CN113138246A - 一种靶向测定生物样本中短链脂肪酸的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物体内源性物质检测技术领域，特别涉及一种靶向测定生物样本中短链脂肪酸的检测方法，包括如下步骤：将短链脂肪酸的标准品定溶于有机溶剂中，制得对照品溶液；将对照品溶液以有机溶剂稀释，并向其中加入¹³C标记的丹磺酰肼溶液进行衍生化反应，制得同位素内标溶液；将动物样本进行前处理，制得空白基质；将空白基质以对照品溶液稀释，向其中加入¹²C标记的丹磺酰肼溶液进行衍生化反应，制得质控样品；将动物样本进行预处理，并向其中加入¹²C标记的丹磺酰肼溶液进行衍生化反应，制得供试品溶液；将同位素内标溶液、空白基质、质控样品和供试品溶液分别进行UHPLC‑MS/MS分析，获得动物样本中短链脂肪酸含量。

Description

一种靶向测定生物样本中短链脂肪酸的检测方法

技术领域

本发明涉及生物体内源性物质检测技术领域，特别涉及一种靶向测定生物样本中短链脂肪酸的检测方法。

背景技术

短链脂肪酸(SCFAs)是由6个及以下碳原子所组成的饱和脂肪酸，主要为乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和己酸等。肠道中的SCFAs主要由拟杆菌属、梭菌属和双歧杆菌属等厌氧菌发酵产生，根据其化学结构可分为直链脂肪酸与支链脂肪酸。SCFAs产生后被近端结肠的上皮细胞所迅速吸收，其中仅有5％～10％由粪便排出。SCFAs参与了人体内能量代谢过程，可提供日需能量的10％，并作为葡萄糖、胆固醇和脂质代谢的底物发挥重要的生理作用。随着现代医学对肠道疾病的研究并发现，肠道疾病可诱发肠道菌群的紊乱，进而可导致SCFAs的产量减少和肠道屏障的破坏。并且在最新的学术研究中发现，SCFAs与肠易激综合征、炎症性肠炎及结直肠癌均有一定的相关性。因此，SCFAs在一定程度上可作为肠道健康指标以用来评价生物体的肠道健康，然而，对于肠道SCFAs的研究成果主要基于啮齿类动物获得，由于动物和人类的肠道和机体功能存在一定的差异性，使得现行的评价肠道与疾病之间分析指标缺乏一定的临床应用研究基础。近年来，LC-MS在代谢组学的研究中的应用越来越广泛，其检测器的多样化可满足不同代谢组学的检测需求。在选用LC-MS对SCFAs定量分析时，常需选用同位素内标法在最大程度上减少分析误差，然而生物样本内的代谢物种类众多，对应的同位素化合物难寻，同时大部分代谢物极性较大且化学性质不稳定，不利于对生物样本内的SCFAs的定量检测。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺陷，本发明所要解决的技术问题为：提供一种检测灵敏度高、靶向性好的基于化学衍生化法靶向测定生物样本中短链脂肪酸的检测方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种靶向测定生物样本中短链脂肪酸的检测方法，包括如下步骤：

S1、将短链脂肪酸的标准品定溶于有机溶剂中，制得对照品溶液；

S2、将对照品溶液以有机溶剂稀释，并向其中加入¹³C标记的丹磺酰肼溶液进行衍生化反应，制得同位素内标溶液；

S3、将动物样本进行前处理，制得空白基质；

S4、将空白基质以对照品溶液稀释，制得空白基质稀释液，向空白基质稀释液中加入¹²C标记的丹磺酰肼溶液进行衍生化反应，制得质控样品；

S5、将动物样本进行预处理，制得预处理产物，并向预处理产物中加入¹²C标记的丹磺酰肼溶液进行衍生化反应，制得供试品溶液；

S6、将同位素内标溶液、空白基质、质控样品和供试品溶液分别进行UHPLC-MS/MS分析，计算获得动物样本中短链脂肪酸含量。

本发明的有益效果在于：通过基于同位素标记的化学衍生化法对SCFAs进行衍生化反应，有效提高对SCFAs中各类脂肪酸的检测靶向性和检测灵敏度；通过采用超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用技术以提高对SCFAs中各类同分异构体的分辨能力，进一步提高对SCFAs中各类脂肪酸的检测精度。将标准溶液与同位素标记的试剂进行衍生化，并在分析之前加入到样品溶液中，可降低基质效应，提高电喷雾离子源(ESI)的灵敏度和特异性。

