CN109799295A - 一种用于秀丽隐杆线虫代谢组学分析的样品前处理方法 - Google Patents

一种用于秀丽隐杆线虫代谢组学分析的样品前处理方法 Download PDF

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叶永丽
纪剑
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Abstract

本发明公开了一种用于秀丽隐杆线虫代谢组学分析的样品前处理方法，属于化学分析检测领域。本发明开发了一种秀丽隐杆线虫代谢组学分析的前处理方法，通过对提取溶剂的选择优化，利用乙腈、异丙醇和无菌水的混合溶液作为提取液，得到一种通用性强、提取充分、提取选择性高、重现性好的样品前处理方法。本发明方法在低温条件下对线虫样品代谢物进行充分的提取，可降低高温条件对代谢物结构的影响，通过除去脂溶性的次级代谢物避免了次级代谢物对仪器的污染干扰，所得的代谢物峰数据丰富。该方法可应用于以线虫为研究模型的现代发育生物学、遗传学、基因组学、环境毒理学等研究中，特别是以GC‑MS作为分析工具的代谢组学研究。

Description

一种用于秀丽隐杆线虫代谢组学分析的样品前处理方法
技术领域
本发明涉及一种用于秀丽隐杆线虫代谢组学分析的样品前处理方法，属于化学分析检测领域。
背景技术
秀丽隐杆线虫(C.elegans)是一种生长在土壤中的成虫体长约1-1.5mm的新模式生物，主要以细菌为食物，具有体积小、容易培养、生长周期短、保存简便等特点。秀丽隐杆线虫拥有高等生物衰老的一般性特征，如行动力减缓、肌肉萎缩等，是近年来衰老研究中最重要的非脊椎类模式生物之一。研究数据表明，线虫高度类似哺乳动物，至少38％的线虫蛋白表达基因被证明与人类基因有直接同源性，60％-80％的人类基因均可在线虫基因组中找到同源基因，其中含与人类疾病相关的40％比例的基因。因此，秀丽线虫被广泛应用于现代发育生物学、遗传学、基因组学、环境毒理学等研究中，而在毒理评价以及药物筛选中应用最为广泛。
代谢组学(Metabonomics/mebabolomics)是研究生物体系在受到外界不同刺激或干扰(基因改造或外部环境变化等)前后等特定条件下的代谢产物(分子量<1000)的种类、数量和变化规律的科学，能够分析机体局部的一条代谢通路，是一种新型的系统生物学重要组成部分。代谢组学与其它组学相比，可以从代谢物层面上对生命活动进行探究，通过分析内源性代谢物的调节以及与整体生物学状况的关系，找出生物标记物，从而找出外界环境对引起生物体变化的可能途径。因此，通过对线虫代谢组研究，不仅可以了解线虫在不同环境条件下的变化，还可以进行以线虫为载体在药物等物质暴露条件下的毒理以及功效等的评价，并提供准确的代谢物组分和含量。
高通量的代谢组学研究要求检测分析技术具有高灵敏度、高分辨率、无偏性和良好的重现性。气相色谱质谱联用仪(GC-MS)是基于质谱的主要检测平台之一，是代谢组学研究中应用最早的分析技术，也是最为成熟的色谱-质谱联用技术之一，具有分离能力强、分辨率高、灵敏度高、重现性好、有较高的分析速度、标准代谢物图库丰富等优点，在分析相对分子质量小、极性和沸点低的代谢物或衍生化后在具有挥发性的物质有明显优势。此外，GC-MS仪器相对便宜，且有较为完整的人体代谢质谱数据库(HMDB)，物质鉴定起来相对便捷，尤其适用于分析多组分混合物中未知成分的定性分析，可准确判断化合物的分子式，能够鉴别甚至未分离的色谱峰。但目前基于GC-MS分析的线虫代谢组学样本前处理方法通用性不强，缺少对方法的优化，提取不够充分，难以实现高通量全范围的检测分析。在对药物筛选、毒理评价等研究时，对于性质或者含量差异较大的物质难以实现同步检测，提取的选择性较低，物质丰度低。因此，优化一种线虫样本前处理方法，将为科研人员研究以线虫为模型的代谢组学分析提供方便。
发明内容
本发明主要侧重于优化秀丽隐杆线虫基于GC-MS的代谢组学分析的样品前处理的提取方法通过对提取溶剂的选择优化，得到一种通用性强、提取充分、提取选择性高、重现性好的基于GC-MS代谢组学分析的秀丽隐杆线虫样品预处理方法。
