CN103336065A - 一种同时提取和检测生物介质中多种激素及其代谢物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种同时提取和检测生物介质中多种激素及其代谢物的方法，其主要步骤包括样品的采集、样品的前处理以及样品中目标物的提取、生物流体介质以及生物固体介质中目标物的萃取和检测。本发明通过基于高效液相色谱-串联电喷雾离子化源质谱，建立一种适于同时提取和检测血液、尿液和唾液等生物流体介质和头发、指甲等固体生物介质中皮质醇、可的松、睾酮、黄体酮和脱氢表雄酮及其代谢物的新方法。本发明的通过同时检测生物流体介质和生物固体介质，检测技术灵敏、准确和可靠。

Description

一种同时提取和检测生物介质中多种激素及其代谢物的方法

技术领域

本发明涉及卫生分析化学领域，具体涉及一种同时提取和检测生物介质中多种激素及其代谢物的方法，特别是同时提取和检测血液、尿液和唾液等流体生物介质和毛发、指甲等固体生物介质中皮质醇、可的松、睾酮、黄体酮和脱氢表雄酮及其代谢物之中多种激素的新方法。

背景技术

激素是维持生命的必要活性物质。例如，肾上腺皮质激素是维持生命的必需激素，人体内含量的多少对物质代谢、血管反应、神经系统、泌尿系统及消化系统的功能有不同程度的影响。若肾上腺皮质激素水平低下，人体对外来损伤性刺激或剧烈环境变化的适应能力将大大降低。

皮质醇是一种非常重要的肾上腺皮质激素，反映了下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴(HPA)的活性。此外，皮质醇是心理应激反应的一个重要生物指针，已成为评价心理应激的一个重要指标。皮质醇在11β羟基甾体脱氢酶（11β-HSD）的作用下转换成没有生物活性的可的松。人体内皮质醇与可的松的比值可以反映11β-HSD的活性，而11β-HSD的酶活性与肾病、高血压和血液病等疾病密切相关。尿液中皮质醇与可的松的比值是诊断多种与肾脏相关疾病的重要依据。此外，皮质醇与可的松的比值可能与HPA轴的调节作用有关。脱氢表雄酮是人体内具有保护神经功能的肾上腺皮质激素，是一类重要的神经激素；能促进海马区神经元再生，拮抗糖皮质激素的负性作用，减少脑垂体分泌促肾上腺皮质激素的分泌，进而减少皮质醇的分泌。此外，脱氢表雄酮还与长期应激压力、焦虑、抑郁等心理活动或心理疾病有关。例如，人体内脱氢表雄酮（或其代谢物脱氢表雄酮硫酸酯）与皮质醇的比值与慢性应激压力和抑郁相关。睾酮和黄体酮均为人体内的甾体激素，均以胆固醇为初始原料在各种酶的作用下经一系列反应而合成。睾酮对人体的两性功能起关键作用，同DHEA共同影响人体的性欲望和感觉唤醒等。另外，其含量的下降会引起两性体内骨质和肌肉含量的减少。黄体酮主要的生理功能是在月经周期后期使子宫粘膜内腺体生长，子宫充血，内膜增厚，为受精卵植入作好准备。黄体酮能有效地防止急性脑缺血导致的尾状核内中型神经元的丢失。此外，睾酮和黄体酮也是神经甾体激素，能调节人的情境、欲望、学习和记忆等认知和心理行为；睾酮水平与抑郁的相关性显著。因此，检测生物介质中皮质醇、可的松、睾酮、黄体酮和脱氢表雄酮及其代谢物在临床医学和心理健康评测等领域中都十分重要和必要。

实施检测时，通常是测定血液（或血清或血浆）、唾液和尿液等流体生物介质中激素的含量。这些生物介质中皮质醇、可的松、睾酮、黄体酮和脱氢表雄酮及其代谢物的分析已在临床医学、心理健康研究（如人类应激等）、违禁药物防治和法医检验等领域有广泛的应用。然而，血样采集需要静脉穿刺，往往会产生额外的应激，可能影响结果的可靠性。此外，唾液与血液仅能反映采样时间点几分钟至几十分钟短时间内的人体激素水平；尿液能记录过去12小时至24小时激素变化。这些流体生物介质中的激素不能准确且有效地反映长期的基础水平。近年来，头发和指甲等固体介质中皮质醇等激素的分析日益受到关注。相较于血液、唾液和尿液等流体生物介质而言，头发和指甲等固体介质中激素的含量更稳定，能够反映几周至几个月的激素含量变化，间接地反映人体长时期所处的生理状态和慢性应激等心理状态。毛发和指甲等固体介质中的激素均来源于血液，是由血液中游离的激素从毛细血管中扩散到毛囊中最后固化至毛发和指甲内。