附图说明

图1所示为本发明在实施例中空白基质的选择离子流图；

图2所示为本发明在实施例中质控样品的选择离子流图；

图3所示为本发明在实施例中供试品溶液的选择离子流图；

图4所示为本发明在具体实施方式中的衍生化反应流程图。

标号说明：1、¹²C-DnsHz-乙酸；2、¹³C-DnsHz-乙酸；3、¹²C-DnsHz-丙酸；4、¹³C-DnsHz-丙酸；5、¹²C-DnsHz-异丁酸；6、¹³C-DnsHz-异丁酸；7、¹²C-DnsHz-丁酸；8、¹³C-DnsHz-丁酸；9、¹²C-DnsHz-2-甲基丁酸；10、¹³C-DnsHz-2-甲基丁酸；11、¹²C-DnsHz-异戊酸；12、¹³C-DnsHz-异戊酸；13、¹²C-DnsHz-戊酸；14、¹³C-DnsHz-戊酸；15、¹²C-DnsHz-己酸；16、¹³C-DnsHz-己酸。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。

本发明最关键的构思在于：基于同位素标记的化学衍生化法，采用超高效液相色谱-三重四极杆质谱(UHPLC-MS/MS)联用技术对生物样本中短链脂肪酸的含量进行测定，有效提高对短链脂肪酸的检测靶向性、检测灵敏度和检测精度。

本发明提供一种靶向测定生物样本中短链脂肪酸的检测方法，包括如下步骤：

S1、将短链脂肪酸的标准品定溶于有机溶剂中，制得对照品溶液；

S2、将对照品溶液以有机溶剂稀释，并向其中加入¹³C标记的丹磺酰肼溶液进行衍生化反应，制得同位素内标溶液；

S3、将动物样本进行前处理，制得空白基质；

S4、将空白基质以对照品溶液稀释，制得空白基质稀释液，向空白基质稀释液中加入¹²C标记的丹磺酰肼溶液进行衍生化反应，制得质控样品；

S5、将动物样本进行预处理，制得预处理产物，并向预处理产物中加入¹²C标记的丹磺酰肼溶液进行衍生化反应，制得供试品溶液；

S6、将同位素内标溶液、空白基质、质控样品和供试品溶液分别进行UHPLC-MS/MS分析，计算获得动物样本中短链脂肪酸含量。

进一步的，在S1和S6中，所述短链脂肪酸为乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、2-甲基丁酸、异戊酸、戊酸和己酸中的一种或多种的组合。

优选的，所述乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、2-甲基丁酸、异戊酸、戊酸和己酸标准品的添加量的物质的量之比为10∶2.5∶5∶5.5∶6∶4∶2∶7，短链脂肪酸标准品的总添加量在所述有机溶剂中的摩尔浓度为50mmol/L。

优选的，所述乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、2-甲基丁酸、异戊酸、戊酸和己酸标准品被配制成对照品溶液时其摩尔浓度分别为10mmol/L乙酸，2.5mmol/L丙酸，5mmol/L异丁酸，5.5mmol/L丁酸，6mmol/L 2-甲基丁酸，4mmol/L异戊酸，2mmol/L戊酸，7mmol/L己酸。

进一步的，在S3中，所述前处理包括如下步骤：

S1、将多个生物样本等质量混合，并向其中加入50％乙腈涡旋、离心，取上清液并以氮气干燥，制得初级冻干粉；

S2、将基质冻干粉以5％氨水复溶并以二氯甲烷萃取，取二氯甲烷层并以氮气干燥，制得基质冻干粉；

S3、将基质冻干粉以50％乙腈复溶，制得空白基质。

优选的，称取6只大鼠各15mg粪便，混合，加入2-5mL 50％乙腈涡旋2-5min后，于12000rpm，4℃离心5-15min，取1.5-4.5mL上清液，氮气吹干，用1-4mL5％氨水复溶，加入2-5mL的二氯甲烷进行萃取，重复三次，合并二氯甲烷层。氮气吹干，加入2.5mL 50％乙腈复溶，即得空白基质；

