CN102928528B - 贝肉中16种脂溶性贝类毒素的液质联用检测方法 - Google Patents

Abstract

一种贝肉中16种脂溶性贝类毒素的液质联用检测方法，包括样品处理、净化、测定条件、定性测定和定量测定。本发明检测方法采用甲醇提取，固相萃取柱净化，进行贝肉中16种脂溶性贝类毒素的同时检测。方法操作简单方便，净化效果好，整体回收率高，重现性强，同时节省了有机溶剂和处理时间，简化了样品的前处理过程。

Description

贝肉中16种脂溶性贝类毒素的液质联用检测方法

技术领域

本发明涉及一种脂溶性贝类毒素的检测方法，特别是一种贝肉中16种脂溶性贝类毒素的液质联用检测方法

背景技术

海洋生物毒素(贝类毒素)特指主要由海洋有毒微藻或微生物产生、能够在海洋生物尤其是双壳贝类中富集的、对其他生物包括人类产生危害的一大类小分子有毒化学物质。针对这些生物毒素，研究者初期主要根据所引起的中毒症状将其分为六大类：麻痹性贝类毒素(Paralytic Shellfish Poisoning，PSP)、腹泻性贝类毒素(Diarrhetic Shellfish Poisoning，DSP)、神经性贝类毒素(Neurotoxic Shellfish Poisoning，NSP)、记忆缺失性贝类毒素(AmnesicShellfish Poisoning，ASP)、西加鱼毒素(Ciguatera Fish Poisoning，CFP)、蓝绿藻毒素。不过随着研究的深入，新的生物毒素种类不断被发现，且多种毒素如OA往往与毒素AZA和PTX伴生而成，但具有不同的致毒机理，原有分类方法已不能满足管理和科研的需求。因此，2004年，由联合国粮农组织、世界卫生组织和政府间海洋委员会共同组建的双壳类软体生物毒素工作组将贝类毒素分为八大类，分别为石房蛤毒素组(Saxitoxin，STX)、软骨藻酸组(Domoic acid，DA)、大田软海绵酸毒素组(Okadaic acid，OA)、原多甲酸毒素组(Azaspiracid，AZA)、短裸甲藻毒素组(Brevetoxin，BTX)、蛤毒素组(Pecenotoxins，PTX)、虾夷扇贝毒素组(Yessotoxin，YTX)和环亚胺类毒素(Cyclic imines，CIs)。除此之外，水螅毒素(Palytoxins，P1TX)和西加鱼毒素(Ciguatoxins，CTX)也正在被考虑是否划作贝类毒素中。

现有8大类贝类毒素中，STX和DA毒素组较易溶解于水，比较而言OA、AZA、BTX、PTX、YTX、CIs均为聚醚类物质，具热稳定性，易溶解于甲醇、乙醚等非极性有机试剂中，因此被统一称作为脂溶性贝类毒素(lipophilic phycotoxins，LPs)。LPs的脂溶性导致这类毒素在贝类等生物体中的消除半衰期长达数十天甚至数月，在贝类肌肉、内脏团等组织中的分布不具有显著的组织差异性，且加热、微波等常规加工方式因降低水产品中的水分含量而导致毒素浓度更高，因此这类毒素对消费者带来的潜在危害更难预防，已成为欧盟等发达国家制定贸易和技术壁垒的重要关注点。现有的检测技术主要还是小鼠生物法，存在动物福利以及检出限高且不能明确辨析贝毒成分等问题，虽然质谱检测技术也已开始用于贝类毒素的检测，但检测种类比较单一，或前处理方法尚需进一步完善。因此建立一种快速、灵敏、准确的多种脂溶性贝类毒素同时检测方法变得尤为重要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种方法针对性强、操作简单、准确快速、检测面广、测试成本低、易于推广应用的贝肉中16种脂溶性贝类毒素的液质联用检测方法。

本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。

一种贝肉中16种脂溶性贝类毒素的液质联用检测方法，包括样品处理、净化、测定条件、定性测定和定量测定，其具体步骤如下：

(1)样品处理：精确称取样品后，加入甲醇，涡旋混合，超声提取，离心取上清液，残渣中加入甲醇，重复提取一次，合并两次提取液，于40℃氮气吹至约1mL，加入3mL水涡旋混匀，超声1min；

