CN109633141A - 一种胆固醇以及脂肪酸代谢抑制药物的高通量评价方法 - Google Patents

一种胆固醇以及脂肪酸代谢抑制药物的高通量评价方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种胆固醇以及脂肪酸代谢抑制药物的高通量评价方法，包括以下步骤：(1)细胞培养及标记；(2)碱性环境下石油醚萃取胆固醇，利用Microbeta液体闪烁计数仪进行计数，获取待评价的抑制药物对胆固醇代谢的抑制作用；(3)酸性环境下石油醚萃取脂肪酸，利用Microbeta液体闪烁计数仪进行计数，获取待评价的抑制药物对脂肪酸代谢的抑制作用。与现有技术相比，本发明建立起一套简便，快捷，高效，高通量的胆固醇与脂肪酸提取工艺，降低了仪器设备的成本，便于操作，同时具有较高的产物提取效率，大大提高了该方法的市场竞争力。

Description

一种胆固醇以及脂肪酸代谢抑制药物的高通量评价方法
技术领域
本发明涉及示踪技术领域，具体涉及一种胆固醇以及脂肪酸代谢抑制药物的高通量评价方法。
背景技术
胆固醇广泛存在于动物体内，尤以脑及神经组织中最为丰富，在肾、脾、皮肤、肝和胆汁中含量也高。胆固醇是动物组织细胞所不可缺少的重要物质，它不仅参与形成细胞膜，而且是合成胆汁酸，维生素D以及甾体激素的原料。胆固醇还是临床生化检查的一个重要指标，在正常情况下，机体在肝脏中合成和从食物中摄取的胆固醇，将转化为甾体激素或成为细胞膜的组分，并使血液中胆固醇的浓度保持恒定。当肝脏发生严重病变时，胆固醇浓度会降低。而在黄疸性梗阻和肾病综合征患者体内，胆固醇浓度往往会升高。
脂肪酸是由碳、氢、氧三种元素组成的一类化合物，是中性脂肪、磷脂和糖脂的主要成分。当脂肪酸在人体内被氧化生成二氧化碳和水，并放出一定的热量时，脂肪酸是一种能源。脂肪酸贮存在脂肪细胞中，以备人体不时之需。
目前，对于胆固醇以及脂肪酸生成及代谢的高通量研究方法集中在HPLC以及质谱分析。但是，该方法对于仪器设备要求较高，并不具有广泛使用的优势。而传统的胆固醇和脂肪酸提取方法也局限于材料的使用量，并不具备高通量药物筛选的条件。
胆固醇与脂肪酸代谢对于机体具有重要作用。近年来，许多疾病研究的靶点都集中在胆固醇与脂肪酸代谢途径中的关键酶，即通过抑制胆固醇与脂肪酸代谢来治疗相关疾病。因此，对于开发一种便于操作，对仪器设备要求较低，并且能够进行高通量药物筛选的胆固醇与脂肪酸合成代谢追踪与提取方法是非常必要和紧迫的。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种对仪器设备要求低的胆固醇以及脂肪酸代谢抑制药物的高通量评价方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种胆固醇以及脂肪酸代谢抑制药物的高通量评价方法，包括以下步骤：
(1)在细胞培养板上接种细胞，培养后加入待评价的抑制药物以及C14标记的丙酮酸或乙酸，标记得到标记型细胞及培养基；此步骤中，抑制药物进入细胞内，结合到胆固醇或脂肪酸合成的关键酶上，抑制其活性。
(2)将标记型细胞培养基转移至新的聚丙烯深孔板中，加入NaOH溶液裂解细胞并将细胞裂解液转移至上述深孔板中，再加入KOH溶液，将聚丙烯深孔板封口，并置于烘箱中加热，然后冷却过夜，加入无水乙醇，静置后加入石油醚，第一次离心萃取得到上层液和下层液；此步骤中，脂肪酸与强碱发生皂化反应生成高级脂肪酸盐溶于水相，胆固醇溶于石油醚层，便于萃取。
(3)将上层液转移至新的聚丙烯深孔板中，真空浓缩直至石油醚全部挥发，然后加入闪烁液，混合均匀后转移至Optiplate白色板中，利用Microbeta液体闪烁计数仪进行计数，获取待评价的抑制药物对胆固醇代谢的抑制作用；闪烁液将放射信号转化成荧光分子从而进行计数。
(4)在下层液中加入浓盐酸调节pH至小于1，然后加入石油醚进行第二次离心萃取，吸取上层石油醚至新的聚丙烯深孔板中，留下萃余层；将皂化的脂肪酸盐重新生成不溶于水的脂肪酸，进入到石油醚层，便于萃取。
