CN114487185A - 一种胆固醇通路的分离鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种可以快速高效检测样本中胆固醇代谢通路中物质的方法，所述的方法是将样本处理后利用超高效液相色谱串联质谱的方法进行检测；对所样本中胆固醇代谢通路相关物质进行定性定量分析，每个色谱峰的峰面积(Peak Area)代表对应抗生素的相对含量，最终得到样本中抗生素的定性和定量分析结果，所述的方法可以一次性检测八大类共88胆固醇代谢通路相关物质。
Description
技术领域
本申请涉及样本中标志物的检测，具体涉及胆固醇代谢通路物质的检测，属于生物检测领域。
背景技术
胆固醇是一种环戊烷多氢菲的衍生物，广泛存在于动物体内，是动物组织细胞内不可缺少的物质，同时也是类固醇激素、胆汁酸、维生素D3的前体。随着我国经济的快速发展，人们的生活水平有着显著提高，以肥胖、血脂异常等特征的代谢综合症的发病率显著提高。胆固醇通路涉及血糖代谢、血脂代谢、能量代谢等多种代谢过程，其作为信号分子在人体的代谢中发挥重要的调节作用，对胆固醇通路的分离鉴定，成为了肥胖、胰岛素抵抗、代谢综合征全新研究视角，对代谢组学发展具有重要研究价值，更全面、高效、快速的综合评估人体健康状况。
液相色谱法-质谱联用(英语：Liquid chromatography–mass spectrometry，简称液质联用，英文缩写LC-MS或HPLC-MS)是一种将高效液相色谱(High performance liquidchromatography，简称HPLC)的物理分离能力和质谱(mass spectrometry，简称MS)的质量分析能力结合起来的分析化学技术。LC-MS是一项具有非常高的敏感度和选择性的非常强而有力的分析技术，它使用于很多的领域。一般说来，它的使用方向是在多种其他化合物从在的复合混合物中，测出各种组分并有可能确定其详细结构。LC-MS在尿液中药物筛选分析中的局限性在于它常常不能区分特定的代谢产物，特别是对于氢可酮及其代谢物尤为明显。LC-MS尿液分析测试仅测定特定类别的药物，对于有些药物及其代谢物的测定需要用气相色谱法-质谱联用(Gas chromatography-mass spectrometry，简称GC-MS)。
液相色谱与串联质谱(LC-MS/MS)是基于LC-MS联用后的又一种强大的分析技术，它结合了液相色谱的分离能力和三重四极杆质谱的高灵敏度和选择性质量分析能力。通过在高压下流过的流动相将含有目标分析物的样品溶液泵送通过固定相(LC柱)。样品组分，固定相和流动相之间的化学相互作用影响通过LC柱影响分离的不同迁移速率。多种固定相和流动相组合允许定制分离以适应许多复杂的解决方案。
从LC柱洗脱后，将流出物导入质谱仪。用于LC/MS/MS系统的质谱仪具有电离源，其中LC柱流出物被雾化，去溶剂化和离子化，产生带电粒子。然后，这些带电粒子通过施加电磁场在高真空下通过一系列质量分析器(四极)迁移。目标特定质量/电荷前体离子(或母离子)通过第一个四极杆，排除所有其他质量/电荷比粒子。在碰撞室中，所选择的质量/电荷离子然后通过与惰性气体碰撞而碎裂成产物离子(或子离子)。第三个四极杆用于靶向特定产物离子片段。然后用电子倍增器对得到的分离的产物离子进行定量。离子从前体到产物离子的转变(也称为MS2)对目标化合物的结构具有高度特异性，因此提供高度选择性。该技术的优势在于LC对多种化合物的分离能力，以及MS根据独特的质量/电荷(M/Z)跃迁量化具有高灵敏度和选择性的化合物的能力。每种感兴趣的化合物。
目前现有技术中并没有利用LC-MS/MS的方法检测样本中胆固醇代谢物质的的方法，本发明针对人体重要的四大类胆固醇通路物质(88种)：维生素类、固醇类、类固醇激素类、胆汁酸类进行定性定量检测。
发明内容
为克服现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供88种胆固醇代谢通路物质的鉴定方法，该方法能够实现对，通过质谱分析仪鉴定样本中88种抗生素含量，从而指导人对其饮食结构与日常生活进行调整。
本发明的一个方面是提供一种检测样本中88种胆固醇通路物质的方法，所述的方法包括：
1)样本处理：
2)上机检测：
3)数据处理；
所述的检测是利用超高效液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)的方法进行检测；
所述的数据处理是利用软件Analyst 1.6.3处理质谱数据。根据每种物质保留时间和离子对信息，对每种物质在样本中检测到的质谱峰进行校正，以确保定性定量的准确。对所样本中胆固醇通路行定性定量分析，每个色谱峰的峰面积(Peak Area)代表对应物质的相对含量，最终得到样本中物质的定性和定量分析结果。