当前，皮质醇、可的松、睾酮、黄体酮和脱氢表雄酮及其代谢物的检测方法主要有免疫法、高效液相色谱法和液相色谱-质谱联用法。免疫法灵敏度高，使用简单方便，但是交叉反应较强，往往得到假阳性结果，而且在低浓度时重现性较差。高效液相色谱法多应用于血液、尿液和唾液等流体生物介质目标物的测定，但有些激素（如脱氢表雄酮）的紫外吸收和荧光性都较差，需要富集或衍生后方可进行检测。液相色谱-质谱联用法具备较高的灵敏度和特异性。由于激素多为弱极性或非极性物质，检测激素时多使用两种弱电离离子化源，即大气压化学电离离子化源和大气压光学电离离子化源，但其检测范围较窄，并不适用于较强极性物质的检测。相较而言，电喷雾离子化源的检测范围较广，非极性、弱极性和极性物质均能检测，而且在多极性物质检测上有较好的应用和潜力。目前，已有研究报道液相色谱-质谱联用法结合电喷雾离子化源和正离子模式应用于同时检测血液、尿液和唾液等流体生物介质中的皮质醇和可的松。然而，同时检测这些流体生物介质和和毛发等固体生物介质中的皮质醇、可的松、睾酮、黄体酮和脱氢表雄酮及其代谢物的方法还未见有报道，有待开发。此外，较之于血液、尿液和唾液等流体生物介质皮质醇、可的松、睾酮、黄体酮和脱氢表雄酮及其代谢物的含量，其头发和指甲等固体介质中这些目标物的含量较低，约为流体介质中的十分之一；这就提示非常有必要优化实验条件，开发高效的、准确以及同时提取头发、指甲等固体介质中目标物的方法。同时提取和检测皮质醇、可的松、睾酮、黄体酮和脱氢表雄酮及其代谢物等目标物，可节约大量的检测成本，实行快速检测，给临床诊断提供有效的生物依据。因此，本发明旨在基于高效液相色谱-串联电喷雾离子化源质谱，建立一种适于同时提取和检测血液、尿液和唾液等流体生物介质和头发、指甲等固体生物介质中皮质醇、可的松、睾酮、黄体酮和脱氢表雄酮及其代谢物的新方法。

发明内容

发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种基于高效液相色谱串联质谱检测技术和电喷雾离子化源技术，同时提取和检测生物介质中多种激素及其代谢物的方法。

技术方案：为实现上述目的，本发明提供了一种同时提取和检测生物介质中多种激素及其代谢物的方法，包括以下步骤：

（1）样品的采集：采集检测目标的生物流体介质和生物固体介质；

（2）样品的前处理以及样品中目标物的提取：

（2.1）对生物流体介质的前处理和目标物提取：取100～500μl生物流体介质，在生物流体介质中加入100～500μl的0.05～0.2mol/l的高氯酸以及含1～50ng内标物的内标溶液，除去生物流体介质中的蛋白质，然后用水将流体样品稀释5～10倍减少盐分浓度，再加入2～5ml有机溶剂萃取，涡旋震荡2～10min后在离心机中进行离心，取上清有机相；

（2.2）对生物固体介质的前处理和目标物提取：取5～500mg生物固定介质在室温下用0.1～5ml小分子有机溶剂清洗2～5次，每次1～10min，风干；然后加入1～3ml的甲醇以及含1～50ng内标物的内标溶液，在20～60℃条件下孵化10～72h，再将孵化后的溶液离心，取上清液；

（3）生物流体介质以及生物固体介质中目标物的萃取和检测：

（3.1）生物流体介质中目标物的萃取和检测：将步骤（2.1）中所取的上清有机溶液注入到固相萃取柱中，用1～30ml的去离子水冲洗，然后干燥5～60min，再用100～2000μl的甲醇洗脱；最后将所得到的洗脱液中的溶剂蒸发，再重新用30～100μl的甲醇溶解，然后将其用高效液相色谱进行分离，并使用质谱仪进行检测，并用内标法进行定量；

（3.2）生物固体介质中目标物的萃取和检测：将步骤（2.2）中孵化后所取的上清液注入到固相萃取柱中，用1～30ml的去离子水冲洗，然后干燥5～60min，再用100～2000μl的甲醇洗脱；最后将所得到的洗脱液中的溶剂蒸发，再重新用30～100μl的甲醇溶解，然后将其用高效液相色谱进行分离，并使用质谱仪进行检测，并用内标法进行定量。

优选地，所述步骤（1）中的生物流体介质包括血液、尿液和唾液中的一种或者多种。

优选地，所述步骤（1）中的生物固体介质包括毛发和指甲中的一种或者两种。

优选地，所述步骤（2）中的目标物包括皮质醇、可的松、睾酮、黄体酮、脱氢表雄酮和脱氢表雄酮硫酸酯中的一种或者多种。

优选地，皮质醇、可的松、睾酮、黄体酮和脱氢表雄酮及其代谢物的极性都较低，用低极性的有机溶剂萃取效果更好，所述步骤（2.1）中有机溶剂包括乙酸乙酯和二氯甲烷中的一种或者两种，所述步骤（2.2）中的小分子有机溶剂为甲醇、异丙烷、正辛烷中的一种或者多种。

