CN107121517A - 一种用于粪便和土壤代谢组学研究的样品制备处理方法 - Google Patents

一种用于粪便和土壤代谢组学研究的样品制备处理方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于粪便和土壤代谢组学研究的样品制备处理方法。先对样品预处理得第一悬混液，再加入钢珠震荡破碎提取得到破碎后的第一悬混液，超声，离心，收集第一上清液和沉淀；第一上清液浓缩至近干，加入水溶性复溶液，钢珠，震荡复溶；高速离心，所得第二上清液为水溶性代谢提取物，可直接上机分析；收集的沉淀加入脂溶性代谢物提取液混匀，得第二悬混液；震荡破碎提取，超声，离心，收集下层溶液，氮吹的方法使所得下层溶液吹干，加入脂溶性复溶液，钢珠，震荡复溶；高速离心，所得为脂溶性代谢提取物，可直接上机分析。本发明所述方法操作简单、稳定性强、全面的、回收率高，对大量开展粪便和土壤代谢组学的相关研究具有重大的意义。

Description

一种用于粪便和土壤代谢组学研究的样品制备处理方法
技术领域
本发明涉及粪便和土壤样品处理中以代谢组学分析为目的的全代谢物提取和处理方法。尤其涉及一种用于粪便和土壤代谢组学研究的样品制备处理方法。
背景技术
代谢组学作为继基因组学和蛋白质组学后兴起的新技术，是系统生物学的重要组成。代谢组学对某一时刻生物体内所有生命活动所涉及代谢物的质和量的变化情况进行综合分析，从而揭示生物体所处的生理状态。代谢组学具有高通量检测和强大的数据模型分析能力，已经广泛应用于众多研究领域，比如疾病诊断与机理、药物研发、污染物毒理、营养食品科学、植物学及生态学等。利用代谢组学可以高通量地筛选暴露-效应标志物，标志物本身就是毒性机制中的关键分子，与其它分子指标结合通过聚类和关联分析可发现重要毒性通路。
粪便是生物体最终的代谢产物集合体，富含大量的内源性代谢物以及微生物代谢物的信息，对于我们认识生命活动的生物学过程具有重要意义。
生态代谢组近年来引起了科学界的广泛关注，旨在研究生化因子影响与生态学现象之间的关系、生物群落中不同种群间的协同进化等等，在环境监测、生态系统预警等应用生态学及物种进化、生态型鉴别等理论生态学研究中显示出巨大潜力。生态代谢组研究涉及土壤样品，通过定性和定量测定某种扰动情况(如温度、湿度、环境污染等等)下土壤代谢组的变化，从而在代谢物层面表征对生态环境的影响。
粪便和土壤这类固体样品成分非常复杂，代谢物质种类繁多，物理性质差异较大，且基质干扰非常严重。目前常规的代谢组提取和处理方法过程繁琐，提取和处理过程容易造成污染和不确定因素，且通常伴随着代谢物质组的变性，活性丧失和代谢物回收率低下。而且由于往往采用单一的提取液，造成代谢组提取不完整的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种操作简单、稳定性强、全面的、回收率高的粪便和土壤代谢组学研究样品的制备处理方法。
为实现上述目的，本发明提供一种用于粪便和土壤代谢组学研究的样品制备处理方法，其特征在于，其经过下列工艺步骤，
(1)样品预处理：取适量在-80℃冰箱内过夜预冷的粪便或土壤样品，放入冷冻干燥机，干燥至衡重，低温破碎，按照100mg样品/1mL水溶性代谢物提取液的比例加入水溶性代谢物提取液，使其混匀，得到第一悬混液；(低温可使酶失活并防止代谢物发生降解)
