JP2023525915A - 質量分析のための試薬 - Google Patents

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Abstract

本発明は、質量分析で使用するのに適した化合物と、該化合物を用いる分析物分子の質量分析による決定の方法と、に関する。

Description

発明の分野
本発明は、質量分析に使用するのに適した化合物、該化合物を含む組成物、該組成物及び／又は化合物並びに複合体を含むキットに関する。さらに、本発明は、該化合物を使用する分析物の質量分析による決定方法に関する。
発明の背景
質量分析（ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ＭＳ）は、小分子から高分子にわたる化学物質の定性及び定量分析に広く使用されている技術である。概してこれは非常に高感度で特異的な方法であり、複雑な生物学的試料、例えば環境又は臨床試料の分析さえ可能である。しかしながら、いくつかの分析物、特に血清のように複雑な生物学的マトリックスから分析した場合、測定の感度は問題のままである。
多くの場合、ＭＳは、クロマトグラフィ技術、特にガス及び液体クロマトグラフィ、例えばＨＰＬＣと組み合わされる。ここで、分析された目的の分子（分析物）は、クロマトグラフィによって分離され、個別に質量分光分析に供される（Ｈｉｇａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｊ．ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ １３０ ｐ．１８１－１９０）。
しかしながら、ＭＳ分析法、特に存在量が少ないか又は利用可能な材料が少ない（生検組織など）場合の分析物の分析の感度を高める必要性が、依然として存在する。
当該技術分野では、これらの分析物の測定の感度を改善することを目的とするいくつかの誘導体化試薬（化合物）が知られている。とりわけ、単一の機能ユニットで組み合わされた荷電ユニット及びニュートラル・ロス・ユニットを含む試薬（例えば、国際公開第２０１１／０９１４３６号）。別個のユニットを含む他の試薬は構造的に比較的大きく、試料調製及びＭＳ測定の一般的なワークフローに影響を及ぼす（Ｒａｈｉｍｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３９（３０），ｐ．１０３５９－１０３６４）。既知の誘導体化試薬は、例えば、塩化ダンシル、ＲａｐｉＦｌｕｏｒ－ＭＳ（ＲＦＭＳ）、Ｃｏｏｋｓｏｎ型試薬、Ａｍｐｌｉｆｅｘ Ｄｉｅｎｅ、Ａｍｐｌｉｆｅｘ Ｋｅｔｏ、Ｇｉｒａｒｄ Ｔ、Ｇｉｒａｒｄ Ｐ及びピリジルアミンである（Ｈｏｎｇ ａｎｄ Ｗａｎｇ，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．，２００７，７９（１）：３２２－３２６；Ｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｒｏｉｄｓ，２０１６ Ｄｅｃ，１１６：６０－６６；Ｆｒａｎｃｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ，２００５，３９（３－４），４１１－４１７；Ａｌｌｅｙ Ｗｉｌｌｉａｍ，２８ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，Ｎｅｗ Ｏｒｌｅａｎｓ，ＬＡ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ，Ｊｕｌｙ １７－２１（２０１６），ＩＣＳ－２０９）。他には、目的の分析物に永久電荷（正又は負）を設置する方法が記載されており、これにより、分析物は既にイオン化されていることが可能になり、したがって、イオン源内（そのほとんどが分析物損失発生部分である）のイオン化工程を回避することができる。これら全ては、しばしば、不充分な標識効率、カップリング化学に起因する構造異性体の生成、非最適イオン化効率、カップリング後のクロマトグラフ分離に対する不利益、多くのフラグメンテーション経路に起因する非最適フラグメンテーション挙動、及び高い衝突エネルギーの必要性に起因するに起因する不利益を有する。
したがって、ＭＳ測定ワークフローに悪影響を及ぼさない化学構造を示すだけでなく、複雑な生物学的マトリックスからの分析物の高感度検出を可能にする誘導体化試薬が当該技術分野で早急に必要とされている。これは、異なる化学的特性を呈するいくつかの異なる分析物を短時間で測定しなければならない、ランダムアクセス、ハイスループットＭＳセットアップにおいて特に重要である。
本発明は、生体試料中のステロイド、タンパク質、及び他の種類の分析物といった分析物分子の高感度定量を可能にする新規の試薬／化合物に関する。試薬は、特定の分析物の測定で生じる特定の必要性のため、又は特定のワークフロー適応のために個々の適応を可能にするようなモジュール方式で設計される。
本発明の目的は、質量分析による分析物の効率的な検出のための、化合物、該化合物をそれぞれが含むキット及び組成物を提供することである。さらに、本発明の目的は、分析物の質量分析による決定のための複合体及び方法を提供することである。
この目的（複数可）は、独立請求項の主題によって解決される。さらなる実施形態は、従属請求項の対象となる。
発明の概要
以下において、本発明は以下の態様に関する：
第１の態様では、本発明は、質量分析による決定を使用する分析物の定量的検出のための化合物に関し、
当該化合物は、永久電荷、特に永久正味電荷を含んでおり、分析物に共有結合することが可能であり、
当該化合物は、質量ｍ１及び正味電荷ｚ１を有し、
化合物は、質量分析による決定によるフラグメンテーション後に、質量ｍ２＜ｍ１及び正味電荷ｚ２＜ｚ１を有する少なくとも１つの娘イオンを形成することが可能であり、
ｍ１／ｚ１＜ｍ２／ｚ２である。
第２の態様では、本発明は、本発明の第１の態様の化合物を含む組成物に関する。
第３の態様では、本発明は、本発明の第１の態様の化合物又は本発明の第２の態様の組成物を含むキットに関する。
第４の態様では、本発明は、質量分析による決定を使用する分析物の定量的検出のための複合体に関し、
複合体は、互いに共有結合した分析物と化合物とによって形成され、複合体は、永久電荷、特に永久正味電荷を含み、
当該複合体は、質量ｍ３及び正味電荷ｚ３を有し、
複合体は、質量分析による決定によるフラグメンテーション後に、質量ｍ４＜ｍ３及び正味電荷ｚ４＜ｚ３を有する少なくとも１つの娘イオンを形成することが可能であり、
ｍ３／ｚ３＜ｍ４／ｚ４である。
第５の態様では、本発明は、分析物の質量分析による決定のための本発明の第１の態様の化合物の使用に関する。
第６の態様では、本発明は、分析物の質量分析による決定のための方法に関し、
（ａ）分析物を本発明の第１の態様の化合物と反応させる工程であって、それにより、本発明の第４の態様の複合体が形成される、分析物を本発明の第１の態様の化合物と反応させる工程と、
（ｂ）工程（ａ）からの複合体を質量分光分析に供することと
を含む。
ＭＳスペクトルの概略図（強度（％）対ｍ／ｚ）を示す：本発明の化合物又は複合体、特に、前駆体及びフラグメンテーションの１回（単一）荷電分析物に対する、２回荷電標識分析物を含む複合体のフラグメンテーション挙動を記載している。複数の電荷は、結果として生じる正味電荷のそれぞれであり得、又はそれぞれである。 ＭＳスペクトルの概略図（強度（％）対ｍ／ｚ）を示す：＋／－０．５ダルトン・ウインドウ（ウインドウは２つの破線の間に表されている）で１回荷電した比較化合物のフラグメンテーション挙動を記載している。 ＭＳスペクトルの概略図（強度（％）対ｍ／ｚ）を示す：＋／－０．５ダルトン・ウインドウ（ウインドウは２つの破線の間に表されている）で２回荷電した本発明の化合物又は複合体のフラグメンテーション挙動を記載している。 図４Ａ～図４Ｅは、標識された２回荷電エストラジオールを含む複合体の定量下限（ＬＬＯＱ）を示す。図４Ａは、複合体（標識６とコンジュゲートしたエストラジオール）の構造を示す。図４Ｂは、それぞれの質量遷移（強度（％）対保持時間）におけるＭＳブランククロマトグラムを示す。図４Ｃは、標識６とコンジュゲートしたエストラジオール（関連する０．５ｐｇ／ｍｌのエストラジオール）のそれぞれの質量遷移（強度（％）対保持時間）におけるクロマトグラムを示す。図４Ｄは、エストラジオールに関して０～０．０１ｎｇ／ｍｌの濃度範囲で標識６とコンジュゲートしたエストラジオールの検量線を示す。図４Ｅは、エストラジオールに関して標識６とコンジュゲートした０ｎｇ／ｍｌ～０．０５ｎｇ／ｍｌの範囲のエストラジオールの検量線のデータを示す。３回の個々の注入の絶対面積を示し、ＤＩＮ ３２６４５によるそれぞれの検出限界を報告する。ＮＧは検出限界を意味し、ＥＧは９５％の正確性を有する検出限界を意味し、ＢＧは定量限界（ＬＯＱ）を意味する。最良のモード／設定のためのネイティブ・エストラジオールのＬＬＯＱは、約５ｎｇ／ｍｌである。 図４Ａ～図４Ｅは、標識された２回荷電エストラジオールを含む複合体の定量下限（ＬＬＯＱ）を示す。図４Ａは、複合体（標識６とコンジュゲートしたエストラジオール）の構造を示す。図４Ｂは、それぞれの質量遷移（強度（％）対保持時間）におけるＭＳブランククロマトグラムを示す。図４Ｃは、標識６とコンジュゲートしたエストラジオール（関連する０．５ｐｇ／ｍｌのエストラジオール）のそれぞれの質量遷移（強度（％）対保持時間）におけるクロマトグラムを示す。図４Ｄは、エストラジオールに関して０～０．０１ｎｇ／ｍｌの濃度範囲で標識６とコンジュゲートしたエストラジオールの検量線を示す。図４Ｅは、エストラジオールに関して標識６とコンジュゲートした０ｎｇ／ｍｌ～０．０５ｎｇ／ｍｌの範囲のエストラジオールの検量線のデータを示す。３回の個々の注入の絶対面積を示し、ＤＩＮ ３２６４５によるそれぞれの検出限界を報告する。ＮＧは検出限界を意味し、ＥＧは９５％の正確性を有する検出限界を意味し、ＢＧは定量限界（ＬＯＱ）を意味する。最良のモード／設定のためのネイティブ・エストラジオールのＬＬＯＱは、約５ｎｇ／ｍｌである。 図４Ａ～図４Ｅは、標識された２回荷電エストラジオールを含む複合体の定量下限（ＬＬＯＱ）を示す。図４Ａは、複合体（標識６とコンジュゲートしたエストラジオール）の構造を示す。図４Ｂは、それぞれの質量遷移（強度（％）対保持時間）におけるＭＳブランククロマトグラムを示す。図４Ｃは、標識６とコンジュゲートしたエストラジオール（関連する０．５ｐｇ／ｍｌのエストラジオール）のそれぞれの質量遷移（強度（％）対保持時間）におけるクロマトグラムを示す。図４Ｄは、エストラジオールに関して０～０．０１ｎｇ／ｍｌの濃度範囲で標識６とコンジュゲートしたエストラジオールの検量線を示す。図４Ｅは、エストラジオールに関して標識６とコンジュゲートした０ｎｇ／ｍｌ～０．０５ｎｇ／ｍｌの範囲のエストラジオールの検量線のデータを示す。３回の個々の注入の絶対面積を示し、ＤＩＮ ３２６４５によるそれぞれの検出限界を報告する。ＮＧは検出限界を意味し、ＥＧは９５％の正確性を有する検出限界を意味し、ＢＧは定量限界（ＬＯＱ）を意味する。最良のモード／設定のためのネイティブ・エストラジオールのＬＬＯＱは、約５ｎｇ／ｍｌである。 図５ａ～図５ｃは、ブランク注入のＭＳクロマトグラム、並びに、ＲＨＡ１３９Ｆ２、ＲＨＡ１７１Ｆ２及び標識６とコンジュゲートしたエストラジオールの（３つの実施形態の強度（％）対保持時間）のそれぞれの質量遷移の図をそれぞれ示す。 結合分析物としてのエストラジオール又はそのフラグメントと、本発明による結合化合物としての標識６とコンジュゲートしたエストラジオール又はそのフラグメントとを含む、２回正に荷電した複合体のＭＳスペクトル（強度（％）対ｍ／ｚ）の図である。 ピーク「分割」の概略図を示す。分析物分子の誘導体化反応から生じる異なる異性体を互いに分離するクロマトグラフィシステムの能力を説明している。 非誘導体化分析物と比較して、増強係数を決定するワークフローの概略図を示す。 図９Ａ及び９Ｂは、二重荷電化合物／誘導体又はその複合体に対するＴＦＡによるシグナル消光効果を示す。 図１０Ａ～図１０Ｄは、化合物及び／又は複合体のフラグメンテーションのパターンのＭＳスペクトル（強度（％）対ｍ／ｚ）を示す。 図１０Ａ～図１０Ｄは、化合物及び／又は複合体のフラグメンテーションのパターンのＭＳスペクトル（強度（％）対ｍ／ｚ）を示す。 図１０Ａ～図１０Ｄは、化合物及び／又は複合体のフラグメンテーションのパターンのＭＳスペクトル（強度（％）対ｍ／ｚ）を示す。 図１０Ａ～図１０Ｄは、化合物及び／又は複合体のフラグメンテーションのパターンのＭＳスペクトル（強度（％）対ｍ／ｚ）を示す。 図１１は、化合物及び／又は複合体のフラグメンテーションのパターンのＭＳスペクトル（強度（％）対ｍ／ｚ）を示す。
発明の詳細な説明
本発明を以下に詳細に説明する前に、本発明は、本明細書に記載される特定の実施形態及び実施例に限定されず、これらは変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図しないことも理解されるべきである。別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当該技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。
いくつかの文献が本明細書中で引用されている。本明細書に引用されている各文献（全ての特許、特許出願、科学出版物、製造者の仕様書、説明書等を含む）は、上記であろうと以下であろうと、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。このように組み込まれた参照の定義又は教示と、本明細書に引用された定義又は教示との間に矛盾がある場合には、本明細書の本文が優先する。
以下、本発明の各要素について説明する。これらの要素は特定の実施形態と共に列挙されているが、これらは任意の方法及び任意の数で組み合わせて追加の実施形態を作成することができることを理解されたい。種々の説明された実施例及び好ましい実施形態は、本発明を明示的に説明された実施形態のみに限定するように解釈されるべきではない。この記載は、明示的に記載された実施形態を任意の数の開示、及び／又は好ましい要素と組み合わせる実施形態を支持し、かつ包含するものと理解されるべきである。さらに、本出願に記載されている全ての要素の任意の順列及び組み合わせは、文脈が別段の意味を示さない限り、本出願の説明によって開示されていると考えるべきである。
定義
単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、並びに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のような変形は、記載された整数若しくは工程又は整数若しくは工程のグループの包含を意味するが、いかなる他の整数若しくは工程又は整数若しくは工程のグループの除外を意味しないことが理解されよう。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、別途内容が明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。
比率、濃度、量、及び他の数値データは、「範囲」の形式で本明細書に表す又は提示することができる。このような範囲の形式は、便宜上及び簡潔にするために単に使用されているに過ぎないことが理解され、したがって、その範囲の境界として明示的に列挙されている数値を含むだけではなく、各数値及び部分範囲があたかも明示的に列挙されているかのごとく、その範囲内に包含される個々の数値又は部分範囲の全てを含むことを柔軟に解釈するべきである。例示として、「４％～２０％」の数値範囲は、４％～２０％という明示的に列挙されている値を含むだけではなく、表示されている範囲内の個々の値及び部分範囲を含むと解釈されるべきである。したがって、この数値範囲には、４、５、６、７、８、９、１０、．．．１８、１９、２０％等の個々の値と、４～１０％、５～１５％、１０～２０％等のサブレンジとが含まれる。この同じ原理は、最小値又は最大値を列挙する範囲に適用される。さらに、このような解釈は、その範囲の幅又は記載されている特性にかかわらず、適用すべきである。
「約」という用語は、数値に関連して使用される場合、示された数値よりも５％小さい下限値を有し、かつ示された数値よりも５％大きい上限値を有する範囲内の数値を包含することを意味する。
本発明の文脈において、用語「化合物」とは、特定の化学構造を有する化学物質を指す。該化合物は、１つ又は複数の反応性基を含み得る。各反応性基は異なる機能を実行することができ、２つ以上の反応性基が同じ機能を実行することができる。反応性基は、反応性ユニット、荷電ユニット、及びニュートラル・ロス・ユニットを含むが、これらに限定されない。本発明の文脈において、「結合化合物」という用語は、分析物に結合される該化合物を指す。原則として、化合物と結合化合物は同一であり得る。化合物及び結合化合物は、実質的に同一であり得る。実質的に同一とは、反応性ユニットＫの構造及び／又はカップリング基Ｑの構造が互いに異なることを除いて、両方の化合物が同一の化学構造を有することを意味し得る。好ましくは、化合物は、分析物への結合を形成することができるが、まだ分析物に結合していない。結合化合物は、分析物に結合される。
「質量分析」（「Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃ」若しくは「ＭＳ」）又は「質量分析による決定」若しくは「質量分光分析」という用語は、化合物をその質量によって同定するために使用される分析技術に関する。ＭＳは、その質量電荷比又は「ｍ／ｚ」に基づいてイオンをフィルタにかける、検出する、及び測定する方法である。ＭＳ技術は、概して、（１）化合物をイオン化して荷電化合物を形成すること；及び、（２）荷電化合物の分子量を検出し、質量電荷比を計算することを含む。化合物は、任意の好適な手段によってイオン化されて、検出され得る。「質量分析計」は、一般に、イオン化装置及びイオン検出器を含む。一般に、１つ以上の目的の分子がイオン化されて、続いて、このイオンは、質量分析機器に導入されて、この機器において、磁場及び電場の組み合わせにより、イオンは、質量（「ｍ」）及び電荷（「ｚ」）に依存して空間の経路をたどる。「イオン化」又は「イオン化する」という用語は、１つ以上のユニットに等しい正味の電荷を有する分析物のイオンを発生させるプロセスを指す。陰イオンは、１つ以上の単位の正味の負電荷を有するものである一方、陽イオンは、１つ以上のユニットの正味の正電荷を有するものである。ＭＳ法は、ネガティブイオンを発生させ検出する「ネガティブ・イオン・モード」、又はポジティブイオンを発生させ検出する「ポジティブ・イオン・モード」のいずれかで実施することができる。「質量分析による決定によるフラグメンテーション後」は、例えば、化合物、組成物又は複合体が質量分析計を通過し、フラグメント化されたことを意味し得る。
「タンデム質量分析」又は「ＭＳ／ＭＳ」は、分析物のフラグメンテーションが段階間で生じる、質量分析の選択の複数工程を含む。タンデム質量分析計では、イオンをイオン源で生成し、質量分析の第一段階（ＭＳ１）で質量電荷比により分離する。特定の質量電荷比（前駆イオン又は親イオン）のイオンが選択され、フラグメントイオン（娘イオン）が、衝突誘起解離、イオン分子反応、又は光解離によって生成される。次いで、得られたイオンを分離し、質量分析の第二段階（ＭＳ２）で検出する。
質量分析計は、わずかに異なる質量のイオンを分離して検出するので、所与の元素からなる異なる同位体を容易に区別する。したがって、質量分析は、以下に限定されないが、低分子量の分析物、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を含めた、分析物の正確な質量決定及び特徴付けにとって重要な方法である。その用途は、タンパク質及びその翻訳後修飾の同定、タンパク質複合体、そのサブユニット及び機能的相互作用の解明、並びにプロテオミクスにおけるタンパク質の全測定を含む。質量分析によるペプチド又はタンパク質のデノボ配列決定は、通常、アミノ酸配列のこれまでの知識なしに行うことができる。
ＭＳにおけるほとんどの試料ワークフローは、さらに、試料調製、及び／又は濃縮工程を含む。ここで、例えば目的の分析物は、ガス又は液体クロマトグラフィを用いてマトリックスから分離する。通常、質量分析測定の場合、以下の３つの工程が行われる：
１．目的の被分析物を含む試料が、通常は陽イオンとの複合体形成によって、多くの場合、陽イオンへのプロトン化によってイオン化される。イオン化源は、エレクトロスプレイイオン化（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ：ＥＳＩ）及び大気圧化学イオン化（ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ：ＡＰＣＩ）を含むが、これらに限定されない。
２．該イオンをその質量及び電荷に応じて分類し、分離する。高電場非対称波形イオン移動度分光分析（ＦＡＩＭＳ）をイオンフィルタとして使用することができる。
３．分離されたイオンを、例えば多重反応モード（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｏｄｅ：ＭＲＭ）で検出し、その結果をチャートに表示する。
「エレクトロスプレーイオン化」又は「ＥＳＩ」という用語は、溶液を長さの短いキャピラリー管に沿って通過させて、キャピラリー管の端部に高い正電位又は負電位を印加する、方法を指す。チューブの端に到達した溶液は、溶媒蒸気中の非常に小さな液滴のジェット又はスプレイへと気化（噴霧）される。液滴のこの霧は、エバポレーションチャンバーを通り、このチャンバーは、わずかに加熱されて、縮合を予防して溶媒をエバポレートする。液滴が小さくなるほど、同じ電荷間の自然な反発によってイオンと中性分子が放出されるまで、電気的な表面電荷密度が向上する。
「大気圧化学イオン化」又は「ＡＰＣＩ」という用語は、ＥＳＩに類似した質量分析法を指す。しかしながら、ＡＰＣＩは、大気圧のプラズマ内で起こるイオン分子反応によってイオンを生成する。プラズマは、スプレーキャピラリーと対電極との間の電気放電により維持される。次いで、イオンは、典型的には、差動的にポンピングされたスキマステージのセットを使用して質量分析器に抽出される。溶媒の除去を改善するために、乾燥及び予熱されたＮｉガスの対向流を使用してもよい。ＡＰＣＩにおける気相イオン化は、極性がより低い実体を分析するためにＥＳＩよりも有効となり得る。
「高電界非対称波形イオン移動度分光法（ＦＡＩＭＳ）」は、気相イオンを強電界及び弱電界での挙動によって分離する大気圧イオン移動度技術である。
「多重反応モード」又は「ＭＲＭ」は、前駆イオン及び１つ以上のフラグメントイオンが選択的に検出される、ＭＳ機器の検出モードである。
質量分析による決定は、ガスクロマトグラフィ（ＧＣ）、液体クロマトグラフィ（ＬＣ）、特にＨＰＬＣ、及び／又はイオン移動度に基づく分離技法等のクロマトグラフィ法を含めた追加の分析法と組み合わされてもよい。
本開示の文脈において、用語「分析物」、「分析物分子」、又は「目的の分析物」は、質量分析によって分析される化学種（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｐｅｃｉｓ）を相互交換的に参照して使用される。質量分析によって分析されるのに適した化学種（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｐｅｃｉｓ）、すなわち分析物は、核酸（例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｒＲＮＡ等）、アミノ酸、ペプチド、タンパク質（例えば、細胞表面受容体、細胞質タンパク質等）、代謝産物又はホルモン（例えば、テストステロン、エストロゲン、エストラジオール等）、脂肪酸、脂質、炭水化物、ステロイド、ケトステロイド、セコステロイド（例えば、ビタミンＤ）、別の分子のある特定の修飾を特徴とする分子（例えば、タンパク質上の糖部分又はホスホリル残基、ゲノムＤＮＡ上のメチル残基）、若しくは生物によって内在化されている物質（例えば、治療薬、依存性薬物、毒素等）、又はそのような物質の代謝産物を含むが、これらに限定されない、生存生物内に存在する任意の種類の分子であり得る。このような被分析物は、バイオマーカーとして役立つことがある。本発明の文脈において、用語「バイオマーカー」とは、生物学的システムの生物学的状態のインジケータとして使用される、上記システム内の物質を指す。本発明の文脈において、「結合分析物」という用語は、複合体を形成するために化合物に結合される該分析物を指す。原則として、分析物と結合分析物は同一であり得る。分析物及び結合分析物は、実質的に同一であり得る。実質的に同一とは、官能基の構造が互いに異なることを除いて、両方の分析物が同一の化学構造を有することを意味し得る。好ましくは、分析物は、化合物への結合を形成することができるが、まだ化合物に結合していない。結合分析物は、化合物に結合される。
「永久電荷」又は「永久に荷電した」という用語は、ユニットの電荷、例えば正又は負の電荷が、例えば、洗浄、希釈、濾過などによって容易に可逆的ではないという本開示の文脈で使用される。特に、これは、文脈において、永久電荷がそれらの非永久電荷と平衡状態にないことを意味する。永久電荷は共有結合形成によって形成され、これは高ｐＨ環境下及び低ｐＨ環境下でも安定である（例えば、正電荷ｐＨ＞１２及び負電荷ｐＨ＜１）。したがって、それぞれの永久に荷電した分子は、強塩基又は強酸のいずれかである。正電荷ｚ＝１の場合、永久電荷はｐＫｓ＞１２のｐＫｓ値を示し、負電荷ｚ＝－１の場合、ｐＫｓ＜１を示す。永久電荷は、例えば、共有結合の結果であり得る。可逆電荷（非永久電荷）は、例えば静電相互作用の永久電荷とは対照的な結果であり得る。本発明の化合物は、特にフラグメンテーション前に、正味電荷ｚ１を有する。フラグメンテーション後、化合物は、少なくとも１つの娘イオンに分割又は開裂され得る。娘イオンは正味電荷ｚ２を有し、それは正味電荷ｚ１より小さい（ｚ２＜ｚ１）。本発明の複合体は、特にフラグメンテーション前に、正味電荷ｚ３を有する。フラグメンテーション後、複合体は、正味電荷ｚ３よりも小さい正味電荷ｚ４（ｚ４＜ｚ３）を有する少なくとも１つの娘イオンに分割又は開裂され得る。少なくとも１つの娘イオンは、この文脈において、１つ以上の娘イオンがフラグメンテーション後に形成されることを意味し得る。１つの娘イオン及び他の娘イオンは、少なくともそれらの質量、電荷又は構造によって互いに区別される。本開示の文脈では、娘イオンの正味電荷ｚ２と化合物の正味電荷ｚ１とを比較することにより、正味電荷の絶対値は厳密である。例えば、化合物が二重の負の正味電荷ｚ１（ｚ１＝－２）を有し、娘イオンが１つの負の正味電荷ｚ２（ｚ２＝－１）を有する場合、正味電荷ｚ１（ｚ１＝２）の絶対値は正味電荷ｚ２（ｚ２＝１）の絶対値よりも大きいので、正味電荷ｚ２は正味電荷ｚ１よりも小さい（ｚ２＜ｚ１）。正味電荷ｚ１とｚ２とを比較することにより、合計値の代わりに正味電荷の絶対値が比較される。
本開示の文脈において、「永久電荷」又は「永久正味電荷」という用語は、偽分子イオン、例えば、［Ｍ＋Ｈ］＋又は［Ｍ－Ｈ］－又は［Ｍ＋Ｎａ＋］＋又は［Ｍ＋Ｃｌ－］－などを含まない。
「永久正味電荷」又は「正味電荷」という用語は、永久正味電荷が、イオン又は分子が有する全永久電荷である本開示の文脈で使用される。永久正味電荷は、次のように計算することができる：プロトンの数－電子の数＝永久正味電荷。永久正味電荷は、結合再編成によって分子内に荷電部分（ｃｈａｒｇｅｄ ｍｏｊｅｔｙ）を形成する原子の共有結合的な組み合わせとして見ることができ（例えば、四級窒素、テトラメチルアンモニウム）、正味電荷はまた、原子、例えば水素の付加又は引き抜きによって存在して、［Ｍ＋Ｈ］＋又は［Ｍ－Ｈ］－－からなる擬似分子イオンをもたらすことができる。例えば、化合物が２つの永久正電荷と１つの永久負電荷を有する場合、永久正味電荷は＋１である（２＊（＋１）＋（－１）＝（＋１））。
「当該化合物は、分析物に共有結合することが可能である」という用語は、化合物が分析物に結合するのに適していることを意味する。化合物と分析物との間の結合は共有結合性である。
「質量分析による決定を使用する分析物の定量的検出」という用語は、目的の分析物の量が質量分析によって測定又は決定されることを意味する。
「質量」という用語、例えば、ｍ１、ｍ２、ｍ３、ｍ４、又はｍｘ（ｘ＞４）は、原子質量、特に統一原子質量を表す。統一原子質量の単位はｕである。生物医学分野では、統一原子質量［ｕ］の代わりにダルトン［Ｄａ］を使用することができる。ダルトンはＳＩ単位ではない。ダルトンは、これらの単位間に変換係数がないという点で、統一原子質量に相当する。「質量スペクトル」は、シグナル強度（縦座標）対ｍ／ｚ（横座標）の２次元表現である。シグナルと通常呼ばれるピークの位置は、イオン源内の化合物、分析物又はそれらの組み合わせ（複合体）から生成されたイオンのｍ／ｚを反映する。このピークの強度は、そのイオンの存在量と相関する。必ずしもそうとは限らないが、多くの場合、最高ｍ／ｚのピークは、無傷のイオン化分子、分子イオン、Ｍ＋の検出から生じる。分子イオンピークは、通常、化合物、分析物又は複合体のフラグメンテーションによって引き起こされるより低い又はより高いｍ／ｚのいくつかのピークを伴い、フラグメントイオンを生じる。したがって、質量スペクトルにおけるそれぞれのピークは、フラグメントイオンピーク又は娘イオンピークと称され得る。ｍ／ｚは定義上無次元である。
