CN103901139B - 一种用于生物尿液中四溴双酚a分析的前处理方法 - Google Patents

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一种用于生物尿液中四溴双酚A分析的前处理方法，涉及生物样品中有机污染物的检测分析技术，可为尿液中四溴双酚A含量的测定提供前处理技术。尿液样品经pH值调节后，添加β-葡萄糖苷酸/芳基硫酸脂酶的方式对尿液进行酶解，酶解液通过ENVI-18小柱富集，富集的洗脱液用1％盐酸溶液和二氯甲烷涡旋震荡洗涤，然后用蒸馏水对回收的有机层再次洗涤。样品经超高效液相色谱-串联质谱仪检测表明方法操作简单、回收率高、除杂效果好，适用于生物尿液样品前处理，且特别适用于大批量生物尿液样品的提取净化操作。该发明可有效分解样品中四溴双酚A的共轭物并有效净化尿液样品，为尿液中四溴双酚A检测提供支持。

Description

一种用于生物尿液中四溴双酚A分析的前处理方法
技术领域
本发明涉及生物样品中有机污染物的检测分析技术，特别是涉及分析一种生物尿液中四溴双酚A含量的样品提取、净化方法。
背景技术
近年来，四溴双酚A作为使用量巨大的溴系阻燃剂之一被广泛应用于家用电器和日常用品中，如计算机、打印机、手机、电视机、洗衣机等电子产品以及纺织品、泡沫家具、建筑材料等。根据欧洲溴科学和环境论坛(BrominatedScienceandEnvironmentalForum，BSEF)报告，除约旦、以色列、美国、日本等，我国也是四溴双酚A主要生产国。由于相关产品生产规模的不断增长、含四溴双酚A电子废弃物的不断增加，以及可释放到环境中四溴双酚A数量的增加，使得人们开始关注四溴双酚A潜在的环境污染问题和对人体健康的影响。
调查显示，由于四溴双酚A使用广泛，世界上很多国家和地区的土壤、沉积物、水体和大气等多种环境介质以及生物样品中均检测到四溴双酚A的赋存，且含量较高。由于频繁在环境介质及生物介质中检测出四溴双酚A，使得公众对四溴双酚A的生物毒性倍加关注。目前研究发现四溴双酚A及其代谢产物在生物体反复暴露的情况下具有潜在的生物蓄积性，及细胞、免疫和内分泌干扰等生物毒性。近年来，四溴双酚A被认为是一种值得探讨和关注的潜在内分泌干扰物，也有研究认为四溴双酚A具有潜在环境持久性和生物累积性，可能引起持久性有机污染问题。欧洲保护东北大西洋海洋环境公约组织(OSPAR)自2001年将四溴双酚A纳入优化控制污染物后至今未将其取消，其报告中认为四溴双酚A具有持久性污染问题。基于此，开展四溴双酚A环境与健康方面的研究具有重要意义，特别是四溴双酚A在生物体介质中的浓度以及通过动物实验模拟四溴双酚A进入生物体后在不同介质中的分布规律对四溴双酚A的影响研究具有重要意义。
尿液样品作为非创伤性获取的生物介质，可准确反应生物体经四溴双酚A暴露后的内暴露剂量，可通过监测生物尿液中四溴双酚A含量评价污染物的健康损害，因此尿液样品中四溴双酚A含量的分析技术成为热点。由于尿液样品基质复杂，特别是其中的蛋白等大分子量物质严重影响监测准确度以仪器寿命，尿液中四溴双酚A前处理技术成为四溴双酚A检测的关键。
发明内容
本发明的目的是针对生物尿液样品的前处理问题，提供一种操作简单快速、回收率高、除杂效果好、适用于处理批量样品的净化技术，实现对生物尿液样品中四溴双酚A定量分析的技术。本发明与现有技术的区别在于，利用酶解法提取尿液样品中四溴双酚A，并用固相萃取小柱与无机溶液洗涤相结合的净化方式，保证了提取效率并避免复杂的净化步骤损失样品中四溴双酚A含量。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下所述。
一种适用于分析生物尿液样品中四溴双酚A的前处理方法(图1)，包括以下步骤：
(1)准确移取尿液，用稀盐酸调整尿液pH值至5.5，加入pH值为5.5的醋酸钠缓冲液；
(2)加入C13标记的四溴双酚A和β-葡萄糖苷酸/芳基硫酸脂酶，充分混合均匀；
(3)置水浴恒温振荡器内恒温避光震荡酶解；
(4)酶解后溶液加入少量甲醇混匀，经活化好的ENVI-18小柱富集，用5％甲醇水淋洗，分别用二氯甲烷、甲醇洗脱，并将两次洗脱液混合均匀；
(5)洗脱液加入稀盐酸溶液和二氯甲烷后涡旋震荡，置于离心机中低速离心，回收二氯甲烷层；
(6)二氯甲烷层加入蒸馏水涡旋震荡洗涤，置于离心机中低速离心，保留有机层；
(7)氮气吹干溶剂后，用甲醇复溶，经0.2μm过滤器过滤，过滤后至超高效液相色谱-串联质谱联用仪检测四溴双酚A浓度；另取100μL尿液，用酶法测定尿液中肌酐，用肌酐校准，避免尿液样品浓度不同对数据的影响。
本方法所述生物包括实验动物、野生动物及人群。
本方法所述步骤(3)中尿液中四溴双酚A的提取方法为一次酶解法，酶解温度为37℃，酶解时间为4小时，可同时酶解大批量尿液样品。
本方法所述尿液四溴双酚A酶解提取方法与超声波清洗仪超声提取相比较具有高回收率特点。长时间超声提取使得提取液温度升高，回收率降低；多次长时间提取，操作繁琐，且耗费大量有机试剂。
