CN101776656A

CN101776656A - 一种测定果蔬酱中棒曲霉素的方法

Info

Publication number: CN101776656A
Application number: CN201010045512A
Authority: CN
Inventors: 李锋格; 姚伟琴; 田延河; 苏敏; 朱慧萍; 李炎; 胡建民; 李欣; 沈梦园
Original assignee: XINJIANG ENTRY-EXIT INSPECTION QUARANTINE BUREAU INSPECTION QUARANTINE TECHNOLOGY CENTER
Current assignee: XINJIANG ENTRY-EXIT INSPECTION QUARANTINE BUREAU INSPECTION QUARANTINE TECHNOLOGY CENTER
Priority date: 2010-01-15
Filing date: 2010-01-15
Publication date: 2010-07-14

Abstract

本发明公开了一种快速测定果蔬酱中棒曲霉素的方法。通过称取2.00克果蔬酱于离心管中，加水0.5-3mL，振摇，加5mL乙酸乙酯-正己烷溶液(95+5，v/v)，振摇，同时加入0.5-2克海沙，4-8克无水硫酸钠和0.5-2克碳酸氢钠，剧烈振摇2min，离心3min。移取4mL上清液至乙酸乙酯活化炭黑小柱，用加有冰乙酸的试管接受洗脱液，3-7mL乙酸乙酯洗脱，吹干。240μL乙腈溶解，移取150μL溶解液至样品瓶中，加50μL衍生化试剂，微波加热1-7min，冷却，供气相色谱-质谱测定。该方法是一种快速，简便、灵敏、准确、专一、耐用的确证和定量方法，广泛应用于果蔬酱中棒曲霉素检测领域。

Description

一种测定果蔬酱中棒曲霉素的方法

发明领域

本发明属于食品安全检测领域，具体涉及食品中有害毒素化合物的检测方法，特别是涉及一种快速检测果蔬酱中棒曲霉素的方法领域。

背景技术

棒曲霉素(Patulin，PAT)，又称展青霉素。化学名称：4-羟基-4H-呋喃(3，2-c)并吡喃-2(6H)酮(4-hydroxy-4H-Furo[3，2-c]Pyran-2(6H)-One)，是属于真菌毒素的一类有毒化合物，主要是青霉属(Penicillium)、曲霉属(Aspergillus)和丝衣霉(Byssochlamys)等多种真菌的次生代谢产物，有强烈的抗菌活性，对动物的细胞和组织有很强的毒性，具有潜在的致癌、致畸和致突变性，主要存在于苹果、梨和葡萄。欧盟规定果汁、特别是苹果汁及含苹果汁的酒精饮料中，棒曲霉素最大限量为50μg/L，固体苹果产品中，棒曲霉素最大限量为25μg/L，儿童用苹果汁和婴儿食品中，棒曲霉素最大限量为10μg/L。

目前，测定棒曲霉素的检测方法有高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱法(GC-MS)、高效液相色谱-质谱法(HPLC-MS)。尚未出台国家标准方法，仅有行业标准，SN/T2008-2007《进出口果汁中棒曲霉毒素的检测方法-高效液相色谱法》规定了棒曲霉毒素测定的HPLC法，SN/T1859-2007《饮料中棒曲霉素和5-羟甲基糠醛的测定方法-液相色谱-质谱法和气相色谱-质谱法》规定了棒曲霉素测定的GC-MS法、HPLC-MS法。上述方法均为测定果汁饮料中尤其是苹果汁中的棒曲霉素，未见有关果蔬酱中棒曲霉素的测定方法。其中GC-MS法均采用N，O-双三甲基硅基三氟乙酰胺(BSTFA)为衍生剂，为了降低检测限，分别采用增加称样量，大体积溶剂提取，液-液分配净化，多个离子面积和来定量，方法存在过程冗长，操作步骤繁琐，费时，试剂用量大等不足。

用目前公开的果汁饮料中检测棒曲霉素的方法不适宜应用在果蔬酱中棒曲霉素的检测，国内外也未见有关快速、简便、灵敏度高、准确、专一、耐用的测定果蔬酱中棒曲霉素的方法的报道。因此，探索和研究快速，灵敏、准确、专一、耐用的果蔬酱中棒曲霉素的方法，对于维护食品安全，保护人民的身体健康和消费者的合法权益，促进食品行业的快速发展均具有重要意义。