「フラグメンテーション」という用語は、化合物、分析物及び／又は複合体が、質量分析計のイオン化チャンバー内に化合物、分析物及び／又は複合体を通過させることによって解離し、イオン、例えば少なくとも１つの娘イオンを形成することを意味し得る。フラグメントは、質量スペクトルに固有のパターンを引き起こす。用語「フラグメンテーション」とは、単一の分子が２つ以上の別個の分子へと解離することを指すことができる。本明細書で使用される場合、フラグメンテーションという用語は、フラグメンテーションイベントが発生する親分子の破壊点が明確に定義され、フラグメンテーションイベントから生じる複数の娘分子が充分に特徴付けられる、特定のフラグメンテーションイベントを指す。親分子及び得られる複数の娘分子の破壊点を決定する方法は当業者に周知である。得られる娘分子は安定であり得るか、又は後続のフラグメンテーションイベントの際に解離し得る。例示すると、フラグメンテーションを受ける親分子がＮ－ベンジルピリジニウムユニットを含む場合、当業者は、分子の全体構造に基づいて、ピリジニウムユニットがフラグメンテーションしてベンジル実体を放出するか、又は親分子から完全に放出されるかを決定することができ、すなわち、得られた娘分子はベンジル分子及びベンジルを欠く親分子のいずれかである。フラグメンテーションは、衝突誘起解離（ＣＩＤ）、電子捕獲解離（ｅｌｅｃｔｒｏｎ－ｃａｐｔｕｒｅ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ：ＥＣＤ）、電子移動解離（ｅｌｅｃｔｒｏｎ－ｔｒａｎｓｆｅｒ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ：ＥＴＤ）、負電子移動解離（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｅｌｅｃｔｒｏｎ－ｔｒａｎｓｆｅｒ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ：ＮＥＴＤ）、電子脱離解離（ｅｌｅｃｔｒｏｎ－ｄｅｔａｃｈｍｅｎｔ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ：ＥＤＤ）、光解離、特に赤外多光子解離（ｉｎｆｒａｒｅｄ ｍｕｌｔｉｐｈｏｔｏｎ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ：ＩＲＭＰＤ）及び黒体赤外放射解離（ｂｌａｃｋｂｏｄｙ ｉｎｆｒａｒｅｄ ｒａｄｉａｔｉｖｅ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ：ＢＩＲＤ）、表面誘起解離（ｓｕｒｆａｃｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ：ＳＩＤ）、高エネルギーＣトラップ解離（Ｈｉｇｈｅｒ－ｅｎｅｒｇｙ Ｃ－ｔｒａｐ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ：ＨＣＤ）、チャージ・リモート・フラグメンテーションを介して生じ得る。
用語「ｍ１／ｚ１＜ｍ２／ｚ２」とは、化合物の質量電荷比（ｍ１／ｚ１）が、化合物の少なくとも１つ又は正確に１つの娘イオンの質量電荷比（ｍ２／ｚ２）よりも小さいことを意味する。
用語「ｍ３／ｚ３＜ｍ４／ｚ４」とは、複合体の質量電荷比（ｍ３／ｚ３）が、複合体の少なくとも１つ又は正確に１つの娘イオンの質量電荷比（ｍ４／ｚ４）よりも小さいことを意味する。
用語「検出限界」又は「ＬＯＤ」とは、生物学分析法が分析物をバックグラウンドノイズから確実に区別することができる、分析物の最低濃度である。
用語「シグナル対ノイズ比」又はＳ／Ｎとは、強度測定の不確実性を表し、ノイズに対するシグナルの強度の比を定量化することによってシグナルの品質の定量的尺度を提供する。
分析物は、目的の試料中、例えば、生体試料又は臨床試料中に存在することがある。「試料」又は「目的の試料」という用語は、本明細書において互換的に使用され、組織、器官若しくは個体の部分又は片を指し、通常、組織、器官又は個体の全体を表すことが意図されているこのような組織、器官又は個体よりも小さい。分析に際して、試料は、組織の状態、又は器官若しくは個体の健康若しくは疾患状態に関する情報をもたらす。試料の例は、以下に限定されないが、血液、血清、血漿、滑液、髄液、尿、唾液及びリンパ液等の液体試料、又は乾燥血液スポット及び組織抽出物等の固体試料を含む。試料の更なる例は、細胞培養物又は組織培養物である。
「共有結合（ｃｏｖａｌｅｎｔ ｂｏｎｄ）」又は「共有結合した（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」又は「共有結合した（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ ｂｏｎｄｅｄ）」は、原子又は分子間、例えば化合物と分析物との間の電子対の共有を含む少なくとも１つの化学結合である。
「ユニット」及び「部分」という用語は交換可能に使用することができ、例えば、Ｍｃ Ｌａｆｆｅｒｔｙフラグメンテーション部分及びＭｃＬａｆｆｅｒｔｙフラグメンテーションユニットは交換可能に使用することができる。
電荷の数値、例えば１、２、３、４、５又は６、例えばｚ１、ｚ２、ｚ３、ｚ４又はｚｘ（ｘ＞４）は、電荷の絶対値である。例えば、正味電荷ｚ１＝２は、正味電荷ｚ１が＋２であるか、又は正味電荷が－２であることを意味することができる。好ましくは、この場合の電荷は、正の数値、例えば２＝＋２である。
「化合物」及び「標識」という用語は互換的に使用することができる。
「化合物は更なる娘イオンを形成することが可能であり、更なる娘イオンの各々は化合物の１つのフラグメント又は化合物の複数のフラグメントを含む」という用語における「複数のフラグメント」という用語は、化合物が、１つのフラグメント又は互いに異なる若しくは互いに異なり得る１つよりも多くのフラグメントを含むことを意味する。特に、更なる娘イオンは、少なくともそれらの質量、電荷又は構造によって互いに区別される。
本開示の文脈において、試料は、「個体」又は「対象」に由来し得る。典型的には、対象は、哺乳動物である。哺乳動物としては、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及び非ヒト霊長類、例えば、サル）、ウサギ及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）が含まれるが、これらに限定されない。
質量分析による分析前に、試料は、試料及び／又は分析物に特有の方法で前処理されてもよい。本開示の文脈において、「前処理」という用語は、質量分析による所望の分析物の後の分析を可能にするために必要な任意の手段を指す。前処理手段としては、典型的には、固体試料の溶出（例えば、乾燥血液スポットの溶出）、全血試料への溶血試薬（ｈｅｍｏｌｉｚｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ：ＨＲ）の添加、及び尿試料への酵素試薬の添加が挙げられるが、これらに限定されない。また、試料の前処理として内部標準（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｓｔａｎｄａｒｄ：ＩＳＴＤ）の添加が考えられる。
用語「溶血試薬（ＨＲ）」とは、試料中に存在する細胞を溶解する試薬を指し、本発明の文脈においては、溶血試薬とは特に、全血試料中に存在する赤血球を含むがこれに限定されない、血液試料中に存在する細胞を溶解する試薬を指す。よく知られた溶血試薬は水（Ｈ２Ｏ）である。溶血試薬の更なる例としては、脱イオン水、高浸透圧の液体（例えば、８Ｍ尿素）、イオン性液体、及び異なる界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。
通常、内部標準（ＩＳＴＤ）は、質量スペクトル検出のワークフローに施すと、目的の分析物と類似の特性を示す、既知量の物質である（すなわち、任意の前処理、濃縮及び実際の検出工程を含む）。ＩＳＴＤは目的の分析物と同様の特性を呈するが、目的の分析物とは明確に区別できる。例示すると、ガス又は液体クロマトグラフィのようなクロマトグラフ分離の間、ＩＳＴＤは、試料からの目的分析物とほぼ同じ保持時間を有する。したがって、分析物及びＩＳＴＤの両方が同時に質量分析計に入る。ＩＳＴＤは、しかしながら、試料からの目的分析物とは異なる分子量を呈する。これにより、異なる質量／電荷（ｍ／ｚ）比を用いて、ＩＳＴＤからのイオンと分析物からのイオンとを質量分析で区別することができる。両方をフラグメンテーションに供し、娘イオンを得る。これらの娘イオンは、互いのｍ／ｚ比及びそれぞれの親イオンによって区別することができる。結果として、ＩＳＴＤ及び分析物からのシグナルの別個の決定及び定量化を行うことができる。ＩＳＴＤは既知量で添加されているので、試料からの分析物のシグナル強度は、特定の定量的量の分析物に帰属し得る。かくして、ＩＳＴＤの添加は、検出された分析物の量の相対的比較を可能にし、分析物（複数可）が質量分析計に到達した際、試料中に存在する目的の分析物の明白な同定及び定量化を可能にする。典型的には、必ずしもそうではないが、ＩＳＴＤは目的の分析物の同位体標識されたバリアントである（例えば、２Ｈ、１３Ｃ、又は１５Ｎ等の標識を含む）。
前処理に加えて、試料をまた、１つ以上の濃縮工程に供してもよい。本開示の文脈において、用語「第１の濃縮プロセス」又は「第１の濃縮ワークフロー」とは、試料の前処理に続いて発生し、初回試料と比べて濃縮された分析物を含む試料を提供する、濃縮工程を指す。第１の濃縮ワークフローは、化学沈殿（例えば、アセトニトリルを用いる）又は固相の使用を含むことができる。好適な固相は、固相抽出（Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ：ＳＰＥ）カートリッジ及びビーズを含むが、これらに限定されない。ビーズは、非磁性、磁性、又は常磁性であり得る。ビーズは、対象の分析物に特異的であるように、異なってコーティングされてもよい。コーティングは、意図された用途、すなわち意図された捕捉分子によって異なることがある。どのコーティングがどの分析物に適しているかは当業者によく知られている。ビーズは種々の異なる材料で作ることができる。ビーズは様々なサイズを有し得、細孔のある又は細孔のない表面を含み得る。
本開示の文脈において、用語「第２の濃縮プロセス」又は「第２の濃縮ワークフロー」とは、試料の前処理及び第１の濃縮プロセスに続いて発生し、初回試料及び第１の濃縮プロセス後の試料と比べて濃縮された分析物を含む試料を提供する、濃縮プロセスを指す。
「クロマトグラフィ」という用語は、液体又はガスによって運ばれる化学混合物が、静止した液相又は固相の周り又は上を流れる際に化学成分の異なる分布の結果として成分中に分離される、プロセスを指す。
「液体クロマトグラフィ」又は「ＬＣ」という用語は、細かく分かれた物質のカラム又は毛管路を通って流体が均一に浸透する際に、流体溶液の１つ以上の成分を選択的に遅延させるプロセスを指す。遅延は、この流体が固定相（複数可）に対して移動する際の、１つ以上の固定相とバルク流体（すなわち、移動相）との間の混合物成分の分布に起因する。固定相が移動相よりも高い極性である（例えば、移動相としてトルエン、固定相としてシリカ）方法は順相液体クロマトグラフィ（ｎｏｒｍａｌ ｐｈａｓｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＮＰＬＣ）と呼ばれ、固定相が移動相よりも低い極性である（例えば、移動相として水－メタノール混合物、固定相としてＣ１８（オクタデシルシリル））方法は逆相液体クロマトグラフィ（ｒｅｖｅｒｓｅｄ ｐｈａｓｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＲＰＬＣ）と呼ばれる。
「高速液体クロマトグラフィ」又は「ＨＰＬＣ」とは、圧力下において固定相、典型的には高密度に充填されたカラムに移動相を通すことによって分離の程度が増加する、液体クロマトグラフィの方法を指す。典型的に、カラムには、不規則又は球形の粒子、多孔質モノリシック層、又は多孔質膜で構成される固定相が充填されている。ＨＰＬＣは、歴史的に、移動相及び固定相の極性に基づいて２つの異なるサブクラスに分けられる。固定相が移動相よりも高い極性である（例えば、移動相としてトルエン、固定相としてシリカ）方法は順相液体クロマトグラフィ（ＮＰＬＣ）と呼ばれ、反対の（例えば、移動相として水－メタノール混合物、固定相としてＣ１８（オクタデシルシリル））方法は逆相液体クロマトグラフィ（ＲＰＬＣ）と呼ばれる。マイクロＬＣとは、典型的には１ｍｍ未満、例えば約０．５ｍｍの狭い（ｎｏｒｒｏｗ）内径を有するカラムを用いるＨＰＬＣ法を指す。「超高速液体クロマトグラフィ」又は「ＵＨＰＬＣ」とは、１２０ＭＰａ（１７，４０５ｌｂｆ／ｉｎ２）又は約１２００気圧の圧力を用いるＨＰＬＣ法を指す。ラピッドＬＣとは、上記のような内径であり、長さが２ｃｍ未満、例えば１ｃｍの短いカラムを用いて、上記のような流量及び上記のような圧力を加えるＬＣ法を指す（マイクロＬＣ、ＵＨＰＬＣ）。短いラピッドＬＣプロトコルは、単一の分析カラムを用いるトラッピング／洗浄／溶出工程を含み、１分未満の非常に短い時間でＬＣを実現する。
さらに、「親水性相互作用クロマトグラフィ」（ＨＩＬＩＣ）、サイズ排除型ＬＣ、イオン交換型ＬＣ、及びアフィニティ型ＬＣがよく知られている。
ＬＣ分離は、並列に配置された複数のＬＣチャネルを含むシングルチャネルＬＣ又はマルチチャネルＬＣであってもよい。ＬＣにおいて、分析物は、当業者に一般的に知られているように、それらの極性又はログＰ値、サイズ、又は親和性に従って分離され得る。
用語「反応性ユニット」とは、別の分子と反応することができる、すなわち、対象分析物などの別の分子と共有結合を形成することができるユニットを指す。典型的には、このような共有結合は、他の分子中に存在する化学基で形成される。したがって、化学反応の際、化合物の反応性ユニットは、分析物分子中に存在する好適な化学基と共有結合を形成する。分析物分子に存在するこの化学基は化合物の反応性ユニットと反応する機能を果たすため、分析物分子中に存在する化学基は、分析物の「官能基」とも呼ばれる。共有結合の形成は、反応性基の原子と分析物の官能基との間に新たな共有結合が形成される化学反応の各場合に生じる。反応性基と分析物の官能基との間に共有結合を形成する際に、この化学反応中に原子が失われることは当業者に周知である。
本開示の文脈において、用語「複合体」とは、化合物と分析物分子との反応によって生成される生成物を指す。この反応により、化合物と分析物との間に共有結合が形成される。したがって、複合体という用語は、化合物と分析物分子との反応によって形成される共有結合した反応生成物を指す。
「キット」は、少なくとも１つの試薬、例えば障害の処置のための薬品、又は本発明のバイオマーカー遺伝子若しくはタンパク質を特異的に検出するためのプローブを含む、任意の製品（例えば、パッケージ又は容器）である。キットは、好ましくは、本発明の方法を実行するためのユニットとして、奨励、流通、又は販売される。典型的には、キットは、バイアル、チューブ等の１つ以上の容器手段を密接に閉じ込めて受け入れるように区画化された担体手段を更に含むことができる。特に、容器手段の各々は、第１の態様の方法で使用される別個の要素のうちの１つを備える。キットは、反応触媒を含むがこれに限定されない１つ以上の他の試薬を更に含み得る。キットは、緩衝液、希釈剤、フィルタ、針、注射器、及び使用説明を伴う添付文書を含むがこれらに限定されない、更なる材料を含む１つ以上の他の容器を更に含んでもよい。標識は、組成物が特定の用途に使用されることを示すために容器上に提示され得、インビボ使用又はインビトロ使用のいずれかに関する指示も示し得る。コンピュータ・プログラム・コードは、光記憶媒体（例えば、コンパクトディスク）等のデータ記憶媒体若しくは装置上に、又はコンピュータ若しくはデータ処理装置に直接提供されてもよい。その上キットは、較正目的のために、本明細書の別の箇所に記載されるようなバイオマーカーの標準量を含み得る。
実施形態
第１の態様では、本発明は、質量分析による決定を使用して分析物を定量的に検出するための化合物又は少なくとも１つの化合物に関し、当該化合物は、永久電荷、特に永久正味電荷を含み、分析物に共有結合することが可能であり、質量ｍ１及び正味電荷ｚ１を有し、質量分析による決定によるフラグメンテーション後に質量ｍ２＜ｍ１及び正味電荷ｚ２＜ｚ１を有する少なくとも１つの娘イオンを形成することが可能であり、ｍ１／ｚ１＜ｍ２／ｚ２である。
本発明者らは、驚くべきことに、複数の永久電荷（ｘ回の正電荷、ｙ回の負電荷、又は正味電荷として（ｘ－ｙ）回の正電荷及び負電荷のいずれか）を設置することが可能な本明細書に記載の試薬（化合物）が、１つ又は複数のフラグメントへのフラグメンテーション挙動を示し、フラグメンテーション後の標識の部分及び分析物分子イオンの部分に関する情報を有することを見出した。したがって、分析物のＭＳシグナル増強は、例えば、少量の分析物にとって重要なものとなる。
例えば、２回永久に荷電した分子／化合物では、ｍ／ｚ値は、同じ分析物の１回永久に荷電したイオン（標識前の分析物分子）の半分である。この複数回永久に荷電した分子、例えば２回永久に荷電した化合物が、異なる回数の永久に荷電した分子にフラグメント化される場合、標識情報のフラグメンテーション経路は、より高いｍ／ｚ値の前駆体からより低いｍ／ｚ値の標識情報に、並びにより低いｍ／ｚ値の前駆体からより高いｍ／ｚ値の分析イオンに進む（図１及び図６を参照）。
永久に荷電した標識を設置することにより、分子のフラグメンテーション挙動は、ネイティブ分子と比較して交互になる。ＭＳＭＳプロセス内での分析物標識分子のフラグメンテーション後、永久電荷は分析物分子部分又は標識部分のいずれかに留まる。したがって、高強度で測定される定量イオンは、フラグメンテーションプロセス後、分子情報又は標識情報のいずれかを有することができる。標識された構造の分子情報を得るために、得られたフラグメントの更なるイオン単離プロセスを行う必要があり、これはＭＳ３機器を必要とし、それぞれの走査の全体的な感度を更に低下させる。フラグメンテーションプロセス後、得られたイオンは、標識情報イオン又は分析物情報含有イオンのいずれかであり得るので、複合体又は化合物に１つの永久電荷のみが設置されている場合、本明細書に記載の修飾子及び定量子イオンの概念は実行することができない。
本発明の第１の態様の実施形態では、質量分析による決定を使用して分析物を定量的に検出するための化合物は、永久電荷、特に永久正味電荷を含み、分析物に共有結合することが可能であり、質量ｍ１及び正味電荷ｚ１を有し、質量分析による決定によるフラグメンテーション後に質量ｍ２＜ｍ１及び正味電荷ｚ２＜ｚ１を有する少なくとも１つの娘イオンを形成し、ｍ１／ｚ１＜ｍ２／ｚ２である。
本発明の第１の態様及び／又は第６の態様の実施形態では、フラグメンテーションは一段階プロセスである。これは、化合物が、再配列又は偽分子イオン種形成の中間段階なしに、少なくとも１つの娘イオンに直接フラグメント化されることを意味し得る。
本発明の第１の態様の実施形態では、化合物は、少なくとも２つの永久電荷、特に少なくとも２つの永久正味電荷を含む。
本発明の第１の態様の実施形態では、ｍ１／ｚ１は少なくとも６０又はそれを超える。６０を超えるとは、Ｃ７Ｈ２ＯＮ２ ２＋の場合、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４又は７５、例えば６６を意味し得る。これに代えて、又はこれに加えて、ｍ１／ｚ１は少なくとも６０であり、ｍ２／ｚ２は少なくとも７０又はそれを超え、例えば Ｃ４Ｈ１２Ｎ＋では７４である。７０を超えるとは、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９又は８０を意味し得る。さらに、ｍ１／ｚ１及びｍ２／ｚ２の各々又は両方は、最大で１５００、例えば１３００、１３５０、１４００、１４５０又は１５００であり得る。言い換えれば、ｍ１／ｚ１及び／又はｍ２／ｚ２は、６０～１５００の範囲内（境界を含む）とすることができる。
本発明の第１の態様の実施形態では、化合物はスルホキシドユニット（ＳＯ）を含まない。特に、化合物は、スルホキシドユニット（ＳＯ）を含まず、ニュートラル・ロスを阻害し、これにより、二重荷電誘導体から単一荷電イオンへの好ましいフラグメンテーション方法を可能にする。したがって、例えば、二重荷電化合物から１回荷電化合物へのフラグメンテーション経路は、ＳＯユニットを有する化合物と比較して、ＳＯユニットを含まない化合物の方が容易である。
本発明の第１の態様の実施形態では、ｚ１は整数であり、２であるか、又は２を超える。特に、ｚ１は正の整数である。正の整数は、分数ではなく整数、例えば＋２、＋３、＋４、＋５を意味することができる。あるいは、ｚ１は、負の整数、例えば－２、－３、－４、－５である。正の整数、例えば＋２、＋３、＋４、＋５は、この文脈において、化合物が＋２の場合には二重の正の正味電荷ｚ１を有し、＋３の場合には三重の正の正味電荷ｚ１を有することなどを意味する。負の整数、例えば－２、－３、－４、－５は、この文脈において、化合物が－２の場合には二重の負の正味電荷ｚ１を有し、－３の場合には三重の負の正味電荷ｚ１を有することなどを意味する。
これは、本開示の文脈では、娘イオンの正味電荷ｚ２と化合物の正味電荷ｚ１とを比較することにより、正味電荷の絶対値が厳密であることを意味する。例えば、化合物が二重の負の正味電荷ｚ１（ｚ１＝－２）を有し、娘イオンが１つの負の正味電荷ｚ２（ｚ２＝－１）を有する場合、正味電荷ｚ１（ｚ１＝２）の絶対値は正味電荷ｚ２（ｚ２＝１）の絶対値よりも大きいので、正味電荷ｚ２は正味電荷ｚ１よりも小さい（ｚ２＜ｚ１）。正味電荷ｚ１とｚ２とを比較することにより、合計値の代わりに正味電荷の絶対値が比較される。
本発明の第１の態様の実施形態では、ｚ１は２、３、４又は５であり、好ましくはｚ１は２である。この文脈において、２は＋２としての意味を有することができ（２＝＋２）、３は＋３としての意味を有することができ、４は＋４としての意味を有することができ、５は＋５としての意味を有することができる。あるいは、化合物が負に荷電している場合、２は－２としての意味を有することができ（２＝－２）、３は－３としての意味を有することができ、４は－４としての意味を有することができ、５は－５としての意味を有することができる。
本発明の第１の態様の実施形態では、ｚ２はｚ１よりも小さい。特に、ｚ２＝ｚ１－１であり、好ましくはｚ２は１である。この文脈において、１は＋１又は－１と同じ意味を有する。
本発明の第１の態様の実施形態では、ｚ１及びｚ２の各々又は両方は、永久電荷、特に永久正味電荷である。
本発明の第１の態様の実施形態では、ｚ１及びｚ２の各々又は両方は、永久正電荷、特に永久正味電荷である。
本発明の第１の態様の実施形態では、ｚ１及びｚ２の各々又は両方は、永久負電荷、特に永久正味電荷である。
本発明の第１の態様の実施形態では、正味電荷ｚ１は、化合物のｘ回の正及びｙ回の負の永久電荷の合計である。
本発明の第１の態様の実施形態では、正味電荷ｚ２は、少なくとも１つの娘イオンのｘ回の正及びｙ回の負の永久電荷の合計である。
本発明の第１の態様の実施形態では、化合物は、質量ｍ２及び正味電荷ｚ２を有する少なくとも１つの娘イオンとは異なる更なる娘イオンを形成することが可能である。さらなる娘イオンは、１個又は２個又は３個又は４個又は５個又は６個又は６個よりも多い娘イオンであり得る。これらの娘イオンの各々は、質量対ノイズｍ／ｚを有する。さらなる娘イオンのｍ／ｚ値は、一般に、ｍｘ／ｚｘ値（ｘ＞４）と命名することができる。例えば、１つの更なる娘イオンはｍ５／ｚ５値を有し、２つの更なる娘イオンはｍ５／ｚ５及びｍ６／ｚ６値を有し、３つの更なる娘イオンはｍ５／ｚ５、ｍ６／ｚ７及びｍ８／ｚ８値を有するなどである。
本発明の第１の態様の実施形態では、更なる娘イオンのｍ／ｚはｍ１／ｚ１よりも小さい。すなわち、質量スペクトルにおける更なる娘イオンのピークの位置は、ｍ１／ｚ１値を有するピーク（親イオン）の左に位置する。これに対して、ｍ２／ｚ２値を有する少なくとも１つの娘イオンのピークの位置は、親イオンのピークの右側に位置する。親イオンピークは、ベースピークとも呼ばれ得る。主に、ベースピークの強度は１００％の相対強度に正規化される。相対強度は、検出器によって記録された絶対イオン存在量から基本的に独立しているため、正規化を行うことができる。
本発明の第１の態様の実施形態では、化合物は更なる娘イオンを形成することが可能であり、更なる娘イオンの各々は化合物の１つのフラグメント又は複数のフラグメントを含み、各々がｘ＞４のｍｘ／ｚｘ値を有し、更なる娘イオンのｍｘ／ｚｘ値の各々はｍ１／ｚ１値よりも小さい。特に、化合物のフラグメントは、少なくともそれらのｍ／ｚ値によって互いに異なる。
本発明の第１の態様の実施形態では、化合物は、少なくとも３つのユニットＺ１、Ｚ２、Ｑ及び任意の更なるユニットＬ１を含み、ユニットは互いに共有結合しており、
Ｑは、分析物と共有結合を形成可能な反応性ユニットであり、
Ｚ１は、少なくとも１つの永久に荷電した部分、特に永久に正に荷電した部分又は永久に負に荷電した部分を含む荷電ユニットであり、
Ｚ２は、少なくとも１つの永久に荷電した部分、特に永久に正に荷電した部分又は永久に負に荷電した部分を含む荷電ユニットであり、かつ
Ｌ１は、置換又は非置換リンカー、特に、フラグメンテーションによる切断可能な基、例えば、Ｍｃ Ｌａｆｆｅｒｔｙフラグメンテーション部分、Ｒｅｔｒｏ Ｄｉｅｌｓ Ａｌｄｅｒフラグメンテーション部分、ベンジル又は脂肪族であり、
化合物の正味電荷は１より大きい。
本発明の第１の態様の実施形態では、化合物は、分析物分子と反応することができる反応性ユニットＱを含む。反応性ユニットＱは、化合物と分析物分子との間に共有結合が形成されるように、分析物分子と反応することができる。本発明の第１の態様の実施形態では、反応性ユニットＱは、化合物と共有結合を形成する。特に、共有結合は、化合物の反応性ユニットと分析物分子に存在する官能基との間に形成される。
測定される分析物分子に存在する官能基に応じて、当業者は、当該化合物に適切な反応性ユニットＱを選択する。どの反応性ユニットＱが対象の分析物の官能基への結合に適しているかを決定することは周知である。
本発明の第１の態様の実施形態では、分析物分子は、カルボニル基、ジエン基、ヒドロキシル基、アミン基、イミン基、ケトン基、アルデヒド基、チオール基、ジオール基、フェノール基、エポキシ基、ジスルフィド基、核酸塩基基、カルボン酸基、末端システイン基、末端セリン基及びアジド基からなる群から選択される官能基を含み、それぞれが化合物の反応性ユニットＱと共有結合を形成することができる。さらに、分析物分子上に存在する官能基が、最初に、化合物の反応性ユニットＱとの反応により容易に利用可能な別の基に変換されることもまた、本発明の範囲内と考えられる。
本発明の第１の態様の実施形態では、分析物分子は、小分子代謝物及び補因子、並びに治療薬、依存性薬物、毒素、又はそれらの代謝産物を含む、ステロイド、ケトステロイド、セコステロイド、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、炭水化物、脂肪酸、脂質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸、及び他の生体分子からなる群から選択される。
本発明の第１の態様の実施形態では、分析物分子は、カルボン酸基、アルデヒド基、ケト基、マスクされたアルデヒド、マスクされたケト基、エステル基、アミド基、及び無水基からなる群より選択される官能基としてのカルボニル基を含む。アルドース（アルデヒド及びケト）は、親アルデヒド／ケトの一種のマスクされた形態であるアセタール及びヘミアセタールとして存在する。
本発明の第１の態様の実施形態では、カルボニル基はアミド基であり、当業者には、アミド基自体が安定基であるが、アミド基を加水分解してカルボン酸基及びアミノ基に変換することができることが周知である。アミド基の加水分解は、酸／塩基触媒反応を介して、又はいずれかが当業者によく知られている酵素プロセスによって達成することができる。カルボニル基がマスクされたアルデヒド基又はマスクされたケト基である本発明の第１の態様の実施形態では、それぞれの基は、ヘミアセタール基又はアセタール基、特に環状ヘミアセタール基又はアセタール基のいずれかである。本発明の第１の態様の実施形態では、アセタール基は、化合物との反応の前に、アルデヒド基又はケト基へと変換される。
本発明の第１の態様の実施形態では、カルボニル基は、ケト基である。本発明の第１の態様の実施形態では、ケト基は、化合物の反応性ユニットと反応する前に、中間体のイミン基に移すことができる。本発明の第１の態様の実施形態では、１つ以上のケト基を含む分析物分子は、ケトステロイドである。本発明の第１の態様の特定の実施形態では、ケトステロイドは、テストステロン、エピテストステロン、ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）、デソクシメチルテストステロン（ＤＭＴ）、テトラヒドロゲストリノン（ＴＨＧ）、アルドステロン、エストロン、４－ヒドロキシエストロン、２－メトキシエストロン、２－ヒドロキシエストロン、１６－ケトエストラジオール、１６α－ヒドロキシエストロン、２－ヒドロキシエストロン－３－メチルエーテル、プレドニゾン、プレドニゾロン、プレグネノロン、プロゲステロン、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）、１７－ヒドロキシプレグネノロン、１７－ヒドロキシプロゲステロン、アンドロステロン、エピアンドロステロン、Δ４－アンドロステンジオン、１１－デオキシコルチゾール、コルチコステロン、２１－デオキシコルチゾール、１１－デオキシコルチコステロン、アロプレグネノロン、及びアルドステロンからなる群から選択される。
本発明の第１の態様の実施形態では、カルボニル基は、カルボキシ基である。本発明の第１の態様の実施形態では、カルボキシル基は、化合物と直接反応するか、又は化合物との反応の前に活性化エステル基に変換される。本発明の第１の態様の実施形態では、１つ以上のカルボキシル基を含む分析物分子は、Δ８－テトラヒドロカンナビノール酸、ベンゾイルエクゴニン、サリチル酸、２－ヒドロキシ安息香酸、ガバペンチン、プレガバリン、バルプロ酸、バンコマイシン、メトトレキサート、ミコフェノール酸、モンテルカスト、レパグリニド、フロセミド、テルミサルタン、ゲムフィブロジル、ジクロフェナク、イブプロフェン、インドメタシン、ゾメピラク、イソキセパック、及びペニシリンからなる群から選択される。本発明の第１の態様の実施形態では、１つ以上のカルボキシル基を含む分析物分子は、アルギニン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、バリン、プロリン、及びグリシンからなる群から選択されるアミノ酸である。
本発明の第１の態様の実施形態では、カルボニル基は、アルデヒド基である。本発明の第１の態様の実施形態では、アルデヒド基は、化合物の反応性ユニットと反応する前に、中間体のイミン基に移すことができる。本発明の第１の態様の実施形態では、１つ以上のアルデヒド基を含む分析物分子は、ピリドキサール、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン、アルカフタジン、ストレプトマイシン、及びジョサマイシンからなる群から選択される。
本発明の第１の態様の実施形態では、カルボニル基は、カルボニルエステル基である。本発明の第１の態様の実施形態では、１つ以上のエステル基を含む分析物分子は、コカイン、ヘロイン、リタリン、アセクロフェナク、アセチルコリン、アムシノニド、アミロキサート、アミロキサート、アミロカイン、アニレリジン、アラニジピン、アルテスネート、及びペチジンからなる群から選択される。
本発明の第１の態様の実施形態では、カルボニル基は、無水基である。本発明の第１の態様の実施形態では、１つ以上の無水基を含む分析物分子は、カンタリジン、無水コハク酸、無水トリメリット酸、及び無水マレイン酸からなる群から選択される。