(5)在步骤(4)的萃余层中加入石油醚进行第三次离心萃取，吸取上层石油醚并和步骤(4)得到的上层石油醚合并，得到下层液萃取液；
(6)将下层液萃取液真空浓缩直至石油醚全部挥发，然后加入闪烁液，混合均匀后转移至optiplate白色板中，利用Microbeta液体闪烁计数仪进行计数，获取待评价的抑制药物对脂肪酸代谢的抑制作用。
优选的，步骤(1)中，接种细胞包括以下步骤：
a)在细胞培养板的孔中填充培养基，所述培养基中含有体积分数为8％～12％的胎牛血清及摩尔浓度为20～30mM的葡萄糖，每个孔中接种的细胞数为5000～10000个；
b)40～50h后更换完全新鲜的培养基；
c)15～20h后更换成新鲜的无血清及摩尔浓度为1～10mM的葡萄糖的培养基。
优选的，加入的待评价的抑制药物起始浓度为10～30μM，3倍稀释，共8个点。C14标记的丙酮酸或乙酸的用量为1～3μCi；所述标记的温度为35～38℃，标记的时间为4～8h，标记时的气体环境中含有4％～6％的CO2。
优选的，步骤(2)中，加入的NaOH溶液的浓度为0.1N，细胞培养板每个孔中加入的NaOH溶液体积为培养基体积的80％～120％；此步骤中NaOH可以将细胞充分裂解，释放细胞内生成的胆固醇和脂肪酸。
加入的KOH溶液的浓度为40％～50％(W/V)，细胞培养板每个孔中加入的KOH溶液体积为培养基体积的25％～40％；此步骤中，KOH为后续皂化反应提供了强碱环境。
所述烘箱中的温度为70～90℃，加热时间为0.5～2h；进行皂化反应。
加入的无水乙醇的体积与培养基体积之比为(1.5～3)：1：静置的时间为0.5～2h。
优选的，第一次离心萃取时加入的石油醚体积与培养基体积之比为(4～6)：1，离心的转速为800～1200rpm，离心萃取的时间为5～10min。
优选的，所述真空浓缩的温度为40～60℃，所述闪烁液体积为150μl～250μl。
优选的，第二次离心萃取时加入的石油醚体积与下层液的体积之比为(0.8～1.2)：1，离心的转速为800～1200rpm，离心萃取的时间为5～10min。
优选的，第三次离心萃取时加入的石油醚体积与萃余层的体积之比为(0.4～1)：1，离心的转速为800～1200rpm，离心萃取的时间为5～10min。
与现有技术相比，本发明的有益效果体现在以下几方面：
(1)本方法采用高通量(96孔板)C14示踪法检测胆固醇与脂肪酸的合成，旨在以工业化的高效，简便手段对胆固醇与脂肪酸合成途径中的靶点进行药物筛选，以满足科研与市场的需求；
(2)建立起一套简便，快捷，高效，高通量的胆固醇与脂肪酸提取工艺，降低了仪器设备的成本，便于操作，同时具有较高的产物提取效率，大大提高了该方法的市场竞争力。
附图说明
图1为实施例1中两次利用Microbeta液体闪烁计数仪进行计数的结果示意图；
图2为实施例2中两次利用Microbeta液体闪烁计数仪进行计数的结果示意图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
HepG2细胞的培养与标记：
在96孔细胞培养板中接种细胞，细胞数量为10000个每孔。培养基为完全培养基，包含10％胎牛血清以及25mM葡萄糖。48小时后，更换新鲜的完全培养基。18小时后，更换200μl每孔的新鲜培养基(10％胎牛血清，5.5mM葡萄糖以及不含丙酮酸)。加入候选化合物1、2、3、4处理1小时。再加入C14标记的丙酮酸(2μCi)到对应孔内，37℃,5％CO2标记5小时。
胆固醇合成途径中，C14标记的丙酮酸掺入量的测定：