发明内容

针对现有测定棒曲霉素方法存在过程冗长，操作步骤繁琐，费时，试剂用量大等不足，也未见有关快速、简便、灵敏度高、准确、专一、耐用的测定果蔬酱中棒曲霉素的方法的报道。

本发明的目的在于提供了一种测定果蔬酱中棒曲霉素的快速，简便、灵敏、准确、专一、耐用的确证和定量方法。

本发明具体提供了一种测定果蔬酱中棒曲霉素的确证和定量方法。

本发明的技术方案：通过采用N-甲基N-特丁基二甲基硅基三氟乙酰胺(MTBSTFA)为衍生剂，DB-35MS为色谱柱，建立了GC-MS法测定果蔬酱中棒曲霉素的高灵敏度方法，用乙酸乙酯-正己烷提取果蔬酱中棒曲霉素，碳黑小柱净化。通过选择性离子监测(SIM)模式选择离子的优化，消除果蔬酱基质影响，增强抗干扰能力，降低检测限和定量重现性。

本发明具体提供了一种快速测定果蔬酱中棒曲霉素的方法，果蔬酱经提取、净化，衍生，气相色谱-质谱测定，选择离子监测模式，外标法定量，具体测定方法步骤如下：

称取2.00克果蔬酱于离心管中，加水0.5-3mL，振摇，加5mL乙酸乙酯-正己烷溶液(95+5，V/V)，振摇，同时加入0.5-2克海沙，4-8克无水硫酸钠和0.5-2克碳酸氢钠，剧烈振摇2min，离心3min。移取4mL上清液至乙酸乙酯活化碳黑小柱，用加有30μL冰乙酸的试管接受洗脱液，3-7mL乙酸乙酯洗脱。在40℃下通氮气缓缓吹干，240μL乙腈溶解，准确移取150μL溶解液至样品瓶中，加入50μL衍生化试剂，用隔垫密封，微波800W高档条件下反应1-7min，冷却，供气相色谱-质谱测定。

该方法是一种快速，简便、灵敏、准确、专一、耐用的确证和定量方法，广泛应用于果蔬酱中棒曲霉素检测领域。

本发明优先选用衍生化试剂为N-甲基N-特丁基二甲基硅基三氟乙酰胺(MTBSTFA)+特丁基二甲基硅基氯硅烷(TBDMCS)(99+1，V/V)。

本发明中隔垫密封优先采用PTFE/硅橡胶/PTFE隔垫密封。

同时，本发明通过系列实验验证了上述测定棒曲霉素的方法适用山楂酱、草莓酱、苹果酱、蓝莓酱等各种果酱和蔬菜酱。

进一步，本发明提供测定番茄酱中棒曲霉素的确证和定量方法，优选技术方案步骤如下：

称取2.00克番茄酱于15mL具螺旋塞聚丙烯刻度离心管，加水3mL，振摇，加5mL乙酸乙酯-正己烷溶液(95+5，V/V)，振摇，同时加入1克海沙，5克无水硫酸钠和1克碳酸氢钠，剧烈振摇混合2min，4500r/min离心3min；用5mL乙酸乙酯活化碳黑(Carb)小柱，移取4mL上清液至小柱，用加有30μL冰乙酸的10mL刻度试管接受洗脱液，用4mL乙酸乙酯洗脱；在40℃下通氮气缓缓吹干，加240μL乙腈溶解，准确移取150μL溶解液至1.5mL螺纹口高回收率样品瓶中，加50μL衍生化试剂，用隔垫密封，微波800W高档条件下反应3min，冷却，供气相色谱-质谱测定。

进一步，本发明提供测定杏酱中棒曲霉素的确证和定量方法，优选技术方案步骤如下：

称取2.00克杏酱于15mL具螺旋塞聚丙烯刻度离心管，加水3mL，振摇，加5mL乙酸乙酯-正己烷溶液(95+5，V/V)，振摇，同时加入1克海沙，5克无水硫酸钠和1克碳酸氢钠，剧烈振摇混合2min，4500r/min离心3min；用5mL乙酸乙酯活化碳黑(Carb)小柱，移取4mL上清液至固相萃取小柱，用加有30μL冰乙酸的10mL刻度试管接受洗脱液，用4mL乙酸乙酯洗脱；在40℃下通氮气缓缓吹干，加240μL乙腈溶解，准确移取150μL溶解液至1.5mL螺纹口高回收率样品瓶中，加入50μL衍生化试剂，用隔垫密封，微波800W高档条件下反应3min，冷却，供气相色谱-质谱测定。

本领域所熟知，棒曲霉素易溶于水、乙酸乙酯、丙酮、乙醇及氯仿，微溶于乙醚和苯，不溶于石油醚，其水溶液易分解，在有机溶剂中相对稳定。现有技术报道的提取溶剂有乙酸乙酯、乙酸乙酯-正己烷溶液(60+40，V/V)、乙酸乙酯-正己烷溶液(95+5，V/V)。本发明综合考虑果蔬酱的特性和对后续的净化有利，选择乙酸乙酯-正己烷溶液(95+5，V/V)为提取溶剂，同时加入海沙、无水硫酸钠和碳酸氢钠，加入碳酸氢钠的目的是为了除去酚类物质，加入海沙是为了提高提取效率，加入无水硫酸钠使液-液分配更加完全，提高棒曲霉素的萃取率。