进一步的，在S5中，所述预处理为：将动物样本以氮气干燥，将干燥产物以50％乙腈涡旋、离心，取上清液，制得预处理产物。

优选的，分别称取6只大鼠粪便2-3g，称取1-5mg冷冻干燥后粪便，加入50-150μL50％乙腈涡旋2min，于12000rpm，4℃离心5-15min，移取上清液即得；

进一步的，在S4和S5中，所述衍生化反应包括如下步骤：

S1、取空白基质稀释液或预处理产物并向其中加入EDC溶液和HOAT溶液混合，获得反应底物溶液；

S2、向反应底物溶液中加入¹²C标记的丹磺酰肼溶液，涡旋混合并以水浴条件孵育，待孵育完成后再加入无水氯化铜溶液，以水浴条件孵育，待孵育完成后获得衍生化产物溶液；

S3、将衍生化产物溶液以25％乙腈稀释并离心，取上清液并加入等体积同位素内标溶液，混匀，制得质控样品或供试品溶液。

优选的，取10-30μL样品加入10-30μLEDC溶液及10-30μLHOAT溶液后混匀，再加入10-30μL ¹²C-DnsHz溶液，涡旋混匀，15-25℃水浴条件下孵育70-100min后，加入10-30μL无水氯化铜溶液，于40-60℃水浴条件下孵育30-40min，使反应终止。化学反应过程如图4所示，其中，X为¹³C或¹²C，ROOH为乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、2-甲基丁酸、异戊酸、戊酸和己酸中的一种。反应结束后加入880-960μL25％乙腈进行稀释，并于10000rpm，4℃离心10min，取100-200μL上清液加入100-200μL同位素内标溶液，混匀。

进一步的，在S2中，所述衍生化反应包括如下步骤：

S1、将已稀释的对照品溶液中加入EDC溶液和HOAT溶液混合，获得反应底物溶液；

S2、向反应底物溶液中加入¹³C标记的丹磺酰肼溶液，涡旋混合并以水浴条件孵育，待孵育完成后再加入无水氯化铜溶液，以水浴条件孵育，待孵育完成后获得衍生化产物溶液；

S3、将衍生化产物溶液以25％乙腈涡旋混合，制得同位素内标溶液。

优选的，取10-30μL混合对照品溶液加入10-30μL EDC溶液及10-30μLHOAT溶液后混匀，再加入10-30μL ¹³C-DnsHz溶液，涡旋混匀，15-25℃水浴条件下孵育70-100min后，加入10-30μL无水氯化铜溶液，于40-60℃水浴条件下孵育30-40min，使反应终止.反应结束后。化学反应过程如图4所示。反应完成后，每30μL溶液加入1mL25％乙腈涡旋混匀，即得同位素内标溶液，放入-80℃保存备用，使用前过0.22μm微孔滤膜。

进一步的，在S6中，所述UHPLC-MS/MS分析中，色谱柱的填料粒径小于5μm。

从上述描述可知，由于异丁酸、丁酸和2-甲基丁酸、异戊酸和戊酸互为同分异构体，通过使用填料粒径小于5μm的色谱柱，以提高UHPLC-MS/MS分析过程中上述短链脂肪酸的分离能力。

实施例一：

一种靶向测定生物样本中短链脂肪酸的检测方法，具体步骤如下：

1、仪器与试剂

1.1、实验试剂

乙酸(货号：A116173，质量分数为100％)、丙酸(货号：P110446，质量分数为100％)、异丁酸(货号：I103524，质量分数>99.5％)、丁酸(货号：B110438，质量分数为100％)、2-甲基丁酸(货号：M107377，质量分数为98％，2-BA)、异戊酸(货号：I108280，质量分数≥99.5％)、戊酸(货号：V108271，质量分数为100％)、己酸(货号：H103632，质量分数为100％)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(货号：E106172，EDC)、1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑(货号H309128，HOAT)均购自阿拉丁试剂有限公司。丹磺酰肼(货号：276443，质量分数≥98％，¹²C-DnsHz)、乙腈(质谱级)购自百灵威科技有限公司。无水氯化铜(货号：C804817)购自上海麦克林生化科技有限公司。超纯水为实验室自制。