将上述细胞培养记转移到新的96孔聚丙烯深孔板中。在室温下，向细胞中加入200μl 0.1N NaOH裂解细胞，合并细胞裂解液与培养液。向上述混合液中加入68μl 50％(W/V)KOH，封口膜封口并加盖。将含有细胞裂解液的96孔深孔板放入烘箱中，80℃1小时，自然冷却过夜。第二天，向96孔深孔板中加入400μl无水乙醇，室温放置1小时。向每个孔中加入1ml石油醚来抽提非皂化的脂类(例如胆固醇)，摇匀后，1000rpm离心5分钟。小心吸取上层600μl液体，转移到新的96孔深孔板中。真空离心浓缩仪，2-3小时直至石油醚全部蒸发。向96孔深孔板中加入220μl闪烁液，摇匀，溶解非皂化脂类。将上述闪烁液转移到96孔Optiplate白色板中，利用Microbeta液体闪烁计数仪进行计数。结果见附图
脂肪酸合成途径中，C14标记的丙酮酸掺入量的测定：
将步骤上述余下的石油醚层小心吸弃，向下层水相加入400μl浓盐酸，确保溶液pH值小于1。向上述孔中加入1ml石油醚来抽提皂化脂类(脂肪酸)，摇匀后，1000rpm离心5分钟。小心吸取600μl上层石油醚层至新的96孔深孔板中。向96孔深孔板中补充600μl石油醚，摇匀，1000rpm离心5分钟。小心吸取300μl上层石油醚层合并至新的96孔深孔板中。真空离心浓缩仪，2-3小时直至石油醚全部蒸发。向96孔深孔板中加入220μl闪烁液，摇匀，溶解皂化脂类(脂肪酸)。将上述闪烁液转移到96孔Optiplate白色板中，利用Microbeta液体闪烁计数仪进行计数。两次Microbeta液体闪烁计数仪进行计数的结果见附图1，从图中我们可以发现化合物1对于乙酸在胆固醇合成中的显著抑制作用，而化合物2,3,4对于乙酸在脂肪酸合成中的利用具有明显的抑制作用。通过现有技术对化合物1～4进行检测，确认化合物1对于乙酸在胆固醇合成具有抑制作用，化合物2～4对于乙酸在脂肪酸合成中的利用具有明显的抑制作用，与本发明所用方法结论一致。
实施例2
A549细胞的培养与标记：
在96孔细胞培养板中接种细胞，细胞数量为10000个每孔。培养基为完全培养基，包含10％胎牛血清以及25mM葡萄糖。48小时后，更换新鲜的完全培养基。18小时后，更换200μl每孔的新鲜培养基(10％胎牛血清，5.5mM葡萄糖以及不含丙酮酸)。加入候选化合物5、6、7、8处理1小时。再加入C14标记的丙酮酸(2μCi)或乙酸(1μCi)到对应孔内，37℃,5％CO2标记5小时。
胆固醇合成途径中，C14标记的丙酮酸与乙酸掺入量的测定：
将上述细胞培养记转移到新的96孔聚丙烯深孔板中。在室温下，向细胞中加入200μl 0.1N NaOH裂解细胞，合并细胞裂解液与培养液。向上述混合液中加入68μl 50％(W/V)KOH，封口膜封口并加盖。将含有细胞裂解液的96孔深孔板放入烘箱中，80℃1小时，自然冷却过夜。第二天，向96孔深孔板中加入400μl无水乙醇，室温放置1小时。向每个孔中加入1ml石油醚来抽提非皂化的脂类(例如胆固醇)，摇匀后，1000rpm离心5分钟。小心吸取上层600μl液体，转移到新的96孔深孔板中。真空离心浓缩仪，2-3小时直至石油醚全部蒸发。向96孔深孔板中加入220μl闪烁液，摇匀，溶解非皂化脂类。将上述闪烁液转移到96孔Optiplate白色板中，利用Microbeta液体闪烁计数仪进行计数。结果见附图
脂肪酸合成途径中，C14标记的丙酮酸与乙酸掺入量的测定：
将步骤上述余下的石油醚层小心吸弃，向下层水相加入400μl浓盐酸，确保溶液pH值小于1。向上述孔中加入1ml石油醚来抽提皂化脂类(脂肪酸)，摇匀后，1000rpm离心5分钟。小心吸取600μl上层石油醚层至新的96孔深孔板中。向96孔深孔板中补充600μl石油醚，摇匀，1000rpm离心5分钟。小心吸取300μl上层石油醚层合并至新的96孔深孔板中。真空离心浓缩仪，2-3小时直至石油醚全部蒸发。向96孔深孔板中加入220μl闪烁液，摇匀，溶解皂化脂类(脂肪酸)。将上述闪烁液转移到96孔Optiplate白色板中，利用Microbeta液体闪烁计数仪进行计数。两次Microbeta液体闪烁计数仪进行计数的结果见附图1，从图中我们可以发现四种候选化合物对丙酮酸在胆固醇和脂肪酸合成中的利用均表现出明显的抑制作用。
过现有技术对化合物5～8进行检测，确认化合物5～8对于丙酮酸在胆固醇合成及脂肪酸合成具有抑制作用，与本发明所用方法结论一致。