同时，本发明在确定色谱条件的技术环节中，比较了棒曲霉素特丁基二甲基硅烷(TBDMS)衍生物在DB-1、DB-5、DB-1701P、DB-35MS四种色谱柱的分离效果，发现棒曲霉素TBDMS衍生物在DB-1、DB-5、DB-1701P色谱柱上出现拖尾，灵敏度低，在DB-35MS色谱柱峰形尖锐、对称，灵敏度最高，本发明最终选定DB-35MS色谱柱。使用本发明的上述样品提取和净化方法及DB-35MS色谱柱，在棒曲霉素TBDMS衍生物出峰的时间窗口无干扰，半峰宽为0.025min，确保了本发明测定杏酱中棒曲霉素的确证和定量方法的高质量。

众所周知，现有技术报道的净化方法主要有三类，一类为液-液萃取，加入碳酸钠溶液净化；一类为液体样品直接加到C18、OASIS HLB、聚苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)共聚物等固相萃取小柱上提取净化；等固相萃取小柱上提取净化；一类为固相萃取法，使用硅胶固相萃取小柱，氰基固相萃取小柱，硅胶+弗罗里硅土固相萃取小柱等。果蔬酱中含有大量的色素，其色素的存在将影响衍生化反应，对测定有干扰，必须除去。活性炭对色素的吸附作用很强，选择碳黑(Carb)固相萃取柱为净化柱，结果表明Carb柱去除干扰的效果最好，洗脱物比较干净，基质背景和基线噪音低，可获得稳定、满意的回收率和较好的重现性。选择乙酸乙酯为洗脱溶剂，4mL乙酸乙酯可将棒曲霉素完全洗脱，回收率95％以上。本发明最终选择3-7mL乙酸乙酯为洗脱液。

本发明充分考虑到，棒曲霉素为极性化合物，挥发性低，为增加挥发性，提高分离的柱效，降低检出限，需要衍生后进行GC-MS分析。现有技术报道均采用N，O-双三甲基硅基三氟乙酰胺(BSTFA)为衍生化试剂，试验发现，采用N-甲基-N-特丁基二甲基硅基三氟乙酰胺(MTBSTFA)为衍生剂，特丁基二甲基硅烷衍生物(TBDMS)较为稳定，不易变化分解，比棒曲霉素三甲基硅烷衍生物(TMS)有更高的灵敏度，专一性好。本发明最终选择N-甲基-N-特丁基二甲基硅基三氟乙酰胺(MTBSTFA)为衍生剂。

本领域熟知，衍生化反应一般为80℃下加热60min，本发明经过反复试验确定采用在微波高档800W条件下，衍生化3min，大大缩短了反应时间。

本发明通过对选择离子监测模式(SIM)离子选择的优化，有效提高方法的选择性和抗干扰能力、降低检测限和测定低限；本发明对果蔬酱空白样品的分析，样品基质中含有155、167、255离子碎片，对定性定量测定干扰大，并结合棒曲霉素TBDMS衍生物的裂解途径，最终选定定性离子为183、184、211、212，183为定量离子，采用上述离子组合来定性和确证，抗干扰能力强，专一性强，灵敏度高，能准确地对棒曲霉素进行定性和定量分析。

通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下有益效果。

1.高灵敏度：采用乙酸乙酯-正己烷溶液(95+5，V/V)为提取溶剂，加入海沙、无水硫酸钠和碳酸氢钠来提高提取效率，选择碳黑(Carb)固相萃取柱为净化柱，采用N-甲基-N-特丁基二甲基硅基三氟乙酰胺(MTBSTFA)为衍生剂，对色谱柱和选择离子监测模式(SIM)离子选择进行了优化，消除基质影响，增强抗干扰能力，降低检出限和测定低限，棒曲霉素的检出限(LOD)为2.5μg/kg，测定低限(LOQ)为10μg/kg，实现了对果蔬酱中棒曲霉素的高灵敏度检测。

2.样品前处理时间短：2人在180min内可处理40份样品，可实现对果蔬酱样品中棒曲霉素进行高通量检测。

3.净化效果好：加入碳酸氢钠有效除去了酚类物质，选择碳黑(Carb)固相萃取柱为净化柱，有效除去了色素，优选DB-35MS色谱柱为分离柱，峰形尖锐、对称，在棒曲霉素TBDMS衍生物出峰的时间窗口无干扰，利于准确确证和定量。