本发明的优点和积极效果是：尿液样品经pH值调节后，采用了添加β-葡萄糖苷酸/芳基硫酸脂酶的方式对尿液进行提取，可以将四溴双酚A-葡糖苷酸共轭物、四溴双酚A-硫酸盐中的四溴双酚A酶解出来，使得尿液中四溴双酚A的测定更精准。酶解液通过ENVI-18小柱富集，富集的洗脱液用1％盐酸溶液和二氯甲烷涡旋震荡洗涤，然后用蒸馏水对回收的有机层再次洗涤后，浓缩并置换为甲醇溶剂，采用超高效液相色谱-串联质谱仪测定，检出限为0.01ng/mL。本方法操作简单、回收率高、除杂效果好，适用于生物尿液样品中四溴双酚A含量的测定，且特别适用于大批量生物尿液样品的同时提取净化操作。
本前处理方法的加标回收率如表1所示。
表1本前处理方法的加标回收率
附图说明
图1为分析方法流程图；
图2为标准曲线图；
图3为尿液样品不同提取方式的回收率比较图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的描述。
(1)尿液的提取与净化
准确移取尿液，加入10ngC13标记的四溴双酚A，用6moL/L盐酸调整尿样pH值至5.5，加入0.5mLpH值为5.5的醋酸钠缓冲液及10μLβ-葡萄糖苷酸/芳基硫酸脂酶，置水浴恒温振荡器内37℃恒温避光震荡4小时；水解后溶液加入少量甲醇混匀，用活化好的ENVI-18小柱富集，3mL5％甲醇水淋洗，分别用2mL二氯甲烷、3mL甲醇洗脱；洗脱液混合均匀后，加入10mL1％盐酸溶液和10mL二氯甲烷溶剂，涡旋震荡混合均匀，置于离心机内以3000转每分钟的速度离心5分钟，回收二氯甲烷层；再加入15mL蒸馏水，涡旋震荡混合，洗涤溶液，置于离心机内以3000转每分钟的速度离心5分钟，弃去水层，保留有机层；处理后的有机层经氮气吹干，1mL甲醇复溶，用0.2μm过滤器过滤，过滤后至超高效液相色谱-串联质谱联用仪检测四溴双酚A浓度。另取100μL尿液，用酶法测定尿液中肌酐，用肌酐校准四溴双酚A浓度。
(2)利用超高效液相色谱-串联质谱仪分析四溴双酚A浓度
仪器型号：超高效液相色谱-串联质谱联用仪ACQUITYUPLC-MS/MS(美国Waters公司)，包括四元梯度液相色谱泵，高压二元梯度泵，以及Masslynx4.1工作站。
色谱条件：采用Waters公司生产的ACQUITYUPLCBEHC18色谱柱(1.7μm，500mm×2.1mmI.D.，Waters)；柱温40℃；流速0.30mL/min；进样量10μL；流动相A为超纯水，流动相B为甲醇。梯度洗脱条件：初始浓度，70％B；0～0.5min，70％B线性升高到100％B；0.5～2min，100％B；2min，瞬间降至70％B；2～3min，70％B，总体运行时间共计3min。
质谱条件：采用电喷雾负离子检测模式(ESI-)；毛细管电压为3.5kV；离子源温度为120℃；脱溶剂气为氮气(N2)；锥孔反吹气流速为50L/h；脱溶剂气温度为350℃；脱溶剂气流速为800L/h；碰撞室压力为3.8×10-3mbar；质量分析器低端分辨率LM1为13.0，LM2为13.0；高端分辨率HM1为13.0V，HM2为13.0V；离子能量1为1.0，2为4.0；采用MRM多通道检测。
(3)标准曲线的绘制
取混合均匀的空白尿液样品，按照步骤(1)中所述尿液样品的前处理方法分别对样品进行处理。待处理结束后，用获得的空白尿液样品配置系列基质四溴双酚A与C13标记的四溴双酚A标准曲线。以四溴双酚A对C13标记的四溴双酚A的峰面积比与浓度值做定量标准曲线(图2)，用以计算样品中分析物的量。
(4)样品浓度及回收率的测定
尿液样品采集于实验用品系为Wistar的大鼠。将18只大鼠于实验动物房内适应性饲养一周，观察无异常后随机分为3组，分别为对照组、低剂量组、高剂量组。对照组大鼠不做处理，低剂量组大鼠每日上午8时经口灌胃给予10mg/kg剂量的四溴双酚A的羧甲基纤维素钠悬浊液，高剂量组大鼠每日上午8时经口灌胃给予30mg/kg剂量的四溴双酚A的羧甲基纤维素钠悬浊液，之后将大鼠放代谢笼单笼饲养，于次日收集24小时尿液样品，置于保温箱内迅速带回实验室，于-80℃低温冰箱内贮藏。按照步骤(1)对样品进行处理，6moL/L盐酸调整尿样pH值至5.5，加入0.5mLpH值为5.5的醋酸钠缓冲液及10μLβ-葡萄糖苷酸/芳基硫酸脂酶，置水浴恒温振荡器内37℃恒温避光震荡4小时；酶解提取液经ENVI-18小柱富集，3mL5％甲醇水淋洗后分别用2mL二氯甲烷、3mL甲醇洗脱；洗脱液用10mL1％盐酸溶液和10mL二氯甲烷涡旋震荡洗涤，然后用蒸馏水对回收的有机层再次洗涤，将有机层浓缩并置换为甲醇溶剂，用0.2μm过滤器过滤，过滤后经超高效液相色谱-串联质谱仪检测，与步骤(3)中标准曲线对照获得尿液中四溴双酚A的含量。
根据样品中C13标记的四溴双酚A的峰面积与相同浓度标准曲线中C13标记的四溴双酚A的峰面积做对比，计算回收率。方法回收率按照下式进行计算：
R＝(A/A0)×100％
R-回收率，％；
A-测定样品中C13标记的四溴双酚A的峰面积；
A0-标准曲线中相同浓度下C13标记的四溴双酚A峰面积。
利用本发明检测经口暴露不同剂量四溴双酚A后大鼠尿液中四溴双酚A浓度，结果如表2所示。
表2实际尿液样品中四溴双酚A浓度