Claims (8)

1.一种胆固醇以及脂肪酸代谢抑制药物的高通量评价方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在细胞培养板上接种细胞，培养后加入待评价的抑制药物以及C14标记的丙酮酸或乙酸，标记得到标记型细胞及培养基；
(2)将标记型细胞培养基转移至新的聚丙烯深孔板中，加入NaOH溶液裂解细胞并将细胞裂解液转移至上述深孔板中，再加入KOH溶液，将聚丙烯深孔板封口，并置于烘箱中加热，然后冷却过夜，加入无水乙醇，静置后加入石油醚，第一次离心萃取得到上层液和下层液；
(3)将上层液转移至新的聚丙烯深孔板中，真空浓缩直至石油醚全部挥发，然后加入闪烁液，混合均匀后转移至Optiplate白色板中，利用Microbeta液体闪烁计数仪进行计数，获取待评价的抑制药物对胆固醇代谢的抑制作用；
(4)在下层液中加入浓盐酸调节pH至小于1，然后加入石油醚进行第二次离心萃取，吸取上层石油醚至新的聚丙烯深孔板中，留下萃余层；
(5)在步骤(4)的萃余层中加入石油醚进行第三次离心萃取，吸取上层石油醚并和步骤(4)得到的上层石油醚合并，得到下层液萃取液；
(6)将下层液萃取液真空浓缩直至石油醚全部挥发，然后加入闪烁液，混合均匀后转移至optiplate白色板中，利用Microbeta液体闪烁计数仪进行计数，获取待评价的抑制药物对脂肪酸代谢的抑制作用。
2.根据权利要求1所述的一种胆固醇以及脂肪酸代谢抑制药物的高通量评价方法，其特征在于，步骤(1)中，接种细胞包括以下步骤：
a)在细胞培养板的孔中填充培养基，所述培养基中含有体积分数为8％～12％的胎牛血清及摩尔浓度为20～30mM的葡萄糖，每个孔中接种的细胞数为5000～10000个；
b)40～50h后更换完全新鲜的培养基；
c)15～20h后更换成新鲜的无血清及摩尔浓度为1～10mM的葡萄糖的培养基。
3.根据权利要求1所述的一种胆固醇以及脂肪酸代谢抑制药物的高通量评价方法，其特征在于，加入的待评价的抑制药物起始浓度为10～30μM，3倍稀释，共8个点。C14标记的丙酮酸或乙酸的用量为1～3μCi；所述标记的温度为35～38℃，标记的时间为4～8h，标记时的气体环境中含有4％～6％的CO2。
4.根据权利要求1所述的一种胆固醇以及脂肪酸代谢抑制药物的高通量评价方法，其特征在于，步骤(2)中，加入的NaOH溶液的浓度为0.1N，细胞培养板每个孔中加入的NaOH溶液体积为培养基体积的80％～120％；
加入的KOH溶液的浓度为40％～50％(W/V)，细胞培养板每个孔中加入的KOH溶液体积为培养基体积的25％～40％；
所述烘箱中的温度为70～90℃，加热时间为0.5～2h；
加入的无水乙醇的体积与培养基体积之比为(1.5～3)：1：静置的时间为0.5～2h。
5.根据权利要求1所述的一种胆固醇以及脂肪酸代谢抑制药物的高通量评价方法，其特征在于，第一次离心萃取时加入的石油醚体积与培养基体积之比为(4～6)：1，离心的转速为800～1200rpm，离心萃取的时间为5～10min。
6.根据权利要求1所述的一种胆固醇以及脂肪酸代谢抑制药物的高通量评价方法，其特征在于，所述真空浓缩的温度为40～60℃，所述闪烁液体积为150μl～250μl。
7.根据权利要求1所述的一种胆固醇以及脂肪酸代谢抑制药物的高通量评价方法，其特征在于，第二次离心萃取时加入的石油醚体积与下层液的体积之比为(0.8～1.2)：1，离心的转速为800～1200rpm，离心萃取的时间为5～10min。
8.根据权利要求1所述的一种胆固醇以及脂肪酸代谢抑制药物的高通量评价方法，其特征在于，第三次离心萃取时加入的石油醚体积与萃余层的体积之比为(0.4～1)：1，离心的转速为800～1200rpm，离心萃取的时间为5～10min。
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