CN102636610A - 一种水环境中雌激素结合体的共检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种水环境中内分泌干扰物的检测技术，特别是涉及一种采用液相色谱-串联质谱联用技术对水体样品中雌激素结合体雌酮硫酸盐结合体(Estrone-3-sulfate，E1-3S)、17β-雌二醇硫酸盐结合体(Estradiol-3-sulfate，E2-3S)及雌酮葡萄糖苷酸结合体(Estrone-3-glucuronide，E1-3G)、17β-雌二醇葡萄糖苷酸结合体(Estradiol-3-glucuronide，E2-3G)的共检测方法。本方法将采集好的水体样品，采用HLB固相萃取小柱富集其中的E1-3S、E2-3S及E1-3G、E2-3G，再将活化好的NH2柱接于HLB柱下方，用甲醇淋洗，最后用2％氨水甲醇溶液洗脱，利用液相色谱-串联质谱联用分析。该方法环境友好、易于操作、且回收率较高，能够快速分析水体样品中痕量存在的雌激素结合体E1-3S、E2-3S及E1-3G、E2-3G。

Description

一种水环境中雌激素结合体的共检测方法

技术领域

本发明涉及一种水环境中有机污染物的检测技术领域，特别是涉及自然水体样品中痕量天然雌激素结合体的提取、净化和仪器检测方法。

背景技术

由人或哺乳动物卵巢分泌的天然雌激素雌酮(Estrone，E1)、17β-雌二醇(17β-Estradiol，E2)、雌三醇(Estriol，E3)和人工合成雌激素乙炔基雌二醇(17α-Ethinyl Estradiol，EE2)是最具潜在雌性化风险的内分泌干扰物(Endocrine Disrupting Compounds，EDCs)，在水环境中ng/L浓度水平就会导致鱼类的雌性化。雌激素排出时其雌激素分子结构中C3-或者C7-位置的羟基多被硫酸盐或者葡萄糖醛酸所取代，转变成为无雌激素活性的结合体结构，但在水体或污水处理厂生物酶的作用下，会转化为其单体结构，恢复雌激素活性。

近十年来雌激素作为典型的内分泌干扰物受到广泛关注。欧美等国对多家污水处理厂雌激素浓度及去除效率的调查结果显示，在污水处理厂出水及受纳水体中残留着ng/L浓度水平的雌激素。目前，国内外关注自然水体、土壤中雌激素单体的研究比较多，对于环境介质中雌激素结合体的调查研究相对较少，这也包括水环境中雌激素结合体的相关研究。这很大原因归结为水环境中雌激素结合体痕量存在，易受水体基质影响。因次，建立回收率高、重现性好的水环境中天然雌激素结合体分析方法，是进一步研究环境介质中雌激素迁移转化的前提条件。

近年来，痕量有机物的仪器检测技术有了很大的提高，如气相色谱-质谱联用(GC/MS)、气相色谱-串联质谱联用(GC/MS/MS)、液相色谱-质谱联用(LC/MS)、液相色谱-串联质谱联用(LC/MS/MS)等，具有较高的灵敏度和精确度。然而，对于实际环境样品，比如自然水体样品，由于基质干扰作用，使分析方法的准确性和精密性大大降低。因此，如何将水环境中痕量存在的雌激素结合体富集并进行适当净化，成了水环境中雌激素结合体分析的一个瓶颈。

发明内容

本发明的目的是针对水环境中雌激素结合体痕量存在、基质干扰大、前处理技术难度大等问题，拟开发一种回收率高、灵敏度高、准确、快速的分析技术，实现对水环境样品中四种雌激素结合体雌酮硫酸盐结合体(Estrone-3-sulfate，E1-3S)、17β-雌二醇硫酸盐结合体(Estradiol-3-sulfate，E2-3S)及雌酮葡萄糖苷酸结合体(Estrone-3-glucuronide，E1-3G)、17β-雌二醇葡萄糖苷酸结合体(Estradiol-3-glucuronide，E2-3G)的定量测定。

本发明的技术方案如下：

一种检测水环境样品中痕量存在的雌酮硫酸盐结合体(E1-3S)、17β-雌二醇硫酸盐结合体(E2-3S)及雌酮葡萄糖苷酸结合体(E1-3G)、17β-雌二醇葡萄糖苷酸结合体(E2-3G)的定量测定方法。附图1为分析方法具体步骤，其特征在于该方法包括如下部分：

