CN103776935A - 一种测定黄体酮生产母液中主要成分含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种测定黄体酮生产母液中主要成分含量的方法，其为高效液相色谱法，包括将母液样品定量稀释，配制浓度相当的孕烯醇酮和黄体酮对照品外标溶液，设置高效液相色谱仪参数，样品含量计算等过程。该方法具有较高好的选择性、灵敏度和准确度极高，且操作简便，测定快速，简单易行。为生产回收工艺提供了准确的数据支持，为反确定应物及溶剂用量提供了数据支持，从而将黄体酮生产母液中的黄体酮回收，提高了产品经济效益；另一方面，降低了危险废弃物的排放量。

Description

一种测定黄体酮生产母液中主要成分含量的方法

技术领域

本发明属于化学制药的仪器分析领域，具体涉及一种测定黄体酮生产母液中主要成分孕烯醇酮和黄体酮含量的方法。

背景技术

黄体酮生产过程中产生的生产母液的回收是提高产品收率及减少危险废弃物排放的重要环节，准确测定母液中主要成分孕烯醇酮和黄体酮含量对整个生产母液的回收至关重要。由于母液中成分复杂，孕烯醇酮和黄体酮含量不高，因此，要用一种选择性好、灵敏度高的测定方法才能保证测定结果准确可靠，同时要考虑操作简易快速。在该项目上，至今没有明确的简单易行的方法。目前国内外没有公开报道的黄体酮生产母液中测定的黄体酮和孕烯醇酮的分析方法。

现有技术中，测量某一种液体中某一成分的含量，主要有以下几种方法，化学滴定法、仪器分析方法（包括高效液相色谱法、气相色谱法、紫外测定法）等，具体选择哪种方法，不仅需要对母液的进行分析，还要综合考虑很多因素。以液相色谱法为例，在使用该方法的进行含量测定的过程中，需要根据母液的具体情况选择色谱条件，而色谱条件的选择对测定结果的准确性影响非常关键，需要投入大量的时间、精力以及资金进行摸索验证。

发明内容

本发明提供一种测定黄体酮生产母液中主要成分含量的方法，解决如何从成分复杂的黄体酮生产母液中高效、快捷、准确测定孕烯醇酮和黄体酮含量以便于提高产品收率、减少环境危害的问题。

本发明的技术解决方案是：

一种测定黄体酮生产母液中主要成分含量的方法，其特殊之处在于，包括以下步骤：用液相色谱法测定黄体酮生产母液中孕烯醇酮和黄体酮含量，选择高效液相色谱仪作为检测仪器，流动相为乙腈和水,检测波长为210nm-220nm。

上述流动相中乙腈的体积百分含量为30-40%。优选的，乙腈的体积百分含量为40%。

上述检测波长为215nm，是黄体酮在紫外可见光区的最大吸收波长。

上述液相色谱法中，色谱柱为岛津VP-ODS C18柱，150×4.6mm，5μm粒径。

分析时间为20-40分钟，20分钟为最短分析时间，能有效提高检测效率。

采用外标法计算孕烯醇酮和黄体酮含量；进样量为20μl；流速为1.0ml/min；柱温为室温。

在液相色谱法中，配制标准溶液的过程是：精密称取孕烯醇酮对照品50.0±0.5mg和黄体酮对照品100.0±0.5mg，同置于一个100ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，备用。

在液相色谱法中，配制样品溶液的过程是：精密称取黄体酮母液样品1.00±0.05g，精密称定，置100ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，备用。