1.2、实验仪器

LCMS-8045液质联用仪(日本岛津)、KB–3漩涡混合器(海门市其林贝尔仪器有限公司)、H1650R台式冷冻小型高速离心机(湖南湘仪实验开发有限公司)。

1.3、粪便样本

本研究选取6只健康雄性SD大鼠，体重180～220g，由广东省医学实验动物中心提供。分别收集每只大鼠2～3g粪便于EP管中，液氮冷冻后放于真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥，待完全干燥后用密封袋封存，并放于-80℃冰箱备用。

2、实验方法

2.1、液相条件：

色谱柱：Shim-pack GIST C18(2.1×100mm，2μm)；流动相：0.1％甲酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脱：0～9min，25～30％B；9～11min，30～40％B；11～20min，40～50％B；20～20.1min，50～100％B；20.1～23min，100％B；23.10～30min，25％B；流速：0.3mL/min；柱温：35℃，自动进样器：4℃；进样体积：1μL。

2.2、质谱条件：

离子源：电喷雾离子化源(ESI源)；采用多反应监测模式(MRM)，待测物及内标物均为正离子模式；待测物及其对应内标物离子通道选择见表1；雾化气(N2)：3.0L·min-1；干燥气(N2)：10L·min-1；加热气(空气)：10L·min-1；碰撞气(Ar2)：17kpa；DL管温度：250℃；接口温度：300℃；加热块：400℃。

表1

2.3、样品的制备

2.3.1、按表2配置各衍生化试剂

表2

试剂名称	配制浓度	溶剂
			<sup>12</sup>C-DnsHz	50mg·mL<sup>-1</sup>	乙腈
<sup>13</sup>C-DnsHz	50mg·mL<sup>-1</sup>	乙腈
			MES	500mmol·L<sup>-1</sup>	水
HOAT	50mmol·L<sup>-1</sup>	MES
			EDC	500mmol·L<sup>-1</sup>	MES
CuCl<sub>2</sub>	500mmol·L<sup>-1</sup>	水

2.3.2、对照品溶液的制备

取适量乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、2-甲基丁酸、异戊酸、戊酸和己酸用50％乙腈溶解，制成每1L 50％乙腈中含有10mmol乙酸，2.5mmol丙酸，5mmol异丁酸，5.5mmol丁酸，6mmol 2-甲基丁酸，4mmol异戊酸，2mmol戊酸，7mmol己酸的对照品溶液，于4℃冰箱保存。

2.3.3、同位素内标溶液的制备

取适量对照品溶液以50％乙腈稀释成含乙酸2mmol/L，丙酸0.5mmol/L，异丁酸1mmol/L，丁酸1.1mmol/L，2-甲基丁酸1.2mmol/L，异戊酸0.8mmol/L，戊酸0.4mmol/L，己酸1.4mmol/L的混合溶液，取20μL混合溶液加入20μL EDC溶液及20μLHOAT溶液后混匀，再加入20μL ¹³C标记的丹磺酰肼溶液，涡旋混匀，20℃水浴条件下孵育90min后，加入20μL无水氯化铜溶液，于40℃水浴条件下孵育30min，使反应终止。化学反应过程如图4所示。反应结束后，每30μL溶液加入1mL25％乙腈涡旋混匀，即得同位素内标溶液，放入-80℃保存备用，使用前过0.22μm微孔滤膜。

2.3.4、供试品溶液的制备

精密称取3mg冷冻干燥后大鼠粪便，加入100μL 50％乙腈涡旋2min，于12000rpm，4℃离心10min，移取上清液，即得预处理产物。

取20μL预处理产物加入20μL EDC溶液及20μL HOAT溶液后混匀，再加入20μL ¹²C-DnsH溶液，涡旋混匀，20℃水浴条件下孵育90min后，加入20μL无水氯化铜溶液，于40℃水浴条件下孵育30min，使反应终止。化学反应过程如图4所示。反应结束后加入900μL25％乙腈进行稀释，并于10000rpm，4℃离心10min，取100μL上清液加入100μL同位素内标溶液，混匀，制得供试品溶液。

2.3.5、质控样品的制备

精密称取各个大鼠15mg粪便，混合，加入3mL 50％乙腈涡旋2min后，于12000rpm，4℃离心10min，取2.5mL上清液，氮气吹干，用2.5mL 5％氨水复溶，加入3mL的二氯甲烷进行萃取，重复三次，合并二氯甲烷层。氮气吹干，加入2.5mL 50％乙腈复溶，制得空白基质，4℃保存备用；