(2)震荡破碎提取：按照100-200mg粪便或土壤样品/2颗钢珠的比例加入钢珠到所述第一悬混液，低温下震荡破碎得到破碎后的第一悬混液；
(3)超声提取：将所述破碎后的第一悬混液在冰上进行超声，进一步破碎样品使代谢物质溶出；离心，收集第一上清液和沉淀；
(4)将上述所得第一上清液放入旋转浓缩仪中，浓缩至近干后，再按照100-200mg粪便或土壤样品/200μL水溶性复溶液的比例加入水溶性复溶液，再按照100-200mg粪便或土壤样品/1颗钢珠的比例加入钢珠，震荡复溶；高速离心，所得第二上清液为水溶性代谢提取物，可直接上机分析；
(5)按照100mg粪便或土壤样品/1mL脂溶性代谢物提取液的比例加入向上述所得沉淀中加入脂溶性代谢物提取液，使其混匀，得第二悬混液；
(5)震荡破碎提取：将所得第二悬混液在0～4℃下震荡破碎得到破碎后的第二悬混液；
(6)超声提取：将所得破碎后的第二悬混液在冰上进行超声，进一步破碎样品使代谢物质溶出；离心，收集下层溶液，得到脂溶性代谢物溶液；
(7)使用氮吹的方法将上述所得下层溶液吹干，按照100-200mg粪便或土壤样品/200μL脂溶性复溶液的比例加入200μL脂溶性复溶液，再按照100-200mg粪便或土壤样品/1颗钢珠的比例加入1颗钢珠，震荡复溶；高速离心，所得第三上清液为脂溶性代谢提取物，可直接上机分析；
进一步的，所述步骤(1)中的粪便为各种动物以及人类的粪便排泄物。
进一步的，所述步骤(1)中的低温破碎为液氮研磨破碎或其他可以保持破碎环境为零度以下低温破碎装置；
任选的，所述步骤(1)中水溶性代谢物提取液的配方为：甲醇、乙腈、乙酸和水按照体积比为1:1:0.1:2形成的混合液。
进一步的，所述步骤(2)、步骤(4)和步骤(8)中所使用的钢珠直径为1-3mm，为除去钢珠表面所吸附的外源性污染物，钢珠使用前经过清洗和400℃高温烘烤2小时。
进一步的，所述步骤(2)和步骤(6)中的震荡破碎、步骤(4)和和步骤(8)中的震荡复溶，使用的频率为80-120Hz，时间为60-120s。
进一步的，所述步骤(3)、步骤(7)中所述的超声，其使用的超声破碎仪功率为80～100w，超声30s，关闭30s，超声破碎时间为5～10min；
任选的，所述步骤(3)、步骤(7)中离心的条件为温度4℃，转速10000rpm，离心10min。
进一步的，所述步骤(4)中水溶性复溶液为甲醇、乙酸和水按照体积比1:0.05:1混合得到的混合液；
任选的，所述步骤(4)、步骤(8)中高速离心的条件为温度4℃，转速14000rpm，离心15min。
进一步的，所述步骤(5)中脂溶性代谢物提取液的配方为：-20℃的三氯甲烷、异丙醇和甲醇按照体积比1:1:1混合得到的混合液。
进一步的，所述步骤(8)中脂溶性复溶液的配方为：异丙醇、乙腈和水按照体积比10:4:1混合得到的混合物。
进一步的，所述步骤(4)、步骤(8)中所述上机检测是指利用液相色谱串联质谱或者经过衍生化后利用气相色谱串联质谱进行定性定量检测。
本发明所述土壤不受限制，为各种可采集到的土壤。
本发明所述粪便不受限制，为各种可采集到的粪便。