Claims (1)

1.一种用于生物尿液样品中四溴双酚A分析的前处理方法，其特征在于：该方法包括如下步骤，
(1)准确移取尿液，用稀盐酸调整尿液pH值至5.5，加入pH值为5.5的醋酸钠缓冲液；
(2)加入C13标记的四溴双酚A和β-葡萄糖苷酸/芳基硫酸脂酶，充分混合均匀；
(3)置水浴恒温振荡器内恒温避光震荡酶解；
(4)酶解后溶液加入少量甲醇混匀，经活化好的ENVI-18小柱富集，用5％甲醇水淋洗，分别用二氯甲烷、甲醇洗脱，并将两次洗脱液混合均匀；
(5)洗脱液加入1％盐酸溶液和二氯甲烷后涡旋震荡，置于离心机中低速离心，回收二氯甲烷层；
(6)二氯甲烷层加入蒸馏水涡旋震荡洗涤，置于离心机中低速离心，保留有机层；
(7)氮气吹干有机层溶剂后，用甲醇复溶，经0.2μm过滤器过滤，过滤后至超高效液相色谱-串联质谱联用仪检测四溴双酚A浓度；另取100μL尿液，用酶法测定尿液中肌酐，用肌酐校准，避免尿液样品浓度不同对数据的影响，
该方法所述生物包括实验动物、野生动物及人群，
步骤(3)所述的酶解，温度为37℃，酶解时间为4小时，酶解提取过程不需要有机试剂。
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