取空白基质以对照品溶液逐级稀释，制成摩尔浓度在0.03125-10000μmol/L范围内不同浓度的质控溶液；

分别取20μL不同摩尔浓度的质控溶液，加入20μL EDC溶液及20μL HOAT溶液后混匀，再加入20μL ¹²C-DnsH溶液，涡旋混匀，20℃水浴条件下孵育90min后，加入20μL无水氯化铜溶液，于40℃水浴条件下孵育30min，使反应终止。化学反应过程如图4所示。反应结束后加入900μL 25％乙腈进行稀释，并于10000rpm，4℃离心10min，取100μL上清液加入100μL同位素内标溶液，混匀，制得不同摩尔浓度的质控样品。

2.4、UHPLC-MS/MS分析

2.4.1、线性关系

2.4.1.1、溶剂标准曲线的制得

将不同的对照品溶液以50％乙腈梯度稀释，获得不同浓度的对照品溶液稀释液，分别取20μL不同浓度的对照品溶液稀释液，加入20μL EDC溶液及20μLHOAT溶液后混匀，再加入20μL ¹³C标记的丹磺酰肼溶液，涡旋混匀，20℃水浴条件下孵育90min后，加入20μL无水氯化铜溶液，于40℃水浴条件下孵育30min，使反应终止。反应结束后，每30μL溶液加入1mL25％乙腈涡旋混匀。分别将已衍生化完成的对照品溶液稀释液上机分析，获得溶剂标准曲线。

2.4.1.2、基质标准曲线的制备

将不同摩尔浓度的质控样品上机分析，获得基质标准曲线。其中，供试品溶液的稀释浓度点与对照品溶液稀释浓度点相一致。

2.4.1.3、标准曲线的绘制

溶剂标准曲线与基质标准曲线均采用内标法，待测物与其内标的对应关系如表1所示，各短链脂肪酸以其对应的同位素衍生化物为内标；以短链脂肪酸质量浓度(μmol·L^-1)为横坐标(X)，待测物与内标物的峰面积比为纵坐标(Y)，绘制标准曲线并进行线性回归计算，得到相应的线性回归方程。结果表明各成分在相应的线性范围内线性关系良好。同时以溶剂标准曲线中峰面积信噪比为10倍(S/N＝10)的短链脂肪酸进样浓度为定量下限，结果如表3所示，表3为溶剂标准曲线、基质标准曲线线性范围及定量下限考察结果表。

表3

2.4.2、样品测定结果取6只大鼠的供试品溶液分别上机分析，将各面积比代入基质标准曲线进行计算，各大鼠粪便中短链脂肪酸含量如表4所示，表4为大鼠短链脂肪酸含量测定结果(μmol·g^-1，n＝6)。质控样品及供试品溶液质谱色谱图如图2、图3所示。

表4

检测例：

1、空白基质的考察

取空白基质20μL，加入20μLEDC溶液及20μL HOAT溶液后混匀，再加入20μL ¹²C-DnsH溶液，涡旋混匀，20℃水浴条件下孵育90min后，加入20μL无水氯化铜溶液，于40℃水浴条件下孵育30min，使反应终止。反应结束后，将样品于12000rpm，4℃离心10min，取100μL上机分析。空白基质除乙酸外，在待测物通道及内标物通道均不出峰。空白基质的质谱色谱图如图1所示。

2、待测物对内标通道的影响

取处于溶剂标准曲线最高浓度点的对照品溶液稀释液20μL，加入20μL EDC溶液及20μLHOAT溶液后混匀，再加入20μL ¹³C标记的丹磺酰肼溶液，涡旋混匀，20℃水浴条件下孵育90min后，加入20μL无水氯化铜溶液，于40℃水浴条件下孵育30min，使反应终止。反应结束后，将样品于12000rpm，4℃离心10min，取100μL上机分析。待测物在内标物通道不出峰，表明待测物对内标物无影响。