一种从黄体酮生产母液中回收黄体酮的方法，其特殊之处在于，包括以下步骤：

1】母液预处理：

1.1】对黄体酮生产母液进行蒸馏，将黄体酮生产母液中的溶剂蒸出，记录残留物重量M1；所述母液是由孕烯醇酮氧化为黄体酮的生产过程中所产生的母液；

1.2】用溶剂将步骤1.1】得到的残留物进行溶解，使其全溶；

2】除去部分杂质：用稀酸溶液对步骤1.2】中得到的溶液进行洗涤，然后水洗至PH＞6；

3】黄体酮纯度提高：

3.1】对步骤2】中水洗后的溶液进行回流分水，至无水分出；

3.2】从分水后的溶液中取样，用液相色谱法测定样品中孕烯醇酮和黄体酮含量，计算分水后的溶液中孕烯醇酮的重量M2、黄体酮的重量M3，然后加入环己酮和异丙醇铝进行沃氏氧化；

在液相色谱法中，选择高效液相色谱仪作为检测仪器，流动相为乙腈和水,检测波长为210nm-220nm；上述流动相中乙腈的体积百分含量为30-40%。优选的，乙腈的体积百分含量为40%。检测波长为215nm，是黄体酮在紫外可见光区的最大吸收波长。色谱柱为岛津VP-ODS C18柱，150×4.6mm，5μm粒径。分析时间为20-40分钟，20分钟为最短分析时间，能有效提高检测效率。采用外标法计算孕烯醇酮和黄体酮含量；进样量为20μl；流速为1.0ml/min；柱温为室温。配制标准溶液的过程是：精密称取孕烯醇酮对照品50.0±0.5mg和黄体酮对照品100.0±0.5mg，同置于一个100ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，备用。配制样品溶液的过程是：精密称取黄体酮母液样品1.00±0.05g，精密称定，置100ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，备用。

4】产品的提取：向步骤3.2】沃氏氧化后的溶液中加酸溶液中和，水洗，蒸出溶剂；

5】产品析出：加结晶溶剂、活性炭、氧化铝，热滤后降温析晶得黄体酮粗品M4；

6】粗品精制：加精制溶剂经重结晶得黄体酮。

在从黄体酮生产母液中回收黄体酮的方法中，步骤2】中洗涤所用的稀酸溶液为稀盐酸、稀硫酸、稀乙酸、稀甲酸中的一种或多种；稀酸溶液的重量为1.0M1～4.0M1，稀酸溶液的质量百分比浓度为5%～10%。

在从黄体酮生产母液中回收黄体酮的方法中，步骤1.2】中溶剂为苯、甲苯、氯仿、二氯甲烷中的一种或多种；有机溶剂的重量为1.0M1～4.0M1。

在从黄体酮生产母液中回收黄体酮的方法中，步骤3.2】中，加入1.0M2～4.0M2重量的环己酮，0.5M2～2.0M2重量的异丙醇铝。

在从黄体酮生产母液中回收黄体酮的方法中，步骤4】中酸溶液是质量百分比浓度为5%～10%稀硫酸溶液，所述稀硫酸溶液是由0.75倍异丙醇铝重量的浓硫酸经水稀释而来，浓硫酸的质量百分比浓度大于等于95%；水洗时，水量为1.0M1～4.0M1，水洗过程保持温度30～90℃；然后减压蒸馏溶剂至蒸干，降温至30～90℃。

在从黄体酮生产母液中回收黄体酮的方法中，步骤5】具体为：加入0.8M1～3.0M1重量的结晶溶剂、0.05M1～0.15M1重量的活性炭、0.05M1～0.15M1重量的氧化铝后升温至回流，保温回流10～60分钟，降温至50～70℃；热滤,以0.1M1～0.4M1重量的结晶溶剂洗涤滤饼；升温蒸馏，蒸出部分溶剂，剩余溶剂量为1.0（M2+M3）～3.0（M2+M3）；降温至-5℃～10℃；保温析晶0.5～2小时，离心，得黄体酮粗品M4；其中结晶溶剂是甲醇、乙醇、丙酮中的一种。

在从黄体酮生产母液中回收黄体酮的方法中，步骤6】粗品精制的方法具体为：向黄体酮生产母液回收粗品M4中加0.8M4～4.0M4精制溶剂，精制溶剂包括甲醇、乙醇、丙酮中的一种或多种，搅拌，升温至回流，保温回流10～60分钟；降温至-5℃～10℃，保温析晶0.5～2小时，离心，烘干，得黄体酮产品。