(1)HLB柱富集

水样采用GF/F玻璃纤维滤膜进行过滤，并用盐酸调节pH为3；利用固相萃取装置活化Waters公司的HLB固相萃取柱(200mg，6cc)，活化的顺序为：5mL色谱纯乙酸乙酯、5mL色谱纯甲醇及10mL超纯水，流速为1mL/min；采用已活化的固相萃取柱对水样进行固相萃取富集，控制流速为3mL/min；萃取结束后真空抽干5min，待净化。

(2)NH2柱净化

将用5mL甲醇活化过的Waters公司的NH2柱(500mg，6cc)用固相萃取柱转接头接于干燥的HLB柱下方，接着用6mL甲醇淋洗HLB柱和NH2柱串联装置，去除基质干扰，再用6mL 2％氨水甲醇溶液洗脱NH2柱上的雌激素结合体，洗脱液收集于10mL玻璃离心管中，控制流速为1mL/min，洗脱液在氮气流下缓慢吹干，加入1mL乙腈/水(1/1，v/v)混合液，漩涡混合，冷藏等待浓度测定。

(3)利用液相色谱-串联质谱分析雌激素结合体

液相色谱-串联质谱联用仪器为：Agilent 1100高效液相色谱系统，包括四元输液泵，美国Agilent公司的自动进样器，3200QTRAP型液相色谱/串联质谱仪，配有电喷雾离子化源(ESI)以及Analyst 1.4.1数据处理软件；

色谱柱：Nova-Pak C18(3.9mm×150mm×4μm)，Waters公司；离子源：电喷雾离子化源(ESI)，负离子方式检测；离子喷射电压：-4500V；温度：450℃；源内气体1(GS1，N₂)压力：45psi；源内气体2(GS2，N₂)压力：45psi；气帘气体(N₂)压力：20psi；扫描方式为多重反应监测(MRM)；碰撞气(N₂)压力：Medium。雌酮硫酸盐结合体(E1-3S)、17β-雌二醇硫酸盐结合体(E2-3S)及雌酮葡萄糖苷酸结合体(E1-3G)、17β-雌二醇葡萄糖苷酸结合体(E2-3G)进行分离的HPLC流动相梯度洗脱条件详见表1和表2。

表1  测定雌酮硫酸盐结合体(E1-3S)和17β-雌二醇硫酸盐结合体(E2-3S)流动相梯度洗脱条件

表2  测定雌酮葡萄糖苷酸结合体(E1-3G)和17β-雌二醇葡萄糖苷酸结合体(E2-3G)流动相梯度洗脱条件

(4)标准曲线的绘制，以外标法进行定量测定

所述的外标法标准曲线的绘制：利用分析天平准确称量4种雌激素结合体，溶于色谱纯乙腈内，配置成系列浓度的标准溶液，采用液相色谱-串联质谱联用进行分析，分别以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行回归，得到标准曲线，用于测定样品中分析物的量。

(5)样品及回收率的测定

采集自然水体样品，按步骤1对水样中的雌激素结合体进行富集，再按步骤2进行提取物的净化，然后用液相色谱-串联质谱联用检测，并与步骤4得到的标准曲线比较，通过换算最终得到待测自然水体样品中雌激素结合体E1-3S、E2-3S及E1-3G、E2-3G的含量。

采用同样的水体样品，按10ng/L的添加量加入标准溶液，进行上述预处理并测定四种雌激素结合体含量，按照下式进行回收率计算：

$R=\frac{C-C_0}{10}\×100\%---\left(1\right)$

R-回收率，％；

C-添加标准溶液水体样品的雌激素结合体含量，ng/L；

C₀-未添加标准溶液水体样品的雌激素结合体含量，ng/L。

本发明所述的雌激素结合体为雌酮硫酸盐结合体(E1-3S)、17β-雌二醇硫酸盐结合体(E2-3S)及雌酮葡萄糖苷酸结合体(E1-3G)、17β-雌二醇葡萄糖苷酸结合体(E2-3G)。

本发明的有益效果是采用HLB柱进行富集，再用NH2柱进行净化，最后采用液相色谱-串联质谱联用进行检测，检测限低，具有较高的灵敏度和精确度。本发明提供一种检测限低、重现性好、灵敏度高、回收率较好、操作简单易行的分析方法，能够快速分析水环境样品中雌激素结合体的含量。本方法的回收率与最低检测限，如表3所示

