定容作为待分析样品，并从每个样品的滤液中取出等体积溶液混匀得到质量控制样本；
(2)仪器分析
确定色谱参数，设定质谱参数，利用GC×GC-HRTOFMS对步骤(1)制得的待分析样品进行分析；
(3)数据预处理
通过ChromaTOF软件对GC×GC-HRTOFMS分析获得的数据进行质量校准、解卷积、峰识别和峰对齐；
(4)多元统计分析
针对多变量大数据集，利用SIMCA软件进行主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)，对不同样品生成的化学指纹数据集搜索特征，探究不同样品中有机污染物组成是否具有一定的相似性或差异性，执行正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)筛选具有不同有机污染物指纹特征的两组样本间具有显著性含量差异的化合物；
(5)差异化合物鉴定
通过谱库检索，保留指数比对，同位素峰验证，精确质量数偏差以及离子碎裂模式诊断方法对筛选出的差异性化合物进行鉴定。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，以经正己烷：二氯甲烷(1:1,v/v)为溶剂进行加速溶剂萃取；
通过旋转蒸发和稳定氮气流进行浓缩，
所述膜过滤为采用0.22μm的有机滤膜去除大分子杂质。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤(3)的操作为：通过ChromaTOF软件中Reference功能将QC样本中检测出的色谱峰产生一个峰列表，作为样品间色谱峰的比对基准(reference standard)；将不同样品中的色谱峰参照此reference standard进行峰对齐和峰比对，将一维保留时间偏差在±10s，二维保留时间偏差在±0.1s，质谱相似度在500以上的色谱峰指认为同一化合物，从而获得包含保留时间，质荷比，峰强度和样品信息的数据矩阵；并依据峰响应把所有检测出的色谱峰标记为match，out of tolerance，not found和unknown四类，即通过以质控样品为参照进行样品间比对，将不同样品中检出的全部化合物根据色谱保留时间和质谱碎片离子进行峰对齐，得到一个包含保留时间，质荷比，峰强度和样品信息的数据矩阵用于后续多元统计分析。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于：步骤(4)的操作为：将每个数据集通过对数变换和帕累托缩放进行归一化，通过无监督主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)探究不同环境样本间有机组分的聚类情况，判断不同组别样品中有机污染物的组成较为相似还是差异较大，在正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)中构建模型并利用7重交叉验证和200次置换检验表明所构建模型的稳健性可靠性和预测能力，依据方差重要性投影(VIP)>1以及p<0.05两个标准筛选出不同组别样品间具有显著性差异的化合物。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于：步骤(3)和(4)之间还可进一步包括数据质量评价步骤，即，通过QC样本的重复多次分析，观察检出的化合物有无明显的信号漂移，表征检测方法的稳定性。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN116202918A (zh) * | 2023-03-07 | 2023-06-02 | 中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所 | 大气颗粒物组分混合暴露的关键毒性组分的识别方法及系统 |
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