在从黄体酮生产母液中回收黄体酮的方法中，步骤1】中所述母液包括粗品母液或者精制母液或者两者以任何比例混合的混合液。

在从黄体酮生产母液中回收黄体酮的方法中，步骤1.1】中蒸馏的终点温度为90～100℃。

本发明的优点是：本发明对于黄体酮生产母液中孕烯醇酮重量百分含量0.25%至10%之间，黄体酮重量百分含量0.5%至20%之间的测定均具有较好的选择性、灵敏度和准确度，且操作简便，测定快速，简单易行。

具体实施方式

黄体酮生产母液中的成分复杂，主要为孕烯醇酮和黄体酮，但孕烯醇酮和黄体酮的含量较低，如何对母液中孕烯醇酮和黄体酮的含量进行准确测定，以便进行高效率的黄体酮回收，是本发明的难点。

本发明采用高效液相色谱法中的标准物质对照方法，配制合适的标准溶液和样品溶液，并根据母液的待测物质含量具体情况进行参数选择，用外标法计算孕烯醇酮和黄体酮的含量。

一、色谱条件的选择如下：

色谱仪：高效液相色谱仪；

色谱柱：VP-ODS，C18柱，150×4.6mm，5μm粒径；

流动相：乙腈：水的体积比为40：60；

检测波长：215nm；

流速：1.0ml/min；

进样量：20μl；

柱温：室温；

分析时间：20分钟。

二、试剂选择：

甲醇（HPLC级）；乙腈（HPLC级）；纯水（HPLC级）；

三、溶液配制

1、样品溶液配制：(根据生产经验，母液中孕烯醇酮含量按照5%设定，黄体酮含量按照10%设定)

精密称取黄体酮生产母液样品1.00±0.05g，精密称定，置100ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，备用。

2、标准溶液配制：

精密称取孕烯醇酮对照品50.0±0.5mg和黄体酮对照品100.0±0.5mg，同置于一个100ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，备用。

计算方法：外标法。

$\mathrm{Assay}\%=\frac{{\stackrel{\‾}{A}}_{\mathrm{SPL}}\×W_{\mathrm{STD}}\×P}{{\stackrel{\‾}{A}}_{\mathrm{STD}}\×W_{\mathrm{SPL}}}\×100\%$

式中：

     供试品溶液中主峰的峰面积；

     标准品溶液中主峰的峰面积；

WSTD：   标准品溶液中标准品的称量，单位mg；

WSPL：   供试品溶液中供试品的称量，单位mg；

P：      标准品的含量（as is），单位mg/mg。

说明：HPLC检验方法中，通常使用样品溶液配制为0.5～1.0mg/ml，该方法中标准溶液浓度为孕烯醇酮0.5mg/ml、黄体酮1.0mg/ml，母液中孕烯醇酮含量约5%黄体酮含量约10%设定，因此称取母液1.00±0.05g，精密称定，置100ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，孕烯醇酮0.5mg/ml和黄体酮1.0mg/ml。

方法精密度验证：

色谱条件及试剂选择不变。

1、样品溶液配制：

精密称取六份生产中黄体酮生产母液样品各1.00±0.05g，置于100ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，备用。

2、标准溶液配制：

精密称取孕烯醇酮对照品50.0±0.5mg，黄体酮对照品100.0±0.5mg，精密称定，同置于一个100ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，备用。