本发明所提供的用于粪便和土壤代谢组学研究样品的制备处理方法，其是将粪便或土壤样品经过冷冻干燥和低温破碎后，加入水溶性代谢物提取液后混匀，低温震荡破碎，低温超声提取，取上清液和沉淀；上清液为水溶性代谢物提取液，浓缩至干后复溶，可以利用液相色谱串联质谱或者经过衍生化后利用气相色谱串联质谱进行定性定量检测；沉淀中加入脂溶性代谢物提取液后混匀，低温震荡破碎，低温超声提取，下层溶液为脂溶性代谢物提取液，氮吹至干后复溶，可以利用液相色谱串联质谱或者经过衍生化后利用气相色谱串联质谱进行定性定量检测。本发明采用新的水溶性/脂溶性提取液和复溶液配方，结合低温震荡破碎和低温超声提取的方法，同时对脂溶性和水溶性两种类型的代谢物组进行了提取，能够实现对粪便和土壤样品代谢组的高回收率、全覆盖的提取，并且能够有效避免外源性污染的引入，确保了提取效率和样品的纯度，操作简便易行且稳定，可以实现大批样品的高效制备。本发明提取的最终产物可以直接进行液相色谱串联质谱分析或者经过衍生化后利用气相色谱串联质谱进行定性定量检测；本发明工艺合理，操作可靠易行，制备科学，应用范围广，在保证代谢物提取效率的情况下最大限度地回收代谢物质，简化了操作步骤，对大量开展粪便和土壤代谢组学的相关研究具有较为重大的意义。
附图说明
图1是实施例1中采用不同提取方法从老鼠粪便中提取代谢物种类的数量比较图。
图2是实施例2中采用不同提取方法从土壤中提取代谢物种类的数量比较图。
图3是实施例3中采用不同提取方法从新生儿胎便中提取代谢物种类的数量比较图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本发明的描述中，“第一”、“第二”为指代或描述方便，不能理解为有顺序关系或者有相对重要性指示，除非另有说明，“多个”、“多组”、“多重”的含义是两个(组或重)或两个(组或重)以上。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：一种用于老鼠粪便代谢组学研究样品的制备处理方法
(1)样品预处理：利用代谢笼收集大鼠粪便颗粒，-80℃冰箱冷冻过夜后，放入冷冻干燥机，干燥至衡重，加液氮研磨破碎，过100目筛子，称取100mg粪便粉末，加入1mL-20℃(-20℃是为了防止样品中代谢物发生生物降解)水溶性代谢物提取液，使用移液枪吹打粪便，使其混匀，得到第一混悬液；所述水溶性代谢物提取液为甲醇、乙腈、乙酸和水按照体积比1:1:0.1:2混合得到的混合液。
(2)震荡破碎提取：将2颗经过清洗和400℃烘烤后直径为3mm的钢珠加入步骤(1)中得到的第一悬混液，低温下震荡破碎，震荡频率为80Hz，时间为120s；
(3)超声提取：将所得第一悬混液溶液在冰上进行超声，进一步破碎粪便使代谢物质溶出，超声破碎仪功率80w，超声30s，关闭30s，超声破碎时间为10min；4℃下，转速10000rpm，离心10min，收集第一上清液和沉淀；
(4)将步骤(3)中所得第一上清液放入旋转浓缩仪中，浓缩至近干。加入200μL水溶性复溶液(甲醇、乙酸和水按照体积比1:0.05:1混合得到的混合液)，加入一颗经过清洗和400℃烘烤后直径为3mm的钢珠，震荡复溶，震荡频率为60Hz，时间为30s；高速离心，离心条件为温度4℃，转速14000rpm，离心15min，所得第二上清液为粪便水溶性代谢提取物，可直接上机分析；
(5)向步骤(3)所得沉淀中加入1mL-20℃的脂溶性代谢物提取液(三氯甲烷、异丙醇和甲醇按照体积比1:1:1混合得到的混合液)，使用移液枪吹打，使其混匀，得第二悬混液；
(6)震荡破碎提取：0～4℃下震荡破碎，震荡频率为90Hz，时间为60s，得到破碎后的第二悬混液；