本発明の第１の態様の実施形態では、分析物分子は、官能基として１つ以上のジエン基、特にコンジュゲートしたジエン基を含む。本発明の第１の態様の実施形態では、１つ以上のジエン基を含む分析物分子は、セコステロイドである。実施形態では、セコステロイドは、コレカルシフェロール（ビタミンＤ３）、エルゴカルシフェロール（ビタミンＤ２）、カルシフェジオール、カルシトリオール、タキステロール、ルミステロール、及びタカルシトールからなる群から選択される。特に、セコステロイドは、ビタミンＤ、特にビタミンＤ２若しくはＤ３、又はそれらの誘導体である。特定の実施形態では、セコステロイドは、ビタミンＤ２、ビタミンＤ３、２５－ヒドロキシビタミンＤ２、２５－ヒドロキシビタミンＤ３（カルシフェジオール）、３－エピ－２５－ヒドロキシビタミンＤ２、３－エピ－２５－ヒドロキシビタミンＤ３、１，２５－ジヒドロキシビタミンＤ２、１，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３（カルシトリオール）、２４，２５－ジヒドロキシビタミンＤ２、２４，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３からなる群から選択される。本発明の第１の態様の実施形態では、１つ以上のジエン基を含む分析物分子は、ビタミンＡ、トレチノイン、イソトレチノイン、アリトレチノイン、ナタマイシン、シロリムス、アムホテリシンＢ、ナイスタチン、エベロリムス、テムシロリムス及びフィダキソミシンからなる群から選択される。
本発明の第１の態様の実施形態では、分析物分子は、官能基として１つ以上のヒドロキシル基を含む。本発明の第１の態様の実施形態では、分析物分子は、単一のヒドロキシル基又は２つのヒドロキシル基を含む。複数のヒドロキシル基が存在する実施形態では、２つのヒドロキシル基（１，２－ジオール）は、互いに隣接して位置していてもよく、又は１、２、若しくは３個のＣ原子（それぞれ、１，３－ジオール、１，４－ジオール、１，５－ジオール）によって分離されていてもよい。第１の態様の特定の実施形態では、分析物分子は、１，２－ジオール基を含む。１つのヒドロキシル基のみが存在する実施形態では、該分析物は、第一級アルコール、第二級アルコール、及び第三級アルコールからなる群から選択される。分析物分子が１つ以上のヒドロキシル基を含む本発明の第１の態様の実施形態では、分析物は、ベンジルアルコール、メントール、Ｌ－カルニチン、ピリドキシン、メトロニダゾール、イソソルビドモノニトラート、グアイフェネシン、クラブラン酸、ミグリトール、ザルシタビン、イソプレナリン、アシクロビル、メトカルバモール、トラマドール、ベンラファキシン、アトロピン、クロフェダノール、α－ヒドロキシアルプラゾラム、α－ヒドロキシトリアゾラム、ロラゼパム、オキサゼパム、テマゼパム、エチルグルクロニド、エチルモルヒネ、モルヒネ、モルヒネ－３－グルクロニド、ブプレノルフィン、コデイン、ジヒドロコデイン、ｐ－ヒドロキシプロポキシフェン、Ｏ－デスメチルトラマドール、デスメトラマドール、ジヒドロキニジン、及びキニジンからなる群から選択される。分析物分子が複数のヒドロキシル基を含む本発明の第１の態様の実施形態では、分析物は、ビタミンＣ、グルコサミン、マンニトール、テトラヒドロビオプテリン、シタラビン、アザシチジン、リバビリン、フロクスウリジン、ゲムシタビン、ストレプトゾトシン
、アデノシン、ビダラビン、クラドリビン、エストリオール、トリフルリジン、クロファラビン、ナドロール、ザナミビル、ラクツロース、アデノシン一リン酸、イドクスウリジン、レガデノソン、リンコマイシン、クリンダマイシン、カナグリホジン、トブラマイシン、ネチルマイシン、カナマイシン、チカグレロール、エピルビシン、ドキソルビシン、アルベカシン、ストレプトマイシン、ウアバイン、アミカシン、ネオマイシン、フラミセチン、パロモマイシン、エリスロマイシン、クラリスロマイシン、アジスロマイシン、ビンデシン、ジギトキシン、ジゴキシン、メトリザミド、アセチルジギトキシン、デスラノシド、フルダラビン、クロファラビン、ゲムシタビン、シタラビン、カペシタビン、ビダラビン、及びプリカマイシンからなる群から選択される。
本発明の第１の態様の実施形態では、分析物分子は、官能基としての１つ以上のチオール基（アルキルチオール及びアリールチオール基を含むがこれらに限定されない）を含む。本発明の第１の態様の実施形態では、１つ以上のチオール基を含む分析物分子は、チオマンデル酸、ＤＬ－カプトプリル、ＤＬ－チオルファン、Ｎ－アセチルシステイン、Ｄ－ペニシラミン、グルタチオン、Ｌ－システイン、ゾフェノプリラート、チオプロニン、ジメルカプロール、サクシマからなる群から選択される。
本発明の第１の態様の実施形態では、分析物分子は、官能基として１つ以上のジスルフィド基を含む。本発明の第１の態様の実施形態では、１つ以上のジスルフィド基を含む分析物分子は、グルタチオンジスルフィド、ジピリチオン、硫化セレン、ジスルフィラム、リポ酸、Ｌ－シスチン、フルスルチアミン、オクトレオチド、デスモプレシン、バプレオチド、テルリプレシン、リナクロチド、及びペギネサチドからなる群から選択される。硫化セレンは、二硫化セレン、ＳｅＳ２、又は六硫化セレン、Ｓｅ２Ｓ６であり得る。
本発明の第１の態様の実施形態では、分析物分子は、官能基として１つ以上のエポキシド基を含む。本発明の第１の態様の実施形態では、１つ以上のエポキシド基を含む分析物分子は、カルバマゼピン－１０，１１－エポキシド、カルフィルゾミブ、フロセミドエポキシド、ホスホマイシン、塩酸セベラマー、セルレニン、スコポラミン、チオトロピウム、チオトロピウムブロミド、メチルスコポラミンブロミド、エプレレノン、ムピロシン、ナタマイシン、及びトロレアンドマイシンからなる群から選択される。
本発明の第１の態様の実施形態では、分析物分子は、官能基として１つ以上のフェノール基を含む。本発明の第１の態様の特定の実施形態では、１つ以上のフェノール基を含む分析物分子は、ステロイド又はステロイド様の化合物である。本発明の第１の態様の実施形態では、１つ以上のフェノール基を含む分析物分子は、ｓｐ２ハイブリダイズされたＡ環と、Ａ環の３位におけるＯＨ基とを有するステロイド又はステロイド様化合物である。本発明の第１の態様の特定の実施形態では、ステロイド又はステロイド様分析物分子は、エストロゲン、エストロゲン様化合物、エストロン（Ｅｌ）、エストラジオール（Ｅ２）、１７ａ－エストラジオール、１７ｂ－エストラジオール、エストリオール（Ｅ３）、１６－エピエストリオール、１７－エピエストリオール、及び１６、１７－エピエストリオール、並びに／又はそれらの代謝産物からなる群から選択される。実施形態では、代謝産物は、エストリオール、１６－エピエストリオール（１６－エピＥ３）、１７－エピエストリオール（１７－エピＥ３）、１６，１７－エピエストリオール（１６，１７－エピＥ３）、１６－ケトエストラジオール（１６－ケトＥ２）、１６ａ－ヒドロキシエストロン（１６ａ－ＯＨＥｌ）、２－メトキシエストロン（２－ＭｅＯＥｌ）、４－メトキシエストロン（４－ＭｅＯＥｌ）、２－ヒドロキシエストロン－３－メチルエーテル（３－ＭｅＯＥｌ）、２－メトキシエストラジオール（２－ＭｅＯＥ２）、４－メトキシエストラジオール（４－ＭｅＯＥ２）、２－ヒドロキシエストロン（２－ＯＨＥ１）、４－ヒドロキシエストロン（４－ＯＨＥ１）、２－ヒドロキシエストラジオール（２－ＯＨＥ２）、エストロン（Ｅｌ）、硫酸エストロン（Ｅｌｓ）、１７ａ－エストラジオール（Ｅ２ａ）、１７ｂ－エストラジオール（Ｅ２Ｂ）、エストラジオール硫酸塩（Ｅ２Ｓ）、エクイリン（ＥＱ）、１７ａ－ジヒドロエキリン（ＥＱａ）、１７ｂ－ジヒドロエキリン（ＥＱｂ）、エキレニン（ＥＮ）、１７－ジヒドロエキレニン（ＥＮａ）、１７α－ジヒドロエキレニン、１７β－ジヒドロエキレニン（ＥＮｂ）、Δ８，９－デヒドロエストロン（ｄＥｌ）、Ａ８，９－デヒドロエストロン硫酸（ｄＥｌ）、Δ９－テトラヒドロカンナビノール、ミコフェノール酸からなる群から選択される。β又はｂは交換可能に使用することができる。α及びａは交換可能に使用することができる。
本発明の第１の態様の実施形態では、分析物分子は、官能基としてアミン基を含む。本発明の第１の態様の実施形態では、アミン基は、アルキルアミン基又はアリールアミン基である。本発明の第１の態様の実施形態では、１つ以上のアミン基を含む分析物分子は、タンパク質及びペプチドからなる群から選択される。本発明の第１の態様の実施形態では、アミン基を含む分析物分子は、３，４－メチレンジオキシアンフェタミン、３，４－メチレンジオキシ－Ｎ－エチルアンフェタミン、３，４－メチレンジオキシメタンフェタミン、アンフェタミン、メタンフェタミン、Ｎ－メチル－１，３－ベンゾジオキソリルブタンアミン、７－アミノクロナゼパム、７－アミノフルニトラゼパム、３，４－ジメチルメトカチノン、３－フルオロメトカチノン、４－メトキシメトカチノン、４－メチルエトカチノン、４－メチルメトカチノン、アンフェプラモン、ブチロン、エトカチノン、フレフェドロン、メトカチノン、メチロン、メチレンジオキシピロバレロン、ベンゾイルエクゴニン、デヒドロノルケタミン、ケタミン、ノルケタミン、メサドン、ノルメサドン、６－アセチルモルヒネ、ジアセチルモルヒネ、モルヒネ、ノルヒドロコドン、オキシコドン、オキシモルフォン、フェンシクリジン、ノルプロポキシフェン、アミトリプチリン、クロミプラミン、ドチエピン、ドキセピン、イミプラミン、ノルトリプチリン、トリミプラミン、フェンタニル、グリシルキシリジド、リドカイン、モノエチルグリシルキシリジド、Ｎ－アセチルプロカインアミド、プロカインアミド、プレガバリン、２－メチルアミノ－１－（３，４－メチレンジオキシフェニル）ブタン、Ｎ－メチル－１，３－ベンゾジオキソリルブタンアミン、２－アミノ－１－（３，４－メチレンジオキシフェニル）ブタン、１，３－ベンゾジオキソリルブタンアミン、ノルメペリジン、Ｏ－デストラマドール、デスメトラマドール、トラマドール、ラモトリジン、テオフィリン、アミカシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、バンコマイシン、メトトレキサート、ガバペンチンシソマイシン、及び５－メチルシトシンからなる群より選択される。
本発明の第１の態様の実施形態では、分析物分子は、炭水化物、又は例えば糖タンパク質又はヌクレオシドなど炭水化物部分を有する物質である。本発明の第１の態様の実施形態では、分析物分子は単糖類、特に、リボース、デソキシリボース（ｄｅｓｏｘｙｒｉｂｏｓｅ）、アラビノース、リブロース、グルコース、マンノース、ガラクトース、フコース、フルクトース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、ノイラミン酸、Ｎ－アセチルノイラミン酸等からなる群から選択される。実施形態では、分析物分子は、オリゴ糖、特に、二糖、三糖、四糖、多糖からなる群から選択される。本発明の第１の態様の実施形態では、二糖類は、スクロース、マルトース、及びラクトースからなる群から選択される。本発明の第１の態様の実施形態では、分析物分子は、上述の単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、又は多糖類部分を含む物質である。
本発明の第１の態様の実施形態では、分析物分子は、アルキル又はアリールアジドからなる基から選択される官能基としてアジド基を含む。本発明の第１の態様の実施形態では、１つ以上のアジド基を含む分析物分子は、ジドブジン及びアジドシリンからなる群から選択される。
そのような分析物分子は、体液、例えば血液、血清、血漿、尿、唾液、髄液など、組織又は細胞抽出物などの生物学的又は臨床試料中に存在し得る。本発明の第１の態様の実施形態では、分析物分子（複数可）は、血液、血清、血漿、尿、唾液、髄液、及び乾燥血液スポットからなる群から選択される生物学的又は臨床試料中に存在する。本発明の第１の態様のいくつかの実施形態では、分析物分子は、精製された又は部分的に精製された試料、例えば、精製された又は部分的に精製されたタンパク質混合物又は抽出物である試料中に存在し得る。
本発明の第１の態様の実施形態では、反応性ユニットＱは、カルボニル反応性ユニット、ジエン反応性ユニット、ヒドロキシル反応性ユニット、アミノ反応性ユニット、イミン反応性ユニット、チオール反応性ユニット、ジオール反応性ユニット、フェノール反応性ユニット、エポキシド反応性ユニット、ジスルフィド反応性ユニット、及びアジド反応性ユニットからなる群から選択される。
本発明の第１の態様の実施形態では、反応性ユニットＱは、カルボニル反応性ユニットであり、これは、カルボニル基を有する任意の種類の分子と反応することができる。本発明の第１の態様の実施形態では、カルボニル反応性ユニットは、カルボキシル反応性ユニット、ケト反応性ユニット、アルデヒド反応性ユニット、無水物反応性ユニット、カルボニルエステル反応性ユニット、及びイミド反応性ユニットからなる群から選択される。本発明の第１の態様の実施形態では、カルボニル反応性ユニットは、隣接するＯ若しくはＮ原子ＮＨ２－Ｎ／Ｏ、又はジチオール分子を介したα効果によって強化された超求核性Ｎ原子のいずれかを有し得る。
本発明の第１の態様の実施形態では、カルボニル反応性ユニットは、以下からなる群：
（ｉ）ヒドラジンユニット、例えばＨ２Ｎ－ＮＨ－又はＨ２Ｎ－ＮＲ１－ユニット（式中、Ｒ１はアリール又はＣ１～４アルキル、特にＣ１又はＣ２アルキルであり、任意に置換される）と、
（ｉｉ）ヒドラジドユニット、特にカルボヒドラジド又はスルホヒドラジド、特にＨ２Ｎ－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－又はＨ２Ｎ－ＮＲ２－Ｃ（Ｏ）－ユニット（式中、Ｒ２は、アリール又はＣ１～４アルキル、特にＣ１又はＣ２アルキルであり、任意に置換される）と、
（ｉｉｉ）ヒドロキシルアミノユニット、例えばＨ２Ｎ－Ｏ－ユニットと、
（ｉｖ）ジチオールユニット、特に１，２－ジチオール又は１，３－ジチオールユニットと
から選択される。
カルボニル反応性ユニットがカルボキシル反応性ユニットである本発明の第１の態様の実施形態では、カルボキシル反応性ユニットは、分析物分子上のカルボキシル基と反応する。本発明の第１の態様の実施形態では、カルボキシル反応性ユニットは、ジアゾユニット、ハロゲン化アルキル、アミン、及びヒドラジンユニットからなる群から選択される。
本発明の第１の態様の実施形態では、分析物分子はケトン又はアルデヒド基を含み、Ｑはカルボニル反応性ユニットであり、これは以下の群：
（ｉ）ヒドラジンユニット、
（ｉｉ）ヒドラジドユニット、
（ｉｉｉ）ヒドロキシルアミノユニット、及び
（ｉｖ）ジチオールユニット
から選択される。
本発明の第１の態様の実施形態では、反応性ユニットＱは、ジエン反応性ユニットであり、これは、ジエン基を有する分析物と反応することができる。本発明の第１の態様の実施形態では、ジエン反応性ユニットは、ジエノフィルとして作用することができるクックソン型試薬、例えば、１，２，４－トリアゾリン－３，５－ジオンからなる群から選択される。
本発明の第１の態様の実施形態では、反応性ユニットＱは、ヒドロキシル反応性ユニットであり、これは、ヒドロキシル基を有する分析物と反応することができる。本発明の第１の態様の実施形態では、ヒドロキシル反応性ユニットは、塩化スルホニル、活性化カルボン酸エステル（ＮＨＳ又はイミダゾリド）、及びフッ素の求核置換が可能なフルオロ芳香族／ヘテロ芳香族からなる群より選択される（Ｔ．Ｈｉｇａｓｈｉ、「Ｊ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．」（２０１６年９月）第１６２巻第５７～６９頁）。本発明の第１の態様の実施形態では、反応性ユニットＱは、分析物分子上のジオール基と反応するジオール反応性ユニットである。反応性ユニットが１，２ジオール反応性ユニットである本発明の第１の態様の実施形態では、１，２ジオール反応性ユニットは、ボロン酸を含む。更なる実施形態では、ジオールは、それぞれのケトン又はアルデヒドに酸化され得、次いで、ケトン／アルデヒド反応性ユニットＫと反応され得る。
本発明の第１の態様の実施形態では、アミノ反応性ユニットは、分析物分子上のアミノ基と反応する。本発明の第１の態様の実施形態では、アミノ反応性ユニットは、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル又はスルホ－ＮＨＳエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、カボニルイミダゾールエステル、スクアリン酸エステル、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）エステル、１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）エステル、及び塩化スルホニルユニットなどの活性エステル基からなる群から選択される。
本発明の第１の態様の実施形態では、チオール反応性ユニットは、分析物分子上のチオール基と反応する。本発明の第１の態様の実施形態では、チオール反応性ユニットは、特にＢｒ／Ｉ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ユニット、アクリルアミド／エステルユニット、マレイミド、メチルスルホニルフェニルオキサジアゾール、及び塩化スルホニルユニットなどの不飽和イミドユニットからなる群から選択される、ハロアセチル基からなる群から選択される。
本発明の第１の態様の実施形態では、フェノール反応性ユニットは、分析物分子上のフェノール基と反応する。本発明の第１の態様の実施形態では、フェノール反応性ユニットは、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル又はスルホ－ＮＨＳエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、カルボニルイミダゾールエステル、スクアリン酸エステル、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）エステル、１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）エステル、及び塩化スルホニルユニットなどの活性エステルユニットからなる群から選択される。分析物分子上に存在するフェノール基は、反応（Ｈ．Ｂａｎら、「Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．」（２０１０年）第１３２巻第５号第１５２３～１５２５頁）によって、又はジアゾ化によって、又はあるいはオルトニトロ化によって、トリアゾリンジオン（ＴＡＤなど）のような高反応性求電子試薬と反応させ、その後、アミンへ還元することができ、次いでこれによりアミン反応試薬と反応させることができる。本発明の第１の態様の実施形態では、フェノール反応性ユニットはフルオロ－１－ピリジニウムである。
本発明の第１の態様の実施形態では、反応性ユニットＱは、エポキシド反応性ユニットであり、これは、エポキシド基を含む分析物と反応することができる。本発明の第１の態様の実施形態では、エポキシド反応性ユニットは、隣接するＯ若しくはＮ原子ＮＨ２－Ｎ／Ｏ分子を介したα効果によって強化された、アミノ、チオール、超求核性Ｎ原子からなる群から選択される。本発明の第１の態様の実施形態では、エポキシド反応性ユニットは、以下の群：
（ｉ）ヒドラジンユニット、例えばＨ２Ｎ－ＮＨ－又はＨ２Ｎ－ＮＲ１－ユニット（式中、Ｒ１は、アリール、１つ以上のヘテロ原子を含むアリール、又はＣ１～４アルキル、特にＣ１又はＣ２アルキルであり、任意に例えば、ハロ、ヒドロキシル、及び／又はＣ１～３アルコキシで置換されている）と、
（ｉｉ）ヒドラジドユニット、特にカルボヒドラジド又はスルホヒドラジドユニット、特にＨ２Ｎ－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－又はＨ２Ｎ－ＮＲ２－Ｃ（Ｏ）－ユニット、
（式中、Ｒ２は、アリール、１つ以上のヘテロ原子を含むアリール、又はＣ１～４アルキル、特にＣ１又はＣ２アルキルであり、任意に例えば、ハロ、ヒドロキシル、及び／又はＣ１～３アルコキシで置換されている）と、
（ｉｉｉ）ヒドロキシルアミノユニット、例えばＨ２Ｎ－Ｏ－ユニットと、から選択される。
本発明の第１の態様の実施形態では、反応性ユニットＱは、ジスルフィド反応性ユニットであり、これは、ジスルフィド基を含む分析物と反応することができる。本発明の第１の態様の実施形態では、ジスルフィド反応性ユニットは、チオールからなる群から選択される。更なる実施形態では、ジスルフィド基は、それぞれのチオール基に還元され、次いで、チオール反応性ユニットＱと反応され得る。
本発明の第１の態様の実施形態では、反応性ユニットＱは、チオール反応性基であるか、又はＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル若しくはスルホ－ＮＨＳエステル、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）エステル、又は１－ヒドロキシ－７－アカベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）エステル基といった、活性エステル基などのアミノ反応性基である。
本発明の第１の態様の実施形態では、反応性ユニットＱは、４－置換１，２，４－トリアゾリン－３，５－ジオン（ＴＡＤ）、４－フェニル－１，２，４－トリアゾリン－３，５－ジオン（ＰＴＡＤ）又はフルオロ置換ピリジニウムから選択される。
本発明の第１の態様の実施形態では、反応性ユニットＱは、分析物分子上のアジド基と反応するアジド反応性ユニットである。本発明の第１の態様の実施形態では、アジド反応性ユニットは、アジド－アルキン環化付加によりアジド基と反応する。本発明の第１の態様の実施形態では、アジド反応性ユニットは、アルキン（アルキル又はアリール）、線形アルキン、又は環状アルキンからなる群から選択される。アジドとアルキンとの間の反応は、触媒の使用の有無にかかわらず進行することができる。本発明の第１の態様の更なる実施形態では、アジド基はそれぞれのアミノ基に還元され得、次いで、アミノ反応性ユニットＫと反応され得る。
本発明の第１の態様の実施形態では、分析物の官能基は、表１の左列に記載された選択肢から選択される。分析物の対応する官能基のＱの反応性基は、表１の右列に記載の基から選択される。
Figure 2023525915000001
本発明の第１の態様の実施形態では、化合物は、Ｚ１及びＺ２と呼ばれる２つの荷電ユニットを含む。Ｚ１は、少なくとも１つの永久に荷電した部分、特に永久に正に荷電した部分又は永久に負に荷電した部分を含む荷電ユニットである。Ｚ２は、少なくとも１つの永久に荷電した部分、特に永久に正に荷電した部分又は永久に負に荷電した部分を含む荷電ユニットである。
本発明の第１の態様の実施形態では、荷電ユニットＺ１及び／又はＺ２は、特に中性条件下において、特に６～８のｐＨ値で永久に荷電している。
本発明の第１の態様の実施形態では、荷電ユニットＺ１及びＺ２の各々は、
（ｉ）少なくとも１つ又は正確に１つの正電荷部分を含むか、又はそれからなる。あるいは、荷電ユニットＺ１及びＺ２の各々は、
（ｉｉ）少なくとも１つ又は正確に１つの負電荷部分を含むか、又はそれからなる。化合物は、２又は２を超える、例えば３、４又は５の正味電荷ｚ１を含む。
本発明の第１の態様の実施形態では、Ｚ１及びＺ２は、少なくとも１個の原子、例えばＣ原子によって互いに分離されている。
本発明の第１の態様の実施形態では、荷電ユニットＺ１又は荷電ユニットＺ２は、正荷電ユニットである。本発明の第１の態様の実施形態では、正荷電ユニットＺ１及び／又はＺ２は、得られる化合物が１０以上のｐＫａ、より具体的には１２以上のｐＫａを有するように選択される。本発明の第１の態様の実施形態では、正荷電ユニットＺ１及び／又はＺ２は、第一級、第二級、第三級、又は第四級アンモニウム、スルホニウム、イミダゾリウム、ピリジニウム、又はホスホニウムからなる群から選択される。第１の態様の特定の実施形態では、正荷電部分は、トリ－メチル－アンモニウム、Ｎ，Ｎ－ジメチル－ピペリジニウム、又はＮ－アルキル－キヌクリジニウムである。
本発明の第１の態様の実施形態では、荷電ユニットＺ１又は荷電ユニットＺ２は、負荷電ユニットである。本発明の第１の態様の実施形態では、負荷電ユニットＺ１及び／又はＺ２は、得られる化合物が１０以上のｐＫｂ、より具体的には１２以上のｐＫｂを有するように選択される。本発明の第１の態様の実施形態では、負荷電ユニットＺ１及び／又はＺ２は、リン酸塩、硫酸塩、スルホン酸塩、又はカルボン酸塩からなる群から選択される。
本発明の第１の態様の実施形態では、Ｌ１は、置換リンカー又は非置換リンカー、特に、フラグメンテーションによる切断可能な基、例えば、Ｍｃ Ｌａｆｆｅｒｔｙフラグメンテーション部分、Ｒｅｔｒｏ Ｄｉｅｌｓ Ａｌｄｅｒフラグメンテーション部分又は脂肪族である。本発明の第１の態様の実施形態では、Ｌ１はプロトン化可能ではない。第１の態様の実施形態では、Ｌ１は、３～３０個のＣ原子、特に５～２０個のＣ原子、特に８～１６個のＣ原子を含む。実施形態では、Ｌ１は、１個以上のヘテロ原子、特にＮ、Ｏ又はＳを含む。本発明の第１の態様の実施形態では、Ｌ１は、少なくとも４個のヘテロ原子、特に５、６、又は７個のヘテロ原子、特にＮ及び／又はＯを含む。本発明の第１の態様の実施形態では、Ｌ１は、５個のヘテロ原子、特に３個のＯ原子及び２個のＮ原子を含む。
本発明の第１の態様の実施形態では、リンカーＬ１は、１～１０個のＣ原子を含み、任意に、１個以上のヘテロ原子を含む。
本発明の第１の態様の実施形態では、リンカーＬ１は、ＭｃＬａｆｆｅｒｔｙフラグメンテーションユニット、Ｒｅｔｒｏ Ｄｉｅｌｓ ａｌｄｅｒユニット、ニュートラル・ロス切断ユニット、結合解離ユニット、アルファ切断及び電荷部位再配置からなる群から選択される。
ＭｃＬａｆｆｅｒｔｙフラグメンテーションユニットは、少なくとも１つのガンマ水素を含有するカルボニル化合物である。
Ｒｅｔｒｏ Ｄｉｅｌｓ ａｌｄｅｒユニットは、ディールス・アルダー反応生成物である。
本発明の第１の態様の実施形態では、ニュートラル・ロス切断ユニットは、イオン化時に少なくとも１つの中性成分を放出する。中性成分は、低分子量中性成分であり、特に１０～１００Ｄａ、特に２０～８０Ｄａ、特に２５～６５Ｄａの範囲である。特に、中性成分の分子量は、１００Ｄａ以下、特に８０Ｄａ以下、特に７０Ｄａ以下、特に５０Ｄａ以下、特に３０Ｄａ以下である。
本発明の第１の態様の実施形態では、中性成分は、Ｎ２、ＮＯ、ＮＯ２、Ｓ２、ＳＯ、ＳＯ２、ＣＯ、ＣＯ２からなる群から選択される。特定の実施形態では、中性成分は、Ｎ２である。
本発明の第１の態様の実施形態では、中性成分の損失により、質量／電荷比（ｍ／ｚ）は、－２８Ｄａ（Ｎ２又はＣＯが失われた場合）、－３０Ｄａ（ＮＯが失われた場合）、－４４Ｄａ（ＣＯ２が失われた場合に備えて）、－４６Ｄａ（ＮＯ２が失われた場合）、－４８Ｄａ（ＳＯが失われた場合）、又は－６４Ｄａ（Ｓ２又はＳＯ２が失われた場合）だけ減少する。
本発明の第１の態様の実施形態では、１つの中性成分が放出される。本発明の第１の態様の実施形態では、２つの中性成分が放出される。特に、２番目に放出された中性成分は、最初に放出された中性成分とは異なる。第２の中性成分の放出は、第１の中性成分の放出と同時に、又はその後に発生する。特に、第２の中性成分の放出は、第１の中性成分の放出と同時に発生する、すなわち両方の中性成分が同時に放出される、すなわち、１つの単一フラグメンテーションイベントにおいて発生する。
本発明の第１の態様の実施形態では、ニュートラル・ロス切断ユニットは、フラグメンテーションが可能な環状部分を含むか、又はそれからなる。本発明の第１の態様の実施形態では、ニュートラル・ロス切断ユニットは、特に逆付加環化反応によるフラグメンテーションが可能な複素環部分、特に４、５又は６員複素環部分を含むか又はそれからなる。本発明の第１の態様の実施形態では、ニュートラル・ロス切断ユニットは、５員ヘテロ環部分、特に互いに隣接する少なくとも２個のヘテロ原子、特に互いに隣接する２個のＮ原子を有する４員、５員、６員ヘテロ環部分を含むか、又はこれらからなる。本発明の第１の態様の実施形態では、ニュートラル・ロス切断ユニットは、トリアゾール、テトラゾール、オキサジアゾール、チアジアゾール部分、又はそれらの水素化誘導体を含むか、又はこれらからなる。本発明の第１の態様の実施形態では、ニュートラル・ロス切断ユニットは、１，２，３－トリアゾール、１，４，５－トリアゾール、３，４，５－トリアゾール部分、又は、２，３，４，５－テトラゾール若しくは２，３，５，６－テトラゾール部分を含むか、又はそれらからなる。
結合解離ユニットは、例えば、質量分析条件下で荷電種において解離することが可能な化学結合である。
アルファ切断は、例えば、特定の官能基に隣接する炭素炭素結合である。
電荷部位再配置は、電荷を有する原子に隣接する結合からの電子がその原子に移動し、元の電荷を中和し、それを異なる部位に移動させることである。
本発明の第１の態様の実施形態では、ＱはＺ１又はＺ２に共有結合している。特に、Ｑは、Ｚ１に直接結合しているか、又はＺ２に直接結合している。
本発明の第１の態様の実施形態では、Ｌ１はＺ１とＺ２とを共有結合させる。特に、Ｌ１は、以下の式に従ってＺ１に直接連結され、Ｚ２に直接連結される。Ｚ１－Ｌ１－Ｚ２。
本発明の第１の態様の実施形態では、化合物はＺ１とＺ２との間でフラグメントされる。特に、化合物は、リンカーＬ１の切断によってフラグメント化される。
本発明の第１の態様の実施形態では、化合物は、以下の式１－Ｉ～１－ＩＩＩ：
（Ｚ１－Ｌ１－Ｚ２－Ｑ）Ｎ（Ｎ≧１）（１－Ｉ）、
（Ｑ－Ｚ１－Ｌ１－Ｚ２）Ｎ（Ｎ≧１）（１－ＩＩ）、
（Ｚ１－Ｚ２－Ｑ）Ｎ（Ｎ≧１）（１－ＩＩＩ）、の１つを含む。
この文脈において、「Ｎ」は、化合物の正味電荷を意味する。
下記及び／又は上記の開示の文脈において、「Ｎ≧１」は、Ｎが＋１（プラス１）以上であることを意味する。加えて、又は代替的に、「Ｎ≧１」は、Ｎが－１（マイナス１）以上であることを意味する。
本発明の第１の態様の実施形態では、化合物は式１－Ｉを含み、以下の群：
Figure 2023525915000002
 から選択される。
これらの実施形態の例は、二重荷電、特に二重正荷電である。
本発明の第１の態様の実施形態では、Ｚ１及びＺ２は、互いに独立して、キレート錯体、ホスホニウム、アンモニウム、カルベニウム、ピリジニウム、スルホニウム、Ｎ、Ｓ、Ｈ、及びＣ原子のいずれかを含む３～１０員環の荷電複素環又はその誘導体を含む。
本発明の第１の態様の実施形態では、化合物は、式１－ＩＶ：（Ｚ１－（Ｌ１－Ｚ２）Ｍ－（Ｌ２－Ｚｏ）Ｋ－Ｑ）Ｎ
を含み、
式中、
Ｚｏは、特に正又は負又は中性の荷電ユニットを含む荷電ユニットであり、
Ｌ２は置換又は非置換リンカーであり、特にＬ２はＬ１であるか、又はＬ２はフラグメンテーションによる切断可能な基であり、
Ｍ＞０、Ｋ＞０及びＮ≧１である。Ｌ１、Ｚ１、Ｚ２及びＱは、上記と同じ意味を有する。
この文脈において、「Ｎ」は、化合物の正味電荷を意味する。特に、Ｚｏ＝０の場合はＮ＝Ｍ＋１（－１）であり、Ｚｏが荷電である場合はＮ＝Ｍ＋１（－１）－Ｋである。
本発明の第１の態様の実施形態では、Ｚｏは荷電ユニットである。Ｚｏは、第一級、第二級、第三級又は第四級アンモニウム、カルベニウム、スルホニウム、イミダゾリウム、ピリジニウム、Ｎ、Ｓ、Ｈ及びＣ原子を含有する３～１０員環の荷電複素環若しくはそれらの誘導体、キレート錯体又はホスホニウムからなる群から選択することができる。第１の態様の特定の実施形態では、正荷電部分は、トリ－メチル－アンモニウム、Ｎ，Ｎ－ジメチル－ピペリジニウム、又はＮ－アルキル－キヌクリジニウムである。