表3  本方法的回收率和最低检测限

本发明中相对于现有技术增加了NH2柱净化步骤，能够对HLB柱富集后的样品进一步进行净化，适合河流、甚至污水样品中雌激素结合体的测定分析。而对于现有技术中测定样品是土壤或沉积物介质，其样品性质和前处理方式均有所不同。

另外，为了保证NH2柱对样品较好的回收率，本发明对洗脱溶剂进行了优化，改用2％氨水甲醇溶液(v/v)，增大了洗脱溶剂的极性，保证四种结合体E1-3S、E2-3S及E1-3G、E2-3G充分的洗脱下来。

附图说明

图1为水环境中雌激素结合体分析方法的流程示意图

图2为雌激素结合体E1-3S、E2-3S及E1-3G、E2-3G的标准曲线

图3为标准样品及实际样品的色谱图

其中，左侧为50μg/L标准谱图，右侧为实际样品谱图

依次为雌激素结合体E1-3S(m/z＝349/269；5.02min)、E2-3S(m/z＝351/271；4.96min)及E1-3G(m/z＝445/269；4.83min)、E2-3G(m/z＝447/271；4.74min)

具体实施方式

下面结合实例及附图对本发明的技术方案作进一步的描述

(1)HLB柱富集

取4L水样采用GF/F玻璃纤维滤膜进行过滤，并用4mol/L的盐酸调节pH为3；利用固相萃取装置活化Waters公司的HLB固相萃取柱(200mg，6cc)，活化的顺序为：5mL色谱纯乙酸乙酯、5mL色谱纯甲醇及10mL超纯水，流速为1mL/min；采用已活化的固相萃取柱对该混合液进行固相萃取富集，控制流速为3mL/min；萃取结束后真空抽干5min，待净化。

(2)NH2柱净化

将用5mL甲醇活化过的Waters公司的NH2柱(500mg，6cc)用固相萃取柱转接头接于干燥的HLB柱下方，接着用6mL甲醇淋洗HLB柱和NH2柱串联装置，去除基质干扰，再用6mL 2％氨水甲醇溶液(v/v)洗脱雌激素结合体，洗脱液收集于10mL玻璃离心管中，控制流速为1mL/min，洗脱液在氮气流下缓慢吹干，加入1mL乙腈/水(1/1，v/v)混合液，漩涡混合，冷藏等待浓度测定。

(3)利用液相色谱-串联质谱联用分析雌激素结合体浓度

液相色谱-串联质谱联用仪器为：Agilent 1100高效液相色谱系统，包括四元输液泵，美国Agilent公司的自动进样器，3200QTRAP型液相色谱/串联质谱仪，配有电喷雾离子化源(ESI)以及Analyst 1.4.1数据处理软件；

色谱柱：Nova-Pak C18(3.9mm×150mm×4μm)，Waters公司；离子源：电喷雾离子化源(ESI)，负离子方式检测；离子喷射电压：-4500V；温度：450℃；源内气体1(GS1，N₂)压力：45psi；源内气体2(GS2，N₂)压力：45psi；气帘气体(N₂)压力：20psi；扫描方式为多重反应监测(MRM)；碰撞气(N₂)压力：Medium。雌激素硫酸盐结合体和葡萄糖醛酸结合体的HPLC流动相梯度洗脱条件详见表1和表2。

液相色谱-串联质谱联用对E1-3S、E2-3S及E1-3G、E2-3G的定量检测限(S/N＝10)为分别为200ng/L、200ng/L、400ng/L和400ng/L，换算至分析方法定量限为0.05ng/L、0.05ng/L、0.1ng/L和0.1ng/L。

(4)标准曲线的绘制，以外标法进行定量测定

所述的外标法标准曲线的绘制：利用分析天平准确称量4种雌激素结合体，溶于色谱纯乙腈内，配置成系列浓度的标准溶液，采用液相色谱-串联质谱联用进行分析，分别以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，得到标准曲线，用于测定样品中分析物的量。

(5)样品回收率的测定

采集待测水体样品，按步骤1对样品进行提取，再按步骤2进行净化，最后按步骤3用液相色谱-串联质谱联用检测，并与上述得到的标准曲线比较，通过换算最终得到待测水样中雌激素结合体的背景值。