4.样品称样量少，溶剂使用量少，污染小，环保：样品称样量仅为2克，通过对提取溶剂的筛选和优化，选择出提取效率最佳的溶剂组合，每份果蔬酱样品有机溶剂使用量仅为14mL，废弃物少。

5.流程简单：操作性强，易于掌握，无需良好训练和较高技能便能很好完成。

6.使用较少的玻璃器皿：只需使用15mL具螺旋塞聚丙烯刻度离心管，10mL刻度试管、1.5mL高回收率样品瓶。

7.样品制备过程中所使用装置简单：只需小型离心机、12孔固相萃取装置、氮吹仪、涡旋混合器等，便于推广应用。

8.所需空间小，在小型实验室便可完成：果蔬酱样品的前处理可在10平方的房间内完成，易于实现现场检验。

9.成本低：使用的试剂为实验室常用试剂，价格便宜，易于采购，用量少。

10.本发明通过对选择离子监测(SIM)模式离子选择的优化，有效消除复杂基体干扰：选定棒曲霉素的特征离子为183、184、211、212，采用上述离子组合来定量和确证。获得抗干扰能力强，专一性强，灵敏度高，能准确地对棒曲霉素进行定性和定量分析。

11.首次采用微波加热衍生化反应，缩短反应时间：衍生化反应一般为80℃下加热60min，本发明经过试验确定采用在微波高档条件(800W)下，衍生化3min，大大缩短了反应时间，为该发明为首创。

附图说明：

图1所示为为添加50μg/kg棒曲霉素TBDMS衍生物番茄酱样品选择离子(SIM)质谱图；

图2所示为棒曲霉素TBDMS衍生物质谱图；

图3所示为棒曲霉素TBDMS衍生物质谱裂解途径图。

具体实施方式

下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。另外，在下述的说明中，如无特别说明，％皆指V/V体积百分比。

本发明中设备和材料有：

Agilent7890A/5975C气相色谱-质谱仪(美国Agilent公司)，配备7683自动进样器、增强型化学工作站；氮吹仪(美国Organomation公司)；微波炉(格兰仕公司，800W)；小型离心机；1.5mL螺纹口高回收率样品瓶(美国Agilent公司，P/N5183-2030)；PTFE/硅橡胶/PTFE隔垫(美国Agilent公司，P/N5182-0729)。

棒曲霉素标准品：纯度为99.5％，Chemservice公司提供；

Carb固相萃取柱，500mg，6mL，北京振翔公司；衍生化试剂：N-甲基N-特丁基二甲基硅基三氟乙酰胺(MTBSTFA)+特丁基二甲基硅基氯硅烷(TBDMCS)(99+1，V/V)，1mL×10，(美国塞分科技公司)；乙腈、乙酸乙酯、正己烷(色谱纯)；水为超纯水。

标准工作液的配制：将棒曲霉素用乙腈配制成质量浓度为200mg/L的标准储备液，并根据需要稀释成适当质量浓度的标准工作液，于棕色储存瓶4℃下保存备用。

本发明中选用的所有试剂和仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。

实施例一：

称取2.00克果蔬酱于离心管中，加水0.5-3mL，振摇，加5mL乙酸乙酯-正己烷溶液(95+5，V/V)，振摇，同时加入0.5-2克海沙，4-8克无水硫酸钠和0.5-2克碳酸氢钠，剧烈振摇2min，离心3min；用5mL乙酸乙酯活化碳黑(Carb)固相萃取柱，移取4mL上清液至碳黑小柱，用加有30μL冰乙酸的试管接受洗脱液，用3-7mL乙酸乙酯洗脱；在40℃下通氮气缓缓吹干，加240μL乙腈溶解，准确移取150μL溶解液至样品瓶中，加50μL衍生化试剂，用隔垫密封，微波800W高档条件下反应1-7min，冷却，供气相色谱-质谱测定。

实施例二：

称取2.00克番茄酱于离心管中，加水3mL，振摇，加5mL乙酸乙酯-正己烷溶液(95+5，V/V)，振摇，同时加入1克海沙，5克无水硫酸钠和1克碳酸氢钠，剧烈振摇2min，离心3min；用5mL乙酸乙酯活化碳黑(Carb)固相萃取柱，移取4mL上清液至碳黑小柱，用加有30μL冰乙酸的试管接受洗脱液，用4mL乙酸乙酯洗脱；在40℃下通氮气缓缓吹干，加240μL乙腈溶解，准确移取150μL溶解液至样品瓶中，加50μL衍生化试剂，用隔垫密封，微波800W高档条件下反应3min，冷却，供气相色谱-质谱测定。