本発明の第１の態様の実施形態では、Ｌ２は置換リンカー又は非置換リンカーである。Ｌ２は、フラグメンテーションによる切断可能な基、例えば、Ｍｃ Ｌａｆｆｅｒｔｙフラグメンテーション部分、Ｒｅｔｒｏ Ｄｉｅｌｓ Ａｌｄｅｒフラグメンテーション部分、ベンジル又は脂肪族である。
本発明の第１の態様の実施形態では、Ｍは０、１、２、３、４又は５である。
本発明の第１の態様の実施形態では、Ｋは０、１、２、３、４又は５である。
本発明の第１の態様の実施形態では、化合物は、式１－ＩＶ（Ｍ＝１かつＫ＝１）を含む。例えば、化合物は、以下の群：
Figure 2023525915000003
 から選択される。
本発明の第１の態様の実施形態では、化合物は、式１－Ｖ：（Ｚ１－（Ｌ３－Ｚ２）Ｍ－（Ｌ２－Ｚｏ）Ｋ－Ｑ）Ｎ
を含み、
式中、
Ｚｏは、特に正又は負又は中性のいずれかの荷電ユニットを含む荷電ユニットであり、特に荷電ユニットは正又は負のいずれかの荷電ユニットを含み、
Ｌ２は置換又は非置換リンカーであり、特にＬ２はＬ１であるか、又はＬ２はフラグメンテーションによる切断可能な基であり、
Ｌ３は、置換又は非置換リンカー、特にフラグメンテーションによる切断不可能な性基、例えばベンジル又はジアゾであり、
Ｍ＞０、Ｋ＞０及びＮ≧１である。Ｌ１、Ｚ１、Ｚ２及びＱは、上記と同じ意味を有する。
本発明の第１の態様の実施形態では、Ｌ３は置換又は非置換リンカーである。Ｌ３は、フラグメンテーションによる切断可能な基、例えば、Ｍｃ Ｌａｆｆｅｒｔｙフラグメンテーション部分、Ｒｅｔｒｏ Ｄｉｅｌｓ Ａｌｄｅｒフラグメンテーション部分、ベンジル又は脂肪族から選択される。あるいは、Ｌ３は、特に、ベンジル基、ジアゾ基、又は、少なくとも１個若しくは２個の炭素原子（Ｃ１－Ｃ２）からなる脂肪族基及びＣ１－Ｃ２からなる脂肪族基などの、フラグメンテーションを介して切断不可能な基である。
本発明の第１の態様の実施形態では、化合物は、式１－Ｖ（Ｍ＝１かつＫ＝１）を含む。例えば、化合物は、標識６又は標識７から選択される。
本発明の第１の態様の実施形態では、化合物は、式１－ＶＩ：（（Ｚ１）Ｍ－Ｌ１－Ｚ２－（Ｌ２／Ｌ３）Ｋ－Ｚｏ）Ｎ－Ｑ
を含み、
式中、
Ｚｏは、特に正又は負又は中性の荷電ユニットを含む荷電ユニットであり、
Ｌ２は置換又は非置換リンカーであり、特にＬ２はＬ１であるか、又はＬ２はフラグメンテーションによる切断可能な基であり、
Ｌ３は、置換又は非置換リンカー、特にフラグメンテーションによる切断不可能な性基、例えばベンジル又はジアゾであり、
Ｍ＞０、Ｋ≧０及びＮ≧１である。Ｌ１、Ｚ１、Ｚ２及びＱは、上記と同じ意味を有する。
本発明の第１の態様の実施形態では、化合物は、式１－ＶＩを含み、
Figure 2023525915000004
 である。
本発明の第１の態様の実施形態では、化合物は、式１－ＶＩＩ：（Ｚ１－Ｌ１－Ｚ２－Ｑ）Ｎ
を含み、
式中、Ｎ≧１である。Ｌ１、Ｚ１、Ｚ２及びＱは、上記と同じ意味を有する。
本発明の第１の態様の実施形態では、化合物は、式１－ＶＩＩＩ：
Figure 2023525915000005
 を含み、
式中、
Ｚｏは、特に、正又は負又は中性の荷電ユニットを含む荷電ユニットであり、
Ｌ２は置換又は非置換リンカーであり、特にＬ２はＬ１であるか、又はＬ２はフラグメンテーションによる切断可能な基であり、
Ｌ３は、置換又は非置換リンカー、特にフラグメンテーションによる切断不可能な性基、例えばベンジル又はジアゾであり、
Ｎ＞１、Ｍ＞０及びＫ＞０である。Ｚ１、Ｚ２及びＱは、上記と同じ意味を有する。
本発明の第１の態様の実施形態では、化合物は、式１－ＩＸ：
Figure 2023525915000006
 を含み、
式中、
Ｚｏは、特に正又は負又は中性の荷電ユニットを含む荷電ユニットであり、
Ｌ２は置換又は非置換リンカーであり、特にＬ２はＬ１であるか、又はＬ２はフラグメンテーションによる切断可能な基であり、
Ｌ３は、置換又は非置換リンカー、特にフラグメンテーションによる切断不可能な性基、例えばベンジル又はジアゾであり、
Ｎ≧１である。Ｚ１、Ｚ２及びＱは、上記と同じ意味を有する。
本発明の第１の態様の実施形態では、化合物は、式１－ＩＸを含み、
Figure 2023525915000007
 から選択される。
標識９及び１０は負の二重荷電である。
本発明の第１の態様の実施形態では、化合物は、式１－Ｘ：
Figure 2023525915000008
 を含み、
式中、
Ｚｏは、特に、正又は負又は中性の荷電ユニットを含む荷電ユニットであり、
Ｎ≧１及びＭ＞０である。Ｌ１、Ｚ１、Ｚ２及びＱは、上記と同じ意味を有する。
本発明の第１の態様の実施形態では、化合物は、式１－ＸＩ：
Figure 2023525915000009
 を含み、
式中、
Ｚｏは、特に、正又は負又は中性の荷電ユニットを含む荷電ユニットであり、
Ｚ３は、多重荷電ユニット、特に多重荷電金属ユニットであり、
Ｌ３は、置換又は非置換リンカー、特に、ベンジル基、ジアゾ基、又は、少なくとも１個若しくは２個の炭素原子（Ｃ１－Ｃ２）からなる脂肪族基及びＣ１－Ｃ２からなる脂肪族基などの、フラグメンテーションを介して切断不可能な基である。
Ｌｉｇ１は、多重荷電金属錯体結合配位子であり、特に、高い結合定数ｌｏｇＫｂ＞５に依存し、Ｎ≧１である。Ｌ１及びＱは、上記と同じ意味を有する。
本発明の第１の態様の実施形態では、Ｌｉｇ１は、多重荷電金属錯体結合配位子であり、以下の群：アセチルアセトネート（ａｃａｃ）、２－（２－アミノエチルアミノ）エタノール、２，２’－ビス（ジフェニルホスフィノ）－６，６’－ジメトキシ－１，１’－ビフェニル、２，２’－ビス（ジフェニルホスフィノ）－１，１’－ビナフチル、１，２－ビス［４，５－ジヒドロ－３Ｈ－ビナフト［１，２－ｃ：２’，１’－ｅ］ホスフェピノ］ベンゼン（ＢＩＮＡＰＨＡＮＥ）、１，１’－ビ－２－ナフトール（ＢＩＮＯＬ）、５，５’－ジ－ｔｅｒｔ－ブチル－２，２’－ビピリジン、ビス（オキサゾリン）配位子（ＢＯＸ）、２，２’－ビピリジン、ビス（ジフェニルホスフィノ）ブタン、１，５－シクロオクタジエン、ベンジル（メチル）フェニルホスフィン、１，２－ビス（２，５－ジエチルホスホラノ）エタン、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル－４－ジフェニルホスフィノ－２－（ジフェニルホスフィノメチル）ピロリジン、ビス（４－イソプロピル－４，５－ジヒドロオキサゾール－２－イル）フェニルアミン（ｂｏｐａ－ｉｐ）、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸（ＤＯＴＡ）、Ｎ－複素環カルベン、１，１０－フェナントロリン、ポルフィン、ターピリジン（ｔｅｒｐｙ）、トリフェニルホスフィン、１，２－ビス（ｏ－アミノフェノキシ）エタン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸（ＢＡＰＴＡ）、ビス（ジフェニルホスフィノ）メタン（ｄｐｐｍ）、１，２－ビス（ジフェニルホスフィノ）エタン（ｄｐｐｅ）、１，３－ビス（ジフェニルホスフィノ）プロパン（ｄｐｐｐ）、クラウンエーテル、［２．２．２］クリプタンド、シクロペンタジエニルアニオン、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレンジアミノトリアセテート（ＴＥＤ）、エチレンビス（オキシエチレントリロ）テトラアセテート（ｅｇｔａ４－）、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、トリス（ｏ－トリル）ホスフィン、トリス（２－アミノエチル）アミン、シクロヘキシル－ｏ－アニシルメチルホスフィン（ＣＡＭＰ）、フェニル－ｏ－アニシルメチルホスフィン（ＰＡＭＰ）、トロピリウムイオン、シトレート、シクロオクテン、シクロオクタテトラエン（ＣＯＴ）、シクロペンタジエニルイオン（Ｃｐ）、１，２，３，４，５－ペンタメチルシクロペンタジエニルイオン（Ｃｐ＊）、１，４－ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン（ＤＡＢＣＯ）、ジベンジリデンアセトン（ｄｂａ）、４－ジメチルアミノピリジン（ＤＴＰＡ）、ネオクプロイン、ビス（２，５－ジメチルホスホラノ）ベンゼン、（３，５－ジオキサ－４－ホスファシクロヘプタ［２，１－ａ；３，４－ａ’］ジナフタレン－４－イル）ジメチルアミン（ＭｏｎｏＰｈｏｓ）、１，３－ジケチミン酸配位子、ビシクロ［２．２．１］ヘプタ－２，５－ジエン、アセテート、オキサレート、８－ヒドロキシキノリン、フタロシアニン、ピコリルアミン、２－フェニルピリジン、ピラジン、サレン配位子、１，４，７－トリアザシクロノナン（ＴＡＣＮ）、タルトレート、トリスピラゾリルボレート、テトラフェニルポルフィリン（ＴＰＰ）、３，３’，３’’－ホスホネトリイルトリス（ベンゼンスルホン酸）三ナトリウム塩（ｔｐｐｔｓ）、５－（３－ピリジル）－１Ｈ－テトラゾール、２－（１Ｈ－イミダゾール－２－イル）ピリジン、２－（１Ｈ－１，２，４－トリアゾール－３－イル）ピリジン、ピコリン、２，２’－ビピリジン－４－ブタン酸から選択される。
本発明の第１の態様の実施形態では、化合物は、式１－ＸＩを含み、
Figure 2023525915000010
 である。
本発明の第１の態様の実施形態では、化合物は、式１－ＸＩＩ：
Figure 2023525915000011
 を含み、
式中、
Ｚｏは、特に、正又は負又は中性の荷電ユニットを含む荷電ユニットであり、
Ｚ３は、多重荷電ユニット、特に多重荷電金属ユニットであり、
Ｌ３は、置換又は非置換リンカー、特にフラグメンテーションによる切断不可能な性基、例えばベンジル又はジアゾであり、
Ｌｉｇ１は、多重荷電金属錯体結合配位子であり、特に、結合定数ｌｏｇＫＢ＞５に依存する
Ｌｉｇ２は、多重荷電金属錯体結合配位子であり、特に、結合定数に依存する：１≦ｌｏｇＫＢ≦５
Ｎ≧１である。Ｑは、上記と同じ意味を有する。
本発明の第１の態様の実施形態では、Ｌｉｇ１は複合体中に２回存在する。
本発明の第１の態様の実施形態では、Ｌｉｇ１はＬｉｇ２に等しい。
本発明の第１の態様の実施形態では、Ｌｉｇ１は、上記の群から選択することができる。
本発明の第１の態様の実施形態では、Ｌｉｇ２は、多重荷電金属錯体結合配位子である。Ｌｉｇ２は、以下の群：
２－（２－アミノエチルアミノ）エタノール、１，１’－ビ－２－ナフトール（ＢＩＮＯＬ）、ビス（オキサゾリン）－配位子（ＢＯＸ）、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル－４－ジフェニルホスフィノ－２－（ジフェニルホスフィノメチル）ピロリジン、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸（ＤＯＴＡ）、Ｎ－複素環式カルベン、アミノポリカルボン酸、１，２－ビス（ｏ－アミノフェノキシ）エタン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸（ＢＡＰＴＡ）、クラウンエーテル、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレンビス（オキシエチレンニトリロ）四酢酸（ｅｇｔａ４－）、イミノ二酢酸、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、トリス（２－アミノエチル）アミン、死とレート、シクロオクテン、シクロオクタテトラエン（ＣＯＴ）、アセテート、オキサレート、ピコリルアミン、タルトレート、エチレンジアミノトリアセテート（ＴＥＤ）、２，２’－ビピリジン－４－ブタン酸から選択することができる。
本発明の第１の態様の実施形態では、化合物は、式１－ＸＩＩＩ：（Ｚ１－Ｌ３－Ｚ２－Ｌ１－Ｚ３－Ｌ２－Ｚｏ－Ｑ）Ｎを含む。Ｚ１、Ｌ３、Ｚ２、Ｌ１、Ｚ３、Ｌ２、Ｚｏ、Ｑ及びＮの各々は、上記と同じ意味を有する。
本発明の第１の態様の実施形態では、化合物は、
Figure 2023525915000012
 である。
本発明の第１の態様の実施形態では、Ｍは１であり、Ｋは１であり、Ｎは２である。
本発明の第１の態様の実施形態では、Ｍ、Ｎ、Ｋの各々は整数であり、０より大きい。これは、式１－Ｉ～１－ＸＩＩＩの括弧内の部分がＭ回又はＫ回繰り返され得ることを意味する。Ｎは、得られた分子の正味電荷である。
本発明の第１の態様の実施形態では、Ｌ１及びＬ２は、イオン源においてインソースフラグメンテーションで、又は衝突セルにおいて、すなわち異なる電位（電圧）でフラグメント化され得る。
本発明の第１の態様の実施形態では、化合物は、塩を形成するための対イオンを含み、対イオンは、好ましくは以下の群：Ｃｌ－、Ｂｒ－、Ｆ－、ホルメート、ＰＦ６ －、スルホネート、ホスフェート、アセテートから選択される。
本発明の第１の態様の実施形態では、化合物はトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含まない。強配位アニオンとしてのＴＦＡは、ＴＦＡ分子あたりの正味電荷を補償することができ、したがって、ＴＦＡ付加物として単一荷電種を形成することによって二重荷電部分（ｄｏｕｂｌｅ ｃｈａｒｇｅｄ ｍｏｊｅｔｙ）を阻害することができる。
本発明の第１の態様の実施形態では、化合物は、以下の群：
Figure 2023525915000013
 から選択される。
本発明の第１の態様の実施形態では、化合物は二重荷電、特に二重永久正荷電である。
本発明の第１の態様の実施形態では、化合物は、以下の群：
Figure 2023525915000014
 から選択される
第２の態様では、本発明は、本発明の第１の態様に関して上記で詳細に開示された化合物を含む、組成物に関する。本発明の第１の態様について述べた全ての実施形態は、本発明の第２の態様に適用され、逆もまた同様である。
第３の態様では、本発明は、本発明の第１の態様に関して上記で詳細に開示された化合物、又は本明細書の上記で詳細に開示された本発明の第２の態様の組成物を含む、キットに関する。本発明の第１の態様及び／又は本発明の第２の態様について述べた全ての実施形態は、本発明の第３の態様に適用され、その逆も同様である。
第４の態様では、本発明は、質量分析による決定を使用する分析物の定量的検出のための複合体に関し、複合体は、互いに共有結合した分析物と化合物とによって形成され、複合体は、永久電荷、特に永久正味電荷を含み、当該複合体は、質量ｍ３及び正味電荷ｚ３を有し、複合体は、質量分析による決定によるフラグメンテーション後に質量ｍ４＜ｍ３及び正味電荷ｚ４＜ｚ３を有する少なくとも１つの娘イオンを形成することが可能であり、ｍ３／ｚ３＜ｍ４／ｚ４である。
特に、分析物は、核酸、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、代謝産物、ホルモン、脂肪酸、脂質、炭水化物、ステロイド、ケトステロイド、セコステロイド、別の分子の特定の修飾を特徴とする分子、生物によって内在化された物質、そのような物質の代謝産物、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。本発明の第１の態様及び／又は本発明の第２の態様及び／又は本発明の第３の態様について述べた全ての実施形態は、本発明の第４の態様に適用され、逆もまた同様である。
本発明の第４の態様の実施形態では、化合物と分析物分子中に存在する官能基との間の共有結合の形成から生じる複合体。化合物の反応性ユニットＱ、及び分析物分子の官能基に応じて、当業者は、２つの間に形成された共有結合を充分に決定することができる。
本発明の第４の態様の実施形態では、ｍ３≧１００であり、例えば、ｍ３は、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５又は１５０である。
本発明の第４の態様の実施形態では、ｚ３及びｚ４の各々又は両方は、永久正味電荷である。
本発明の第４の態様の実施形態では、ｚ３及びｚ４の各々又は両方は、永久に正の正味荷電である。
本発明の第４の態様の実施形態では、ｚ３及びｚ４の各々又は両方は、永久に負の正味荷電である。
本発明の第４の態様の実施形態では、娘イオンは分析物又はそのフラグメントを含む。
本発明の第４の態様の実施形態では、娘イオンは、分析物及び化合物のフラグメントを含み、化合物のフラグメントは共有結合を介して分析物に結合しており、特に化合物のフラグメントは１つの永久電荷、特に１つの永久に正の正味電荷又は１つの永久に負の正味電荷を有する。
本発明の第４の態様の実施形態では、複合体は更なる娘イオンを形成することが可能であり、各々が化合物のフラグメントを含み、各々がｘ＞４のｍｘ／ｚｘ値を有し、更なる娘イオンのｍｘ／ｚｘ値の各々はｍ３／ｚ３値よりも小さい。さらなる娘イオンは、分析物又はそのフラグメントを更に含むことができる。
本発明の第４の態様の実施形態では、ｚ３＝２であり、フラグメンテーション後、複合体はｚ４＝１の娘イオン及び更なる娘イオンを形成することが可能であり、更なる娘イオンは正味電荷ｚ５（ｚ５＝１）を有し、娘イオン又は更なる娘イオンは分析物又はそのフラグメントを含む。二重荷電複合体は、複合体の２つの電荷の間で少なくとも２つの娘イオン、すなわち娘イオンと更なる娘イオンにフラグメント化される。娘イオン及び更なる娘イオンは、それぞれ１回荷電され、例えばそれぞれ１回正に荷電され、又はそれぞれ１回負に荷電される。
本発明の第４の態様の実施形態では、分析物は、核酸、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、代謝産物、ホルモン、脂肪酸、脂質、炭水化物、ステロイド、ケトステロイド、セコステロイド、別の分子の特定の修飾を特徴とする分子、生物によって内在化された物質、そのような物質の代謝産物、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。本発明の第１の態様について述べた分析物の全ての実施形態は、本発明の第４の態様に適用され、逆もまた同様である。
更に、分析物分子上に存在する官能基が、最初に、化合物の反応性ユニットＱとの反応により容易に利用可能な別の基に変換され得ることもまた、本発明の範囲内と考えられる。
本発明の第４の態様の実施形態では、分析物は、核酸、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、代謝産物、ホルモン、脂肪酸、脂質、炭水化物、ステロイド、ケトステロイド、セコステロイド、別の分子の特定の修飾を特徴とする分子、生物によって内在化された物質、そのような物質の代謝産物、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
本発明の第４の態様の実施形態では、分析物分子は、カルボニル基、ジエン基、ヒドロキシル基、アミン基、イミン基、チオール基、ジオール基、フェノール基、エキポキシド基、ジスルフィド基、及びアジド基からなる群より選択される官能基を含み、これらの各々は、化合物の反応性ユニットＱと共有結合を形成することができる。
本発明の第４の態様の実施形態では、分析物分子は、小分子代謝物及び補因子、並びに治療薬、依存性薬物、毒素、又はそれらの代謝産物を含む、ステロイド、ケトステロイド、セコステロイド、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、炭水化物、脂肪酸、脂質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸、及び他の生体分子からなる群から選択される。
本発明の第４の態様の実施形態では、複合体は、リンカーＬ１によって互いに離間された２つの正の永久電荷を含む。特に、２つの正の永久電荷のそれぞれは、正の永久正味電荷である。
本発明の第４の態様の実施形態では、複合体は、少なくとも３つのユニットＺ１、Ｚ２、Ｑ’及び任意の更なるユニットＬ１を含み、ユニットは互いに共有結合しており、
Ｑ’は、分析物と共有結合を形成する反応性ユニットであり、
Ｚ１が、少なくとも１つの永久に荷電した部分、特に永久に正に荷電した部分又は永久に負に荷電した部分を含む荷電ユニットであり、
Ｚ２が、少なくとも１つの永久に荷電した部分、特に永久に正に荷電した部分又は永久に負に荷電した部分を含む荷電ユニットであり、かつ
Ｌ１は、置換又は非置換リンカー、特に、フラグメンテーションによる切断可能な基、例えば、Ｍｃ Ｌａｆｆｅｒｔｙフラグメンテーション部分、Ｒｅｔｒｏ Ｄｉｅｌｓ Ａｌｄｅｒフラグメンテーション部分、ベンジル又は脂肪族であり、かつ
複合体の正味電荷は１より大きい。Ｚ１、Ｚ２及びＬ１は、本発明の第１の態様の実施形態に関してＺ１、Ｚ２及びＬ１について述べたのと同じ意味を有することができる。
本発明の第４の態様の実施形態では、Ｑ’は、本発明の第１の態様の化合物の反応性ユニットＱと分析物分子に存在する官能基との間の共有結合の形成から生じる。本発明の第１の態様の化合物の反応性ユニットＱ、及び分析物分子の官能基に応じて、当業者は、２つの間に形成された共有結合を充分に決定することができる。
本発明の第４の態様の実施形態では、複合体の正味電荷は２、３、４又は５である。
本発明の第４の態様の実施形態では、複合体は、以下の式２－Ｉ～２－ＸＩ：
（Ｚ１－Ｌ１－Ｚ２－Ｑ’）Ｎ （２－Ｉ）
（Ｑ’－Ｚ１－Ｌ１－Ｚ２）Ｎ （２－ＩＩ）
（Ｚ１－Ｚ２－Ｑ’）Ｎ （２－ＩＩＩ）
（Ｚ１－（Ｌ１－Ｚ２）Ｍ－（Ｌ２－Ｚｏ）Ｋ－Ｑ’）Ｎ （２－ＩＶ）
（Ｚ１－（Ｌ３－Ｚ２）Ｍ－（Ｌ２－Ｚｏ）Ｋ－Ｑ’）Ｎ （２－Ｖ）
（（Ｚ１）Ｍ－Ｌ１－Ｚ２－（Ｌ２／Ｌ３）Ｋ－Ｚｏ）Ｎ－Ｑ’ （２－ＶＩ）
Figure 2023525915000015
 から選択され、
分析物は、Ｑ’に共有結合しており、
Ｚ１が、少なくとも１つの永久に荷電した部分、特に永久に正に荷電した部分又は永久に負に荷電した部分を含む荷電ユニットであり、
Ｌ１は、置換又は非置換リンカー、特に、フラグメンテーションによる切断可能な基、例えば、Ｍｃ Ｌａｆｆｅｒｔｙフラグメンテーション部分、Ｒｅｔｒｏ Ｄｉｅｌｓ Ａｌｄｅｒフラグメンテーション部分、ベンジル又は脂肪族であり、
Ｚ２は、少なくとも１つの永久に荷電した部分、特に永久に正に荷電した部分又は永久に負に荷電した部分を含む荷電ユニットであり、
Ｚｏは、特に正又は負又は中性の荷電ユニットを含む荷電ユニットであり、
Ｚ３は、多重荷電ユニット、特に多重荷電金属ユニットであり、
Ｌ３は、置換又は非置換リンカー、特にフラグメンテーションによる切断不可能な性基、例えばベンジル又はジアゾであり、
Ｌｉｇ１は、多重荷電金属錯体結合配位子であり、特に、結合定数ｌｏｇＫＢ＞５に依存し、
Ｌ２は置換又は非置換リンカーであり、特にＬ２はＬ１であるか、又はＬ２はフラグメンテーションによる切断可能な基であり、
Ｌｉｇ２は、多重荷電金属錯体結合配位子であり、特に、結合定数に依存する：１≦ｌｏｇＫＢ≦５、
Ｍ＞０、Ｋ＞０及びＮ≧１である。
本発明の第４の態様の実施形態では、結合化合物は、分析物のカルボニル基、ヒドロキシル基又はジエン基を介して共有結合して、該複合体を形成する。結合化合物は、化合物－分析物複合体の化合物を意味する。
第５の態様では、本発明は、分析物の質量分析による決定のための化合物の使用に関する。好ましくは、質量分析による決定は、タンデム質量分析による決定、特にトリプル四重極質量分析による決定を含む。本発明の第１の態様及び／又は本発明の第２の態様及び／又は本発明の第３の態様及び／又は本発明の第４の態様について述べた全ての実施形態は、本発明の第５の態様に適用され、逆もまた同様である。
本発明の第５の態様の実施形態では、本発明の第１の態様の化合物又は本発明の第４の態様の複合体の質量分析スペクトルのシグナル対ノイズ比は、最大値として１以下の１回永久正味電荷を有する例示的な複合体又は例示的な化合物の質量分析スペクトルと比較して低い。
第６の態様では、本発明は、分析物の質量分析による決定のための方法に関し、
（ａ）分析物を本発明の第１の態様に関して本明細書で開示した化合物と反応させる工程であって、それにより、本発明の第４の態様に関して本明細書で開示した複合体が形成される、分析物を本発明の第１の態様に関して本明細書で開示した化合物と反応させる工程と、
（ｂ）工程（ａ）からの複合体を質量分光分析に供することと、を含む。
本発明の第６の態様の実施形態では、質量分光分析工程（ｂ）は、
（ｉ）前記複合体のイオンを質量分光分析の第１段階に供することによって、前記複合体の前記イオンが、その質量／電荷（ｍ／ｚ）比に従って特徴付けられる工程と、
（ｉｉ）複合体のイオンのフラグメンテーションを引き起こす工程であって、それにより、第１の実体、特に低分子量の実体が放出され、かつ複合体の娘イオンが生成され、複合体の娘イオンは、そのｍ／ｚ比が複合体のイオンとは異なる、複合体のイオンのフラグメンテーションを引き起こす工程と、
（ｉｉｉ）前記複合体の前記娘イオンを質量分光分析の第２段階に供することによって、前記複合体の前記娘イオンが、そのｍ／ｚ比に従って特徴付けられる工程と、を含み、並びに／又は、
（ｉｉ）は、複合体のイオンの代替的なフラグメンテーションを更に含んでもよく、それにより、第１の実体とは異なる第２の実体が放出され、複合体の第２の娘イオンが生成され、かつ、
（ｉｉｉ）は、複合体の第１の娘イオン及び第２の娘イオンを質量分光分析の第２段階に供することを更に含んでもよく、それにより、複合体の第１の娘イオン及び第２の娘イオンが、それらのｍ／ｚ比に従って特徴付けられ、
第１の娘イオン及び／又は第２の娘イオンのｍ／ｚ比は、複合体のイオンのｍ／ｚ比よりも大きい。
本発明の第６の態様の実施形態では、工程（ａ）の前の更なる工程（ａ’）は、
（ａ’）複合体のイオン又は化合物のイオンを、対イオンのイオン交換に供することを含み、対イオンとして、特に強く配位しているアニオン、例えばトリフルオロアセテートが、塩化物、臭化物又は弱く配位している対イオンによって交換される。
弱い対イオンは、気相中の分析物に結合しないイオンである。これは、イオン源を介して質量分析計を導入することによって解離する。
強く配位しているアニオンとは、対イオンとして強く配位しているアニオンを含む複合体又は化合物の結合定数が、気相中の対イオンとして塩化物を含む対応する複合体又は化合物の結合定数よりも大きいことを意味する。
本発明の第６の態様の実施形態では、第１の実体及び／又は第２の実体は、トリメチルアミン、ピリジン、ホスフィン、トリメチルアミン、トリプロピルアミン、トリブチルアミンジメチルエチルアミン、メチルジエチルアミン及びトリアルキルアミンからなる群から選択される。
工程（ａ）は、質量分析による決定に先立って、試料調製ワークフロー内の異なる段階で生じ得る。分析物分子を含む試料は、種々の方法によって前処理、かつ／又は濃縮することができる。前処理法は、血液（新鮮又は乾燥）、血漿、血清、尿、又は唾液といった試料の種類に依存し、一方で濃縮法は、目的の分析物に依存する。前処理試料がどの試料型に適しているかは、当業者に周知である。どの濃縮法が目的のどの分析物に適しているかもまた、当業者によく知られている。
本発明の第６の態様の実施形態では、分析物分子の質量分析による決定のための本方法の工程（ａ）は、（ｉ）試料の前処理工程に続いて、（ｉｉ）試料の第１の濃縮に続いて、又は（ｉｉｉ）試料の第２の濃縮に続いて行われる。
試料が全血試料である本発明の第６の態様の実施形態では、該試料は２つの所定の試料前処理（ＰＴ）ワークフローのうちの１つに割り当てられ、これら両方は内部標準（ＩＳＴＤ）及び溶血試薬（ＨＲ）の添加に続いて所定のインキュベーション期間（Ｉｎｃ）を含み、ここで、２つのワークフローの差は、内部標準（ＩＳＴＤ）及び溶血試薬（ＨＲ）が添加される順序である。実施形態では、水は溶血試薬として、特に０．５：１～２０：１ｍｌの水／ｍｌ試料の量、特に１：１～１０：１ｍＬの水／ｍＬ試料の量、特に２：１～５：１ｍｌの水／ｍｌ試料の量で加えられる。
本発明の第６の態様の実施形態では、試料は尿試料であり、該試料は他の２つの所定のＰＴワークフローのうちの１つに割り当てられ、これら両方は内部標準及び酵素試薬の添加に続いて所定のインキュベーション期間を含み、ここで、２つのワークフローの差は、内部標準及び酵素試薬が添加される順序である。酵素試薬は、典型的には、グルクロニド開裂若しくはタンパク質開裂、又は分析物若しくはマトリックスの任意の前処理に使用される試薬である。追加の工程では、本明細書の上記又は下記で開示されるような本発明の化合物などの誘導体化試薬を加え、その後、インキュベーション期間が続く。
本発明の第６の態様の実施形態では、酵素試薬は、グルクロニダーゼ、（部分的）エキソ若しくはエンド脱グリコシル化酵素、又はエキソ若しくはエンドプレオテアーゼ（ｐｒｅｏｔｅａｓｅｓ）からなる群から選択される。実施形態では、グルクロニダーゼを、０．５～１０ｍｇ／ｍＬの量で、特に１～８ｍｇ／ｍＬの量で、特に２～５ｍｇ／ｍＬの量で加える。
本発明の第６の態様の実施形態では、該試料は血漿又は血清であり、所定のインキュベーション時間に先立つ内部標準（ＩＳＴＤ）の添加のみを含む、別の所定のＰＴワークフローに割り当てられる。
本明細書の上記又は下記で記載されているように、考慮される試料処理、化学反応、又は方法工程のために選択するインキュベーション時間及び温度は、当業者に良く知られている。特に、当業者には、インキュベーション時間及び温度が互いに依存し、例えば、高温は典型的にはより短いインキュベーション期間をもたらすが、逆もまた同様であることが既知である。本発明の第６の態様の実施形態では、インキュベーション温度は、４～４５℃の範囲、特に１０～４０℃の範囲、特に２０～３７℃である。実施形態では、インキュベーション時間は、３０秒～１２０分、特に３０秒～１分、３０秒～５分、３０秒～１０分、１分～１０分、又は１分～２０分、１０分～３０分、３０分～６０分、又は６０分～１２０分の範囲である。特定の実施形態では、インキュベーション時間は、３６秒の倍数である。
したがって、本方法の実施形態である工程（ａ）は、上で開示された試料の前処理プロセスのいずれかに続いて実施する。
本発明の第６の態様の実施形態では、化合物と工程（ａ）の分析物分子との反応は、任意の濃縮プロセスの前に行い、化合物を対象の前処理された試料に加える。したがって、分析物分子と化合物との複合体は、前処理の後かつ第１の濃縮プロセスの前に形成される。したがって、複合体は、工程（ｂ）の質量分光分析に供される前に、第１の濃縮プロセス及び第２の濃縮プロセスに供される。
前処理した試料は、分析物濃縮ワークフローへ更に供することができる。分析物濃縮ワークフローは、１つ以上の濃縮方法を含み得る。濃縮方法は当該技術分野においてよく知られており、化学的沈殿を含むがこれに限定されない化学的濃縮方法、並びに固相抽出方法、ビーズワークフロー、及びクロマトグラフ法（例えば、ガス又は液体クロマトグラフィ）を含むがこれらに限定されない固相を用いる濃縮方法を含むが、これらに限定されるものではない。