在一个具体的实施例中，所述的样本可以是液体样本、组织样本或细胞样本，其中优选的样本提取方法包括但不限于：
(1)样品为液体样品时：
a.样本从-80℃冰箱中取出，冰上解冻，解冻后，涡旋10s混匀。
b.自该步骤开始，处理过程在冰上进行，取样本100μL加入到对应的已编号的离心管中，加入400μL纯甲醇提取液。
c.振荡5min，冰上静置5min，重复操作一次，4℃下12000r/min离心10min。
d.取上清液于对应离心管中4℃条件浓缩，浓缩后用100μL纯甲醇复溶，4℃下12000r/min离心1min，移取80μL上清液待用用于LC-MS上机分析；
(2)、组织样本提取方法：
a.样本从-80℃冰箱中取出，冰上解冻，解冻后称取样本50mg于2mL EP管中。加入一颗小钢珠，30Hz匀浆4次，每次30s。(若样本不易称取，可先取一部分于EP管中，匀浆后再称取50mg。)
b.匀浆完后加入400μL纯甲醇提取液，振荡5min，冰上静置5min，重复操作一次，4℃下12000r/min离心10min。
c.取上清液于对应进EP管中浓缩，浓缩后用100μL纯甲醇复溶。
d.复溶后于4℃下12000r/min离心1min，移取80μL上清液用于LC-MS上机分析；
(3)、细胞样本提取方法：
a.样本从-80℃冰箱中取出，冰上解冻，解冻后，加入400μL纯甲醇提取液，振荡5min，冰上静置5min，重复操作一次，4℃条件下12000r/min离心10min。
b.取上清液于对应进EP管中浓缩，浓缩后用100μL纯甲醇复溶。
c.复溶后于4℃下12000r/min离心1min，移取80μL上清液用于LC-MS上机分析。
在另外一个具体的实施例中，所述的上机检测中的超高效液相色谱条件主要包括：
色谱柱：Kinetex C18(1.7μm，100mm×2.1mm i.d.)；
流动相A：乙腈/水(30/70，含0.04％的乙酸)；
流动相B：乙腈/异丙醇(50/50，含0.04％的乙酸)；
洗针液：50％甲醇(超声脱气10min)；
柱温：40℃；流速：0.40mL/min；进样量：2μL；
洗脱梯度：0-1min，5％B；1-10min,5％-90％B；10.1-12.5min，90％B；12.6-15min，5％B；
在另外一个具体的实施例中，其中步骤2中的串联质谱的条件为：
| Ion Mode | ESI-/ESI+ | Curtain Gas | 40 |
| IonSpray Voltage | -4500/+5500 | Temperature | 550 |
| Ion Source Gas1 | 50 | Ion Source Gas2 | 60 |
| Collision Gas | Medium | Scan type | sMRM |
| Entrance Potential | -10/10 | Collision Cell Exit Potential | -12/12 |
| MRM detection | 50 | Target Scan Time | 0.1 |
在另外一个具体的实施例中，其中步骤3)数据分析的具体方法为：
(1)样本质控分析：通过对固定浓度的混标质谱检测分析的总离子流图(TIC图)进行重叠展示分析，以判断胆固醇通路相关代谢物提取和检测的重复性。
(2)标准曲线绘制：配制不同浓度的胆固醇通路相关代谢物标准品溶液，获取各个浓度标准品的对应定量信号的质谱峰强度数据；以标准品浓度(ng/mL)为横坐标，质谱峰的峰面积(Peak Area)为纵坐标，绘制不同抗生素的标准曲线。
(3)绝对定量：将检测到的所有样本的所有物质的积分峰面积分别代入标准曲线线性方程进行计算，将计算结果进一步代入含量计算公式计算后得到实际样本中每种胆固醇通路相关代谢物的绝对含量。
本发明的第二个方面提供所述的的方法在检测人体中胆固醇代谢通路中的应用，所述的应用为非诊断的应用。
本发明的第三个方面是提供所述的方法在检测环境或食品中胆固醇代谢通路物质含量中的应用。
本发明的有益效果为：
1.样品处理简单，可同时快速高效定量88种胆固醇通路。
2.质谱检测特异性强，灵敏度高。
3.88种胆固醇通路物质涵盖多个代谢过程，全面监测人体健康。
附图说明
图1为甘油三酯在两种不同能量下相应离子对的TIC重叠图，蓝色为CE＝30eV时的TIC图，红色为CE＝60eV时的TIC图，由图可以看出，两者在保留时间趋势上完全一致。
具体实施方式
实施例1样本提取方法