(2)净化：依次用1mL甲醇、1mL 30％甲醇水溶液活化Strata^TM-X固相萃取柱，注入提取液，再用1mL 20％甲醇水溶液淋洗，最后用1mL 0.3％氨水甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，甲醇定容至1mL，洗脱液过0.22μm滤膜后，供液相色谱-串联质谱分析；

(3)测定条件：待测样品用液相色谱-串联四极杆质谱进行测定，仪器参数条件见表1，选择反应监测母离子、子离子和碰撞能量见表2；

表1  液相色谱-串联四极杆质谱的仪器参数条件

表2  选择反应监测母离子、子离子、碰撞能量和扫描方式

(4)定性测定

在同样测试条件下，试样溶液中脂溶性贝类毒素的保留时间与标准物质保留时间相对偏差在±5％以内，且检测到的定性离子的相对丰度，应与浓度相当的标准溶液中定性离子的相对丰度一致；基峰与次强碎片离子丰度比应符合表3要求；

表3  基峰与次强碎片离子丰度比要求

次强碎片离子相对丰度％	＞50	＞20～50	＞10～20	≤10
					允许相对偏差％	±20	±25	±30	±50

(5)定量测定

将混合标准工作液和试样溶液等体积进样测定，按外标法使用标准工作曲线对样品进行定量，试样溶液和标准溶液中脂溶性贝类毒素的响应值均应在仪器检测的线性范围内；

试样中脂溶性贝类毒素各组分含量按如下计算，计算结果需扣除空白值，结果保留三位有效数字；

$X=\frac{c\×V}{m}$

式中：X-试样中脂溶性贝类毒素各组分含量，单位为微克每千克(μg/kg)；c-试样溶液中脂溶性贝类毒素各组分的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；V-试样溶液最终体积，单位为毫升(mL)；m-试样质量，单位为克(g)。

本发明与现有技术相比的有益效果：

1)本发明检测方法采用甲醇提取，固相萃取柱净化，进行贝肉中16种脂溶性贝类毒素的检测。操作简单方便，净化效果好，整体回收率高，稳定型强，同时节省了有机溶剂和处理时间，简化了样品的前处理过程。

2)本发明的高效液相色谱串联质谱检测方法显著提高了检测效率，一次实验即可分析十六种脂溶性贝类毒素，检测指标的设置更符合当今贝类毒素污染的客观形势。

3)本发明检测方法采用C₁₈色谱柱，高效液相色谱串联质谱检测方法，具有较高的灵敏度，检出限均不超过25ng/kg b.w.，足以保证日常贝类毒素的监控要求。

4)本发明的高效液相色谱串联质谱检测方法具有优异的定性功能，只需在仪器上完成标准质谱图库的构建，后续分析可不需对照品，只需检测样品，将样品测试结果与质谱图谱库比较即可确证样品中的目标添加物。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明的技术方案做进一步解释，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制

一种贝肉中16种脂溶性贝类毒素的液质联用检测方法，其步骤如下：

(1)样品处理：称取2g试样于15mL具塞离心管中，加入5mL甲醇，涡旋混合1min，超声提取5min。4000r/min离心5min，取上清液于10mL刻度玻璃离心管中。残渣中加入5mL甲醇，重复提取一次，合并两次提取液。于40℃氮气吹至约1mL，加入3mL水涡旋混匀，超声1min，待净化。

(2)净化：依次用1mL甲醇、1mL 30％甲醇水溶液活化Strata^TM-X固相萃取柱，注入提取液，再用1mL 20％甲醇水溶液淋洗，最后用1mL 0.3％氨水甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，甲醇定容至1mL。洗脱液过0.22μm滤膜后，供液相色谱-串联质谱分析。

(3)测定：待测样品用液相色谱-串联四极杆质谱进行测定，仪器参数条件见表1；选择反应监测母离子、子离子、碰撞能量和扫描方式见表2。

表1  液相色谱-串联四极杆质谱的仪器参数条件

表2  选择反应监测母离子、子离子、碰撞能量和扫描方式

(4)定性测定

在同样测试条件下，试样溶液中脂溶性贝类毒素的保留时间与标准物质保留时间相对偏差在±5％以内，且检测到的定性离子的相对丰度，应与浓度相当的标准溶液中定性离子的相对丰度一致；基峰与次强碎片离子丰度比应符合表3要求；