本发明的第一个目的是提供一种秀丽隐杆线虫代谢组学分析的前处理方法，所述方法包括：(1)猝灭秀丽隐杆线虫得到线虫猝灭液；(2)线虫猝灭液中代谢物的提取，所述提取的提取液为乙腈、异丙醇和无菌水的混合溶液。
在本发明的一种实施例中，所述提取液中乙腈、异丙醇和无菌水的体积比为(1～3)：(1～3)：1。
在本发明的一种实施例中，所述猝灭液为甲醇和无菌水的混合溶液。
在本发明的一种实施例中，所述猝灭液中甲醇和无菌水的体积比为(1～3)：1。
在本发明的一种实施例中，所述猝灭方法包括将猝灭液与线虫样品混合进行猝灭，线虫样品与淬灭液的体积比为1：1～1：4。
在本发明的一种实施例中，所述提取方法包括将提取液与线虫猝灭液混合后，加入钢珠组织进行破碎，然后超声提取。
在本发明的一种实施例中，所述线虫代谢产物提取方法具体包括：
将线虫猝灭液放于冰上，加入-20℃预冷的提取液；加入钢珠于离心管中，置于组织破碎机中进行细胞破碎，超声提取；用吸铁石吸出钢珠、离心；取上清液，多次重复，合并上清液。
在本发明的一种实施例中，所述提取液与线虫样品的体积比为1：1～1：4。
在本发明的一种实施例中，所述破碎机是在1200～1800rpm，20～40s，6～9cycle条件下进行细胞破碎。
在本发明的一种实施例中，所述钢珠直径1～3mm。
在本发明的一种实施例中，所述无菌水用高温高压蒸汽灭菌锅121℃，20min灭菌得到。
在本发明的一种实施例中，所述淬灭方法具体包括：
将甲醇和无菌水按照(1～3)：1的体积比混合得到淬灭液，预冷至-20℃以下使用，然后与线虫混合进行淬灭。
在本发明的一种实施例中，所述方法还包括线虫的培养收集、胞内代谢产物干燥和保存。
在本发明的一种实施例中，所述线虫的培养可以在NGM培养基或者大肠杆菌OP50条件下进行培养。
在本发明的一种实施例中，所述方法还包括线虫代谢组衍生化。
在本发明的一种实施例中，所述方法具体包括：
(1)线虫同步化：用M9 buffer溶液将NGM平板上培养的成虫期线虫轻轻洗下，收集于离心管中，用M9 buffer溶液洗涤两边，移去洗涤缓冲液，加入500μL线虫裂解液，振荡5-10min，待虫体裂解后4000rpm/min、4℃离心5min，移去裂解液，用M9 buffer溶液洗涤至少2遍，最后用M9 buffer溶液重悬虫卵，按每板100μL的量接到涂布有大肠杆菌食物的NMG平板上，生化培养箱中20℃培养60h。
(2)收集线虫样本：待线虫培养60h进入L4期后，用M9 buffer溶液洗下NGM平板上的线虫，收集到离心管中，用M9 buffer溶液洗涤2-3次，用M9 buffer溶液稀释虫体密度，计算体积下虫体的数量。然后分装至1.5mL离心管中，1200rpm/min离心，移去溶液。
(3)线虫样本猝灭：离心管中加入0.5mL于-20℃预冷的猝灭溶液，猝灭5min后离心，移去上层溶液，得到线虫样品。
(4)线虫破碎及代谢组提取：将步骤(3)得到的线虫样品加入配制好的预冷提取溶液，离心管中加入2-3粒钢珠，组织破碎机振荡破碎，然后冰浴下超声辅助提取1-5min，14000rpm/min离心2min，上层清液转移至另一离心管中。重复上述步骤提取2次，合并滤液，真空冷冻浓缩得到提取样品。-80℃保存，待用。
(5)线虫代谢组衍生化：步骤(4)所得代谢组提取物质中加入10μL配制浓度为40mg/mL的甲氧胺盐酸盐(MeOX)溶液，旋涡振荡使其混合均匀，样品置于金属浴中1200r/min、30℃孵育90min。取出稍冷却后加入92μL含1％三甲基氯硅烷的N-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(MSTFA)溶液，旋涡混合后继续置于金属浴中1200r/min、37℃孵育30min。衍生化结束后取溶液95μL于装有衬管的色谱进样小瓶装，待进样分析。
(6)线虫代谢组分析：步骤(5)中所得代谢组线虫提取溶液进行GC-MS系统分析检测，根据所得图谱进行线虫代谢组分析。