(7)超声提取：将步骤(6)中得到的破碎后的第二悬混液溶液在冰上进行超声，进一步破碎粪便使代谢物质溶出，超声破碎仪功率60w，超声30s，关闭30s，超声破碎时间为5min；4℃下，转速10000rpm，离心10min，收集下层溶液，得到脂溶性代谢物溶液；
(8)使用氮吹的方法将步骤(7)中所得下层溶液吹干。加入200μL脂溶性复溶液(异丙醇、乙腈和水按照体积比10:4:1混合得到的的混合物)，加入一颗经过清洗和400℃烘烤后直径为3mm的钢珠，震荡复溶，震荡频率为60Hz，时间为30s；高速离心，离心条件为温度4℃，转速14000rpm，离心15min，所得第三上清液为粪便脂溶性代谢提取物，可直接上机分析；
对比例1(方法1)：
(1)利用代谢笼收集大鼠粪便颗粒，-80℃冰箱冷冻过夜后，放入冷冻干燥机，干燥至衡重，研碎，称取100mg粪便粉末，加入1mL-20℃甲醇，涡旋震荡，静置30min。
(2)4℃下，转速10000rpm，离心10min，收集第一上清液和沉淀；
(3)将步骤(2)中所得第一上清液放入旋转浓缩仪中，浓缩至近干。加入200μL甲醇，涡旋，静置10min；高速离心，离心条件为温度4℃，转速14000rpm，离心15min，所得第二上清液为粪便水溶性代谢提取物，可直接上机分析；
(4)向步骤(2)所得沉淀中加入1mL-20℃三氯甲烷，使用移液枪吹打，使其混匀，得第一悬混液，涡旋，静置30min；
(5)4℃下，转速10000rpm，离心10min，收集下层溶液，得到脂溶性代谢物溶液；
(6)使用氮吹的方法将步骤(5)中所得下层溶液吹干。加入200μL乙腈，涡旋，静置10min；高速离心，离心条件为温度4℃，转速14000rpm，离心15min，所得第三上清液为粪便脂溶性代谢提取物，可直接上机分析；
对比例2(方法2)：
(1)利用代谢笼收集大鼠粪便颗粒，-80℃冰箱冷冻过夜后，放入冷冻干燥机，干燥至衡重，研碎，称取100mg粪便粉末，加入1mL-20℃甲醇，涡旋震荡，静置30min，得到混悬液。
(2)将所得悬混液进行超声，超声破碎仪功率60w，超声30s，关闭30s，超声破碎时间为5min；4℃下，转速10000rpm，离心10min，收集第一上清液和沉淀；
(3)将步骤(2)中所得第一上清液放入旋转浓缩仪中，浓缩至近干。加入200μL甲醇，涡旋，静置10min；高速离心，离心条件为温度4℃，转速14000rpm，离心15min，所得第二上清液为粪便水溶性代谢提取物，可直接上机分析；
对比例3(方法3)：
(1)利用代谢笼收集大鼠粪便颗粒，-80℃冰箱冷冻过夜后，放入冷冻干燥机，干燥至衡重，研碎，称取100mg粪便粉末，加入1mL-20℃三氯甲烷，涡旋震荡，静置30min，得到第一混悬液。
(2)将三颗经过清洗和400℃烘烤后直径为3mm的钢珠加入步骤(1)中得到的第一悬混液，低温下震荡破碎，震荡频率为90Hz，时间为60s；
(3)4℃下，转速10000rpm，离心10min，收集下层溶液，得到脂溶性代谢物溶液；
(4)使用氮吹的方法将步骤(3)中所得下层溶液吹干。加入200μL乙腈，涡旋，静置10min；高速离心，离心条件为温度4℃，转速14000rpm，离心15min，所得清液为粪便脂溶性代谢提取物，可直接上机分析；
实验结果见图1。从图1可以看出，采用本发明的方法，其脂溶性提取物和水溶性提取物的提取量远远高于对比例的。方法2和3分别只能提取水溶性或脂溶性提取物，不够全面；方法1虽然可以同时提取水溶性或脂溶性提取物，但采用本发明的方法最终在粪便中能检出更多水溶性代谢物和脂溶性代谢物。