本発明の第６の態様の実施形態では、第１の濃縮ワークフローは、前処理した試料に分析物選択基を運ぶ固相、特に固体ビーズを加えることを含む。本発明の第６の態様の実施形態では、第１の濃縮ワークフローは、前処理した試料に分析物選択基を運ぶ、磁性又は常磁性ビーズを加えること含む。本発明の第６の態様の実施形態では、磁性ビーズの添加は、撹拌又は混合を含む。ビーズ上の対象分析物（複数可）を捕捉するための、所定のインキュベーション期間がこれに続く。本発明の第６の態様の実施形態では、ワークフローは、磁性ビーズとのインキュベーション後に洗浄工程（Ｗ１）を含む。分析物（複数可）に応じて、１つ以上の追加の洗浄工程（Ｗ２）を実施する。１つの洗浄工程（Ｗ１、Ｗ２）は、磁石又は電磁石を含む磁気ビーズ操作ユニットによる磁気ビーズ分離、液体の吸引、洗浄緩衝液の添加、磁気ビーズの再懸濁、別の磁気ビーズ分離工程、及び液体の別の吸引を含む、一連の工程からなる。その上、洗浄工程は、洗浄サイクルの容量及び数又は組み合わせとは別に、溶媒の種類（水／有機／塩／ｐＨ）の点で異なってもよい。各パラメータの選択方法は、当業者にはよく知られている。最後の洗浄工程（Ｗ１、Ｗ２）には、溶出試薬の添加、次いで磁気ビーズの再懸濁、及び磁気ビーズから目的の分析物（複数可）を放出するための所定のインキュベーション期間が続く。その後、結合のない磁気ビーズを分離し、目的の誘導体化分析物（複数可）を含有する上清を捕捉する。
本発明の第６の態様の実施形態では、第１の濃縮ワークフローは、前処理した試料にマトリックス選択基を運ぶ、磁性ビーズを加えること含む。本発明の第６の態様の実施形態では、磁性ビーズの添加は、撹拌又は混合を含む。ビーズ上のマトリックスを捕捉するための、所定のインキュベーション期間がこれに続く。ここで、目的の分析物は磁気ビーズに結合せず、上清中に残る。その後、磁気ビーズを分離し、目的の濃縮分析物（複数可）を含有する上清を収集する。
本発明の第６の態様の実施形態では、上清を、第２の濃縮ワークフローに供する。ここで、上清はＬＣステーションへ移送されるか、又は希釈液の添加による希釈工程の後にＬＣステーションへ移送される。異なる溶出手順／試薬、例えば溶媒の種類（水／有機／塩／ｐＨ）及び容量を変える等も使用することができる。様々なパラメータが当業者によく知られており、容易に選択される。
本発明の第６の態様の実施形態では、本方法の工程（ａ）は、前処理方法の直後に行われなかった。該工程ａ）は、本明細書中の上に記載されるように、磁性ビーズを用いた第１の濃縮ワークフローの後に行われてもよい。
本発明の第６の態様の実施形態では、分析物特異的磁性ビーズが使用され、本明細書中で上記又は以下に開示される化合物は、洗浄工程（Ｗ１、Ｗ２）が、溶出試薬の前、溶出試薬と共に、又は溶出試薬に続くかのいずれかで終結された後、対象の試料に添加され、その後、インキュベーション期間（定義された時間及び温度）が続く。
本発明の第６の態様の実施形態では、次いで、結合のない磁性ビーズを分離し、工程（ａ）の複合体を含有する上清を回収する。本発明の第６の態様の実施形態では、工程（ａ）の複合体を含有する上清は第２の濃縮ワークフローに移され、特に、ＬＣステーションへと直接移されるか、又は希釈液の添加による希釈工程の後に移されるかのいずれかである。
本発明の第６の態様の実施形態では、マトリックス特異的磁性ビーズが使用され、本明細書中の上記又は下記で開示される化合物は、磁気ビーズが分離される前又は後に、対象試料へと添加される。本発明の第６の態様の実施形態では、工程（ａ）の複合体を含有する上清は第２の濃縮ワークフローに移され、特に、ＬＣステーションへと直接か、又は希釈液の添加による希釈工程の後に移されるかのいずれかである。
したがって、本発明の第６の態様の実施形態では、化合物と工程（ａ）における分析物分子との反応が第１の濃縮プロセスに続いて行われ、化合物は、第１の濃縮プロセス、特に磁性ビーズを用いる第１の濃縮プロセスの後に対象の試料へと添加されると結論される。したがって、試料は、まず本明細書で上に記載されるように前処理され、次いで特に、本明細書で上に記載されるように分析物選択基を運ぶ磁性ビーズを用いる第１の濃縮プロセスに供され、そして、ビーズからの溶出の前に、ビーズからの溶出と同時に、又はビーズからの溶出後に、化合物が添加される。したがって、分析物分子と化合物との複合体は、第１の濃縮プロセスの後かつ第２の濃縮プロセスの前に形成される。したがって、複合体は、工程（ｂ）の質量分光分析に供される前に、第２の濃縮プロセスに供される。
本発明の第６の態様の別の実施形態では、本方法の工程（ａ）は、第２の分析物濃縮ワークフローの後に行われる。第２の濃縮ワークフローでは、試料中の対象分析物を更に濃縮するために、クロマトグラフ分離を使用する。本発明の第６の態様の実施形態では、クロマトグラフ分離は、ガス又は液体クロマトグラフィである。どちらの方法も当業者にはよく知られている。本発明の第６の態様の実施形態では、液体クロマトグラフィは、ＨＰＬＣ、ラピッドＬＣ、マイクロＬＣ、フローインジェクション、並びにトラッッピング及び溶出からなる群から選択される。
本発明の第６の態様の実施形態では、本方法の工程（ａ）は、クロマトグラフ分離と同時に又はその後に行われる。本発明の第６の態様の実施形態では、化合物を、溶出緩衝液と共にカラムへと添加する。代替的な実施形態では、化合物を、ポストカラムに添加する。
本発明の第６の態様の実施形態では、第１の濃縮プロセスは、分析物選択的磁性ビーズの使用を含む。本発明の第６の態様の実施形態では、第２の濃縮プロセスは、特に液体クロマトグラフィを用いるクロマトグラフ分離の使用を含む。
したがって、本発明の第６の態様の実施形態では、化合物と工程（ａ）における分析物分子との反応が第２の濃縮プロセスに続いて行われ、化合物は、クロマトグラフィ、特に液体クロマトグラフィを用いる第２の濃縮プロセスの後に対象の試料へと添加されると結論される。したがってこの場合、該試料は、まず本明細書中で上に記載されるように前処理され、次いで特に、本明細書中で上に記載されるように磁性ビーズを用いて第１の濃縮プロセスに供され、その後、特に液体クロマトグラフィを用いてクロマトグラフ分離に供され、続いて化合物が添加される。したがって、結合分析物分子と結合化合物との複合体は、第２の濃縮プロセスの後に形成される。したがって、複合体は、工程（ｂ）の質量分光分析に供される前には、濃縮プロセスに供されない。
本発明の実施形態では、臨床診断システムは、本発明の第１の態様の化合物及び／又は本発明の第２の態様の組成物及び／又は本発明の第３の態様のキット及び／又は本発明の第４の態様の複合体を含む。追加的又は任意に、本発明の第１の態様の化合物は、分析物の質量分析による決定に使用され、臨床診断システムは質量分析による決定を含む。追加的又は任意に、本発明の第６の態様の分析物の質量分析による決定方法は、臨床診断システムによって実行される。
「臨床診断システム」とは、体外診断のための試料の分析専用の検査室用自動化装置である。臨床診断システムは、必要性に応じて、かつ／又は所望の実験室ワークフローに応じて、異なる構成を有することができる。さらなる構成は、複数の装置及び／又はモジュールを共に結合することによって得ることができる。「モジュール」は、専用機能を有する、臨床診断システム全体よりサイズが典型的には小さい作業セルである。この機能は、分析的であるとすることができるが、事前分析的又は事後分析的であるとすることもできる、あるいは、機能は、事前分析機能、分析機能、又は事後分析機能のうちの任意の機能に対する補助機能であるとすることができる。具体的には、例えば、１つ又は複数の事前分析、及び／又は事後分析工程を実行することによって、モジュールは試料処理ワークフローのうちの専用作業を行うために１つ又は複数の他のモジュールと共働するように構成され得る。特に、臨床診断システムは、特定の種類の分析、例えば臨床化学、免疫化学、凝固、血液学、液体クロマトグラフィ分離、質量分析などのために最適化されたそれぞれのワークフローを実行するように設計された１つ又は複数の分析装置を備えることができる。したがって、臨床診断システムは、１つの分析装置、又はそれぞれのワークフローを有するそのような分析装置のいずれかの組み合わせを含むことができ、事前分析及び／又は事後分析モジュールは、個々の分析装置に結合されるか、又は複数の分析装置によって共有され得る。代替法において、事前分析、及び／又は事後分析機能は、分析装置に統合されたユニットによって実施することができる。臨床診断システムは、試料及び／又は試薬及び／又はシステム流体のピペッティング及び／又は圧送及び／又は混合のための液体ハンドリングユニット等の機能ユニット、及び同様に、ソートする、格納する、輸送する、識別する、分離する、検出するための機能ユニットを備えることができる。臨床診断システムは、目的の分析物を含む試料の自動調製のための試料調製ステーション、複数のＬＣチャネルを備える液体クロマトグラフィ（ＬＣ）分離ステーション、及び／又は調製された試料をＬＣチャネルのいずれか１つに入力するための試料調製／ＬＣインターフェースを備えることができる。臨床診断システムは、それぞれが予め定義された一連の試料調製工程を含み、目的の分析物に応じて完了のために予め定義された時間を必要とする予め定義された試料調製ワークフローに試料を割り当てるようにプログラムされたコントローラを更に備えることができる。臨床診断システムは、質量分析計（ＭＳ）、及びＬＣ分離ステーションを質量分析計に接続するためのＬＣ／ＭＳインターフェースをさらに備える。本明細書で使用される「自動的に」又は「自動化」という用語は、広義の用語であり、当業者にとってその通常の慣習的な意味が与えられるべきであり、特別な又はカスタマイズされた意味に限定されるべきではない。この用語は、具体的には、限定されないが、少なくとも１つのコンピュータ及び／又はコンピュータネットワーク及び／又は機械によって、特に手動の動作及び／又はユーザとの相互作用なしに完全に実行されるプロセスを指すことができる。
「試料準備ステーション」は、１つ以上の分析装置又は分析装置内のユニットに結合した分析前モジュールであり得、試料中の妨げとなるマトリックス成分を除去又は少なくとも低減し、かつ／又は試料中の関心の分析物を濃縮することを目的とした一連の試料処理工程を実行するように設計される。このような処理工程は、試料又は複数の試料について順次、並列、又は時差をつけた様相で実行される以下の処理作業、すなわち流体のピペット操作（吸引及び／又は送出）、流体の圧送、試薬との混合、特定の温度での培養、加熱又は冷却、遠心分離、分離、フィルタ処理、ふるい分け、乾燥、洗浄、再懸濁、分取、移送、保管などのうちの１つ以上を含むことができる。
液体クロマトグラフィ（ＬＣ）分離ステーションは、例えば、関心の分析物を、例えば質量分析検出などの後の検出を依然として妨げる可能性がある試料準備後の残留マトリックス成分などのマトリックス成分から分離し、かつ／又は関心の分析物を個別の検出を可能にするために互いに分離するために、準備後の試料をクロマトグラフィ分離に供するように設計された分析装置又はモジュールあるいは分析装置内のユニットである。一実施形態によれば、ＬＣ分離ステーションは、質量分析用の試料を作成し、かつ／又は作成された試料を質量分析計へと移すように設計された中間分析装置又はモジュールあるいは分析装置内のユニットである。特に、ＬＣ分離ステーションは、複数のＬＣチャネルを備えるマルチチャネルＬＣステーションである。
臨床診断システム、例えばサンプル調製ステーションはまた、新しい試料調製開始シーケンスが開始される前に複数の試料を受け取るためのバッファユニットを備えてもよく、試料は個別にランダムにアクセス可能であってもよく、その個々の調製は試料調製開始シーケンスに従って開始されてもよい。
臨床診断システムは、質量分析に接続されたＬＣをより便利で信頼性高く利用し、したがって臨床診断に適している。特に、質量分析へのオンライン接続を可能にしながら、ランダムアクセス試料調製及びＬＣ分離を用いてハイスループット、例えば最大１００試料／時間又はそれ以上を得ることができる。さらに、プロセスを完全に自動化して、立ち去り時間（ｗａｌｋ－ａｗａｙ ｔｉｍｅ）を増やし、必要な技能のレベルを下げることができる。
さらなる実施形態では、本発明は、以下の態様に関する：
１．質量分析による決定を使用する分析物の定量的検出のための化合物であって、
前記化合物が、永久電荷、特に永久正味電荷を含んでおり、前記分析物に共有結合することが可能であり、
前記化合物が、質量ｍ１及び正味電荷ｚ１を有し、
前記化合物が、質量分析による決定によるフラグメンテーション後に、質量ｍ２＜ｍ１及び正味電荷ｚ２＜ｚ１を有する少なくとも１つの娘イオンを形成することが可能であり、
ｍ１／ｚ１＜ｍ２／ｚ２である、化合物。
２．ｍ１／ｚ１が少なくとも６０又それを超え、例えばＣ７Ｈ２ＯＮ２ ２＋については６６であり、かつ／又は、ｍ２／ｚ２が少なくとも７０又はそれを超え、例えば Ｃ４Ｈ１２Ｎ＋については７４である、態様１に記載の化合物。
３．スルホキシドユニット（ＳＯ）を含まない、態様１又は２に記載の化合物。
４．ｚ１が整数であり、２であるか、又は２を超える、態様１～３のいずれか１つに記載の化合物。
５．ｚ１が２、３、４又は５であり、好ましくはｚ１が２である、態様１～４のいずれか１つに記載の化合物。
６．ｚ２＝ｚ１－１、好ましくはｚ２が１である、態様１～５のいずれか１つに記載の化合物。
７．ｚ１及びｚ２の各々又は両方が、永久電荷、特に永久正味電荷である、態様１～６のいずれか１つに記載の化合物。
８．ｚ１及びｚ２の各々又は両方が、永久正電荷、特に永久に正の正味電荷である、態様１～７のいずれか１つに記載の化合物。
９．ｚ１及びｚ２の各々又は両方が、永久負電荷、特に永久に負の正味電荷である、態様１～８のいずれか１つに記載の化合物。
１０．正味電荷ｚ１が、化合物のｘ回の正の永久電荷及びｙ回の負の永久電荷の合計である、態様１～９のいずれか１つに記載の化合物。
１１．正味電荷ｚ２が、少なくとも１つの娘イオンのｘ回の正の永久電荷及びｙ回の負の永久電荷の合計である、態様１～１０のいずれか１つに記載の化合物。
１２．化合物が、更なる娘イオンを形成することが可能であり、更なる娘イオンの各々が化合物の１つのフラグメント又は複数のフラグメントを含み、各々がｘ＞４のｍｘ／ｚｘ値を有し、更なる娘イオンのｍｘ／ｚｘ値の各々がｍ１／ｚ１値よりも小さい、態様１～１０のいずれか１つに記載の化合物。
１３．少なくとも３つのユニットＺ１、Ｚ２、Ｑ及び任意の更なるユニットＬ１を含み、ユニットが互いに共有結合しており、
Ｑが、前記分析物と共有結合を形成可能な反応性ユニットであり、
Ｚ１が、少なくとも１つの永久に荷電した部分、特に永久に正に荷電した部分又は永久に負に荷電した部分を含む荷電ユニットであり、
Ｚ２が、少なくとも１つの永久に荷電した部分、特に永久に正に荷電した部分又は永久に負に荷電した部分を含む荷電ユニットであり、かつ
Ｌ１は、置換又は非置換リンカー、特に、フラグメンテーションによる切断可能な基、例えば、Ｍｃ Ｌａｆｆｅｒｔｙフラグメンテーション部分、Ｒｅｔｒｏ Ｄｉｅｌｓ Ａｌｄｅｒフラグメンテーション部分又は脂肪族であり、
前記化合物の前記正味電荷が１より大きい、態様１～１２のいずれか１つに記載の化合物。
１４．Ｚ１及びＺ２が少なくとも１つの原子によって互いに分離されている、態様１～１３のいずれか１つに記載の化合物。
１５．ＱがＺ１に共有結合しているか、又はＱがＺ２に共有結合している、態様１～１４のいずれか１つに記載の化合物。
１６．Ｌ１がＺ１及びＺ２を共有結合的に連結する、態様１～１５のいずれか１つに記載の化合物。
１７．Ｚ１とＺ２との間でフラグメント化されている、態様１～１６のいずれか１つに記載の化合物。
１８．式１－Ｉ：（Ｚ１－Ｌ１－Ｚ２－Ｑ）Ｎ（Ｎ≧１）
を含む、態様１～１７のいずれか１つに記載の化合物。Ｎ≧１は、Ｎ≧＋１及び／又はＮ≧－１を意味することができる。Ｎ≧＋１は、例えば、＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、＋６などを意味することができる。Ｎ≧－１は、例えば、－１、－２、－３、－４、－５、－６などを意味することができる。
１９．式１－ＩＩ：
（Ｑ－Ｚ１－Ｌ１－Ｚ２）Ｎ（Ｎ≧１）
を含む、態様１～１８のいずれか１つに記載の化合物。
２０．式１－ＩＩＩ：
（Ｚ１－Ｚ２－Ｑ）Ｎ（Ｎ≧１）
を含む、態様１～１９のいずれか１つに記載の化合物。
２１．反応性ユニットＱが、カルボニル反応性ユニット、ジエン反応性ユニット、ヒドロキシル反応性ユニット、アミノ反応性ユニット、イミン反応性ユニット、チオール反応性ユニット、ジオール反応性ユニット、フェノール反応性ユニット、エポキシド反応性ユニット、ジスルフィド反応性ユニット、及びアジド反応性ユニットからなる群から選択される、態様１～２０のいずれか１つに記載の化合物。
２２．反応性ユニットＱが、カルボニル反応性基であり、特に、Ｑが、以下からなる群：
（ｉ）ヒドラジンユニット、例えばＨ２Ｎ－ＮＨ－又はＨ２Ｎ－ＮＲ１－ユニット（式中、Ｒ１はアリール又はＣ１～４アルキル、特にＣ１又はＣ２アルキルであり、任意に置換される）と、
（ｉｉ）ヒドラジドユニット、特にカルボヒドラジド又はスルホヒドラジド、特にＨ２Ｎ－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－又はＨ２Ｎ－ＮＲ２－Ｃ（Ｏ）－ユニット（式中、Ｒ２は、アリール又はＣ１～４アルキル、特にＣ１又はＣ２アルキルであり、任意に置換される）と、
（ｉｉｉ）ヒドロキシルアミノユニット、例えばＨ２Ｎ－Ｏ－ユニットと、
（ｉｖ）ジチオールユニット、特に１，２－ジチオール又は１，３－ジチオールユニットと
から選択される、態様１～２１のいずれか１つに記載の化合物。
２３．反応性ユニットＱが、チオール反応性基であるか、又はＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル若しくはスルホ－ＮＨＳエステル、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）エステル、又は１－ヒドロキシ－７－アカベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）エステル基といった、活性エステル基などのアミノ反応性基である、態様１～２２のいずれか１つに記載の化合物。
２４．反応性ユニットＱが、４－置換１，２，４－トリアゾリン－３，５－ジオン（ＴＡＤ）、４－フェニル－１，２，４－トリアゾリン－３，５－ジオン（ＰＴＡＤ）又はフルオロ置換ピリジニウムから選択される、態様１～２３のいずれか１つに記載の化合物。
２５．リンカーＬ１が、１～１０個のＣ原子を含み、任意に、１個以上のヘテロ原子を含む、態様１～２４のいずれか１つに記載の化合物。
２６．リンカーＬ１が、ＭｃＬａｆｆｅｒｔｙフラグメンテーションユニット、Ｒｅｔｒｏ Ｄｉｅｌｓ ａｌｄｅｒユニット、ニュートラル・ロス切断ユニット、結合解離ユニット、アルファ切断及び電荷部位再配置からなる群から選択される、態様１～２５のいずれか１つに記載の化合物。
２７．Ｚ１及びＺ２が、互いに独立して、キレート錯体、ホスホニウム、アンモニウム、カルベニウム、ピリジニウム、スルホニウム、Ｎ、Ｓ、Ｈ、及びＣ原子のいずれかを含む３～１０員環の荷電複素環又はその誘導体を含む、態様１～２６のいずれか１つに記載の化合物。
２８．式１－ＩＶ：（Ｚ１－（Ｌ１－Ｚ２）Ｍ－（Ｌ２－Ｚｏ）Ｋ－Ｑ）Ｎ
を含み、
式中、
Ｚｏは、特に、正荷電ユニット又は負荷電ユニット又は中性荷電ユニットのいずれかを含む荷電ユニットであり、
Ｌ２は、置換リンカー又は非置換リンカーであり、特にＬ２はＬ１であるか、又は特にＬ２はフラグメンテーションによる切断可能な基であり、
Ｍ＞０、Ｋ＞０及びＮ≧１である、
態様１～２７のいずれか１つに記載の化合物。
２９．式１－Ｖ：（Ｚ１－（Ｌ３－Ｚ２）Ｍ－（Ｌ２－Ｚｏ）Ｋ－Ｑ）Ｎ
を含み、
式中、
Ｚｏは、特に、正荷電ユニット又は負荷電ユニット又は中性荷電ユニットのいずれかを含む荷電ユニットであり、
Ｌ２は、置換リンカー又は非置換リンカーであり、特にＬ２はＬ１であるか、又は特にＬ２はフラグメンテーションによる切断可能な基であり
Ｌ３は、置換リンカー又は非置換リンカー、特にフラグメンテーションによる切断不可能な性基、例えばベンジル又はジアゾであり、
Ｍ＞０、Ｋ＞０及びＮ≧１である、
態様１～２８のいずれか１つに記載の化合物。
３０．式１－ＶＩ：（（Ｚ１）Ｍ－Ｌ１－Ｚ２－（Ｌ２／Ｌ３）Ｋ－Ｚｏ）Ｎ－Ｑ
を含み、
式中、
Ｚｏは、特に、正荷電ユニット又は負荷電ユニット又は中性荷電ユニットのいずれかを含む荷電ユニットであり、
Ｌ２は置換リンカー又は非置換リンカーであり、特にＬ２はＬ１であるか、又は特にＬ２はフラグメンテーションによる切断可能な基であり、
Ｌ３は、置換リンカー又は非置換リンカー、特にフラグメンテーションによる切断不可能な性基、例えばベンジル又はジアゾであり、
Ｍ＞０、Ｋ≧０及びＮ≧１である、
態様１～２９のいずれか１つに記載の化合物。
３１．式１－ＶＩＩ：（Ｚ１－Ｌ１－Ｚ２－Ｑ）Ｎ
を含み、
式中、Ｎ≧１である、態様１～３０のいずれか１つに記載の化合物。
３２．式１－ＶＩＩＩ：
Figure 2023525915000016
 を含み、
式中、
Ｚｏは、特に正荷電ユニット又は負荷電ユニット又は中性荷電ユニットのいずれかを含む荷電ユニットであり、
Ｌ２は置換リンカー又は非置換リンカーであり、特にＬ２はＬ１であるか、又は特にＬ２はフラグメンテーションによる切断可能な基であり、
Ｌ３は、置換リンカー又は非置換リンカー、特にフラグメンテーションによる切断不可能な性基、例えばベンジル又はジアゾであり、
Ｎ≧１、Ｍ＞０及びＫ＞０である、
態様１～３１のいずれか１つに記載の化合物。
３３．式１－ＩＸ：
Figure 2023525915000017
 を含み、
式中、
Ｚｏは、特に、正荷電ユニット又は負荷電ユニット又は中性荷電ユニットのいずれかを含む荷電ユニットであり、
Ｌ２は置換リンカー又は非置換リンカーであり、特にＬ２はＬ１であるか、又は特にＬ２はフラグメンテーションによる切断可能な基であり、
Ｌ３は、置換リンカー又は非置換リンカー、特にフラグメンテーションによる切断不可能な性基、例えばベンジル又はジアゾであり、
Ｎ≧１である、
態様１～３２のいずれか１つに記載の化合物。
３４．式１－Ｘ：
Figure 2023525915000018
 を含み、
式中、
Ｚｏは、特に正荷電ユニット又は負荷電ユニット又は中性荷電ユニットのいずれかを含む荷電ユニットであり、
Ｎ≧１及びＭ＞０である、
態様１～３３のいずれか１つに記載の化合物。
３５．式１－ＸＩ：
Figure 2023525915000019
 を含み、
式中、
Ｚｏは、特に正荷電ユニット又は負荷電ユニット又は中性荷電ユニットのいずれかを含む荷電ユニットであり、
Ｚ３は、多重荷電ユニット、特に多重荷電金属ユニットであり、
Ｌ３は、置換リンカー又は非置換リンカー、特に、ベンジル基、ジアゾ基、又は、少なくとも１個若しくは２個の炭素原子（Ｃ１－Ｃ２）からなる脂肪族基及びＣ１－Ｃ２からなる脂肪族基などの、フラグメンテーションを介して切断不可能な基であり、
Ｌｉｇ１は、多重荷電金属錯体結合配位子であり、特に、結合定数ｌｏｇＫｂ＞５に依存し、
Ｎ≧１である、
態様１～３４のいずれか１つに記載の化合物。
３６．式１－ＸＩＩ：
Figure 2023525915000020
 を含み、
式中、
Ｚｏは、特に正荷電ユニット又は負荷電ユニット又は中性荷電ユニットのいずれかを含む荷電ユニットであり、
Ｚ３は、多重荷電ユニット、特に多重荷電金属ユニットであり、
Ｌ３は、置換リンカー又は非置換リンカー、特にフラグメンテーションによる切断不可能な性基、例えばベンジル又はジアゾであり、
Ｌｉｇ１は、多重荷電金属錯体結合配位子であり、特に、結合定数ｌｏｇＫＢ＞５に依存し、
Ｌｉｇ２は、多重荷電金属錯体結合配位子であり、特に、結合定数１≦ｌｏｇＫＢ≦５に依存し、
Ｎ≧１である、
態様１～３５のいずれか１つに記載の化合物。
３７．式１－ＸＩＩＩ：（Ｚ１－Ｌ３－Ｚ２－Ｌ１－Ｚ３－Ｌ２－Ｚｏ－Ｑ）Ｎ（式中、Ｚ１、Ｌ３、Ｚ２、Ｌ１、Ｚ３、Ｌ２、Ｚｏ、Ｑ及びＮの各々は、他の態様で言及されたのと同じ意味を有することができる）を含む、態様１～３６のいずれか１つに記載の化合物。
３８．Ｍ、Ｎ、Ｋの各々が整数であり、０より大きい、態様１～３７のいずれか１つに記載の化合物。式１－Ｉ～１－ＸＩＩＩの括弧内の部分はＭ回及びＫ回繰り返すことができ、Ｎは化合物の正味電荷である。
３９．塩を形成するための対イオンを含み、該対イオンが好ましくは以下の群：Ｃｌ－、Ｂｒ－、Ｆ－、ホルメート、ＰＦ６ －、スルホネート、ホスフェート、アセテートから選択される、態様１～３８のいずれか１つに記載の化合物。
４０．トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含まない、態様１～３９のいずれか１つに記載の化合物。
４１．請求項１～４０のいずれか一項に記載の化合物を含む、組成物。
４２．請求項１～４０のいずれか一項に記載の化合物、又は請求項４１に記載の組成物を含む、キット。
４３．質量分析による決定を使用する分析物の定量的検出のための複合体であって、
前記複合体が、互いに共有結合した前記分析物及び化合物によって形成され、前記複合体が、永久電荷、特に永久正味電荷を含み、
前記複合体が、質量ｍ３及び正味電荷ｚ３を有し、
複合体は、質量分析による決定によるフラグメンテーション後に、質量ｍ４＜ｍ３及び正味電荷ｚ４＜ｚ３を有する少なくとも１つの娘イオンを形成することが可能であり、
ｍ３／ｚ３＜ｍ４／ｚ４である、複合体。
４４．ｍ３≧１００である、態様４３に記載の複合体。
４５．ｚ３及びｚ４の各々又は両方が永久正味電荷である、態様４３～４４に記載の複合体。
４６．ｚ３及びｚ４の各々又は両方が永久に正の正味電荷である、態様４３～４５に記載の複合体。
４７．ｚ３及びｚ４の各々又は両方が永久に負の正味電荷である、態様４３～４６に記載の複合体。
４８．娘イオンが分析物又はそのフラグメントを含む、態様４３～４７に記載の複合体。
４９．親イオンである、態様４３～４８に記載の複合体。
５０．娘イオンが、分析物及び化合物のフラグメントを含み、化合物のフラグメントが共有結合を介して分析物に結合しており、特に化合物のフラグメントが、１つの永久電荷、特に１つの永久正電荷又は１つの永久負電荷を有する、態様４３～４９に記載の複合体。
５１．複合体が、更なる娘イオンを形成することが可能であり、各々が化合物のフラグメントを含み、各々がｘ＞４のｍｘ／ｚｘ値を有し、更なる娘イオンのｍｘ／ｚｘ値の各々がｍ３／ｚ３値よりも小さい、態様４３～５０に記載の複合体。
５２．ｚ３＝２であり、フラグメンテーション後、複合体が、ｚ４＝１の娘イオン及び更なる娘イオンを形成することが可能であり、更なる娘イオンが、正味電荷ｚ５（ｚ５＝１）を有し、娘イオン又は更なる娘イオンが、分析物又はそのフラグメントを含む、態様４３～５１に記載の複合体。
５３．分析物が、核酸、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、代謝産物、ホルモン、脂肪酸、脂質、炭水化物、ステロイド、ケトステロイド、セコステロイド、別の分子の特定の修飾を特徴とする分子、生物によって内在化された物質、そのような物質の代謝産物、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、態様４３～５２に記載の複合体。
５４．複合体が、リンカーＬ１によって互いに離間された２つの正の永久電荷を含む、態様４３～５３に記載の複合体。
５５．少なくとも３つのユニットＺ１、Ｚ２、Ｑ’及び任意の更なるユニットＬ１を含み、ユニットは互いに共有結合しており、
Ｑ’は、分析物と共有結合を形成する反応性ユニットであり、
Ｚ１が、少なくとも１つの永久に荷電した部分、特に永久に正に荷電した部分又は永久に負に荷電した部分を含む荷電ユニットであり、
Ｚ２が、少なくとも１つの永久に荷電した部分、特に永久に正に荷電した部分又は永久に負に荷電した部分を含む荷電ユニットであり、かつ
Ｌ１が、置換又は非置換リンカー、特に、フラグメンテーションによる切断可能な基、例えば、Ｍｃ Ｌａｆｆｅｒｔｙフラグメンテーション部分、Ｒｅｔｒｏ Ｄｉｅｌｓ Ａｌｄｅｒフラグメンテーション部分又は脂肪族であり、
複合体の正味電荷は１より大きい、態様４３～５４に記載の複合体。
５６．複合体が、以下の式２－Ｉ～２－ＸＩ：
（Ｚ１－Ｌ１－Ｚ２－Ｑ’）Ｎ （２－Ｉ）
（Ｑ’－Ｚ１－Ｌ１－Ｚ２）Ｎ （２－ＩＩ）
（Ｚ１－Ｚ２－Ｑ’）Ｎ （２－ＩＩＩ）
（Ｚ１－（Ｌ１－Ｚ２）Ｍ－（Ｌ２－Ｚｏ）Ｋ－Ｑ’）Ｎ （２－ＩＶ）
（Ｚ１－（Ｌ３－Ｚ２）Ｍ－（Ｌ２－Ｚｏ）Ｋ－Ｑ’）Ｎ （２－Ｖ）
（（Ｚ１）Ｍ－Ｌ１－Ｚ２－（Ｌ２／Ｌ３）Ｋ－Ｚｏ）Ｎ－Ｑ’ （２－ＶＩ）
Figure 2023525915000021
 から選択され、
分析物は、Ｑ’に共有結合しており、
Ｚ１が、少なくとも１つの永久に荷電した部分、特に永久に正に荷電した部分又は永久に負に荷電した部分を含む荷電ユニットであり、
Ｌ１が、置換又は非置換リンカー、特に、フラグメンテーションによる切断可能な基、例えば、Ｍｃ Ｌａｆｆｅｒｔｙフラグメンテーション部分、Ｒｅｔｒｏ Ｄｉｅｌｓ Ａｌｄｅｒフラグメンテーション部分又は脂肪族であり、
Ｚ２は、少なくとも１つの永久に荷電した部分、特に永久に正に荷電した部分又は永久に負に荷電した部分を含む荷電ユニットであり、
Ｚｏは、特に正又は負又は中性の荷電ユニットを含む荷電ユニットであり、
Ｚ３は、多重荷電ユニット、特に多重荷電金属ユニットであり、
Ｌ３は、置換又は非置換リンカー、特にフラグメンテーションによる切断不可能な性基、例えばベンジル又はジアゾであり、
Ｌｉｇ１は、多重荷電金属錯体結合配位子であり、特に、結合定数ｌｏｇＫＢ＞５に依存し、
Ｌ２は置換又は非置換リンカーであり、特にＬ２はＬ１であるか、又はＬ２はフラグメンテーションによる切断可能な基であり、
Ｌｉｇ２は、多重荷電金属錯体結合配位子であり、特に、結合定数に依存する：１≦ｌｏｇＫＢ≦５、
Ｍ＞０、Ｋ＞０及びＮ≧１、好ましくはＮ＞１である、態様４３～５５に記載の複合体。Ｎ＞１は、Ｎ＞＋１、例えば＋２、＋３、＋４、＋５、＋６などを意味することができ、かつ／又はＮ＞－１、例えば－２、－３、－４、－５、－６などを意味することができる。
５７．分析物の質量分析による決定のための請求項１～４０のいずれか一項に記載の化合物の使用であって、好ましくは、質量分析による決定が、タンデム質量分析による決定、特にトリプル四重極質量分析による決定を含む、使用。
５８．態様１～４０のいずれか１つに記載の化合物又は態様４３～５６のいずれか１つに記載の複合体の質量分析スペクトルのシグナル対ノイズ比が、最大値として１以下の１回永久正味電荷を有する例示的な複合体又は例示的な化合物の質量分析スペクトルと比較して低い、態様５７に記載の使用。
５９．分析物の質量分析による決定のための方法であって、以下の工程：
（ａ）分析物を態様１～４０のいずれか１つに記載の化合物と反応させる工程であって、それにより、態様４３～５６のいずれか１つに記載の複合体が形成される、分析物を態様１～４０のいずれか１つに記載の化合物と反応させる工程と、
（ｂ）工程（ａ）からの複合体を質量分光分析に供することと
を含む、方法。
６０．工程（ｂ）が、