上述方案中，所述秀丽隐杆线虫培养用NGM培养基为：1.2g NaCl，1.2g胰蛋白胨，3.5g琼脂粉，蒸馏水溶解后定容至400mL，高温灭菌21min。然后室温冷却至约60℃，依次加入灭菌后溶液：0.4mL乙醇胆固醇、0.4mL 1M CaCl2、0.4mL 1M MgSO4·7H2O和10mL 1M磷酸钾缓冲液(pH＝6.0)，混匀。按每培养皿约15mL倒入无菌培养皿(9cm)中，室温下冷却凝固，4℃保存
上述方案中，所述秀丽隐杆线虫培养用大肠杆菌OP50培养条件为：上述制得的NGM培养基，加入吸光值OD约为0.8的OP50菌液100μL，用L型玻璃棒涂抹均匀，超净台中放置过夜，待溶液挥干后置于37℃下培养2d，取出4℃保存备用。
上述方案中，所述M9 buffer溶液溶液是由3g磷酸二氢钾，6g磷酸氢钠，5g氯化钠，用适量蒸馏水完全溶解后，定容至1000mL，121℃灭菌21min。室温冷却至50-60℃时，按每100mL M9 buffer溶液加入经0.22滤膜过滤除菌的1M MgSO4 100μL。
上述方案中，所述线虫裂解液是由1g NaOH和20mL次氯酸钠溶液与80mL蒸馏水溶解混合，过0.22μm微孔滤膜所得。
上述方案中，所述的线虫数量约为1500～5000条。
上述方案中，所述猝灭液为甲醇与蒸馏水以体积比1～3:1(v/v)混合所得。
上述方案中，所述1M磷酸钾缓冲液(pH＝6.0)是由：13.609g磷酸二氢钾溶于100mL蒸馏水中；17.418g磷酸氢二钾溶于100mL蒸馏水中；取100mL磷酸二氢钾溶液与34mL磷酸氢二钾溶液进行混合，并将pH值调至6.0，121℃灭菌21min。
上述方案中，所述1M CaCl2溶液是由11.1g CaCl2溶解于100mL蒸馏水中，混匀后121℃高压灭菌21min所得。
上述方案中，所述1M MgSO4·7H2O溶液由24.7g MgSO4溶解于100mL dH2O中，混匀后高压灭菌。
上述方案中，所述40mg/mL MeOX由0.4g MeOX加入适量吡啶，超声完全溶解后定容至10mL所得，溶液密封置于干燥器中保存。
本发明的第二个目的是提供一种秀丽隐杆线虫代谢组学分析的检测方法，所述方法包括：预先进行秀丽隐杆线虫的前处理，得到前处理样品，然后进行检测；所述前处理的方法为上述的前处理方法。
在本发明的一种实施方式中，所述检测包括高效液相色谱HPLC检测、液相色谱-质谱联用LC-MS检测、气相色谱GC检测、气相色谱-质谱联用GC-MS检测等。
本发明的第三个目的是将上述方法应用于现代发育生物学、遗传学、基因组学、环境毒理学等领域中。
本发明的第四个目的是提供一种药物筛选方法，所述药物筛选方法是利用秀丽隐杆线虫代谢组学分析进行筛选，所述秀丽隐杆线虫代谢组学分析的检测方法为上述检测方法。
本发明的第五个目的是提供一种毒理评价方法，所述毒理评价方法是利用秀丽隐杆线虫代谢组学分析进行评价；所述秀丽隐杆线虫代谢组学分析的检测方法为上述检测方法。
本发明的有益效果为：
(1)本发明通过优化秀丽隐杆线虫代谢组分析样品前处理中溶剂提取方法，得到一种适用于气相色谱质谱分析的线虫前处理方法。所述线虫代谢组学样品前处理方法是在低温条件下对线虫样品代谢物进行充分的提取，可降低高温条件对代谢物结构的影响，通过除去脂溶性的次级代谢物避免了次级代谢物对仪器的污染干扰。采用本发明的前处理方法处理样品所得的代谢物峰数据丰富，且样品的重现性较高，为以秀丽隐杆线虫作为研究对象的物质毒理、功效等代谢组学和阐明作用机制等提供示范性研究，可应用于现代发育生物学、遗传学、基因组学、环境毒理学等研究中，其中毒理评价以及药物筛选中应用最为广泛。
(2)本发明利用乙腈、异丙醇和水提取溶液作为提取液，对线虫代谢物的提取效果明显优于其它几种溶剂(如水、甲醇水溶液、乙腈)。本发明采用机械组织捣碎与超声辅助结合进行破碎提取，操作方法简单、时间短，且有效提高了分析物质的种类和丰度。
附图说明
图1a-c分别为实施例2筛选得到3次平行的代谢物的总离子流色谱图。
具体实施方式
实施例1