本实施例所提供的粪便代谢组学研究样品的制备处理方法，其工艺合理，操作可靠，制备科学，应用范围广泛，在保证代谢物质稳定和提取效率的情况下最大限度地简化了操作步骤，最终所得样品可以利用液相色谱串联质谱或者经过衍生化后利用气相色谱串联质谱进行定性定量检测。
实施例2：一种用于土壤代谢组学研究样品的制备处理方法
(1)样品预处理：称取适量土壤样品，放入到玻璃烧杯中，-80℃冰箱冷冻过夜后，放入冷冻干燥机，干燥至衡重，加液氮研磨破碎，过100目筛子。称取300mg土壤粉末，加入3mL-20℃水溶性代谢物提取液，使用移液枪吹打，使其混匀，得到第一混悬液；
(2)震荡破碎提取：将6颗经过清洗和400℃烘烤后直径为3mm的钢珠加入步骤(1)中得到的第一悬混液，低温下震荡破碎，震荡频率为100Hz，时间为90s，得到破碎后的第一混悬液；
(3)超声提取：将步骤(2)中得到的破碎后的第一悬混液溶液在冰上进行超声，进一步破碎使代谢物质溶出，超声破碎仪功率90w，超声30s，关闭30s，超声破碎时间为7min；4℃下，转速10000rpm，离心20min，收集第一上清液和沉淀；
(4)将步骤(3)中所得第一上清液放入旋转浓缩仪中，浓缩至近干。加入200μL水溶性复溶液(甲醇、乙酸和水按照体积比1:0.05:1混合得到的混合液)，加入一颗经过清洗和400℃烘烤后直径为3mm的钢珠，震荡复溶，震荡频率为60Hz，时间为30s；高速离心，离心条件为温度4℃，转速14000rpm，离心20min，所得第二上清液为水溶性代谢提取物，可直接上机分析；
(5)向步骤(3)所得沉淀中加入3mL-20℃的脂溶性代谢物提取液，使用移液枪吹打，使其混匀得第二悬混液；
(6)震荡破碎提取：低温下震荡破碎，震荡频率为120Hz，时间为30s，得到破碎后的第二悬混液；
(7)超声提取：将步骤(6)中得到的破碎后的第二悬混液在冰上进行超声，进一步破碎样品使代谢物质溶出，超声破碎仪功率90w，超声30s，关闭30s，超声破碎时间为10min；4℃下，转速10000rpm，离心20min，收集下层溶液；
(8)使用氮吹的方法将步骤(7)中所得下层溶液吹干。加入200μL脂溶性复溶液(异丙醇、乙腈和水按照体积比10:4:1混合得到的的混合物)，加入一颗经过清洗和400℃烘烤后直径为3mm的钢珠，震荡复溶，震荡频率为60Hz，时间为30s；高速离心，离心条件为温度4℃，转速14000rpm，离心20min，所得第三上清液为脂溶性代谢提取物，可直接上机分析；
对比例1(方法1)：
(1)称取适量土壤样品，放入到玻璃烧杯中，-80℃冰箱冷冻过夜后，放入冷冻干燥机，干燥至衡重，研磨。称取300mg土壤粉末，加入1mL-20℃甲醇，涡旋震荡，静置30min，得到混悬液。
(2)将所得悬混液进行超声，超声破碎仪功率60w，超声30s，关闭30s，超声破碎时间为5min；4℃下，转速10000rpm，离心10min，收集第一上清液和沉淀；
(3)将步骤(2)中所得第一上清液放入旋转浓缩仪中，浓缩至近干。加入200μL甲醇，涡旋，静置10min；高速离心，离心条件为温度4℃，转速14000rpm，离心15min，所得第二上清液为土壤水溶性代谢提取物，可直接上机分析；