六份样品溶液测定结果：

方法评述：

该方法对于样品中孕烯醇酮和黄体酮含量测定具有较高好的选择性、灵敏度和准确度，精密度较高，且操作简便，测定快速，简单易行。

标准溶液图谱特征：

化合物名称	保留时间（RT）	相对保留时间（RRT）	分离度
				孕烯醇酮	约11.3min	0.93	/
黄体酮	约12.2min	1.00	1.6

方法耐用性验证：

调整流动相中乙腈的比例、色谱柱的柱长，影响因素如下：

1、只改变乙腈的体积百分比，其他色谱条件不变：

2、只改变色谱柱的柱长，其他色谱条件不变：

色谱柱规格	柱长30cm	柱长25cm	柱长15cm	柱长10cm
					分离度（R）	2.4	1.9	1.6	1.1
分析时间（min）	40	35	20	15

按照方法学规定，(R）应≥1.5，分析时间应最短的原则，结合上述对比看出，本方法中设定参数是最佳参数，既符合方法学要求，又具有简单易行、操作快速的特点。

对本方法的准确度进行验证：

模拟配制孕烯醇酮含量10%、黄体酮含量20%的样品六份；孕烯醇酮含量5%、黄体酮含量的10%样品六份；孕烯醇酮含量0.25%、黄体酮含量0.5%的样品六份，分别进行回收率测定，验证该方法的检测范围及准确度。

孕烯醇酮含量10%、黄体酮含量20%样品六份测定结果：

孕烯醇酮含量5%、黄体酮含量10%样品六测定结果：

孕烯醇酮含量0.25%、黄体酮含量0.5%样品六份测定结果：

从以上的测定结果中可以看出，该方法对于母液中孕烯醇酮含量0.25%至10.0%和黄体酮含量0.5%至20.0%含量范围均能有效测定，具有较高的准确度，从方法验证学角度来说满足国际验证指南ICH要求，比基本要求高很多。

一种从黄体酮生产母液中回收黄体酮的方法，利用上述高效液相色谱法确定黄体酮生产母液中孕烯醇酮和黄体酮的重量百分含量，根据确定的孕烯醇酮和黄体酮的重量百分含量计算黄体酮生产母液中孕烯醇酮重量M2及黄体酮重量M3。确定了孕烯醇酮和黄体酮的重量之后，生产方面就可以定量反应，更有效的回收有用组分。

假定某批黄体酮生产母液总重量M为100kg,通过上述高效液相色谱法测定孕烯醇酮重量百分含量为5.2%，黄体酮重量百分含量为8.5%，则母液中孕烯醇酮的重量M2为：M×5.2%=100×5.2%=5.2kg，黄体酮的重量M3为：M3=M×8.5%=8.5kg。

为了从黄体酮生产母液中更好的回收黄体酮，可以先对黄体酮生产母液进行预处理及除杂，测定并计算除杂后溶液中孕烯醇酮和黄体酮的重量，再进行沃氏氧化，然后提取有效组分，完整的步骤如下：

1.1】对黄体酮生产母液进行蒸馏，将黄体酮生产母液中的溶剂蒸出，记录残留物重量M1；所述母液是由孕烯醇酮氧化为黄体酮的生产过程中所产生的母液；

1.2】用溶剂将步骤1.1】得到的残留物进行溶解，使其全溶；

2】用稀酸溶液对步骤1.2】中得到的溶液进行洗涤，然后水洗至PH＞6；

3】黄体酮纯度提高：

3.1】对步骤2】中水洗后的溶液进行回流分水，至无水分出；

3.2】从分水后的溶液中取样，用液相色谱法测定样品中孕烯醇酮和黄体酮含量，选择高效液相色谱仪作为检测仪器，流动相为乙腈和水,检测波长为210nm-220nm；

计算分水后的溶液中孕烯醇酮的重量M2、黄体酮的重量M3，然后加入环己酮和异丙醇铝进行沃氏氧化；

4】产品的提取：向步骤3.2】沃氏氧化后的溶液中加酸溶液中和，水洗，蒸出溶剂；

5】产品析出：加结晶溶剂、活性炭、氧化铝，热滤后降温析晶得黄体酮粗品M4；

6】粗品精制：加精制溶剂经重结晶得黄体酮。

较佳的，在从黄体酮生产母液中回收黄体酮的方法中，步骤2】中洗涤所用的稀酸溶液为稀盐酸、稀硫酸、稀乙酸、稀甲酸中的一种或多种；稀酸溶液的重量为1.0M1～4.0M1，稀酸溶液的质量百分比浓度为5%～10%。