1、血清样本提取方法：
(1)样本从-80℃冰箱中取出，冰上解冻，解冻后，涡旋10s混匀。
(2)自该步骤开始，处理过程在冰上进行，取血清样本100μL加入到对应的已编号的离心管中，加入400μL纯甲醇提取液。
(3)振荡5min，冰上静置5min，重复操作一次，4℃下12000r/min离心10min。
(4)取上清液于对应离心管中4℃条件浓缩，浓缩后用100μL纯甲醇复溶，4℃下12000r/min离心1min，移取80μL上清液待用用于LC-MS上机分析。
2、肝脏组织样本提取方法：(1)肝脏样本从-80℃冰箱中取出，冰上解冻，解冻后称取样本50mg于2mL EP管中。加入一颗小钢珠，30Hz匀浆4次，每次30s。(若样本不易称取，可先取一部分于EP管中，匀浆后再称取50mg。)
(2)匀浆完后加入400μL纯甲醇提取液，振荡5min，冰上静置5min，重复操作一次，4℃下12000r/min离心10min。
(3)取上清液于对应进EP管中浓缩，浓缩后用100μL纯甲醇复溶。
(4)复溶后于4℃下12000r/min离心1min，移取80μL上清液用于LC-MS上机分析。
3、细胞样本提取方法：(1)样本从-80℃冰箱中取出，冰上解冻，解冻后，加入400μL纯甲醇提取液，振荡5min，冰上静置5min，重复操作一次，4℃条件下12000r/min离心10min。
(2)取上清液于对应进EP管中浓缩，浓缩后用100μL纯甲醇复溶。
(3)复溶后于4℃下12000r/min离心1min，移取80μL上清液用于LC-MS上机分析。
实施例2质谱方法
仪器参数条件：本发明中LC-MS/MS检测所用的数据采集仪器系统主要包括超高效液相色谱(Shimpack UFLC SHIMADZU CBM30A)和串联质谱MS/MS(AppliedBiosystems6500Quadrupole Trap)。
其中，超高效液相色谱条件主要包括：
色谱柱：Kinetex C18(1.7μm，100mm×2.1mm i.d.)；
流动相A：乙腈/水(30/70，含0.04％的乙酸)；
流动相B：乙腈/异丙醇(50/50，含0.04％的乙酸)；
洗针液：50％甲醇(超声脱气10min)；
柱温：40℃；流速：0.40mL/min；进样量：2μL；
洗脱梯度：0-1min，5％B；1-10min,5％-90％B；10.1-12.5min，90％B；12.6-15min，5％B；
质谱条件如下：
| Ion Mode | ESI-/ESI+ | Curtain Gas | 40 |
| IonSpray Voltage | -4500/+5500 | Temperature | 550 |
| Ion Source Gas1 | 50 | Ion Source Gas2 | 60 |
| Collision Gas | Medium | Scan type | sMRM |
| Entrance Potential | -10/10 | Collision Cell Exit Potential | -12/12 |
| MRM detection | 50 | Target Scan Time | 0.1 |
实施例3数据处理方法
利用软件Analyst 1.6.3处理质谱数据。根据每种物质保留时间和离子对(表1)信息，对每种物质在样本中检测到的质谱峰进行校正，以确保定性定量的准确。对所样本中胆固醇通路行定性定量分析，每个色谱峰的峰面积(Peak Area)代表对应物质的相对含量，最终得到样本中物质的定性和定量分析结果。
(1)样本质控分析：通过对固定浓度的混标质谱检测分析的总离子流图(TIC图)进行重叠展示分析(图1)，以判断胆固醇通路相关代谢物提取和检测的重复性。
(2)标准曲线绘制：配制不同浓度的胆固醇通路相关代谢物标准品溶液，获取各个浓度标准品的对应定量信号的质谱峰强度数据；以标准品浓度(ng/mL)为横坐标，质谱峰的峰面积(Peak Area)为纵坐标，绘制不同抗生素的标准曲线。
(3)绝对定量：将检测到的所有样本的所有物质的积分峰面积分别代入标准曲线线性方程进行计算，将计算结果进一步代入含量计算公式(表2)计算后得到实际样本中每种胆固醇通路相关代谢物的绝对含量。
表1 88种胆固醇通路定量离子对
表2 88种胆固醇通路标曲
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但是并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可做各种改动和修饰，以本领域技术人员结合所属领域的常规技术概括获得的均在本发明的范围之内。