实施例三：

称取2.00克杏酱于离心管中，加水3mL，振摇，加5mL乙酸乙酯-正己烷溶液(95+5，V/V)，振摇，同时加入1克海沙，5克无水硫酸钠和1克碳酸氢钠，剧烈振摇2min，离心3min；用5mL乙酸乙酯活化碳黑(Carb)固相萃取柱，移取4mL上清液至碳黑小柱，用加有30μL冰乙酸的试管接受洗脱液，用4mL乙酸乙酯洗脱；在40℃下通氮气缓缓吹干，加240μL乙腈溶解，准确移取150μL溶解液至样品瓶中，加50μL衍生化试剂，用隔垫密封，微波800W高档条件下反应3min，冷却，供气相色谱-质谱测定。

实施例四：

称取2.00克草莓酱于离心管中，加水0.5mL，振摇，加5mL乙酸乙酯-正己烷溶液(95+5，V/V)，振摇，同时加入2克海沙，4克无水硫酸钠和1.5克碳酸氢钠，剧烈振摇2min，离心3min；用5mL乙酸乙酯活化碳黑(Carb)固相萃取柱，移取4mL上清液至碳黑小柱，用加有30μL冰乙酸的试管接受洗脱液，用7mL乙酸乙酯洗脱；在40℃下通氮气缓缓吹干，加240μL乙腈溶解，准确移取150μL溶解液至样品瓶中，加50μL衍生化试剂，用隔垫密封，微波800W高档条件下反应1min，冷却，供气相色谱-质谱测定。

实施例五：

称取2.00克苹果酱于离心管中，加水1.5mL，振摇，加5mL乙酸乙酯-正己烷溶液(95+5，V/V)，振摇，同时加入0.5克海沙，6克无水硫酸钠和2克碳酸氢钠，剧烈振摇2min，离心3min；用5mL乙酸乙酯活化碳黑(Carb)固相萃取柱，移取4mL上清液至碳黑小柱，用加有30μL冰乙酸的试管接受洗脱液，用3mL乙酸乙酯洗脱；在40℃下通氮气缓缓吹干，加240μL乙腈溶解，准确移取150μL溶解液至样品瓶中，加50μL衍生化试剂，用隔垫密封，微波800W高档条件下反应7min，冷却，供气相色谱-质谱测定。

实施例六：

称取2.00克蓝莓酱于离心管中，加水2mL，振摇，加5mL乙酸乙酯-正己烷溶液(95+5，V/V)，振摇，同时加入1.5克海沙，7克无水硫酸钠和0.5克碳酸氢钠，剧烈振摇2min，离心3min；用5mL乙酸乙酯活化碳黑(Carb)固相萃取柱，移取4mL上清液至碳黑小柱，用加有30μL冰乙酸的试管接受洗脱液，用7mL乙酸乙酯洗脱；在40℃下通氮气缓缓吹干，加240μL乙腈溶解，准确移取150μL溶解液至样品瓶中，加50μL衍生化试剂，用隔垫密封，微波800W高档条件下反应2min，冷却，供气相色谱-质谱测定。

实施例七：

称取2.00克山楂酱于离心管中，加水2.5mL，振摇，加5mL乙酸乙酯-正己烷溶液(95+5，V/V)，振摇，同时加入0.5克海沙，8克无水硫酸钠和0.5克碳酸氢钠，剧烈振摇2min，离心3min；用5mL乙酸乙酯活化碳黑(Carb)固相萃取柱，移取4mL上清液至碳黑小柱，用加有30μL冰乙酸的试管接受洗脱液，用5mL乙酸乙酯洗脱；在40℃下通氮气缓缓吹干，加240μL乙腈溶解，准确移取150μL溶解液至样品瓶中，加50μL衍生化试剂，用隔垫密封，微波800W高档条件下反应6min，冷却，供气相色谱-质谱测定。

实施例八：色谱条件的优化

本发明比较了棒曲霉素特丁基二甲基硅烷(TBDMS)衍生物在DB-1、DB-5、DB-1701P、DB-35MS四种色谱柱的分离效果，发现棒曲霉素TBDMS衍生物在DB-1、DB-5、DB-1701P色谱柱上出现拖尾，灵敏度低，在DB-35MS色谱柱峰形尖锐、对称，灵敏度最高，最终选定DB-35MS色谱柱。参见附图1为添加50μg/kg棒曲霉素TBDMS衍生物番茄酱样品选择离子(SIM)质谱图，棒曲霉素TBDMS衍生物的保留时间为8.655min。从质谱图可以看出：使用本发明的样品提取和净化方法及DB-35MS色谱柱，在棒曲霉素TBDMS衍生物出峰的时间窗口无干扰，半峰宽为0.025min，这对确证和定量测定有利。