将以上方法制备的样品在相同条件的液相色谱/质谱系统下检测，并经过XCMS进行代谢物提取，实验结果见图2。目前已报道的土壤代谢组提取的方法极少。从图2可以看出，采用本发明的方法，其水溶性提取物的提取量远远高于对比例。方法2只能提取水溶性提取物，不够全面；采用本发明的方法最终在土壤中能检出更多水溶性代谢物和脂溶性代谢物。
本实施例所提供的土壤代谢组学研究样品的制备处理方法，其工艺合理，操作可靠，制备科学，应用范围广泛，在保证代谢物质稳定和提取效率的情况下最大限度地简化了操作步骤，最终所得样品可以利用液相色谱串联质谱或者经过衍生化后利用气相色谱串联质谱进行定性定量检测。
实施例3：一种用于新生儿胎便代谢组学研究样品的制备处理方法
(1)样品预处理：称取新生儿胎便样品，放入到玻璃烧杯中，-80℃冰箱冷冻过夜后，放入冷冻干燥机，干燥至衡重，加液氮研磨破碎，过100目筛子。称取200mg样品粉末，加入2mL-20℃水溶性代谢物提取液，使用移液枪吹打，使其混匀，得到第一混悬液；
(2)震荡破碎提取：将4颗经过清洗和400℃烘烤后直径为3mm的钢珠加入步骤(1)中得到的第一悬混液，低温下震荡破碎，震荡频率为120Hz，时间为60s，得到破碎后的第一混悬液；
(3)超声提取：将步骤(2)中得到的破碎后的第一悬混液溶液在冰上进行超声，进一步破碎使代谢物质溶出，超声破碎仪功率100w，超声30s，关闭30s，超声破碎时间为5min；4℃下，转速10000rpm，离心20min，收集第一上清液和沉淀；
(4)将步骤(3)中所得第一上清液放入旋转浓缩仪中，浓缩至近干。加入200μL水溶性复溶液(甲醇、乙酸和水按照体积比1:0.05:1混合得到的混合液)，加入一颗经过清洗和400℃烘烤后直径为3mm的钢珠，震荡复溶，震荡频率为60Hz，时间为30s；高速离心，离心条件为温度4℃，转速14000rpm，离心20min，所得第二上清液为水溶性代谢提取物，可直接上机分析；
(5)向步骤(3)所得沉淀中加入3mL-20℃的脂溶性代谢物提取液，使用移液枪吹打，使其混匀得第二悬混液；
(6)震荡破碎提取：低温下震荡破碎，震荡频率为120Hz，时间为30s，得到破碎后的第二悬混液；
(7)超声提取：将步骤(6)中得到的破碎后的第二悬混液在冰上进行超声，进一步破碎样品使代谢物质溶出，超声破碎仪功率90w，超声30s，关闭30s，超声破碎时间为10min；4℃下，转速10000rpm，离心20min，收集下层溶液；
(8)使用氮吹的方法将步骤(7)中所得下层溶液吹干。加入200μL脂溶性复溶液(异丙醇、乙腈和水按照体积比10:4:1混合得到的的混合物)，加入一颗经过清洗和400℃烘烤后直径为3mm的钢珠，震荡复溶，震荡频率为60Hz，时间为30s；高速离心，离心条件为温度4℃，转速14000rpm，离心20min，所得第三上清液为脂溶性代谢提取物，可直接上机分析；
对比例1(方法1)：
(1)收集新生儿胎便，-80℃冰箱冷冻过夜后，放入冷冻干燥机，干燥至衡重，研碎，称取100mg样品粉末，加入1mL-20℃甲醇，涡旋震荡，静置30min。
(2)4℃下，转速10000rpm，离心10min，收集第一上清液和沉淀；
(3)将步骤(2)中所得第一上清液放入旋转浓缩仪中，浓缩至近干。加入200μL甲醇，涡旋，静置10min；高速离心，离心条件为温度4℃，转速14000rpm，离心15min，所得第二上清液为粪便水溶性代谢提取物，可直接上机分析；
(4)向步骤(2)所得沉淀中加入1mL-20℃三氯甲烷，使用移液枪吹打，使其混匀，得第一悬混液，涡旋，静置30min；