(1)线虫同步化：用M9 buffer溶液将NGM平板上培养的成虫期线虫轻轻洗下，收集于离心管中，用M9 buffer溶液洗涤两边，移去洗涤缓冲液，加入500μL线虫裂解液，振荡5min，待虫体裂解后4000rpm/min、4℃离心5min，移去裂解液，用M9buffer溶液洗涤至少2遍，最后用M9 buffer溶液重悬虫卵，按每板100μL的量接到涂布有大肠杆菌食物的NMG平板上，生化培养箱中20℃培养60h。
(2)收集线虫样本：待线虫培养60h进入L4期后，用M9 buffer溶液洗下NGM平板上的线虫，收集到离心管中，继续用M9 buffer溶液洗涤2-3次，加适量M9 buffer溶液稀释虫体密度，计算体积下虫体的数量。然后按1500条/100μL分装至1.5mL离心管中，1200rpm/min离心，移去溶液。
(3)线虫样本猝灭：离心管中加入0.5mL于-20℃预冷的比例为1.5:1的甲醇:水溶液，猝灭7min后离心，移去上层溶液，得到线虫样品。
(4)线虫破碎及代谢组提取：将步骤(3)得到的线虫样品加入0.5mL-20℃预冷的体积比为1:1:1的乙腈:异丙醇:水提取溶液，离心管中加入2-3粒钢珠，组织破碎机振荡破碎，然后冰浴下超声辅助提取3min，14000rpm/min离心2min，上层清液转移至另一离心管中。重复上述步骤提取2次，合并滤液，真空冷冻浓缩得到提取样品。-80℃保存，待用。
(5)线虫代谢组衍生化：步骤(4)所得代谢组提取物质中加入10μL配制浓度为40mg/mL的甲氧胺盐酸盐(MeOX)溶液，旋涡振荡使其混合均匀，样品置于金属浴中1200r/min、30℃孵育90min。取出稍冷却后加入92μL含1％三甲基氯硅烷的N-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(MSTFA)溶液，旋涡混合后继续置于金属浴中1200r/min、37℃孵育30min。衍生化结束后取溶液95μL于装有衬管的色谱进样小瓶装，待进样分析。
(6)线虫代谢组分析：步骤(5)中所得代谢组线虫提取溶液进行GC-MS系统分析检测，根据所得图谱进行线虫代谢组分析。
实施例2
(1)线虫同步化：用M9 buffer溶液将NGM平板上培养的成虫期线虫轻轻洗下，收集于离心管中，用M9 buffer溶液洗涤两边，移去洗涤缓冲液，加入500μL线虫裂解液，振荡7min，待虫体裂解后4000rpm/min、4℃离心5min，移去裂解液，用M9 buffer溶液洗涤至少2遍，最后用M9 buffer溶液重悬虫卵，按每板100μL的量接到涂布有大肠杆菌食物的NMG平板上，生化培养箱中20℃培养60h。
(2)收集线虫样本：待线虫培养60h进入L4期后，用M9 buffer溶液洗下NGM平板上的线虫，收集到离心管中，继续用M9 buffer溶液洗涤2-3次，最后用适量的M9 buffer溶液稀释虫体密度，计算体积下虫体的数量。然后按3000条/100μL分装至1.5mL离心管中，1200rpm/min离心，移去溶液。
(3)线虫样本猝灭：离心管中加入0.5mL于-20℃预冷的比例为1.5:1的溶液，猝灭4min后离心，移去上层溶液，得到线虫样品。
(4)线虫破碎及代谢组提取：将步骤(3)得到的线虫样品加入配制好的于0.5mL-20℃预冷，体积比为3:3:2的乙腈:异丙醇:水溶液，离心管中加入2-3粒钢珠，组织破碎机振荡破碎，然后超声辅助提取5min，12000rpm/min离心2min，上层清液转移至另一离心管中。重复上述步骤提取2次，合并滤液，真空冷冻浓缩得到提取样品。-80℃保存，待用。
(5)线虫代谢组衍生化：步骤(4)所得代谢组提取物质中加入10μL配制浓度为40mg/mL的甲氧胺盐酸盐(MeOX)溶液，旋涡振荡使其混合均匀，样品置于金属浴中1200r/min、30℃孵育90min。取出稍冷却后加入92μL含1％三甲基氯硅烷的N-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(MSTFA)溶液，旋涡混合后继续置于金属浴中1200r/min、37℃孵育30min。衍生化结束后取溶液95μL于装有衬管的色谱进样小瓶装，待进样分析。
(6)线虫代谢组分析：步骤(5)中所得代谢组线虫提取溶液进行GC-MS系统分析检测，根据所得图谱进行线虫代谢组分析。