（ｉ）前記複合体のイオンを質量分光分析の第１段階に供することによって、前記複合体の前記イオンが、その質量／電荷（ｍ／ｚ）比に従って特徴付けられる工程と、
（ｉｉ）前記複合体イオンのフラグメンテーションを引き起こす工程であって、それにより、第１の実体、特に低分子量の実体が放出され、かつ前記複合体の娘イオンが生成され、前記複合体の前記娘イオンは、そのｍ／ｚ比が前記複合体イオンとは異なる、フラグメンテーションを引き起こす工程と、
（ｉｉｉ）前記複合体の前記娘イオンを質量分光分析の第２段階に供することによって、前記複合体の前記娘イオンが、そのｍ／ｚ比に従って特徴付けられる工程と、を含み、並びに／又は、
（ｉｉ）は、前記複合体の前記イオンの代替的なフラグメンテーションを更に含んでもよく、それにより、前記第１の実体とは異なる第２の実体が放出され、前記複合体の第２の娘イオンが生成され、かつ、
（ｉｉｉ）は、複合体の第１の娘イオン及び第２の娘イオンを質量分光分析の第２段階に供することを更に含んでもよく、それにより、複合体の第１の娘イオン及び第２の娘イオンが、それらのｍ／ｚ比に従って特徴付けられ、
第１の娘イオン及び／又は第２の娘イオンのｍ／ｚ比は、複合体のイオンのｍ／ｚ比よりも大きい、態様５９に記載の方法。
６１．工程（ａ）の前の更なる工程（ａ’）が、
（ａ’）前記複合体の前記イオン又は前記化合物のイオンを、対イオンのイオン交換に供することを含み、前記対イオンとして、特に強く配位しているアニオン、例えばトリフルオロアセタートが、塩化物、臭化物又は弱く配位している対イオンによって交換される、態様５９又は６０に記載の方法。
６２．フラグメンテーションが一段階プロセスである、態様１～６１のいずれか１つに記載の化合物又は方法。
以下の実施例は、本明細書で特許請求される発明を例示するために提供されるのであって、限定するものではない。
図１は、前駆体及びそのフラグメンテーションの１回荷電分析物に対する、２回荷電標識分析物の概略質量スペクトルを示す。この場合、２回荷電複合体（親イオン）は、２つの娘イオンにフラグメント化される。第１の娘イオンは、標識フラグメントと分析物分子とを含む１回荷電分子であり、２回荷電複合体のｍ３／ｚ３値よりも大きいｍ／ｚ値を有する。第２の娘イオンは、１回荷電標識フラグメントであり、ｍ３／ｚ３よりも小さいｍ／ｚ値を有する。２回荷電標識分析物は、ＭＳシグナル増強をもたらす。これとは対照的に、既知の１回荷電複合体は、１回荷電娘イオンにのみフラグメント化され、娘イオンのｍ／ｚ値は、既知の１回荷電複合体のｍ／ｚ値よりも小さい。既知の１回荷電複合体は、既知の１回荷電複合体のｍ３／ｚ３値よりも大きいｍ／ｚ値を有する娘イオンにフラグメント化しない。既知の１回荷電複合体は、そのようなフラグメンテーションパターン、ＭＳシグナル増強、又は２回荷電複合体と比較してより良好なノイズ対シグナル比を示さない。
分析物分子の１つの反応性部分に１つの標識を有する１つの永久電荷を設置することにより、フラグメンテーション特性は、ＭＳＭＳプロセス後に高質量前駆イオンから低質量定量イオンになる。このフラグメンテーションパターンは、イオン化プロセス又は化学的誘導体化後に１つの電荷（永久又は擬似分子イオンとして（Ｍ＋Ｈ；Ｍ＋Ｎａなど））が生成される場合に生じる。特に、小分子（最大約２０００ Ｄａ）は、高いｍ／ｚ値からより低いｍ／ｚ値への小さなフラグメントシフトのこのフラグメンテーションパターンを示す。望ましくないイオン、例えばマトリックス又は目的の分子と同様のフラグメンテーションパターンを有する共溶出／等塩基性化合物からのこの偽陽性シグナルが結果として生じる（図５も参照）。これは、ＭＳＭＳプロセス中の同様のシグナルに起因し、したがって、所望の分析物の定量的シグナルと干渉する。少量の臨床的に関連する分析物が、ＥＳＩ（エレクトロスプレーイオン化）プロセスの後に２荷電バージョンで擬似分子イオンとして生じる。これらの種類の分子は、主にペプチド、例えばＴｙｒ－Ｍｅｔ－Ａｒｇ－Ｐｈｅ－ＮＨ２、又は関連物質、例えばバンコマイシンからなる。これらの種類の分子上の電荷は、イオン化を調節するそれぞれのイオン源パラメータに依存する（正イオンモードの）二重プロトン化プロセスから導出される。
図２は、ＭＳスペクトルの概略図（強度（％）対ｍ／ｚ）を示す。＋／－０．５ダルトン・ウインドウ（ウインドウは２つの破線の間に表されている）で１回荷電した比較化合物のフラグメンテーション挙動を記載している。Ｒ＝２０００の分離能を有する典型的な質量分析計は、５００ｍ／ｚ及び＋－０．５Ｄａの同重体種を分離することができ、ＭＳＭＳモードの質量分析計の典型的な分離である。この種の分解能を使用して前駆体分子を分離する選択性を高める場合、イオン化分子に１つの電荷が付加された場合の第１の同位体は＋０．５Ｄａになるため、天然に含まれる同位体はＭＳＭＳの衝突プロセスに入らない。約２０００ｍ／ｚのより高い質量分子の場合、最初の同位体ピークは、前駆体分子の分離後に衝突セルに入る。ほとんどの臨床的に関連する小分子分析物は２０００Ｄａ未満である。したがって、天然に存在する同位体の強度は、フラグメンテーションプロセス中に失われる。ＣＨＮＯＳを含有する分子の場合、これは、約５００Ｄａの質量で最大約３０％の強度である。
図３は、ＭＳスペクトルの概略図（強度（％）対ｍ／ｚ）を示す。＋／－０．５ダルトン・ウインドウ（ウインドウは２つの破線の間に表されている）で２回荷電した本発明の化合物又は複合体のフラグメンテーション挙動を記載している。
２回荷電した（並びにそれぞれ複数回荷電した）分子は、１回荷電した分子と比較して有利である（図２参照）。最初に天然に含有する同位体が、＋１Ｄａの１つの電荷及び＋０．５Ｄａの２つの電荷によって単同位体ピークに分離されるという効果のために、質量分析計での固定単離が設定される。したがって、更なるＭＳＭＳプロセスのために約３０％多くのイオンを使用することができる。
図４Ａ～図４Ｅは、２回荷電した複合体（分析物：エストラジオール又はその誘導体；化合物：２回永久に正に荷電した化合物、標識６とコンジュゲートしたエストラジオール、標識６はＲＨＡ２５６とも呼ばれる）のＬＬＯＱ（定量下限）を示す。永久に正の標識を用いると、分析物対分析物－化合物のより良好なシグナル対ノイズ比を達成することができ、これは、増強された検出限界、したがってそれぞれの増強係数に直接関連する。
図５ａ～図５ｃは、２回荷電分子（標識６とコンジュゲートしたエストラジオール（図５ｃ））と比較して、１回荷電分子（ＲＨＡ１３９Ｆ２（図５ａ）及びＲＨＡ１７１Ｆ２（図５ｂ））の遷移を使用したブランク試料のバックグラウンドノイズを示す。より低いｍ／ｚ前駆体又はより低いｍ／ｚ化合物からより高いｍ／ｚ定量イオン（娘イオン）への異常なフラグメンテーション経路は、有意に低いバックグラウンドノイズをもたらす。同等の非誘導化ワークフロー（エストラジオール本来の検出限界約５ｎｇ／ｍｌの正モード及び約３０ｐｇ／ｍｌの負イオンモード）と比較して、得られた０．４ｐｇ／ｍｌの検出限界は、標識の検出限界増強を示す。標識６の質量スペクトルとコンジュゲートしたエストラジオールのバックグラウンドノイズは、ＲＨＡ１３９Ｆ２及びＲＨＡ１７１Ｆ２の質量スペクトルのものよりも良好である。ＲＨＡ１３９Ｆ２、ＲＨＡ１７１Ｆ２、及び標識６とコンジュゲートしたエストラジオールの構造は、以下の通りである：
Figure 2023525915000022
２回永久に荷電した分子又は複合体のフラグメンテーションにより、２つの永久に設置された電荷は、フラグメンテーション後に、標識情報含有イオンと分析物情報含有イオンとの間で分布する。これらの２つのイオンは、イオンを失うことなく少なくとも同程度の強度で現れるので、修飾子及び定量子イオンとして非常に良好に機能することができる。
全ての妨害物質にはほとんどないこの概念を使用することにより、ＭＳＭＳプロセスの選択性が向上し、バックグラウンドイオンが枯渇する。（図４及び図５を参照されたい）。
図６は、２回正に荷電した複合体（分析物－標識６複合体）の質量スペクトルを示す。複合体は、目的の分析物としてのエストラジオール又はその誘導体と、２回永久に正に荷電した化合物としての標識６とコンジュゲートしたエストラジオールとを含む。フラグメント化されていない複合体は、２５６．１６のｍ３／ｚ３値を有する（親イオン）。エストラジオール及び化合物のフラグメントを含む１回永久に正に荷電した娘イオンは、親イオンのｍ３／ｚ３値よりも大きいｍ／ｚ値３４９．２０を有する。それぞれが化合物のフラグメントを含む２つの更なる娘イオンはそれぞれ、ｍ／ｚ値１９８．０９及び１０４．０５を有する。
複数の正電荷及び１つの負電荷の概念（又はその逆）が１つの標識内で使用され、ＭＳＭＳプロセス後に、（前駆体の結果として生じる電荷に応じて）反対の電荷が分離される場合、分析物の定量は、前駆体単離のためのイオン化モードとは異なるイオン化モードで行うことができる。これは、正イオン化モードと負イオン化モードとの間の高速スイッチングによって行うことができる。
複数の永久電荷（ｘ回の正電荷、ｙ回の負電荷、又は正味電荷として（ｘ－ｙ）回の正電荷及び負電荷のいずれか）を設置することが可能な本明細書に記載の標識は、１つ又は複数のフラグメントへのフラグメンテーション挙動を示し、フラグメンテーション後の標識の部分及び分析物分子イオンの部分に関する情報を有する。したがって、分析物のＭＳシグナル増強は、例えば、少量の分析物にとって重要なものとなる。
図７は、ピーク「分割」の概略図を示す。分析物分子の誘導体化反応から生じる異なる異性体を互いに分離するクロマトグラフィシステムの能力を説明している。
図８は、標識されていない分析物と比較して、標識された分析物の増強係数を決定するワークフローの概略図を示す。
図９Ａ及び図９Ｂは、二重荷電誘導体／化合物に対するＴＦＡのシグナル消光効果の検出を示す。
図９Ａは、ＴＦＡを含まない５００ｐｇ／ｍｌのテストステロンの誘導体化剤／化合物としての標識１５（二重荷電分子イオンから単一荷電フラグメント）のそれぞれのＭＳＭＳ遷移を示す。
Figure 2023525915000023
図９Ｂは、ＴＦＡを含む５００ ｐｇ／ｍｌのテストステロンの誘導体化剤／化合物としての標識１５（二重荷電分子イオンから単一荷電フラグメント）のそれぞれのＭＳＭＳ遷移を示す。
ＴＦＡの添加又は存在は、二重荷電イオンを消光し、ＴＦＡを含まない系と比較して有意により低いシグナルをもたらす。
化合物としての標識１５とＴＦＡを含む又はＴＦＡを含まない分析物としてのテストステロンとを含む複合体を以下のように調製する：
標識１５を使用するテストステロンの分析的誘導体化
テストステロンの５００ｎｇ／ｍＬ溶液（Ｓ１）をメタノールで調製した。メタノール（モル比＞１０００）中で希釈した、溶液（Ｓ１）と比べて誘導体化試薬／標識１５のいずれかを過剰に含む溶液（Ｓ２）を加え、溶液を氷酢酸（ｇｌａｃｉａｌ ａｃｉｄｉｃ ａｃｉｄ）（２０％ｖ／ｖ）で酸性化した。溶液Ｓ１及びＳ２を混合して溶液Ｓ３を得て、６５°Ｃで２時間保持した後、室温で１２時間保持し、メタノールによる希釈工程を行い、総体積１ｍｌで５００ｐｇ／ｍｌの濃度に達した。
そのように調製した分子をその代謝溶液中で溶液（Ｓ３－Ａ）及び（Ｓ３－Ｂ）で１：１（ｖ／ｖ）に分割した。溶液Ｓ３－Ｂに４０μｌの水／ＴＦＡをスパイクし、一方、Ｓ３－Ａには４０μｌの水のみをスパイクした。
両方の溶液を、テストステロンの二重荷電誘導体に対応するｍ／ｚ＝３０２．７１Ｄａの表示質量（ｍａｓｓ ｔｏ ｄｉｓｐｌａｙ）を使用してＥＳＩ－ポジティブ－フルスキャンモードで測定した。
図９Ａに見られるように（溶液Ｓ３－Ａを使用したｍ／ｚ＝３０２．７ＤａのＥＳＩ－ＭＳ；上部クロマトグラム、及び、溶液Ｓ３－Ｂを使用したｍ／ｚ＝３０２．７ＤａのＥＳＩ－ＭＳ；下部クロマトグラム）、Ｓ３－Ｂを使用したクロマトグラムのピーク高さは、Ｓ３－Ａの場合よりも著しく低い。二重荷電（ｃｈａｎｇｅｄ）ピークの消光は、二重荷電（ｃｈａｎｇｅｄ）分子イオンを阻害するＴＦＡのような強く配位しているアニオンの添加によって観察することができ、したがって、擬似分子イオン［Ｍ＋ＴＦＡ］＋の発生をもたらし、これは定量的分析にとって不利である。
クロマトグラフィ及びＭＳパラメータ
極性 ＥＳ＋
較正 静的２
ソフト送信モード無効
キャピラリー（ｋＶ）３．００ ３．１４
コーン（Ｖ）５０．００ １４４．９２
ソースオフセット（Ｖ）３０．０
ソース温度（℃）１４０ １４０
脱溶媒和温度（℃）３５０ ３５０
コーンガス流量（Ｌ／Ｈｒ）１５０ １４９
脱溶媒和ガス流量（Ｌ／Ｈｒ）１０００ ９９０
衝突ガス流（ｍＬ／分）０．１５ ０．１４
ネブライザーガス流（Ｂａｒ）７．００ ６．５２
ＬＭ１解像度 ３．０
ＨＭ１解像度 １５．０
イオンエネルギー１－０．２
ＭＳモード衝突エネルギー ４．００
ＭＳＭＳモード衝突エネルギー ２．００
ＭＳモード入口 １．００
ＭＳモード出口 １．００
ガスオンＭＳモード入口 １．００
ガスオンＭＳモード出口 １．００
ガスオンＭＳＭＳモード入口 １．００
ガスオンＭＳＭＳモード出口 １．００
ガスオフＭＳモード入口 ３０．００
ガスオフＭＳモード出口 ３０．００
ガスオフＭＳＭＳモード入口 ３０．００
ガスオフＭＳＭＳモード出口 ３０．００
ＳｃａｎＷａｖｅ ＭＳモード入口 １．００
ＳｃａｎＷａｖｅ ＭＳモード出口 １．００
ＳｃａｎＷａｖｅ ＭＳＭＳモード入口 １．００
ＳｃａｎＷａｖｅ ＭＳＭＳモード出口 １．００
ＬＭ２解像度 ３．０
ＨＭ２解像度 １５．０
イオンエネルギー２ ０．２
ゲイン １．００
マルチプライヤー ５１３．８０
活性リザーバー Ｃ
コーンエネルギーランプ：無効
プローブ温度ランプ：無効
衝突エネルギーランプ：無効
機器パラメータ－機能２：
パラメータファイル－Ｅ：￥Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｐｒｏｊｅｃｔｓ￥ＥＳＩ－Ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ＿ＰＤＡ．ＰＲＯ￥ＡＣＱＵＤＢ￥ｃｚ２０Ｍｒｚ２０１９－ｔｅｓｔｏ－ｌａｂｅｌ－ｇｅｎｅｒａｌ＿ｔｕｎｉｎｇ．ＩＰＲ
極性 ＥＳ＋
較正 静的２
ソフト送信モード無効
キャピラリー（ｋＶ）３．００ ３．１４
コーン（Ｖ）５０．００ １４４．９２
ソースオフセット（Ｖ）３０．０
ソース温度（℃）１４０ １４０
脱溶媒和温度（℃）３５０ ３５０
コーンガス流量（Ｌ／Ｈｒ）１５０ １４９
脱溶媒和ガス流量（Ｌ／Ｈｒ）１０００ ９９０
衝突ガス流（ｍＬ／分）０．１５ ０．１４
ネブライザーガス流（Ｂａｒ）７．００ ６．５２
ＬＭ１解像度 ３．０
ＨＭ１解像度 １５．０
イオンエネルギー１－０．２
ＭＳモード衝突エネルギー ４．００
ＭＳＭＳモード衝突エネルギー ２．００
ＭＳモード入口 １．００
ＭＳモード出口 １．００
ガスオンＭＳモード入口 １．００
ガスオンＭＳモード出口 １．００
ガスオンＭＳＭＳモード入口 １．００
ガスオンＭＳＭＳモード出口 １．００
ガスオフＭＳモード入口 ３０．００
ガスオフＭＳモード出口 ３０．００
ガスオフＭＳＭＳモード入口 ３０．００
ガスオフＭＳＭＳモード出口 ３０．００
ＳｃａｎＷａｖｅ ＭＳモード入口 １．００
ＳｃａｎＷａｖｅ ＭＳモード出口 １．００
ＳｃａｎＷａｖｅ ＭＳＭＳモード入口 １．００
ＳｃａｎＷａｖｅ ＭＳＭＳモード出口 １．００
ＬＭ２解像度 ３．０
ＨＭ２解像度 １５．０
イオンエネルギー２ ０．２
ゲイン １．００
マルチプライヤー ５１３．８０
活性リザーバー Ｃ
コーンエネルギーランプ：無効
プローブ温度ランプ：無効
衝突エネルギーランプ：無効
エンジニア設定：
ＭＳ１低質量位置 ６７３
ＭＳ１高質量位置 ３３５
ＭＳ１低質量分解能 ２１５
ＭＳ１高質量分解能 ２１５２
ＭＳ１分解能線形性 ５３１
ＭＳ１高質量ＤＣバランス ０．０７
ＭＳ１ ＤＣ極性 陰性
ＭＳ２低質量位置 ６７２
ＭＳ２高質量位置 ２９１
ＭＳ２低質量分解能 ２１９
ＭＳ２高質量分解能 ２１６２
ＭＳ２分解能線形性 ５２８
ＭＳ２高質量ＤＣバランス ０．５０
ＭＳ２ ＤＣ極性 陰性
走査間遅延：
自動モード
ＭＳ走査間遅延（秒）０．００３
極性／モードスイッチ走査間遅延（秒）０．０２０
強化された走査間遅延（秒）０．０２０
チャネル間遅延－表を参照
ＭＳ１遅延表：
Ｒ 遅延
＜＝１．２５０ ０．００１
＜＝４．０００ ０．００２
＜＝１０．０００ ０．００３
＜＝２０．０００ ０．００４
＞ ２０．０００ ０．００５
－－－－－－－－－－－－－－メソッドパラメータ実行－－－－－－－－－－－－－－
Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＳＤＳ
実施時間：６．５０分
コメント：
溶媒選択Ａ：Ａ２
溶媒選択Ｂ：Ｂ１
低圧限界：０．０００バール
高圧限界：１０３４．２００バール
溶媒名Ａ：水＋ＮＨ４Ａｃ＋０．１％ギ酸
溶媒名Ｂ：ＭｅＯＨ＋ＮＨ４Ａｃ＋０．１％ギ酸
スイッチ１：変更なし
スイッチ２：変更なし
スイッチ３：変更なし
シール洗浄：５．０分
チャートアウト１：システム圧力
チャートアウト２：％Ｂ
システム圧力データチャネル：あり
流量データチャネル：なし
％Ａデータチャネル：なし
％Ｂデータチャネル：あり
プライマリＡ圧力データチャネル：なし
アキュムレータＡ圧力データチャネル：なし
プライマリＢ圧力データチャネル：なし
アキュムレータＢ圧力データチャネル：なし
デガッサ圧力データチャネル：なし
［勾配テーブル］
時間（分）流量 ％Ａ ％Ｂ 曲線
１．初期０．４００ ６０．０ ４０．０初期
２．０．５０ ０．４００ ６０．０ ４０．０ ６
３．３．００ ０．４００ １０．０ ９０．０ ６
４．５．００ ０．４００ １０．０ ９０．０ ６
５．５．１０ ０．４００ ６０．０ ４０．０ ６
６．６．５０ ０．４００ ６０．０ ４０．０ ６
ラン事象：あり
勾配開始（注入に対する）：０ｕＬ
２Ｄ反復：なし
Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＰＤＡ
実施時間：６．５０分
ＰＤＡ検出器タイプ：ＵＰＬＣ ＬＧ ５００ｎｍ
ランプ：オン
サンプリングレート：１０ポイント／秒
フィルタ時間定数：０．２０００秒
露出時間：自動ｍｓｅｃ
２次フィルタ領域の補間：なし
ＵＶブロッキングフィルタの使用：なし
３Ｄチャネル．．．
範囲：２００－４００
分解能：２．４ｎｍ
初期スイッチ１：変更なし
初期スイッチ２：変更なし
Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＦＴＮ ＡｕｔｏＳａｍｐｌｅｒ
実施時間：６．５０分
コメント：
事前ロード：無効
オフラインループ：自動ｍｉｎ
洗浄溶媒名：ＡＣＮ：水
注入前洗浄時間：１５．０秒
注入後洗浄時間：１５．０秒
パージ溶媒名：ＡＣＮ：水
希釈：無効
希釈体積：０ｕＬ
遅延時間：０分
希釈針の配置：自動ｍｍ
目標カラム温度：４０．０℃
カラム温度アラームバンド：無効
目標試料温度：６．０ Ｃ
試料温度アラームバンド：無効
シリンジ引出速度：自動
ニードル配置：０．５ｍｍ
吸引前エアギャップ：自動
吸引後エアギャップ：自動
カラム温度データチャネル：なし
室温データチャネル：あり
試料温度データチャネル：あり
試料オーガナイザー温度データチャネル：なし
試料圧力データチャネル：なし
予熱器温度データチャネル：なし
シール力データチャネル：なし
噴射モードなし：なし
自動添加混合ストロークサイクル：自動
自動添加混合ストローク体積：自動ｕＬ
アクティブプリヒーター：コンソール構成を使用する
ラン事象：なし
試料ラン注入パラメータ
注入量（ｕｌ）－５．００
機能１
機能中のスキャン：７３８
サイクル時間（秒）：自動
走査間遅延（秒）：自動
チャネル間遅延（秒）：自動
スパン（Ｄａ）：０．５００
開始時間及び終了時間（分）：０．０００～５．０００
イオン化モード：ＥＳ＋
データタイプ：ＳＩＲ又はＭＲＭの増強
機能タイプ：１チャネルのＭＲＭ
Ｃｈａｎ反応 滞留（秒）コーンボルト。Ｃｏｌ．エネルギー遅延（秒）化合物
１：２８９．２５ ＞ １０８．７８ ０．２００ チューン ２５．０ 自動 テストステロン
機能２
機能中のスキャン：７３７
サイクル時間（秒）：自動
走査間遅延（秒）：自動
チャネル間遅延（秒）：自動
スパン（Ｄａ）：０．５００
開始時間及び終了時間（分）：０．０００～５．０００
イオン化モード：ＥＳ＋
データタイプ：ＳＩＲ又はＭＲＭの増強
機能タイプ：１チャネルのＭＲＭ
Ｃｈａｎ反応 滞留（秒）コーンボルト。Ｃｏｌ．エネルギー遅延（秒）化合物 式｜質量
１：６２４．４０ ＞ ２０３．００ ０．２００ チューン ４０．０ 自動 ＤＭＡ０４１ ＣＥ４０ ４２０．２
機能３
機能中のスキャン：３９０１
機能タイプ：ダイオードアレイ
波長範囲（ｎｍ）：２００～４００
直線較正曲線から、それぞれの検出限界をＤＩＮ ＥＮ ＩＳＯ ３２６４５に記述の手順を用いて得た。増強係数は、非誘導体化分析物、例えばテストステロン検出限界（ＬＯＤ）と比較して、標識分析物、例えばテストステロンＬＯＤに基づいて計算することができる。原理ワークフローを図８に示す。
図１０Ａ～図１０Ｄは、異なるフラグメンテーションエネルギー（５Ｖ～２５Ｖ）での分析物－標識１７複合体のフラグメンテーションパターンを示す。
図１０Ｄは、５Ｖでの複合体のフラグメンテーションパターンを示す。ｍ３／ｚ３値２６１の親イオンは、ｍ４／ｚ４値４６２の第１の娘イオンにフラグメント化される。さらなるイオン、例えばｍ／ｚ値６３５のＴＦＡ付加物及びｍ／ｚ値４５３の第２の娘イオンが示されている。フラグメンテーションエネルギーを５Ｖから２５Ｖに増加させることによって（図１０Ａ～図１０Ｄ）、第１の娘イオンの強度は増加し、ＴＦＡ付加物及び親イオンの強度は減少する。フラグメンテーションエネルギーの最良の性能を検出することができる。例えばコンピュータ（ソフトウェア又はマニュアル）を使用することによってフラグメンテーションエネルギーの最良の性能を選択する方法は当業者に周知である。最適化されたフラグメンテーションエネルギーは、日常的な測定によって調整することができる。
図１１は、分析物－標識１５複合体のフラグメンテーションパターンを示す。
複合体は、互いに共有結合した分析物テストステロン及び化合物標識１５によって形成される。複合体（親イオン）は、２つの永久電荷を含み、ｍ３／ｚ３比は２９１である。複合体は、少なくとも４つの娘イオンにフラグメント化され、それぞれが親イオンのｍ／ｚ比よりも大きいｍ／ｚ比を有する（ｍ／ｚ：３０２、３２８、５１０及び５２４）。これらの娘イオンの可能な構造を図１１に示す。ｍ／ｚ比がｍ３／ｚ３より小さいさらなる娘イオンが検出される。
２つの永久電荷を設置することが可能な本明細書に記載の標識は、１つ又は複数のフラグメントへのフラグメンテーション挙動を示し、フラグメンテーション後の標識の部分及び分析物分子イオンの部分に関する情報を有する。したがって、分析物のＭＳシグナル増強は、例えば、少量の分析物にとって重要なものとなる。
一般的な合成プロトコル１：
Figure 2023525915000024
 Ｔ＝反応性官能基Ｑの前駆体
Ｒ１及びＲ２は、以下の基から互いに独立して選択することができる：
Ｒ１＝メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ペントキシ、ヘキソキシ、シクロプロポキシ、シクロブトキシ、シクロペントキシ、シクロヘキソキシ、フェノキシ、メチルチオキシ、エチルチオキシ、プロピルチオキシ、フェンチオキシ、アシル、ホルミル、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、ブトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、ベンゾイルオキシ、アセトキシ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、ヒドロキシ、フェニル、ベンジル、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、アリール、ヘテロアリール。
Ｒ２＝メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、ヘキシレン、アリール、ヘテロアリール。
反応条件：
ａ＝アルキル化工程、異なる溶媒及び温度：
ｂ＝メチル化工程、異なる溶媒、ＭｅＩ；
ｃ＝ＱにおけるＴの変換：例えば、Ｎ２Ｈ４、ＭｅＯＨ又はＳＯＣｌ２、ＤＣＭ又はヨードベンゼンジアセテート、ＭｅＯＨ
溶媒及び／又は温度の選択は、生成される生成物の性質に依存する。適切な溶媒及び／又は温度を選択する方法は当業者に周知である。
一般的な合成プロトコルのアルキル化工程ａ：
メチルエステル試薬（４．３５ｍｍｏｌ）を１５ｍＬの溶媒に溶解し、エチレンジアミン試薬（１０．９５ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を（室温又は７０°Ｃ）で（２～１０時間）撹拌し、続いて真空中で濃縮した。粗生成物をＤＭＦ（３×１５ｍＬ）と共蒸発させ、２０ｍＬのアセトニトリル及び１０ｍＬの酢酸エチルの混合物に再溶解した。第四級アンモニウム塩を沈殿させるために、溶液を－２０°Ｃで１６時間保存した。上清を除去し、得られた固体を真空中で乾燥させた。
一般的な合成プロトコルメチル化工程ｂ：
粗物質（工程ａ）を溶媒中の混合物に溶解し、ヨウ化メチル（７．５ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で１６時間撹拌し、続いて真空中で乾燥させた。次に、粗ビス－第四級アンモニウム塩をアセトニトリル／メタノール（２／１，２ｘ３０ｍＬ）と共蒸発させた。
一般的な合成プロトコル工程ｃ：
粗物質（工程ｂ）をアセトニトリル／メタノールに溶解し、ヒドラジン水和物（１５ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で４時間撹拌し、続いて真空中で乾燥させた。得られた粗生成物を分取ＲＰ－ＨＰＬＣによって精製して、所望の生成物を結晶性固体として得た。ギ酸活性化陰イオン交換樹脂（Ｌｅｗａｔｉｔ－ＭＰ－６２フリーベースポリマー）を使用することによって、ＴＦＡ塩の対応するギ酸塩への最終的な変換を達成した。
一般的な合成プロトコル２：
Figure 2023525915000025
 Ｔ＝反応性官能基Ｑの前駆体
Ｒ１及びＲ２は、以下の基から互いに独立して選択することができる：
Ｒ１＝メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ペントキシ、ヘキソキシ、シクロプロポキシ、シクロブトキシ、シクロペントキシ、シクロヘキソキシ、フェノキシ、メチルチオキシ、エチルチオキシ、プロピルチオキシ、フェンチオキシ、アシル、ホルミル、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、ブトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、ベンゾイルオキシ、アセトキシ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、ヒドロキシ、フェニル、ベンジル、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、アリール、ヘテロアリール。
Ｒ２＝メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、ヘキシレン、アリール、ヘテロアリール。
反応条件：
ａ＝アルキル化工程、異なる溶媒及び温度
ｂ＝ＱにおけるＴの変換：例えば、Ｎ２Ｈ４、ＭｅＯＨ又はＳＯＣｌ２、ＤＣＭ又はヨードベンゼンジアセテート、ＭｅＯＨ
一般的な合成プロトコルのアルキル化工程ａ：
ピリジン試薬（０．５０ｍｍｏｌ）及び（ブロモメチル）トリメチルアンモニウム試薬（０．６０ｍｍｏｌ）を１ｍＬの乾燥ＤＭＦに溶解した。反応混合物を（室温（ｒ．ｔ）又は７０°Ｃ）で（２４～３６時間）撹拌した。溶媒を真空下で除去し、残渣を分取ＨＰＬＣによって精製した。純粋な画分を回収し、真空下で濃縮して、生成物を固体として得た。
一般的な合成プロトコル工程ｂ：
ＰＴＡＤ－Ｐｙ試薬（０．０２９ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（５００μＬ）に溶解した。ＭｅＯＨ（５００μＬ）中のヨードベンゼンジアセテート（０．０３３ｍｍｏｌ）の溶液を第１の溶液に添加した。反応混合物を室温で１５分間撹拌した。溶媒を真空下で除去し、残渣を更に精製することなく直接使用した。
一般的な合成プロトコル３：
Figure 2023525915000026
 Ｒ１及びＲ２は、以下の基から互いに独立して選択することができる：
Ｒ１＝メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ペントキシ、ヘキソキシ、シクロプロポキシ、シクロブトキシ、シクロペントキシ、シクロヘキソキシ、フェノキシ、メチルチオキシ、エチルチオキシ、プロピルチオキシ、フェンチオキシ、アシル、ホルミル、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、ブトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、ベンゾイルオキシ、アセトキシ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、ヒドロキシ、フェニル、ベンジル、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、アリール、ヘテロアリール。
Ｒ２＝メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、ヘキシレン、アリール、ヘテロアリール。
反応条件：
ａ＝アルキル化工程、異なる溶媒及び温度
一般的な合成プロトコルのアルキル化工程ａ：
２－フルオロピリジン試薬（０．３６ｍｍｏｌ）及び（ブロモメチル）トリメチルアンモニウム試薬（０．４６ｍｍｏｌ）を１ｍＬの乾燥ＤＭＦに溶解した。反応混合物を（ｒ．ｔ又は９０°Ｃ）で（２４～４８時間）撹拌した。溶媒を真空下で除去し、残渣を分取ＨＰＬＣによって精製した。純粋な画分を回収し、真空下で濃縮して、生成物を無色油状物として得た。
一般的な合成プロトコル４：
Figure 2023525915000027
 Ｔ＝反応性官能基Ｑの前駆体
Ｒ１及びＲ２は、以下の基から互いに独立して選択することができる：
Ｒ１＝メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、ヘキシレン、アリール、ヘテロアリール。
Ｒ２＝メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、ヘキシレン、アリール、ヘテロアリール。
反応条件：
ａ＝アルキル化工程、異なる溶媒及び温度
ｂ＝メチル化工程、異なる溶媒、ＭｅＩ；
ｃ＝ＱにおけるＴの変換：例えば、Ｎ２Ｈ４、ＭｅＯＨ又はＳＯＣｌ２、ＤＣＭ又はヨードベンゼンジアセテート、ＭｅＯＨ
実施例１：標識１３
Figure 2023525915000028
標識１３の合成