Claims (10)
1.一种检测样本中88种胆固醇通路物质的方法，所述的方法包括：
1)样本处理；
2)上机检测；
3)数据处理；
所述的检测是利用超高效液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)的方法进行检测；所述的数据处理是利用软件Analyst 1.6.3处理质谱数据；根据每种物质保留时间和离子对信息，对每种物质在样本中检测到的质谱峰进行校正，以确保定性定量的准确；对所样本中胆固醇通路行定性定量分析，每个色谱峰的峰面积(Peak Area)代表对应物质的相对含量，最终得到样本中物质的定性和定量分析结果。
2.如权利要求1所述的方法，其中步骤1)样本处理的方法为：
(1)样品为液体样品时：
a.样本从-80℃冰箱中取出，冰上解冻，解冻后，涡旋10s混匀；
b.自该步骤开始，处理过程在冰上进行，取样本100μL加入到对应的已编号的离心管中，加入400μL纯甲醇提取液；
c.振荡5min，冰上静置5min，重复操作一次，4℃下12000r/min离心10min；
d.取上清液于对应离心管中4℃条件浓缩，浓缩后用100μL纯甲醇复溶，4℃下12000r/min离心1min，移取80μL上清液待用用于LC-MS上机分析；
(2)组织样本提取方法：
a.样本从-80℃冰箱中取出，冰上解冻，解冻后称取样本50mg于2mL EP管中，加入一颗小钢珠，30Hz匀浆4次，每次30s(若样本不易称取，可先取一部分于EP管中，匀浆后再称取50mg)；
b.匀浆完后加入400μL纯甲醇提取液，振荡5min，冰上静置5min，重复操作一次，4℃下12000r/min离心10min；
c.取上清液于对应进EP管中浓缩，浓缩后用100μL纯甲醇复溶；
d.复溶后于4℃下12000r/min离心1min，移取80μL上清液用于LC-MS上机分析；
(3)细胞样本提取方法：
a.样本从-80℃冰箱中取出，冰上解冻，解冻后，加入400μL纯甲醇提取液，振荡5min，冰上静置5min，重复操作一次，4℃条件下12000r/min离心10min；
b.取上清液于对应进EP管中浓缩，浓缩后用100μL纯甲醇复溶；
c.复溶后于4℃下12000r/min离心1min，移取80μL上清液用于LC-MS上机分析。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中步骤2)上机检测中的超高效液相色谱条件主要包括：
色谱柱：Kinetex C18(1.7μm，100mm×2.1mmi.d.)；
流动相A：乙腈/水(30/70，含0.04％的乙酸)；
流动相B：乙腈/异丙醇(50/50，含0.04％的乙酸)；
洗针液：50％甲醇(超声脱气10min)；
柱温：40℃；流速：0.40mL/min；进样量：2μL；
洗脱梯度：0-1min，5％B；1-10min,5％-90％B；10.1-12.5min，90％B；12.6-15min，5％B。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中步骤2中的串联质谱的条件为：
5.权利要求1-4任一项所述的方法，其中步骤3)数据分析的具体方法为：
(1)样本质控分析：通过对固定浓度的混标质谱检测分析的总离子流图(TIC图)进行重叠展示分析，以判断胆固醇通路相关代谢物提取和检测的重复性；
(2)标准曲线绘制：配制不同浓度的胆固醇通路相关代谢物标准品溶液，获取各个浓度标准品的对应定量信号的质谱峰强度数据；以标准品浓度(ng/mL)为横坐标，质谱峰的峰面积(Peak Area)为纵坐标，绘制不同抗生素的标准曲线；
(3)绝对定量：将检测到的所有样本的所有物质的积分峰面积分别代入标准曲线线性方程进行计算，将计算结果进一步代入含量计算公式计算后得到实际样本中每种胆固醇通路相关代谢物的绝对含量。
6.权利要求1-5任一项所述的方法中，其中离子对信息和保留时间如下所示：
7.如权利要求1-6任一项所述的方法，其中所述的标准曲线如下所示：
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其中所述的样本来自人或动物，样本是体液样本，优选是血液或尿液样本，最优选的是血清样本。
9.权利要求1-8任一项所述的方法在检测人体中胆固醇代谢通路中的应用，所述的应用为非诊断的应用。
10.权利要求1-8任一项所述的方法在检测环境或食品中胆固醇代谢通路物质含量中的应用。
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