采用同样的水样，按10ng/L的添加量加入雌激素结合体标准溶液，进行预处理并测定雌激素结合体的含量，扣除背景值后进行回收率计算。

利用本发明检测某河流水体样品中雌激素结合体E1-3S、E2-3S及E1-3G、E2-3G的实施过程：

采集某河流水体样品，迅速装入洗净的4L棕色采样瓶中并放入带有冰块的保温箱内(＜4℃)，带回实验室，按步骤1对样品进行提取，再按步骤2进行净化，最后按步骤3用液相色谱-串联质谱联用检测，并与标准曲线比较，通过换算最终得到待测样品中雌激素结合体的含量。

表3实际河流水体样品中雌激素结合体的含量(ng/L)

注：n.d.表示未检出。

Claims (2)

1.一种水环境中雌激素结合体的共检测方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

(1)水环境样品前处理

取4L水样采用GF/F玻璃纤维滤膜进行过滤，并用4mol/L的盐酸调节pH为3；利用固相萃取装置活化Waters公司的HLB固相萃取柱，活化的顺序为：5mL色谱纯乙酸乙酯、5mL色谱纯甲醇及10mL超纯水，流速为1mL/min；采用已活化的固相萃取柱对水样进行固相萃取富集，控制流速为3mL/min；萃取结束后真空抽干5min，待净化；将用5mL甲醇活化过的Waters公司的NH2柱用固相萃取柱转接头接于干燥的HLB柱下方，接着用6mL甲醇淋洗HLB柱和NH2柱串联装置，再用6mL 2％氨水甲醇溶液(v/v)洗脱NH2柱上的雌激素结合体，洗脱液收集于10mL玻璃离心管中，控制流速为1mL/min，洗脱液在氮气流下缓慢吹干，加入1mL乙腈/水(1/1，v/v)混合液，漩涡混合，冷藏等待浓度测定；

(2)利用液相色谱-串联质谱分析雌激素结合体

液相色谱-串联质谱联用仪器为：Agilent 1100高效液相色谱系统，包括四元输液泵，美国Agilent公司的自动进样器，3200QTRAP型液相色谱/串联质谱仪，配有电喷雾离子化源(ESI)以及Analyst 1.4.1数据处理软件；

色谱柱：Nova-Pak C18(3.9mm×150mm×4μm)，Waters公司；离子源：电喷雾离子化源(ESI)，负离子方式检测；离子喷射电压：-4500V；温度：450℃；源内气体1(GS1，N₂)压力：45psi；源内气体2(GS2，N₂)压力：45psi；气帘气体(N₂)压力：20psi；扫描方式为多重反应监测(MRM)；碰撞气(N₂)压力：Medium；雌酮硫酸盐结合体(Estrone-3-sulfate，E1-3S)、17β-雌二醇硫酸盐结合体(Estradiol-3-sulfate，E2-3S)及雌酮葡萄糖苷酸结合体(Estrone-3-glucuronide，E1-3G)、17β-雌二醇葡萄糖苷酸结合体(Estradiol-3-glucuronide，E2-3G)进行分离的HPLC流动相梯度洗脱条件如表1和表2所示：

表1  测定雌酮硫酸盐结合体(E1-3S)和17β-雌二醇硫酸盐结合体(E2-3S)流动相梯度洗脱条件

表2  测定雌酮葡萄糖苷酸结合体(E1-3G)和17β-雌二醇葡萄糖苷酸结合体(E2-3G)流动相梯度洗脱条件

(3)标准曲线的绘制

以外标法进 行定量测定；

(4)样品的测定

采集待测水样，按步骤(1)对水环境样品进行预处理，再按步骤(2)进行液相色谱-串联质谱联用检测，并与步骤(3)得到的标准曲线比较，通过换算最终得到待测水体样品中雌激素的含量。

2.根据权利要求1所述的水环境中雌激素结合体的共检测方法，其中：所述雌激素结合体为雌酮硫酸盐结合体(Estrone-3-sulfate，E1-3S)、17β-雌二醇硫酸盐结合体(Estradiol-3-sulfate，E2-3S)及雌酮葡萄糖苷酸结合体(Estrone-3-glucuronide，E1-3G)、17β-雌二醇葡萄糖苷酸结合体(Estradiol-3-glucuronide，E2-3G)。

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