3、内标物对待测物的影响

取同位素内标溶液100μL上机分析。内标物在待测物通道不出峰，表明内标物对待测物无影响。

4、系统残留考察

待液质联用仪运行至溶剂标准曲线最高点结束后，对空白样品进行分析，考察系统残留的影响。空白样品在待测物通道及内标物通道均不出峰，表明不存在系统残留。

5、准确度及精确度

根据基质标准曲线范围分别选择基质标准曲线最低浓度点、中浓度点及最高浓度点作为低浓度质控点(LQC)、中浓度质控点(MQC)、高浓度质控点(HQC)。用空白基质配制3个浓度的QC，每个浓度平行配制5份，分别取20μL测试样品，并加入20μL ¹²C-DnsH溶液，涡旋混匀，20℃水浴条件下孵育90min后，加入20μL无水氯化铜溶液，于40℃水浴条件下孵育30min，使反应终止。反应结束后，将测试样品于12000rpm，4℃离心10min，取100μL上机分析。计算准确度及精密度，结果如表5所示，表5为精密度及准确度考察结果表。8种待测物的准确度在83％～113％之间。精密度RSD％均在5％以内。表明该方法精密度良好。

表5

6、基质效应

按表5分别用空白基质及50％乙腈配制3个浓度的QC，每个浓度平行配制3份，分别取20μL测试样品，并加入20μL ¹²C-DnsH溶液，涡旋混匀，20℃水浴条件下孵育90min后，加入20μL无水氯化铜溶液，于40℃水浴条件下孵育30min，使反应终止。反应结束后，将测试样品于12000rpm，4℃离心10min，取100μL上机分析，分别记录面积比A_基质，A_溶剂，基质效应＝A_基质/A_溶剂×100％。结果如表6所示。8种待测物基质效应在89％～109％之间，均在100±15％以内，符合生物样品测定要求。

7、提取回收率

取一份已知含量的粪便样本，峰面积比为A₁，精密称取3mg，分别向其中加入10μLLQC、MQC及HQC对照品溶液，混匀，再加入90μL 50％乙腈涡旋2min，于12000rpm，4℃离心10min，移取上清液20μL，并加入20μL ¹²C-DnsH溶液，涡旋混匀，20℃水浴条件下孵育90min后，加入20μL无水氯化铜溶液，于40℃水浴条件下孵育30min，使反应终止。反应结束后，将测试样品于12000rpm，4℃离心10min，取100μL上机分析，记录其面积比为A₂。精密称取同一份粪便样品，加入90μL 50％乙腈涡旋2min，于12000rpm，4℃离心10min，移取上清液，再分别向上清液中加入10μLLQC、MQC及HQC对照品溶液，混匀，取20μL测试样品并加入20μL ¹²C-DnsH溶液，涡旋混匀，20℃水浴条件下孵育90min后，加入20μL无水氯化铜溶液，于40℃水浴条件下孵育30min，使反应终止。反应结束后，将测试样品于12000rpm，4℃离心10min，取100μL上机分析，记录其面积比为A₃。提取回收率＝(A₂-A₁)/(A₃-A₁)×100％，结果如表6所示，表6为基质效应、回收率及稳定性考察结果表。各待测物提取回收率在89％～108％之间，符合生物样品测定要求。

8、稳定性考察

用空白基质以50％乙腈溶液配制LQC及HQC，取20μL测试样品，并加入20μL ¹²C-DnsH溶液，涡旋混匀，20℃水浴条件下孵育90min后，加入20μL无水氯化铜溶液，于40℃水浴条件下孵育30min，使反应终止。反应结束后，将测试样品于12000rpm，4℃离心10min，取100μL上清液加入100μL同位素内标溶液，混匀，获得质控样品。将前述质控样品放于自动进样器样品架上，分别于0、3、6、9、12、15、18、21、24、28、32、36、42、48h上机分析，记录其面积比。结果如表6所示，各样品48h内稳定性RSD％均在5％以内，表明样品能在4℃条件下保存48h。

表6

需要说明的是，由于50％乙腈作为反应底物进行衍生化反应时会在乙酸相应的位置出锋，且该峰面积恒定，因此在检测例中对乙酸的相关考察均以乙酸峰面显示面积扣除乙腈杂峰峰面面积，以计算获得乙酸实际峰面面积。