实施例九：提取溶剂的选择

棒曲霉素易溶于水、乙酸乙酯、丙酮、乙醇及氯仿，微溶于乙醚和苯，不溶于石油醚。棒曲霉素的水溶液易分解，在有机溶剂中相对稳定。现有技术报道的提取溶剂有乙酸乙酯、乙酸乙酯-正己烷溶液(60+40，V/V)、乙酸乙酯-正己烷溶液(95+5，V/V)。综合考虑果蔬酱的特性和对后续的净化有利，本发明经过比较和选择，最终选择乙酸乙酯-正己烷溶液(95+5，V/V)为提取溶剂。

实施例十：净化方法的选择和净化条件的优化

现有技术报道的净化方法主要有三类，一类为液-液萃取，加入碳酸钠溶液净化；一类为液体样品直接加到C18、OASIS HLB、聚苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)共聚物等固相萃取小柱上提取净化；一类为固相萃取法，使用硅胶固相萃取小柱，氰基固相萃取小柱，硅胶+弗罗里硅土固相萃取小柱等。果蔬酱中含有大量的色素，色素的存在将影响衍生化反应，对测定有干扰，必须除去。活性炭对色素的吸附作用很强，选择碳黑(Carb)固相萃取柱为净化柱，结果表明Carb柱去除干扰的效果最好，洗脱物比较干净，基质背景和基线噪音低，可获得稳定、满意的回收率和较好的重现性。选择乙酸乙酯为洗脱溶剂，实验比较了1、2、3、4、5、6、7mL乙酸乙酯洗脱效果。实验结果表明，4mL乙酸乙酯可将棒曲霉素完全洗脱，回收率95％以上。故最终选择3-7mL乙酸乙酯为洗脱液。

实施例十一：衍生化条件的选择和优化

棒曲霉素为极性化合物，挥发性低，为增加挥发性，提高分离的柱效，降低检出限，需要衍生后进行GC-MS分析。现有技术报道均采用N，O-双三甲基硅基三氟乙酰胺(BSTFA)为衍生化试剂，试验发现，采用N-甲基N-特丁基二甲基硅基三氟乙酰胺(MTBSTFA)为衍生剂，特丁基二甲基硅烷衍生物(TBDMS)较为稳定，不易变化分解，比棒曲霉素三甲基硅烷衍生物(TMS)有更高的灵敏度，专一性好。最终选择N-甲基N-特丁基二甲基硅基三氟乙酰胺(MTBSTFA)为衍生剂。

采用N-甲基N-特丁基二甲基硅基三氟乙酰胺(MTBSTFA)为衍生剂时，衍生化反应一般为80℃下加热60min。本发明试验了微波加热衍生化反应，固定其它条件不变，改变微波加热时间，分别衍生1、2、3、4、5、6、7min，结果表明，微波加热时间对衍生化反应影响不大，最终选定衍生时间3min。

实施例十二：选择离子监测模式特征离子的优选

通过上述实施例，参见附图2为棒曲霉素TBDMS衍生物的质谱图，棒曲霉素TBDMS衍生物的特征离子为155、167、183、184、211、212、255，未出现分子离子峰m/z 268，说明该分子结构并不稳定。m/z 212是由分子离子峰失去丁烯分子后的碎片，m/z 211是由分子离子峰失去特丁基自由基后的正离子碎片，继而失去CO分子关环得到m/z 183的正离子碎片，m/z 184的碎片可能为m/z183的正离子接受一个氢自由基而生成的自由基正离子，棒曲霉素TBDMS衍生物的裂解途径参见附图3。

选择离子监测(SIM)经常被用于降低检测限和提高定量重现性。SIM的离子选择应能有效消除复杂基体干扰，经对果蔬酱空白样品的分析，样品基质中含有155、167、255离子碎片，对定性定量测定干扰大，并结合棒曲霉素TBDMS衍生物的裂解途径，最终选定定性离子为183、184、211、212，183为定量离子，采用上述离子组合来定性和确证，抗干扰能力强，专一性强，灵敏度高，能准确地对棒曲霉素进行定性和定量分析。

实施例十三：

棒曲霉素的定量离子、定性离子及标准相对离子丰度见表1。

定性依据：进行果蔬酱样品测定时，如果试样中的质量色谱峰保留时间与标准工作溶液一致(变化范围在±0.5％之内)；并且在扣除背景后的样品质谱图中，所选择的离子均出现，而且所选择的离子相对丰度与浓度相当标准溶液的相对丰度相差符合表1的有关规定，则可判断样品中存在棒曲霉素。本发明采用外标法定量。