［４－［２－（アザニウムアミノ）－２－オキソ－エチル］フェニル］メチル－ジメチル－［２－（トリメチルアンモニオ）エチル］アンモニウムの合成；２，２，２－トリフルオロアセテート
Figure 2023525915000029
ブロモメチルフェニル酢酸（４．３５ｍｍｏｌ）を１５ｍｌのメタノールに溶解した。トリメチルシリルクロリド（０．８７ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を室温で２時間撹拌した。反応混合物を真空中で濃縮し、残留物をメタノール（２×１５ｍｌ）と共蒸発させた。粗メチルエステルを１５ｍｌのアセトニトリルに溶解し、テトラメチルエチレンジアミン（１０．９５ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を７０°Ｃで５時間撹拌し、続いて真空中で濃縮した。粗生成物をＤＭＦ（３×１５ｍｌ）と共蒸発させ、２０ｍＬのアセトニトリル及び１０ｍＬの酢酸エチルの混合物に再溶解した。第四級アンモニウム塩を沈殿させるために、溶液を－２０°Ｃで１６時間保存した。上清を除去し、得られた固体を真空中で乾燥させた。粗物質をアセトニトリル／メタノール（２／１，３０ ｍＬ）の混合物に溶解し、ヨウ化メチル（７．５ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で１６時間撹拌し、続いて真空中で乾燥させた。次に、粗ビス第四級アンモニウム塩をアセトニトリル／メタノール（２／１，２ｘ ３０ｍＬ）と共蒸発させ、アセトニトリル／メタノール（１／４，４０ｍＬ）に溶解し、ヒドラジン水和物（１５ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で４時間撹拌し、続いて真空中で乾燥させた。得られた粗生成物を分取ＲＰ－ＨＰＬＣによって精製して、所望の生成物（４工程にわたり１６％）を結晶性固体として得た。ギ酸活性化陰イオン交換樹脂（Ｌｅｗａｔｉｔ－ＭＰ－６２フリーベースポリマー）を使用することによって、ＴＦＡ塩の対応するギ酸塩への最終的な変換を達成した。
ＨＰＬＣ－ＭＳ（ｍ／ｚ）［Ｍ２＋＋ＴＦＡ］＋計算値４０７．５、検出値４０７．３
標識１３－分析物誘導体（複合体）の調製及びＭＳによるその分析
Figure 2023525915000030
標識１３（１２０ｍｇ、１９０μｍｏｌ）及びテストステロン（１００ｍｇ、３５０μｍｏｌ、１．８当量）を５ｍＬのＡＣＮ／ＭｅＯＨ／ＡｃＯＨ（１０／９０＋５体積％）に溶解し、混合物を室温で撹拌した。１６時間後、反応混合物を真空中で濃縮し、粗生成物をＨＰＬＣ精製に供した（Ｔｒｉａｒｔ Ｃ１８ ２０×２５０ｍｍ、線形勾配：３０分で２０％～１００％Ｂ；Ａ＝水；Ｂ＝ＡＣＮ）。凍結乾燥により、所望のコンジュゲートが得られた。
ＨＰＬＣ－ＭＳ（ｍ／ｚ）［Ｍ２＋ＦＡ］＋計算値 ６０９．９、検出値６０９．８
実施例２：標識１４
Figure 2023525915000031
標識１４の合成
［４－［［４－（３，５－ジオキソ－１，２，４－トリアゾリジン－４－イル）ピリジン－１－イウム－１－イル］メチル］フェニル］メチル－トリメチル－アンモニウムトリフルオロアセテートの合成：
Figure 2023525915000032
４－（ピリジン－４－イル）－１，２，４－トリアゾリジン－３，５－ジオン（０．５０ｍｍｏｌ）及び４－（ブロモメチル）ベンジルトリメチルアンモニウムブロミド（０．６０ｍｍｏｌ）［Ｐｏｌｙｍ．Ｃｈｅｍ．２０１４，５，１１８０－１１９０で以前に報告されたように合成］を１ｍＬの乾燥ＤＭＦに溶解した。反応混合物を７０°Ｃで３６時間攪拌した。溶媒を真空下で除去し、残渣を分取ＨＰＬＣによって精製した。純粋な画分を回収し、真空下で濃縮して、生成物（７８ｍｇ、２４％収率）を固体として得た。
ＨＰＬＣ法Ｃ－１８カラム：
０分：１００％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ，０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
０～２０分：１００％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ，０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
２０～６０分：７０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ，３０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
６０～６４分：２％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；９８％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
６４～７４分：２％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；９８％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
７４～７９分：６０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；４０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
７９～９０分：６０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；４０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ．
１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，メタノール－ｄ４）δ ｐｐｍ ３．１０（ｓ，９ Ｈ）４．５５（ｓ，２ Ｈ）５．８５（ｓ，２ Ｈ）７．６１－７．７０（ｍ，４ Ｈ）８．８５－８．８９（ｍ，２ Ｈ）９．０１－９．０６（ｍ，２ Ｈ）．
ＨＰＬＣ－ＭＳ（ｍ／ｚ）［Ｍ］２＋計算値 １７０．５９、検出値１７０．７９．
標識１４－分析物誘導体（複合体）の調製及びＭＳによるその分析
Figure 2023525915000033
２５－ヒドロキシビタミンＤ一水和物（０．０２４ｍｍｏｌ）及び［４－［［４－（３，５－ジオキソ－１，２，４－トリアゾリジン－４－イル）ピリジン－１－イウム－１－イル］メチル］フェニル］メチル－トリメチル－アンモニウムトリフルオロアセテート（０．０２９ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（５００μＬ）に溶解した。ＭｅＯＨ（５００μＬ）中のヨードベンゼンジアセテート（０．０３３ｍｍｏｌ）の溶液を第１の溶液に添加した。反応混合物を室温で１５分間撹拌した。ビタミンＤの対応する生成物への完全な変換が観察された。溶媒を真空下で除去し、残渣を分取ＨＰＬＣによって精製した。生成物をイオン交換後にクロロ塩として得た。
ＨＰＬＣ法Ｃ－１８カラム：
０分：１００％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ，０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
０～２０分：５％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ，９５％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
２０～４０分：５％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；９５％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
４０～４５分：２％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；９８％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
４５～５０分：２％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；９８％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
５０～５５分：６０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；４０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
５５～６５分：６０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；４０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ．
１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，メタノール－ｄ４）δ ｐｐｍ ０．４６（ｓ，２ Ｈ）０．５９（ｓ，１ Ｈ）０．９０－０．９８（ｍ，４ Ｈ）１．１４（ｓ，３ Ｈ）１．１５（ｓ，３ Ｈ）１．２５－１．４７（ｍ，１０ Ｈ）１．５８－２．３０（ｍ，１２ Ｈ）２．３７－２．４６（ｍ，１ Ｈ）２．９７－３．８６（ｍ，１ Ｈ）３．１２（ｓ，９ Ｈ）３．８２－４．０２（ｍ，２ Ｈ）４．１５－４．２６（ｍ，１ Ｈ）４．５７（ｓ，２ Ｈ）４．７６－４．８２（ｍ，１ Ｈ）５．１０－５．１７（ｎ，１ Ｈ）５．８７（ｓ，２ Ｈ）７．５９－７．７３（ｍ，４ Ｈ）８．７８－８．９０（ｍ，２ Ｈ）９．０２－９．１６（ｍ，２ Ｈ）．
ＨＰＬＣ－ＭＳ（ｍ／ｚ）［Ｍ］２＋計算値３７６．７５、検出値３７０．０６．
実施例３：標識１５
標識１５の合成
工程１：［４－［［３－（２－メトキシ－２－オキソエチル）ピリジン－１－イウム－１－イル］メチル］フェニル］メチルトリメチル－アンモニウムビストリフルオロアセテートの合成：
Figure 2023525915000034
メチル２－（３－ピリジル）アセテート（０．１６１ｍｍｏｌ）及び３－ブロモプロピル（トリメチル）アンモニウムブロミド（０．１４６ｍｍｏｌ）の混合物を乾燥ＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解した。７０°Ｃで溶液を２０時間撹拌した。溶媒を除去し、分取ＨＰＬＣで精製を進め、３０．８ｍｇの所望の生成物を無色油状物として得た。
ＨＰＬＣ法Ｃ－１８カラム：
０分：１００％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ，０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
０～４０分：９０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ，１０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
４０～４４分：２％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；９８％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
４４～５２分：２％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；９８％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
５２～５４分：６０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；４０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
５４～５９分：６０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；４０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
５９～６０分：６０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；４０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ．
１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，メタノール－ｄ４）δ ｐｐｍ ３．１０（ｓ，９ Ｈ）３．７３（ｓ，３ Ｈ）４．０２（ｓ，２ Ｈ）４．５５（ｓ，２ Ｈ）５．９２（ｓ，２ Ｈ）７．５８－７．７２（ｍ，４ Ｈ）８．１０（ｄｄ，Ｊ＝７．９７，６．２１ Ｈｚ，１ Ｈ）８．５７（ｄ，Ｊ＝８．１６ Ｈｚ，１ Ｈ）９．０２（ｄ，Ｊ＝６．１５ Ｈｚ，１ Ｈ）９．１１（ｓ，１ Ｈ）．
１３Ｃ ＮＭＲ（１５０ ＭＨｚ，メタノール－ｄ４）δ ｐｐｍ ３６．１３（１ Ｃ），５１．６７（１ Ｃ）５１．７６（３ Ｃ），６３．６０（１ Ｃ），６８．２８（１ Ｃ），１２７．８０（１ Ｃ），１２９．３３（１ Ｃ），１２９．３６（２ Ｃ），１３３．７３（２ Ｃ），１３５．９５（１ Ｃ），１３６．７５（１ Ｃ），１４３．１４（１ Ｃ），１４５．４１（１ Ｃ），１４７．３０（１ Ｃ），１６９．９７（１ Ｃ）．
ＨＰＬＣ－ＭＳ（ｍ／ｚ）［Ｍ＋ＴＦＡ］＋計算値４２７．１８、検出値４２７．６１．
工程２：［４－［［３－［２－（アザニウムアミノ）－２－オキソエチル］ピリジン－１－イウム－１－イル］メチル］フェニル］メチル－トリメチルアンモニウムトリストリフルオロアセテートの合成：
Figure 2023525915000035
［４－［［３－（２－メトキシ－２－オキソエチル）ピリジン－１－イウム－１－イル］メチル］フェニル］メチルトリメチル－アンモニウムビストリフルオロアセテート（０．０５７ｍｍｏｌ）を乾燥ＭｅＯＨ（１ｍＬ）に溶解し、ヒドラジン水和物（０．６１７ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を５０°Ｃで３時間撹拌した。次いで、溶液を室温に冷却させ、溶媒を真空中で除去し、粗混合物を分取ＨＰＬＣによって精製すると、２１．６ｍｇの所望の生成物が無色油状物として得られた。
ＨＰＬＣ法Ｃ－１８カラム：
０分：１００％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ，０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
０～４０分：９０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ，１０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
４０～４４分：２％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；９８％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
４４～５２分：２％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；９８％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
５２～５４分：６０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；４０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
５４～５９分：６０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；４０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
５９～６０分：６０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；４０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ．
１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，メタノール－ｄ４）δ ｐｐｍ ３．１０（ｓ，９ Ｈ）３．９８（ｓ，２ Ｈ）４．５５（ｓ，２ Ｈ）５．９２（ｓ，２ Ｈ）７．６０－７．６９（ｍ，４ Ｈ）８．１０（ｄｄ，Ｊ＝７．９７，６．２１ Ｈｚ，１ Ｈ）８．５７（ｄ，Ｊ＝８．０３ Ｈｚ，１ Ｈ）９．０２（ｄ，Ｊ＝６．１５ Ｈｚ，１ Ｈ）９．１４（ｓ，１ Ｈ）．
１３Ｃ ＮＭＲ（１５０ ＭＨｚ，ＭＥＴＨＡＮＯＬ－ｄ４）δ ｐｐｍ ３５．５０（１ Ｃ），５１．７７（３ Ｃ），６３．６１（１ Ｃ），６８．２６（１ Ｃ），１２７．８４（１ Ｃ），１２９．３２（１ Ｃ），１２９．３９（２ Ｃ），１３３．７２（２ Ｃ），１３５．８９（１ Ｃ），１３６．３５（１ Ｃ），１４３．２５（１ Ｃ），１４５．３７（１ Ｃ），１４７．１６（１ Ｃ），１６７．９３（１ Ｃ）．
化合物は、異なる種類の塩として得ることもできる。
実施例４：標識１６
Figure 2023525915000036
標識１６の合成
［４－［［４－（ジメチルアミノ）－２－フルオロ－ピリジン－１－イウム－１－イル］メチル］フェニル］メチル－トリメチル－アンモニウムトリフルオロアセテートの合成：
Figure 2023525915000037
２－フルオロ－Ｎ，Ｎ－ジメチルピリジン－４－アミン（０．３６ｍｍｏｌ）及び４－（ブロモメチル）ベンジルトリメチルアンモニウムブロミド（０．４６ｍｍｏｌ）［Ｐｏｌｙｍ．Ｃｈｅｍ．２０１４，５，１１８０－１１９０で以前に報告されたように合成］を１ｍＬの乾燥ＤＭＦに溶解した。反応混合物を９０°Ｃで４８時間攪拌した。溶媒を真空下で除去し、残渣を分取ＨＰＬＣによって精製した。純粋な画分を回収し、真空下で濃縮して、生成物６６ｍｇ（収率３５％）を無色油状物として得た。
ＨＰＬＣ法Ｃ－１８カラム：
０分：１００％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ，０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
０～６０分：７０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ，３０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
６０～６４分：２％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；９８％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
６４～７４分：２％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；９８％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
７４～７９分：６０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；４０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
７９～９０分：６０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；４０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ．
１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，ＡＣＥＴＯＮＩＴＲＩＬＥ－ｄ３）δ ｐｐｍ ３．０４（ｓ，９ Ｈ）３．１８（ｓ，３ Ｈ）３．２３（ｓ，３ Ｈ）４．５０（ｓ，２ Ｈ）５．４１（ｄ，Ｊ＝２．０１ Ｈｚ，２ Ｈ）６．６９（ｄｄ，Ｊ＝９．２９，２．８９ Ｈｚ，１ Ｈ）６．８７（ｄｄ，Ｊ＝７．７２，２．８２ Ｈｚ，１ Ｈ）７．４８（ｄ，Ｊ＝８．０３ Ｈｚ，２ Ｈ）７．５４－７．６５（ｍ，２ Ｈ）８．０７（ｄｄ，Ｊ＝７．７８，６．１５ Ｈｚ，１ Ｈ）．
１９Ｆ ＮＭＲ（３７６ ＭＨｚ，アセトニトリル－ｄ３）δ ｐｐｍ－９０．６３（ｄｄ，Ｊ＝８．９４，６．５６ Ｈｚ，１ Ｆ）－７５．６６（ｓ，１ Ｆ）．
ＨＰＬＣ－ＭＳ（ｍ／ｚ）［Ｍ］２＋計算値１５１．６０、検出値１５１．７７．
標識１６－分析物誘導体（複合体）の調製及びＭＳによるその分析
エストラジオールコンジュゲートの合成：
Figure 2023525915000038
エストラジオール（０．０９ｍｍｏｌ）及び［４－［［４－（ジメチルアミノ）－２－フルオロ－ピリジン－１－イウム－１－イル］メチル］フェニル］メチル－トリメチル－アンモニウムトリフルオロアセテート（０．１１ｍｍｏｌ）をＣＨ３ＣＮ（１ｍｌ）に溶解した。次いで、ＤＩＰＥＡ（０．１４ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で３０分間攪拌した。溶媒を真空下で除去し、残渣を分取ＨＰＬＣによって精製した。純粋な画分を回収し、凍結乾燥して、生成物を白色固体として得た。
ＨＰＬＣ法Ｃ－１８カラム：
０分：１００％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ，０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
０～６０分：５０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ，５０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
６０～６４分：２％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；９８％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
６４～７４分：２％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；９８％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
７４～７９分：６０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；４０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
７９～９０分：６０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；４０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ．
１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，メタノール－ｄ４）δ ｐｐｍ ０．７７（ｓ，３ Ｈ）１．１５－１．５９（ｍ，７ Ｈ）１．６２－１．７７（ｍ，１ Ｈ）１．８６－２．１０（ｍ，４ Ｈ）２．１９－２．３０（ｍ，１ Ｈ）２．３０－２．４０（ｍ，１ Ｈ）２．８１－２．８７（ｍ，２ Ｈ）２．９６（ｓ，３ Ｈ）３．０９（ｓ，９ Ｈ）３．２３（ｓ，３ Ｈ）３．６６（ｔ，Ｊ＝８．６０ Ｈｚ，１ Ｈ）４．５３（ｓ，２ Ｈ）５．５４（ｓ，２ Ｈ）５．８５（ｄ，Ｊ＝２．７６ Ｈｚ，１ Ｈ）６．７９－６．８５（ｍ，２ Ｈ）６．８７（ｄｄ，Ｊ＝７．７８，２．７６ Ｈｚ，１ Ｈ）７．４０（ｄ，Ｊ＝８．４１ Ｈｚ，１ Ｈ）７．５２（ｄ，Ｊ＝８．１６ Ｈｚ，２ Ｈ）７．６１（ｄ，Ｊ＝８．２８ Ｈｚ，２ Ｈ）８．１９（ｄ，Ｊ＝７．７８ Ｈｚ，１ Ｈ）．
ＨＰＬＣ－ＭＳ（ｍ／ｚ）［Ｍ］２＋計算値２７７．６９、検出値２７８．０５．
化合物は、異なる種類の塩として得ることもできる。
標識１６ｂ：追加の合成コンジュゲート：
Figure 2023525915000039
収率：無色固体として２１．０ｍｇ。
ＨＰＬＣ法Ｃ－１８カラム：
０分：１００％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ，０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
０～６０分：３０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ，７０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
６０～６４分：２％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；９８％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
６４～８０分：２％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；９８％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
８０～８３分：６０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；４０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
８３～８９分：６０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；４０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
８９～９０分：６０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；４０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ．
１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，メタノール－ｄ４）δ ｐｐｍ ０．７８（ｓ，３ Ｈ）１．１６－１．６１（ｍ，７ Ｈ）１．６４－１．８８（ｍ，１ Ｈ）１．８０－２．１２（ｍ，４ Ｈ）２．２１－２．３１（ｍ，１ Ｈ）２．３８（ｂｒ ｓ，１ Ｈ）２．８７（ｂｒ ｓ，２ Ｈ）３．１２（ｓ，９ Ｈ）３．６７（ｔ，Ｊ＝８．５３ Ｈｚ，１ Ｈ）４．６０（ｓ，２ Ｈ）５．９４（ｓ，２ Ｈ）６．９０－７．００（ｍ，２ Ｈ）７．２４（ｄ，Ｊ＝８．６６ Ｈｚ，１ Ｈ）７．４３－７．５３（ｍ，１ Ｈ）７．６２－７．７９（ｍ，５ Ｈ）８．４４（ｔ，Ｊ＝８．０９ Ｈｚ，１ Ｈ）８．９３（ｄ，Ｊ＝６．２７ Ｈｚ，１ Ｈ）．
ＨＰＬＣ－ＭＳ（ｍ／ｚ）［Ｍ］２＋計算値２５６．１７、検出値２５６．６９．
実施例５：標識１７
Figure 2023525915000040
標識１７の合成
工程１：３－［３－（２－メトキシ－２－オキソエチル）ピリジン－１－イウム－１－イル］プロピルトリメチルアンモニウムビストリフルオロアセテートの合成：
Figure 2023525915000041
メチル２－（３－ピリジル）アセテート（１．６１０ｍｍｏｌ）及び３－ブロモプロピル（トリメチル）アンモニウムブロミド（１．６２８ｍｍｏｌ）の混合物を乾燥ＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解した。１００°Ｃで溶液を１８時間撹拌した。溶媒を除去し、分取ＨＰＬＣで精製を進め、２９２．６ｍｇの所望の生成物を黒色油状物として得た。
ＨＰＬＣ法Ｃ－１８カラム：
０分：１００％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ，０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
０～６０分：７０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ，３０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
６０～６４分：２％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；９８％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
６４～８０分：２％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；９８％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
８０～８３分：６０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；４０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
８３～８９分：６０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；４０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
８９～９０分：６０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；４０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ．
１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，メタノール－ｄ４）δ ｐｐｍ １．９５－２．０２（ｍ，２ Ｈ）３．２２（ｓ，３ Ｈ）３．６０－３．６４（ｍ，２ Ｈ）３．７５（ｓ，３ Ｈ）４．０５－４．０８（ｍ，２ Ｈ）４．８１（ｓ，２ Ｈ）８．１３（ｄｄ，Ｊ＝６．１５，７．９３ Ｈｚ，１ Ｈ）８．６０（ｄ，Ｊ＝８．１０ Ｈｚ，１ Ｈ）９．０７（ｄ，Ｊ＝６．２９ Ｈｚ，１ Ｈ）９．１８（ｓ，１Ｈ）．
１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ ＭＨｚ，メタノール－ｄ４）δ ｐｐｍ ２４．８３（１ Ｃ）３６．３３（１ Ｃ）５１．７３（１ Ｃ）５２．６２（１ Ｃ）５２．６６（１ Ｃ）５２．７０（１ Ｃ）５７．８２（１ Ｃ）６２．３５（１ Ｃ）１２７．６９（１ Ｃ）１３６．５５（１ Ｃ）１４３．２４（１ Ｃ）１４５．３４（１ Ｃ）１４７．３１（１ Ｃ）１７０．０２（１ Ｃ）．
工程２：３－［３－［２－（アザニウムアミノ）－２－オキソエチル］ピリジン－１－イウム－１－イル］プロピルトリメチル－アンモニウムトリストリフルオロアセテートの合成：
Figure 2023525915000042
３－［３－（２－メトキシ－２－オキソエチル）ピリジン－１－イウム－１－イル］プロピルトリメチルアンモニウムビストリフルオロアセテート（０．２０５ｍｍｏｌ）を乾燥ＭｅＯＨ（２ｍＬ）に溶解し、ヒドラジン水和物（２．０５８ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を０°Ｃで４時間撹拌した。溶媒を真空中で除去し、粗混合物を分取ＨＰＬＣによる精製に供して、６６．９ｍｇの所望の生成物を褐色がかった固体として得た。