(5)4℃下，转速10000rpm，离心10min，收集下层溶液，得到脂溶性代谢物溶液；
(6)使用氮吹的方法将步骤(5)中所得下层溶液吹干。加入200μL乙腈，涡旋，静置10min；高速离心，离心条件为温度4℃，转速14000rpm，离心15min，所得第三上清液为粪便脂溶性代谢提取物，可直接上机分析；
对比例2(方法2)：
(1)收集新生儿胎便，-80℃冰箱冷冻过夜后，放入冷冻干燥机，干燥至衡重，研碎，称取100mg样品粉末，加入1mL-20℃甲醇，涡旋震荡，静置30min，得到混悬液。
(2)将所得悬混液进行超声，超声破碎仪功率60w，超声30s，关闭30s，超声破碎时间为5min；4℃下，转速10000rpm，离心10min，收集第一上清液和沉淀；
(3)将步骤(2)中所得第一上清液放入旋转浓缩仪中，浓缩至近干。加入200μL甲醇，涡旋，静置10min；高速离心，离心条件为温度4℃，转速14000rpm，离心15min，所得第二上清液为粪便水溶性代谢提取物，可直接上机分析；
对比例3(方法3)：
(1)收集新生儿胎便，-80℃冰箱冷冻过夜后，放入冷冻干燥机，干燥至衡重，研碎，称取100mg样品粉末，加入1mL-20℃三氯甲烷，涡旋震荡，静置30min，得到第一混悬液。
(2)将三颗经过清洗和400℃烘烤后直径为3mm的钢珠加入步骤(1)中得到的第一悬混液，低温下震荡破碎，震荡频率为90Hz，时间为60s；
(3)4℃下，转速10000rpm，离心10min，收集下层溶液，得到脂溶性代谢物溶液；
(4)使用氮吹的方法将步骤(3)中所得下层溶液吹干。加入200μL乙腈，涡旋，静置10min；高速离心，离心条件为温度4℃，转速14000rpm，离心15min，所得清液为粪便脂溶性代谢提取物，可直接上机分析；
实验结果见图3。从图3可以看出，采用本发明的方法，其脂溶性提取物和水溶性提取物的提取量远远高于对比例的。方法2和3分别只能提取水溶性或脂溶性提取物，不够全面；方法1虽然可以同时提取水溶性或脂溶性提取物，但采用本发明的方法最终在新生儿胎便中能检出更多水溶性代谢物和脂溶性代谢物。
本实施例所提供的收集新生儿胎便代谢组学研究样品的制备处理方法，其工艺合理，操作可靠，制备科学，应用范围广泛，在保证代谢物质稳定和提取效率的情况下最大限度地简化了操作步骤，最终所得样品可以利用液相色谱串联质谱或者经过衍生化后利用气相色谱串联质谱进行定性定量检测。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种用于粪便和土壤代谢组学研究的样品制备处理方法，其特征在于，其经过下列工艺步骤，
(1)样品预处理：取适量在-80℃冰箱内过夜预冷的粪便或土壤样品，放入冷冻干燥机，干燥至衡重，低温破碎，按照100mg样品/1mL水溶性代谢物提取液的比例加入水溶性代谢物提取液，使其混匀，得到第一悬混液；
(2)震荡破碎提取：按照100-200mg粪便或土壤样品/2颗钢珠的比例加入钢珠到所述第一悬混液，低温下震荡破碎得到破碎后的第一悬混液；
(3)超声提取：将所述破碎后的第一悬混液在冰上进行超声，进一步破碎样品使代谢物质溶出；离心，收集第一上清液和沉淀；
(4)将上述所得第一上清液放入旋转浓缩仪中，浓缩至近干后，再按照100-200mg粪便或土壤样品/200μL水溶性复溶液的比例加入水溶性复溶液，再按照100-200mg粪便或土壤样品/1颗钢珠的比例加入钢珠，震荡复溶；高速离心，所得第二上清液为水溶性代谢提取物，可直接上机分析；