表1：定性确证时棒曲霉素的定量离子、定性离子和标准相对离子丰度及最大容许相对偏差

*定量离子(Quantitative ions)

定量方法：外标法定量，采用本领域常规技术可知。

实施例十四：

配制棒曲霉素系列工作溶液，按上述实施例进行处理，衍生后上机测试。以棒曲霉素的质量浓度X(μg/mL)为横坐标，定量离子(m/z345)的质谱峰面积Y为纵坐标进行线性回归。棒曲霉素在0.0125-1μg/mL范围内线性良好，线性方程为Y＝1.216×10⁶X+7.176×10，r＝0.9911。

检出限(LOD)是指信噪比(S/N)大于3时的最低检测浓度，测定低限(LOQ)指信噪比(S/N)大于10时的最低检测浓度。本方法的检出限(LOD)和测定低限(LOQ)分别为2.5μg/kg和10μg/kg。

实施例十五：

以可溶性固形物含量为28-30％的番茄酱为样品，做四个水平的添加回收试验，分别为10μg/kg、25μg/kg、50μg/kg、100μg/kg，每个添加水平重复6次；以杏酱、草莓酱、苹果酱、蓝莓酱、山楂酱为样品，做25μg/kg一个水平的添加回收试验，重复6次，按上述实施例进行回收试验，方法回收率和相对标准偏差符合国内外有关标准和法规的要求，见表2。

表2：果蔬酱样品棒曲霉素添加回收率测定结果(n＝6)

实施例十六：

本发明采用色谱条件为常规技术报道，在本发明中，DB-35MS毛细管色谱柱，30m×0.25mm×0.25μm，分流/不分流进样口，进样口温度250℃，脉冲不分流进样，；脉冲压力：2.758×10⁵Pa；载气：高纯氦气(纯度99.999％)，流速1mL/min；程序升温：100℃保留2min，以25℃/min升至200℃，再以20℃/min升至270℃，全部程序时间15min，后运行温度280℃，时间5min，流速0.5mL/min；自动进样，进样量1μL。

实施例十七：

本发明采用质谱条件为常规技术报道，在本发明中，离子源：EI，电子倍增器电压为自动调谐值+200V；电离能量70eV；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；接口温度280℃；采集模式：SIM模式，扫描质量(m/z)范围：40-450；溶剂延迟时间为5min。定量离子：m/z183，定性离子：m/z183、m/z184、m/z211，m/z212，住留时间75ms。

Claims

1.一种快速测定果蔬酱中棒曲霉素的方法，果蔬酱经提取、净化，衍生，气相色谱-质谱测定，选择离子监测模式，外标法定量，具体测定方法步骤如下：称取2.00克果蔬酱于离心管中，加水0.5-3mL，振摇，加5mL乙酸乙酯-正己烷溶液(95+5，V/V)，振摇，同时加入0.5-2克海沙，4-8克无水硫酸钠和0.5-2克碳酸氢钠，剧烈振摇2min，离心3min；移取4mL上清液至乙酸乙酯活化碳黑小柱，用加有30μL冰乙酸的试管接受洗脱液，3-7mL乙酸乙酯洗脱；在40℃下通氮气缓缓吹干，240μL乙腈溶解，准确移取150μL溶解液至样品瓶中，加入50μL衍生化试剂，用隔垫密封，微波800W高档条件下反应1-7min，冷却，供气相色谱-质谱测定。

2.按照权利要求1测定果蔬酱中棒曲霉素的方法，其特征在于，所述果蔬酱中的番茄酱经提取、净化，衍生，气相色谱-质谱测定，选择离子监测模式，外标法定量，具体测定方法步骤如下：

称取2.00克番茄酱于离心管中，加水3mL，振摇，加5mL乙酸乙酯-正己烷溶液(95+5，V/V)，振摇，同时加入1克海沙，5克无水硫酸钠和1克碳酸氢钠，剧烈振摇2min，离心3min；用5mL乙酸乙酯活化碳黑固相萃取柱，移取4mL上清液至碳黑小柱，用加有30μL冰乙酸的试管接受洗脱液，用4mL乙酸乙酯洗脱；在40℃下通氮气缓缓吹干，加240μL乙腈溶解，准确移取150μL溶解液至样品瓶中，加50μL衍生化试剂，用隔垫密封，微波800W高档条件下反应3min，冷却，供气相色谱-质谱测定。

3.按照权利要求1测定果蔬酱中棒曲霉素的方法，其特征在于，所述果蔬酱中的杏酱经提取、净化，衍生，气相色谱-质谱测定，选择离子监测模式，外标法定量，具体测定方法步骤如下：