较佳的，在从黄体酮生产母液中回收黄体酮的方法中，步骤1.2】中溶剂为苯、甲苯、氯仿、二氯甲烷中的一种或多种；有机溶剂的重量为1.0M1～4.0M1。

较佳的，在从黄体酮生产母液中回收黄体酮的方法中，步骤3.2】中，加入1.0M2～4.0M2重量的环己酮，0.5M2～2.0M2重量的异丙醇铝。

较佳的，在从黄体酮生产母液中回收黄体酮的方法中，步骤4】中酸溶液是质量百分比浓度为5%～10%稀硫酸溶液，所述稀硫酸溶液是由0.75倍异丙醇铝重量的浓硫酸经水稀释而来，浓硫酸的质量百分比浓度大于等于95%；水洗时，水量为1.0M1～4.0M1，水洗过程保持温度30～90℃；然后减压蒸馏溶剂至蒸干，降温至30～90℃。

较佳的，在从黄体酮生产母液中回收黄体酮的方法中，步骤5】具体为：加入0.8M1～3.0M1重量的结晶溶剂、0.05M1～0.15M1重量的活性炭、0.05M1～0.15M1重量的氧化铝后升温至回流，保温回流10～60分钟，降温至50～70℃；热滤,以0.1M1～0.4M1重量的结晶溶剂洗涤滤饼；升温蒸馏，蒸出部分溶剂，剩余溶剂量为1.0（M2+M3）～3.0（M2+M3）；降温至-5℃～10℃；保温析晶0.5～2小时，离心，得黄体酮粗品M4；其中结晶溶剂是甲醇、乙醇、丙酮中的一种。

较佳的，在从黄体酮生产母液中回收黄体酮的方法中，步骤6】粗品精制的方法具体为：向黄体酮生产母液回收粗品M4中加0.8M4～4.0M4精制溶剂，精制溶剂包括甲醇、乙醇、丙酮中的一种或多种，搅拌，升温至回流，保温回流10～60分钟；降温至-5℃～10℃，保温析晶0.5～2小时，离心，烘干，得黄体酮产品。

较佳的，在从黄体酮生产母液中回收黄体酮的方法中，步骤1】中所述母液包括粗品母液或者精制母液或者两者以任何比例混合的混合液。

较佳的，在从黄体酮生产母液中回收黄体酮的方法中，步骤1.1】中蒸馏的终点温度为90～100℃。

Claims (10)

1.一种测定黄体酮生产母液中主要成分含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：用液相色谱法测定黄体酮生产母液中孕烯醇酮和黄体酮含量，选择高效液相色谱仪作为检测仪器，流动相为乙腈和水,检测波长为210nm-220nm。

2.根据权利要求1所述的测定黄体酮生产母液中主要成分含量的方法，其特征在于，流动相中乙腈的体积百分含量为30-40%。

3.根据权利要求2所述的测定黄体酮生产母液中主要成分含量的方法，其特征在于，所述检测波长为215nm；液相色谱法所选用的色谱柱为岛津VP-ODS C18柱，150×4.6mm，5μm粒径；液相色谱法的分析时间为20-40分钟；采用外标法计算孕烯醇酮和黄体酮含量；进样量为20μl；流速为1.0ml/min；柱温为室温。

4.根据权利要求1-3任一所述的测定黄体酮生产母液中主要成分含量的方法，其特征在于，在液相色谱法中，配制标准溶液的过程是：精密称取孕烯醇酮对照品50.0±0.5mg和黄体酮对照品100.0±0.5mg，同置于一个100ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，备用。