表3  基峰与次强碎片离子丰度比要求

次强碎片离子相对丰度％	＞50	＞20～50	＞10～20	≤10
					允许相对偏差％	±20	±25	±30	±50

(5)定量测定

将混合标准工作液和试样溶液等体积进样测定，按外标法使用标准工作曲线对样品进行定量，试样溶液和标准溶液中脂溶性贝类毒素的响应值均应在仪器检测的线性范围内；

试样中脂溶性贝类毒素各组分含量按如下计算，计算结果需扣除空白值，结果保留三位有效数字；

$X=\frac{c\×V}{m}$

式中：X-试样中脂溶性贝类毒素各组分含量，单位为微克每千克(μg/kg)；c-试样溶液中脂溶性贝类毒素各组分的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；V-试样溶液最终体积，单位为毫升(mL)；m-试样质量，单位为克(g)。

(6)采用本实施例方法进行的检测实验。

国家水产品质量监督检测中心对2011-2012年对我国6个沿海城市大连、青岛、烟台、日照、广州、厦门的210个贝类样品进行分析，包括牡蛎、蛤、扇贝、贻贝等贝类进行贝类毒素监控检测。结果发现，GYM、SPX1、YTX、OA、PTX-2、AZA1、AZA3、BTX均有检出，阳性检出率分别为23.80％、23.33％、19.05％、20.95％、10.95％、1.90％、5.86％、9.51％。调查结果分析表明：不同季节贝类中的毒素含量有差异，与藻类的生长情况及赤潮爆发情况相关，冬季毒素含量最低；贝类中的不同组织对毒素的富集能力有差异，不同毒素在不同贝类品种间的富集有差异，其中牡蛎对GYM的富集能力高于其它贝类，栉孔扇贝对YTX的富集能力强于其它贝类，栉江珧对AZA1的富集能力较强，总之，本实施例方法准确可靠。

Claims (1)

1.一种贝肉中16种脂溶性贝类毒素的液质联用检测方法，包括试样处理、净化、测定条件、定性测定和定量测定，其特征在于具体步骤如下: 

（1）试样处理：精确称取试样后，加入甲醇，涡旋混合，超声提取，离心取上清液，残渣中加入甲醇，重复提取一次，合并两次提取液，于40℃氮气吹至约1mL，加入3mL水涡旋混匀，超声1min； 

（2）净化：依次用1mL甲醇、1mL30%甲醇水溶液活化Strata^TM-X固相萃取柱，注入提取液，再用1mL20%甲醇水溶液淋洗，最后用1mL0.3%氨水甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，甲醇定容至1mL，洗脱液过0.22μm滤膜后，供液相色谱-串联质谱分析； 

（3）测定条件：待测试样用液相色谱-串联四极杆质谱进行测定，仪器参数条件见表1，选择反应监测母离子、子离子和碰撞能量见表2； 

表1液相色谱-串联四极杆质谱的仪器参数条件 

表2选择反应监测母离子、子离子、碰撞能量和扫描方式 

（4）定性测定 

在同样测试条件下，试样溶液中脂溶性贝类毒素的保留时间与标准物质保留时间相对偏差在±5%以内，且检测到的定性离子的相对丰度，应与浓度相当的标准溶液中定性离子的相对丰度一致；基峰与次强碎片离子丰度比应符合表3要求； 

表3基峰与次强碎片离子丰度比要求 

次强碎片离子相对丰度% ＞50 ＞20～50 ＞10～20 ≤10 允许相对偏差% ±20 ±25 ±30 ±50

（5）定量测定 

将混合标准工作液和试样溶液等体积进样测定，按外标法使用标准工作曲线对试样进行定量，试样溶液和标准溶液中脂溶性贝类毒素的响应值均应在仪 器检测的线性范围内； 

试样中脂溶性贝类毒素各组分含量按如下计算，计算结果需扣除空白值，结果保留三位有效数字； 

式中：X—试样中脂溶性贝类毒素各组分含量，单位为微克每千克；c—试样溶液中脂溶性贝类毒素各组分的浓度，单位为纳克每毫升；V—试样溶液最终体积，单位为毫升；m—试样质量，单位为克。