ＨＰＬＣ法Ｃ－１８カラム：
０分：１００％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ，０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
０～３０分：９０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ，１０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
３０～３４分：２％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；９８％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
３４～５０分：２％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；９８％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
５０～５３分：６０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；４０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
５３～５９分：６０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；４０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
５９～６０分：６０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；４０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ．
１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，メタノール－ｄ４）δ ｐｐｍ ２．６０－２．６９（ｍ，２ Ｈ）３．２１（ｓ，３ Ｈ）３．５８－３．６４（ｍ，２ Ｈ）３．９４－３．９７（ｍ，２ Ｈ）４．８２（ｓ，２ Ｈ）８．１２（ｄｄ，Ｊ＝６．２０，７．９９ Ｈｚ，１ Ｈ）８．５８（ｄ，Ｊ＝８．２８ Ｈｚ，１ Ｈ）９．０５（ｄ，Ｊ＝５．８２ Ｈｚ，１Ｈ）９．２１（ｓ，１ Ｈ）．
標識１７－分析物誘導体（複合体）の調製及びＭＳによるその分析
テストステロンコンジュゲートの合成：
Figure 2023525915000043
３－［３－［２－（アザニウムアミノ）－２－オキソエチル］ピリジン－１－イウム－１－イル］プロピルトリメチル－アンモニウムトリストリフルオロアセテート（０．１１３ｍｍｏｌ）及びテストステロン（０．１０４ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（１ｍＬ）に溶解し、室温で２．５日間撹拌した。溶媒を真空中で除去した後、粗混合物を分取ＨＰＬＣによって精製すると、無色固体として１５．９ｍｇが得られた。
ＨＰＬＣ法Ｃ－１８カラム：
０分：１００％ Ｈ２Ｏ，０％ ＣＨ３ＣＮ；
０～４５分：５％ Ｈ２Ｏ，９５％ ＣＨ３ＣＮ；
４５～４９分：５％ Ｈ２Ｏ；９５％ ＣＨ３ＣＮ；
４９～５０分：４０％ Ｈ２Ｏ；６０％ ＣＨ３ＣＮ；
５０～５５分：４０％ Ｈ２Ｏ；６０％ ＣＨ３ＣＮ；
５５～６０分：４０％ Ｈ２Ｏ；６０％ ＣＨ３ＣＮ．
ＨＰＬＣ－ＭＳ（ｍ／ｚ）［Ｍ２＋＋ＴＦＡ］＋計算値６３５．３８、検出値６３５．５６．
化合物は、異なる種類の塩として得ることもできる。
１８の合成：
Figure 2023525915000044
４－（ピリジン－４－イル）－１，２，４－トリアゾリジン－３，５－ジオン（０．１８ｍｍｏｌ）及び１，４－ビス（ブロモメチル）－２－メトキシベンゼン［以前にＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９６，１１８，４２７１で報告されている］（０．１８ｍｍｏｌ）を３ｍＬの乾燥ＤＭＦに溶解した。反応混合物を週末の間、室温（ｒ．ｔ．）で撹拌した。次いで、ＴＭＡ溶液（０．３５ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で３０分間撹拌した。溶媒を真空下で除去し、粗生成物を分取ＨＰＬＣによって精製した。純粋な画分を回収し、真空下で濃縮した。残渣を希釈ＨＣｌ（水溶液）に溶解し、凍結乾燥した（２回繰り返した）。生成物を、２つの異性体の混合物（ＮＭＲから約７：３の比）（１７％収率）として、白色固体として得た。
ＨＰＬＣ法Ｃ－１８カラム：
０分：１００％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ，０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
０～１０分：１００％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ，０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
１０～６０分：７０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ，３０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
６０～６４分：２％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；９８％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
６４～７４分：２％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；９８％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
７４～７９分：６０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；４０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
７９～９０分：６０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；４０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ．
主異性体：１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，メタノール－ｄ４）δ ｐｐｍ ３．１３（ｓ，９ Ｈ）３．９１（ｓ，３ Ｈ）４．５４（ｓ，２ Ｈ）５．７７（ｓ，２ Ｈ）７．２３－７．３１（ｍ，２ Ｈ）７．７０（ｄ，Ｊ＝８．２８ Ｈｚ，１ Ｈ）８．７６－８．８４（ｍ，２ Ｈ）８．９５－９．０２（ｍ，２ Ｈ）．
副異性体：１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，メタノール－ｄ４）δ ｐｐｍ ３．１０（ｓ，９ Ｈ）３．９６（ｓ，３ Ｈ）４．５４（ｓ，２ Ｈ）５．８２（ｓ，２ Ｈ）７．１８（ｄｄ，Ｊ＝７．８４，１．６９ Ｈｚ，１ Ｈ）７．３６（ｄ，Ｊ＝１．５１ Ｈｚ，１ Ｈ）７．５６（ｄ，Ｊ＝７．７８ Ｈｚ，１ Ｈ）８．８４－８．９３（ｍ，２ Ｈ）９．０２－９．０９（ｍ，２ Ｈ）．
ＨＰＬＣ－ＭＳ（ｍ／ｚ）［Ｍ］２＋計算値１８５．６０、検出値１８５．７８．
標識１８で誘導体化されたビタミンＤの合成：
Figure 2023525915000045
２５－ヒドロキシビタミンＤ一水和物（０．０１９ｍｍｏｌ）及び標識１８（０．０２０ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（５００μＬ）に溶解した。ＭｅＯＨ中のヨードベンゼンジアセテート（０．０２３ｍｍｏｌ）の溶液を第１の溶液に添加した。反応混合物を室温で１５分間撹拌した。ビタミンＤの対応する生成物への完全な変換が観察された。溶媒を真空下で除去し、粗生成物を分取ＨＰＬＣによって精製した。純粋な画分を回収し、真空下で濃縮した。残渣を希釈ＨＣｌ（水溶液）に溶解し、凍結乾燥した（２回繰り返した）。生成物を白色固体として得た。
ＨＰＬＣ法Ｃ－１８カラム：
０分：１００％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ，０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
０～２０分：５％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ，９５％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
２０～４０分：５％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；９５％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
４０～４５分：２％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；９８％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
４５～５０分：２％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；９８％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
５０～５５分：６０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；４０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
５５～６５分：６０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；４０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ．
ＨＰＬＣ－ＭＳ（ｍ／ｚ）［Ｍ］２＋計算値３８４．８、検出値３８５．０５．
標識１９の合成：
Figure 2023525915000046
２－フルオロ－Ｎ，Ｎ－ジメチルピリジン－４－アミン（０．１８ｍｍｏｌ）及び１，４－ビス（ブロモメチル）－２－メトキシベンゼン［以前にＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９６，１１８，４２７１で報告されている］（０．１８ｍｍｏｌ）を３ｍＬの乾燥ＤＭＦに溶解した。反応混合物を週末の間、室温で撹拌した。次いで、ＴＭＡ溶液（０．３６ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で２時間撹拌した。溶媒を真空下で除去し、残渣を分取ＨＰＬＣによって精製した。純粋な画分を回収し、真空下で濃縮して、生成物を２つの異性体の混合物（ＮＭＲから約７：３の比）（収率１４％）として、無色油状物として得た。
ＨＰＬＣ法Ｃ－１８カラム：
０分：１００％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ，０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
０～６０分：７０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ，３０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
６０～６４分：２％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；９８％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
６４～７４分：２％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；９８％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
７４～７９分：６０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；４０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
７９～９０分：６０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；４０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ．
主異性体：１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，アセトニトリル－ｄ３）δ ｐｐｍ ３．０５（ｓ，９ Ｈ）３．１６（ｓ，３ Ｈ）３．２１（ｓ，３ Ｈ）３．８７（ｓ，３ Ｈ）４．４６（ｓ，２ Ｈ）５．２９（ｄ，Ｊ＝１．６３ Ｈｚ，２ Ｈ）６．６３（ｄｄ，Ｊ＝９．４１，２．８９ Ｈｚ，１ Ｈ）６．７７（ｄｄ，Ｊ＝７．７８，２．８９ Ｈｚ，１ Ｈ）７．１６（ｄｄ，Ｊ＝７．７２，１．４４ Ｈｚ，１ Ｈ）７．１９（ｄ，Ｊ＝１．１３ Ｈｚ，１ Ｈ）７．４７（ｄｄ，Ｊ＝７．７８，１．００ Ｈｚ，１ Ｈ）７．９２（ｄｄ，Ｊ＝７．７８，６．１５ Ｈｚ，１ Ｈ）．
副異性体：１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，アセトニトリル－ｄ３）δ ｐｐｍ ３．０４（ｓ，９ Ｈ）３．１６（ｓ，３ Ｈ）３．２１（ｓ，３ Ｈ）３．８７（ｓ，３ Ｈ）４．４３（ｓ，２ Ｈ）５．２８（ｄ，Ｊ＝１．６３ Ｈｚ，２ Ｈ）６．６２（ｂｒ ｄｄ，Ｊ＝９．２９，２．８９ Ｈｚ，１ Ｈ）６．７６（ｂｒ ｄｄ，Ｊ＝７．７２，２．８２ Ｈｚ，１ Ｈ）７．０８－７．２２（ｍ，２ Ｈ）７．４２－７．５０（ｍ，１ Ｈ）７．９１（ｂｒ ｄｄ，Ｊ＝７．７８，６．０２ Ｈｚ，１ Ｈ）．
１９Ｆ ＮＭＲ（３７６ ＭＨｚ，ＡＣＥＴＯＮＩＴＲＩＬＥ－ｄ３）δ ｐｐｍ－７５．３９，－９０．１１．
ＨＰＬＣ－ＭＳ（ｍ／ｚ）［Ｍ＋ＴＦＡ］＋計算値４４６．２１、検出値４４６．３９．
標識１９とコンジュゲートしたエストラジオールの合成：
Figure 2023525915000047
エストラジオール（０．０２２ｍｍｏｌ）及び標識１９（０．０２６ｍｍｏｌ）をＣＨ３ＣＮ（１ｍＬ）に溶解した。次いで、Ｋ２ＣＯ３（０．０６６ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で２時間攪拌した。溶媒を真空下で除去し、残渣を分取ＨＰＬＣによって精製した。純粋な画分を回収し、真空下で濃縮した。残渣を希釈ＨＣｌ（水溶液）に溶解し、凍結乾燥した（２回繰り返した）。生成物を、２つの異性体の混合物（ＮＭＲから約７：３の比）として、白色固体として得た。
ＨＰＬＣ法Ｃ－１８カラム：
０分：１００％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ，０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
０～６０分：５０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ，５０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
６０～６４分：２％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；９８％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
６４～７４分：２％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；９８％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
７４～７９分：６０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；４０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ．
主異性体：１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，メタノール－ｄ４）δ ｐｐｍ ０．７８（ｓ，３ Ｈ）１．１６－１．５９（ｍ，８ Ｈ）１．６３－１．７９（ｍ，１ Ｈ）１．８７－２．１０（ｍ，３ Ｈ）２．１９－２．２９（ｍ，１ Ｈ）２．３２－２．４０（ｍ，１ Ｈ）２．８３－２．８５（ｍ，２ Ｈ）２．９４（ｂｒ ｓ，３ Ｈ）３．１２（ｓ，９ Ｈ）３．２１（ｂｒ ｓ，３ Ｈ）３．６７（ｔ，Ｊ＝８．６６ Ｈｚ，１ Ｈ）３．９４（ｓ，３ Ｈ）４．５２（ｓ，２ Ｈ）５．４６（ｓ，２ Ｈ）５．８２（ｄ，Ｊ＝２．７６ Ｈｚ，１ Ｈ）６．７７－６．８３（ｍ，３ Ｈ）７．１６（ｄｄ，Ｊ＝７．６５，１．５１ Ｈｚ，１ Ｈ）７．２４（ｄ，Ｊ＝１．２５ Ｈｚ，１ Ｈ）７．４１（ｂｒ ｄ，Ｊ＝８．０３ Ｈｚ，１ Ｈ）７．４４（ｄ，Ｊ＝７．７８ Ｈｚ，１ Ｈ）８．１４（ｄ，Ｊ＝７．９１ Ｈｚ，１ Ｈ）．
副異性体：１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，メタノール－ｄ４）δ ｐｐｍ ０．７８（ｓ，３ Ｈ）１．１６－１．５９（ｍ，８ Ｈ）１．６３－１．７９（ｍ，１ Ｈ）１．８７－２．１０（ｍ，３ Ｈ）２．１９－２．２９（ｍ，１ Ｈ）２．３２－２．４０（ｍ，１ Ｈ）２．８３－２．８５（ｍ，２ Ｈ）２．９７（ｂｒ ｓ，３ Ｈ）３．０８（ｓ，３ Ｈ）３．２３（ｂｒ ｓ，１ Ｈ）３．６７（ｔ，Ｊ＝８．６６ Ｈｚ，１ Ｈ）３．８８（ｓ，３ Ｈ）４．５２（ｓ，２ Ｈ）５．５２（ｓ，２ Ｈ）５．８８（ｂｒ ｄ，Ｊ＝２．７６ Ｈｚ，１ Ｈ）６．８３－６．８９（ｍ，１ Ｈ）７．２０－７．２２（ｍ，１ Ｈ）７．４１（ｂｒ ｄ，Ｊ＝８．０３ Ｈｚ，１ Ｈ）７．５１（ｂｒ ｄ，Ｊ＝７．７８ Ｈｚ，１ Ｈ）８．２１（ｂｒ ｄ，Ｊ＝７．７８ Ｈｚ，１ Ｈ）．
ＨＰＬＣ－ＭＳ（ｍ／ｚ）［Ｍ］２＋計算値２９２．７、検出値２９３．０４．
標識２０の合成：
Figure 2023525915000048
２－フルオロ－Ｎ，Ｎ－ジメチルピリジン－４－アミン（０．７８ｍｍｏｌ）及び（３－ブロモプロピル）トリメチルアンモニウムブロミド（０．９４ｍｍｏｌ）を１ｍＬの乾燥ＤＭＦに溶解した。反応混合物を７０°Ｃで週末にわたって撹拌した。溶媒を真空下で除去し、残渣を分取ＨＰＬＣによって精製した。純粋な画分を回収し、真空下で濃縮して、生成物を無色油状物として得た（収率４６％）。
ＨＰＬＣ法Ｃ－１８カラム：
０分：１００％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ，０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
０～６０分：７０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ，３０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
６０～６４分：２％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；９８％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
６４～７４分：２％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；９８％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ．
１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ ｐｐｍ ２．１８－２．３５（ｍ，２ Ｈ）３．０３（ｓ，９ Ｈ）３．０８（ｓ，３ Ｈ）３．１３（ｓ，３ Ｈ）３．３１－３．３９（ｍ，２ Ｈ）４．１０－４．２１（ｍ，２ Ｈ）６．５９（ｄｄ，Ｊ＝９．３５，２．８２ Ｈｚ，１ Ｈ）６．７４（ｄｄ，Ｊ＝７．７８，２．７６ Ｈｚ，１ Ｈ）７．７７（ｄｄ，Ｊ＝７．７２，６．０９ Ｈｚ，１ Ｈ）．
１９Ｆ ＮＭＲ（３７６ ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ ｐｐｍ－９１．３８－－９１．２７，－７５．６３．
１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ ＭＨｚ，酸化重水素）δ ｐｐｍ ２３．０１（１ Ｃ）２５．３７（１ Ｃ）３９．９４（１ Ｃ）４７．８１（１ Ｃ）５３．０３（３ Ｃ）６２．７３（１ Ｃ）９１．０４（１ Ｃ）９１．３１（１ Ｃ）１０６．３２（１ Ｃ）１３９．４５（１ Ｃ）１５９．８７（１ Ｃ）．
ＨＰＬＣ－ＭＳ（ｍ／ｚ）［Ｍ］２＋計算値１２０．６０、検出値１２０．５９．
標識２０とコンジュゲートしたエストラジオールの合成：
Figure 2023525915000049
エストラジオール（０．０７３ｍｍｏｌ）及び標識２０（０．１１ｍｍｏｌ）をＣＨ３ＣＮ（１ｍＬ）に溶解した。次いで、Ｋ２ＣＯ３（０．２２ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で２時間攪拌した。溶媒を真空下で除去し、残渣を分取ＨＰＬＣによって精製した。純粋な画分を回収し、真空下で濃縮した。残渣を希釈ＨＣｌ（水溶液）に溶解し、凍結乾燥した（２回繰り返した）。生成物を白色固体として得た。
ＨＰＬＣ法Ｃ－１８カラム：
０分：１００％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ，０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
０～６０分：５０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ，５０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
６０～６４分：２％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；９８％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
６４～７４分：２％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；９８％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ；
７４～７９分：６０％ Ｈ２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ；４０％ ＣＨ３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ．
１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，メタノール－ｄ４）δ ｐｐｍ ０．７９（ｓ，３ Ｈ）１．２２－１．５５（ｍ，８ Ｈ）１．６４－１．８０（ｍ，１ Ｈ）１．８５－２．１２（ｍ，３ Ｈ）２．２０－２．３４（ｍ，１ Ｈ）２．３４－２．４９（ｍ，３ Ｈ）２．９１（ｂｒ ｄｄ，Ｊ＝８．６０，４．０８ Ｈｚ，２ Ｈ）２．９６（ｓ，３ Ｈ）３．１８（ｓ，９ Ｈ）３．２２（ｓ，３ Ｈ）３．４９－３．５５（ｍ，２ Ｈ）３．６８（ｔ，Ｊ＝８．６０ Ｈｚ，１ Ｈ）４．３７（ｔ，Ｊ＝７．２８ Ｈｚ，２ Ｈ）５．８４（ｄ，Ｊ＝２．７６ Ｈｚ，１ Ｈ）６．８４（ｄｄ，Ｊ＝７．６５，２．７６ Ｈｚ，１ Ｈ）７．０６－７．１０（ｍ，２ Ｈ）７．４９（ｄ，Ｊ＝８．４１ Ｈｚ，１ Ｈ）８．０３（ｄ，Ｊ＝７．６５ Ｈｚ，１ Ｈ）．
ＨＰＬＣ－ＭＳ（ｍ／ｚ）［Ｍ］２＋計算値２４６．６８、検出値２４７．００．
本特許出願は、欧州特許出願２０１７５８０２．６の優先権を主張し、この欧州特許出願の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (15)

  1. 質量分析による決定を使用する分析物の定量的検出のための化合物であって、
    前記化合物が、永久電荷、特に永久正味電荷を含んでおり、前記分析物に共有結合することが可能であり、
    前記化合物が、質量ｍ１及び正味電荷ｚ１を有し、
    前記化合物が、質量分析による決定によるフラグメンテーション後に、質量ｍ２＜ｍ１及び正味電荷ｚ２＜ｚ１を有する少なくとも１つの娘イオンを形成することが可能であり、
    ｍ１／ｚ１＜ｍ２／ｚ２である、
    化合物。
  2. 前記フラグメンテーションが一段階プロセスである、請求項１に記載の化合物。
  3. ｚ１が２、３、４又は５であり、好ましくはｚ１が２であり、かつ／又はｍ１／ｚ１が少なくとも６０であり、かつ／又はｍ２／ｚ２が少なくとも７０である、請求項１又は２に記載の化合物。
  4. ｚ２＝ｚ１－１、好ましくはｚ２が１である、請求項１～３のいずれか一項に記載の化合物。
  5. ｚ１及びｚ２の各々又は両方が、永久電荷、特に永久正味電荷である、請求項１～４のいずれか一項に記載の化合物。
  6. ｚ１及びｚ２の各々又は両方が、永久正電荷、特に永久に正の正味電荷である、請求項１～５のいずれか一項に記載の化合物。
  7. 前記化合物が、さらなる娘イオンを形成することが可能であり、前記さらなる娘イオンの各々が、前記化合物の１つのフラグメント又は前記化合物の複数のフラグメントを含み、各々がｘ＞４のｍｘ／ｚｘ値を有し、前記さらなる娘イオンの前記ｍｘ／ｚｘ値の各々がｍ１／ｚ１値よりも小さい、請求項１～６のいずれか一項に記載の化合物。
  8. 少なくとも３つのユニットＺ１、Ｚ２、Ｑ及び任意のさらなるユニットＬ１を含み、前記ユニットが互いに共有結合しており、
    Ｑが、前記分析物と共有結合を形成可能な反応性ユニットであり、
    Ｚ１が、少なくとも１つの永久に荷電した部分、特に永久に正に荷電した部分又は永久に負に荷電した部分を含む荷電ユニットであり、
    Ｚ２が、少なくとも１つの永久に荷電した部分、特に永久に正に荷電した部分又は永久に負に荷電した部分を含む荷電ユニットであり、かつ
    Ｌ１が、置換又は非置換リンカー、特に、フラグメンテーションによる切断可能な基、例えば、Ｍｃ Ｌａｆｆｅｒｔｙフラグメンテーション部分、Ｒｅｔｒｏ Ｄｉｅｌｓ Ａｌｄｅｒフラグメンテーション部分又は脂肪族であり、
    前記化合物の前記正味電荷が１より大きい、請求項１～７のいずれか一項に記載の化合物。
  9. トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含まない、請求項１～８のいずれか一項に記載の化合物。
  10. 請求項１～９のいずれか一項に記載の化合物を含む、組成物。
  11. 請求項１～９のいずれか一項に記載の化合物、又は請求項１０に記載の組成物を含む、キット。
  12. 質量分析による決定を使用する分析物の定量的検出のための複合体であって、
    前記複合体が、互いに共有結合した前記分析物及び化合物によって形成され、前記複合体が、永久電荷、特に永久正味電荷を含み、
    前記複合体が、質量ｍ３及び正味電荷ｚ３を有し、
    前記複合体が、質量分析による決定によるフラグメンテーション後に、質量ｍ４＜ｍ３及び正味電荷ｚ４＜ｚ３を有する少なくとも１つの娘イオンを形成することが可能であり、
    ｍ３／ｚ３＜ｍ４／ｚ４であり、特に、ｚ３及びｚ４の各々又は両方が永久正味電荷である、複合体。
  13. ｚ３＝２であり、フラグメンテーション後、前記複合体が、ｚ４＝１の前記娘イオン及びさらなる娘イオンを形成することが可能であり、前記さらなる娘イオンが、正味電荷ｚ５（ｚ５＝１）を有し、前記娘イオン又は前記さらなる娘イオンが、前記分析物又はそのフラグメントを含む、請求項１２に記載の複合体。
  14. 前記分析物の質量分析による決定のための請求項１～９のいずれか一項に記載の化合物の使用であって、好ましくは、前記質量分析による決定が、タンデム質量分析による決定、特にトリプル四重極質量分析による決定を含む、使用。
  15. 分析物の質量分析による決定のための方法であって、
    （ａ）前記分析物を請求項１～９のいずれか一項に記載の化合物と反応させる工程であって、それにより、請求項１２又は１３のいずれか一項に記載の複合体が形成される、前記分析物を請求項１～９のいずれか一項に記載の化合物と反応させる工程と、
    （ｂ）工程（ａ）からの前記複合体を質量分光分析に供する工程と
    を含み、好ましくは工程（ｂ）が、
    （ｉ）前記複合体のイオンを質量分光分析の第１段階に供する工程であって、それにより、前記複合体の前記イオンが、その質量／電荷（ｍ／ｚ）比に従って特徴付けられる、前記複合体のイオンを質量分光分析の第１段階に供する工程と、
    （ｉｉ）前記複合体の前記イオンのフラグメンテーションを引き起こす工程であって、それにより、第１の実体、特に低分子量の実体が放出され、かつ前記複合体の娘イオンが生成され、前記複合体の前記娘イオンは、そのｍ／ｚ比が前記複合体の前記イオンとは異なる、フラグメンテーションを引き起こす工程と、
    （ｉｉｉ）前記複合体の前記娘イオンを質量分光分析の第２段階に供する工程であって、それにより、前記複合体の前記娘イオンが、そのｍ／ｚ比に従って特徴付けられる、前記複合体の前記娘イオンを質量分光分析の第２段階に供する工程と
    を含み、並びに／又は、
    （ｉｉ）は、前記複合体の前記イオンの代替的なフラグメンテーションを更に含んでもよく、それにより、前記第１の実体とは異なる第２の実体が放出され、前記複合体の第２の娘イオンが生成され、かつ、
    （ｉｉｉ）は、前記複合体の第１の娘イオン及び第２の娘イオンを質量分光分析の第２段階に供することを更に含んでもよく、それにより、前記複合体の前記第１の娘イオン及び前記第２の娘イオンが、それらのｍ／ｚ比に従って特徴付けられ、
    前記第１の娘イオン及び／又は前記第２の娘イオンの前記ｍ／ｚ比が、前記複合体の前記イオンの前記ｍ／ｚ比よりも大きく、
    好ましくは、工程（ａ）の前のさらなる工程（ａ’）が、
    （ａ’）前記複合体の前記イオン又は前記化合物のイオンを、対イオンのイオン交換に供することを含み、前記対イオンとして、特に強く配位しているアニオン、例えばトリフルオロアセタートが、塩化物、臭化物又は弱く配位している対イオンによって交換される、方法。
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