综上所述，本发明提供的一种靶向测定生物样本中短链脂肪酸的检测方法，基于同位素标记的化学衍生化法和采用超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用技术(UHPLC-MS/MS)，在同一条件下对乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、2-甲基丁酸、异戊酸、戊酸和己酸8个成分进行含量测定，可用于靶向分析生物样品SCFAs含量随疾病的变化。具有灵敏度高，稳定性好，生物样品前处理和预处理步骤简单等特点，为研究SCFAs与疾病之间的关系提供一种可行的测定手段。通过选用二氯甲烷作为萃取液，有效防止其他萃取液中痕量乙酸对空白基质造成影响，同时相较于活性炭吸附和固相萃取，通过二氯甲烷进行液液萃取可有效将空白基质内的内源性脂肪酸除尽，有效提高检测精度；并且，由于乙腈可使各个物质的出峰时间提前，并且可得到更好的峰型，故在对有机相的选择中选用乙腈-0.1％甲酸水溶液作为流动相，可有效缩短检测时间和提高检测精度；通过在UHPLC系统中选用填料粒径小于5μm的色谱柱，可有效提高UHPLC系统对短链脂肪酸内同分异构体进行分离，有效提高UHPLC的分离能力。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (7)

1.一种靶向测定生物样本中短链脂肪酸的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、将短链脂肪酸的标准品定溶于有机溶剂中，制得对照品溶液；

S2、将对照品溶液以有机溶剂稀释，并向其中加入¹³C标记的丹磺酰肼溶液进行衍生化反应，制得同位素内标溶液；

S3、将动物样本进行前处理，制得空白基质；

S4、将空白基质以对照品溶液稀释，制得空白基质稀释液，向空白基质稀释液中加入¹²C标记的丹磺酰肼溶液进行衍生化反应，制得质控样品；

S5、将动物样本进行预处理，制得预处理产物，并向预处理产物中加入¹²C标记的丹磺酰肼溶液进行衍生化反应，制得供试品溶液；

S6、将同位素内标溶液、空白基质、质控样品和供试品溶液分别进行UHPLC-MS/MS分析，计算获得动物样本中短链脂肪酸含量。

2.根据权利要求1所述靶向测定生物样本中短链脂肪酸的检测方法，其特征在于，在S1和S6中，所述短链脂肪酸为乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、2-甲基丁酸、异戊酸、戊酸和己酸中的一种或多种的组合。

3.根据权利要求1所述靶向测定生物样本中短链脂肪酸的检测方法，其特征在于，在S3中，所述前处理包括如下步骤：

S1、将多个生物样本等质量混合，并向其中加入50％乙腈涡旋、离心，取上清液并以氮气干燥，制得初级冻干粉；

S2、将基质冻干粉以5％氨水复溶并以二氯甲烷萃取，取二氯甲烷层并以氮气干燥，制得基质冻干粉；

S3、将基质冻干粉以50％乙腈复溶，制得空白基质。

4.根据权利要求1所述靶向测定生物样本中短链脂肪酸的检测方法，其特征在于，在S5中，所述预处理为：将动物样本以氮气干燥，将干燥产物以50％乙腈涡旋、离心，取上清液，制得预处理产物。

5.根据权利要求1所述靶向测定生物样本中短链脂肪酸的检测方法，其特征在于，在S4和S5中，所述衍生化反应包括如下步骤：

S1、取空白基质稀释液或预处理产物并向其中加入EDC溶液和HOAT溶液混合，获得反应底物溶液；

S2、向反应底物溶液中加入¹²C标记的丹磺酰肼溶液，涡旋混合并以水浴条件孵育，待孵育完成后再加入无水氯化铜溶液，以水浴条件孵育，待孵育完成后获得衍生化产物溶液；

S3、将衍生化产物溶液以25％乙腈稀释并离心，取上清液并加入等体积同位素内标溶液，混匀，制得质控样品或供试品溶液。

6.根据权利要求1所述靶向测定生物样本中短链脂肪酸的检测方法，其特征在于，在S2中，所述衍生化反应包括如下步骤：

S1、将已稀释的对照品溶液中加入EDC溶液和HOAT溶液混合，获得反应底物溶液；

S2、向反应底物溶液中加入¹³C标记的丹磺酰肼溶液，涡旋混合并以水浴条件孵育，待孵育完成后再加入无水氯化铜溶液，以水浴条件孵育，待孵育完成后获得衍生化产物溶液；

S3、将衍生化产物溶液以25％乙腈涡旋混合，制得同位素内标溶液。

7.根据权利要求1所述靶向测定生物样本中短链脂肪酸的检测方法，其特征在于，在S6中，所述UHPLC-MS/MS分析中，色谱柱的填料粒径小于5μm。

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