称取2.00克杏酱于离心管中，加水3mL，振摇，加5mL乙酸乙酯-正己烷溶液(95+5，V/V)，振摇，同时加入1克海沙，5克无水硫酸钠和1克碳酸氢钠，剧烈振摇2min，离心3min；用5mL乙酸乙酯活化碳黑固相萃取柱，移取4mL上清液至碳黑小柱，用加有30μL冰乙酸的试管接受洗脱液，用4mL乙酸乙酯洗脱；在40℃下通氮气缓缓吹干，加240μL乙腈溶解，准确移取150μL溶解液至样品瓶中，加50μL衍生化试剂，用隔垫密封，微波800W高档条件下反应3min，冷却，供气相色谱-质谱测定。

4.按照权利要求1测定果蔬酱中棒曲霉素的方法，其特征在于，所述果蔬酱中的草莓酱经提取、净化，衍生，气相色谱-质谱测定，选择离子监测模式，外标法定量，具体测定方法步骤如下：

称取2.00克草莓酱于离心管中，加水0.5mL，振摇，加5mL乙酸乙酯-正己烷溶液(95+5，V/V)，振摇，同时加入2克海沙，4克无水硫酸钠和1.5克碳酸氢钠，剧烈振摇2min，离心3min；用5mL乙酸乙酯活化碳黑固相萃取柱，移取4mL上清液至碳黑小柱，用加有30μL冰乙酸的试管接受洗脱液，用7mL乙酸乙酯洗脱；在40℃下通氮气缓缓吹干，加240μL乙腈溶解，准确移取150μL溶解液至样品瓶中，加50μL衍生化试剂，用隔垫密封，微波800W高档条件下反应1min，冷却，供气相色谱-质谱测定。

5.按照权利要求1测定果蔬酱中棒曲霉素的方法，其特征在于，所述果蔬酱中的苹果酱经提取、净化，衍生，气相色谱-质谱测定，选择离子监测模式，外标法定量，具体测定方法步骤如下：

称取2.00克苹果酱于离心管中，加水1.5mL，振摇，加5mL乙酸乙酯-正己烷溶液(95+5，V/V)，振摇，同时加入0.5克海沙，6克无水硫酸钠和2克碳酸氢钠，剧烈振摇2min，离心3min；用5mL乙酸乙酯活化碳黑固相萃取柱，移取4mL上清液至碳黑小柱，用加有30μL冰乙酸的试管接受洗脱液，用3mL乙酸乙酯洗脱；在40℃下通氮气缓缓吹干，加240μL乙腈溶解，准确移取150μL溶解液至样品瓶中，加50μL衍生化试剂，用隔垫密封，微波800W高档条件下反应7min，冷却，供气相色谱-质谱测定。

6.按照权利要求1测定果蔬酱中棒曲霉素的方法，其特征在于，所述果蔬酱中的蓝莓酱经提取、净化，衍生，气相色谱-质谱测定，选择离子监测模式，外标法定量，具体测定方法步骤如下：

称取2.00克蓝莓酱于离心管中，加水2mL，振摇，加5mL乙酸乙酯-正己烷溶液(95+5，V/V)，振摇，同时加入1.5克海沙，7克无水硫酸钠和0.5克碳酸氢钠，剧烈振摇2min，离心3min；用5mL乙酸乙酯活化碳黑固相萃取柱，移取4mL上清液至碳黑小柱，用加有30μL冰乙酸的试管接受洗脱液，用7mL乙酸乙酯洗脱；在40℃下通氮气缓缓吹干，加240μL乙腈溶解，准确移取150μL溶解液至样品瓶中，加50μL衍生化试剂，用隔垫密封，微波800W高档条件下反应2min，冷却，供气相色谱-质谱测定。

7.按照权利要求1测定果蔬酱中棒曲霉素的方法，其特征在于，所述果蔬酱中的山楂酱经提取、净化，衍生，气相色谱-质谱测定，选择离子监测模式，外标法定量，具体测定方法步骤如下：

称取2.00克山楂酱于离心管中，加水2.5mL，振摇，加5mL乙酸乙酯-正己烷溶液(95+5，V/V)，振摇，同时加入0.5克海沙，8克无水硫酸钠和0.5克碳酸氢钠，剧烈振摇2min，离心3min；用5mL乙酸乙酯活化碳黑固相萃取柱，移取4mL上清液至碳黑小柱，用加有30μL冰乙酸的试管接受洗脱液，用5mL乙酸乙酯洗脱；在40℃下通氮气缓缓吹干，加240μL乙腈溶解，准确移取150μL溶解液至样品瓶中，加50μL衍生化试剂，用隔垫密封，微波800W高档条件下反应6min，冷却，供气相色谱-质谱测定。