(5)按照100mg粪便或土壤样品/1mL脂溶性代谢物提取液的比例加入向上述所得沉淀中加入脂溶性代谢物提取液，使其混匀，得第二悬混液；
(6)震荡破碎提取：将所得第二悬混液在0～4℃下震荡破碎得到破碎后的第二悬混液；
(7)超声提取：将所得破碎后的第二悬混液在冰上进行超声，进一步破碎样品使代谢物质溶出；离心，收集下层溶液，得到脂溶性代谢物溶液；
(8)使用氮吹的方法将上述所得下层溶液吹干，按照100-200mg粪便或土壤样品/200μL脂溶性复溶液的比例加入200μL脂溶性复溶液，再按照100-200mg粪便或土壤样品/1颗钢珠的比例加入1颗钢珠，震荡复溶；高速离心，所得第三上清液为脂溶性代谢提取物，可直接上机分析。
2.根据权利要求1所述的一种用于粪便和土壤代谢组学研究的样品制备处理方法，其特征在于，所述步骤(1)中的粪便为各种动物以及人类的粪便排泄物。
3.根据权利要求1所述的一种用于粪便和土壤代谢组学研究的样品制备处理方法，其特征在于：所述步骤(1)中的低温破碎为液氮研磨破碎或其他可以保持破碎环境为零度以下低温破碎装置；
任选的，所述步骤(1)中水溶性代谢物提取液的配方为：甲醇、乙腈、乙酸和水按照体积比为1:1:0.1:2形成的混合液。
4.根据权利要求1所述的一种用于粪便和土壤代谢组学研究的样品制备处理方法，其特征在于：所述步骤(2)、步骤(4)和步骤(8)中所使用的钢珠直径为1-3mm，为除去钢珠表面所吸附的外源性污染物，钢珠使用前经过清洗和400℃高温烘烤2小时。
5.根据权利要求1所述的一种用于粪便和土壤代谢组学研究的样品制备处理方法，其特征在于：所述步骤(2)和步骤(6)中的震荡破碎、步骤(4)和和步骤(8)中的震荡复溶，使用的频率为80-120Hz，时间为60-120s。
6.根据权利要求1所述的一种用于粪便和土壤代谢组学研究的样品制备处理方法，其特征在于：所述步骤(3)、步骤(7)中所述的超声，其使用的超声破碎仪功率为80～100w，超声30s，关闭30s，超声破碎时间为5～10min；
任选的，所述步骤(3)、步骤(7)中离心的条件为温度4℃，转速10000rpm，离心10min。
7.根据权利要求1所述的一种用于粪便和土壤代谢组学研究的样品制备处理方法，其特征在于：所述步骤(4)中水溶性复溶液为甲醇、乙酸和水按照体积比1:0.05:1混合得到的混合液；
任选的，所述步骤(4)、步骤(8)中高速离心的条件为温度4℃，转速14000rpm，离心15min。
8.根据权利要求1所述的一种用于粪便和土壤代谢组学研究的样品制备处理方法，其特征在于：所述步骤(5)中脂溶性代谢物提取液的配方为：-20℃的三氯甲烷、异丙醇和甲醇按照体积比1:1:1混合得到的混合液。
9.根据权利要求1所述的一种用于粪便和土壤代谢组学研究的样品制备处理方法，其特征在于：所述步骤(8)中脂溶性复溶液的配方为：异丙醇、乙腈和水按照体积比10:4:1混合得到的混合物。
10.根据权利要求1所述的一种用于粪便和土壤代谢组学研究的样品制备处理方法，其特征在于：所述步骤(4)、步骤(8)中所述上机检测是指利用液相色谱串联质谱或者经过衍生化后利用气相色谱串联质谱进行定性定量检测。
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