5.根据权利要求1-3任一所述的测定黄体酮生产母液中主要成分含量的方法，其特征在于，在液相色谱法中，配制样品溶液的过程是：精密称取黄体酮母液样品1.00±0.05g，精密称定，置100ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，备用。

6.一种从黄体酮生产母液中回收黄体酮的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1】母液预处理：

1.1】对黄体酮生产母液进行蒸馏，将黄体酮生产母液中的溶剂蒸出，记录残留物重量M1；所述母液是由孕烯醇酮氧化为黄体酮的生产过程中所产生的母液；

1.2】用溶剂将步骤1.1】得到的残留物进行溶解，使其全溶；

2】除去部分杂质：用稀酸溶液对步骤1.2】中得到的溶液进行洗涤，然后水洗至PH＞6；

3】黄体酮纯度提高：

3.1】对步骤2】中水洗后的溶液进行回流分水，至无水分出；

3.2】从分水后的溶液中取样，用权利要求1的方法测定样品中孕烯醇酮和黄体酮的重量百分含量，根据重量百分含量计算分水后的溶液中孕烯醇酮的重量M2、黄体酮的重量M3，然后加入环己酮和异丙醇铝进行沃氏氧化；

4】产品的提取：向步骤3.2】沃氏氧化后的溶液中加酸溶液中和，水洗，蒸出溶剂；

5】产品析出：加结晶溶剂、活性炭、氧化铝，热滤后降温析晶得黄体酮粗品M4；

6】粗品精制：加精制溶剂经重结晶得黄体酮。

7.根据权利要求6所述的从黄体酮生产母液中回收黄体酮的方法，其特征在于，步骤2】中洗涤所用的稀酸溶液为稀盐酸、稀硫酸、稀乙酸、稀甲酸中的一种或多种；稀酸溶液的重量为1.0M1～4.0M1，稀酸溶液的质量百分比浓度为5%～10%。

8.根据权利要求6或7所述的从黄体酮生产母液中回收黄体酮的方法，其特征在于，步骤1.2】中溶剂为苯、甲苯、氯仿、二氯甲烷中的一种或多种；有机溶剂的重量为1.0M1～4.0M1。

9.根据权利要求8所述的从黄体酮生产母液中回收黄体酮的方法，其特征在于，在从黄体酮生产母液中回收黄体酮的方法中，步骤3.2】中，加入1.0M2～4.0M2重量的环己酮，0.5M2～2.0M2重量的异丙醇铝。

10.根据权利要求9所述的从黄体酮生产母液中回收黄体酮的方法，其特征在于，在从黄体酮生产母液中回收黄体酮的方法中，步骤4】中酸溶液是质量百分比浓度为5%～10%稀硫酸溶液，所述稀硫酸溶液是由0.75倍异丙醇铝重量的浓硫酸经水稀释而来，浓硫酸的质量百分比浓度大于等于95%；水洗时，水量为1.0M1～4.0M1，水洗过程保持温度30～90℃；然后减压蒸馏溶剂至蒸干，降温至30～90℃；

步骤5】具体为：加入0.8M1～3.0M1重量的结晶溶剂、0.05M1～0.15M1重量的活性炭、0.05M1～0.15M1重量的氧化铝后升温至回流，保温回流10～60分钟，降温至50～70℃；热滤,以0.1M1～0.4M1重量的结晶溶剂洗涤滤饼；升温蒸馏，蒸出部分溶剂，剩余溶剂量为1.0（M2+M3）～3.0（M2+M3）；降温至-5℃～10℃；保温析晶0.5～2小时，离心，得黄体酮粗品M4；其中结晶溶剂是甲醇、乙醇、丙酮中的一种；

步骤6】粗品精制的方法具体为：向黄体酮生产母液回收粗品M4中加0.8M4～4.0M4精制溶剂，精制溶剂包括甲醇、乙醇、丙酮中的一种或多种，搅拌，升温至回流，保温回流10～60分钟；降温至-5℃～10℃，保温析晶0.5～2小时，离心，烘干，得黄体酮产品。