所得提取物中代谢物的总离子流色谱图见图1。
实施例3
按实施例2的步骤进行线虫代谢组分析样品前预处理，区别在于，代谢物提取溶剂为-20℃下预冷的体积比为3:3:1的乙腈:异丙醇:水提取溶液。
对实施例1-3所得处理代谢物结果进行检测分析，见表1。
表1不同混合比提取液所得代谢物检测结果
乙腈:异丙醇:水 代谢物数量 总峰面积
1:1:1 135 6071940696
3:3:2 137 7995350449
3:3:1 137 7268303498
对照例1
按实施例2的步骤进行线虫代谢组分析样品前预处理，区别在于，代谢物提取溶剂为-20℃下预冷的乙腈有机溶液。
对照例2
按实施例2的步骤进行线虫代谢组分析样品前预处理，区别在于，代谢物提取溶剂为4℃下预冷的无菌生理盐水溶液。
对照例3
按实施例2的步骤进行线虫代谢组分析样品前预处理，区别在于，代谢物提取溶剂为-20℃下预冷的体积比为4:1的甲醇:水溶液。
对照例4
按实施例2的步骤进行线虫代谢组分析样品前预处理，区别在于，代谢物提取溶剂为4℃下预冷的5％甲酸:水溶液。
对照例5
按实施例2的步骤进行线虫代谢组分析样品前预处理，区别在于，代谢物提取溶剂为-20℃下预冷的体积比为1:1:3的乙腈:异丙醇:水溶液。
对对照例1-5所得处理结果进行检测分析，见表2。
表2不同提取液所得代谢物的检测结果
上述实施例和对照例获得的提取样品，进行相同条件的GC-MS检测和数据分析，从谱图的峰形、检索结果的匹配度、最终代谢物的数量及量化等多方面考察，得出结论：乙腈:异丙醇:水混合作为提取溶剂有非常好的丰度、代谢物数量也比较高；其中，体积比为3:3:2的乙腈:异丙醇:水作为提取溶剂提取效果明显优于其它溶剂提取。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种秀丽隐杆线虫代谢组学分析的前处理方法，其特征在于，所述方法包括：(1)猝灭秀丽隐杆线虫得到线虫猝灭液；(2)线虫猝灭液中代谢物的提取，所述提取的提取液为乙腈、异丙醇和无菌水的混合溶液；所述提取液中乙腈、异丙醇和无菌水的体积比为(1～3)：(1～3)：1。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述提取方法包括将提取液与线虫猝灭液混合后，加入钢珠组织进行破碎，然后超声提取。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述猝灭液为甲醇和无菌水的混合溶液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述猝灭液中甲醇和无菌水的体积比为(1～3)：1。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述猝灭方法包括将猝灭液与线虫样品混合进行猝灭，线虫样品与淬灭液的体积比为1：1～1：4。
6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于，所述提取液与线虫样品的体积比为1：1～1：4。
7.一种秀丽隐杆线虫代谢组学分析的检测方法，其特征在于，所述方法包括：预先进行秀丽隐杆线虫的前处理，得到前处理样品，然后进行检测；所述前处理的方法为权利要求1-6任一所述的前处理方法。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述检测包括高效液相色谱HPLC检测、液相色谱-质谱联用LC-MS检测、气相色谱GC检测、气相色谱-质谱联用GC-MS检测。
9.一种药物筛选方法，其特征在于，所述药物筛选方法是利用秀丽隐杆线虫代谢组学分析进行筛选，所述秀丽隐杆线虫代谢组学分析的检测方法为权利要求7或8所述的检测方法。
10.一种毒理评价方法，其特征在于，所述毒理评价方法是利用秀丽隐杆线虫代谢组学分析进行评价；所述秀丽隐杆线虫代谢组学分析的检测方法为权利要求7或8所述的检测方法。
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