优选地，为了更好离心得出目标物，所述步骤（2.1）中离心机进行离心时，以5000～12000转/分钟的速度离心5～10min，静置5～10min。

优选地，为了更好的达到清洗目的，缩短清洗时间和次数，所述步骤（2.2）中通过超声对生物固体介质协助清洗。

优选地，为了使生物固体介质中更多的目标物溶出，所述步骤（2.2）中清洗完毕后，将生物固体介质剪碎至0.1～0.5cm的碎片或研磨成150～300目的碎末。

所述步骤（3.1）和（3.2）中使用固相萃取柱前，先用1～10ml的甲醇活化，然后用1～30ml的水洗。

优选地，所述步骤（2.1）和（2.2）中加入的内标溶液中的内标物为四氘化皮质醇和六氘化脱氢表雄酮的一种或两种。

优选地，所述步骤（3）中高效液相色谱的检测条件包括如下：

（1）色谱柱：C18色谱柱；

（2）流动相：甲醇：水的体积比为50:50～95:5，其中每100ml流动相含0.1～1.0ml甲酸，用0.22μm的微孔滤膜过滤，超声脱气；

（3）流速：0.2～0.5ml/min；

（4）进样量：2～20μl；

（5）柱温：25～40℃。

优选地，所述步骤（3）中质谱质荷比和质谱条件如表1所示：

表1待测目标物的母离子、子离子的质荷比和质谱条件

本发明通过基于高效液相色谱-串联电喷雾离子化源质谱，建立一种适于同时提取和检测血液、尿液和唾液等流体生物介质和头发、指甲等固体生物介质中皮质醇、可的松、睾酮、黄体酮和脱氢表雄酮及其代谢物的新方法。本发明利用高效液相色谱将共溶物与目标物分离，并使用QTRAP四级线性质谱系统进行检测，用内标法进行定量。使用高效液相色谱得到的图谱，内标皮质醇的滞留时间在4.5～12.5分钟，内标脱氢表雄酮的滞留时间在12.0～20.2分钟；皮质醇的滞留时间在4.5～12.5分钟，可的松的滞留时间在3.4～11.4分钟，脱氢表雄酮的滞留时间在12.1～20.3分钟，睾酮的滞留时间在10.2～19.4分钟，黄体酮的滞留时间在17.1～27.3分钟，脱氢表雄酮硫酸酯的滞留时间在10.1～19.5分钟，这表明待测目标物峰均与干扰峰完全分开。

有益效果：本发明相对于现有技术而言，具有以下优点：

1.本方法适用于血液、尿液和唾液等生物流体介质以及毛发和指甲等固体生物介质中皮质醇、可的松、睾酮、黄体酮和脱氢表雄酮及其代谢物的提取和多种目标物的完全分离和同时检测。

2.本方法针对流体生物介质的检测限为0.2ng/ml，针对固体生物介质的检测限为0.5pg/mg；线性范围宽，对流体生物介质的线性范围为0.5～100ng/ml，对固体生物介质的线性范围为2～500pg/mg；回收率为98.1～105.8％；日内标准偏差小于6.5％，日间标准偏差小于7.7％。证明本发明的检测技术灵敏、准确和可靠。

附图说明

图1是(a)标准品中的皮质醇和可的松的高效液相色谱-质谱色谱图。

图2是(a)标准品中(b)加尿液基质时皮质醇和可的松的高效液相色谱-质谱色谱图。

图3是本发明中头发中皮质醇、可的松、脱氢表雄酮、脱氢表雄酮硫酸酯和两种内标（四氘代皮质醇和六氘代脱氢表雄酮）的高效液相色谱-质谱色谱图。

图4是本发明中的皮质醇、可的松、睾酮和黄体酮的高效液相色谱图。

图5是以尿液为基质的（a）皮质醇和（b）可的松的标准曲线。

图6是以头发为基质的皮质醇、可的松、脱氢表雄酮和脱氢表雄酮硫酸酯的标准曲线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作更进一步的说明。

实施例1：

一种同时提取和检测生物介质中多种激素及其代谢物的方法，包括以下步骤：

（1）样品的采集：采集血液和指甲，所述血液为静脉血，所述指甲为已陈化的白色手指指甲或脚趾指甲；

（2）样品的前处理以及样品中黄体酮和脱氢表雄酮的提取：

（2.1）对血液的前处理以及黄体酮和脱氢表雄酮提取：取500μl血液，在血液中加入500μl0.2mol/l的高氯酸以及含有1ng六氘化脱氢表雄酮的六氘化脱氢表雄酮溶液，充分混匀，然后用水将流体样品稀释10倍，再加入5ml乙酸乙酯，涡旋震荡10min后在离心机中进行萃取，取上清有机相；

（2.2）对指甲的前处理以及黄体酮和脱氢表雄酮提取：取500mg指甲在室温下用5ml异丙烷，清洗5次，每次10min，风干；然后加入3ml的甲醇以及50ng六氘化脱氢表雄酮的六氘化脱氢表雄酮溶液，在60℃条件下孵化72h，再将孵化后的溶液离心，取上清液；

（3）生物流体介质以及生物固体介质中黄体酮和脱氢表雄酮的萃取和检测：

（3.1）血液中目标物的萃取和检测：将步骤（2.1）中所取的上清有机溶液注入到固相萃取柱中，待流干后用5ml的去离子水冲洗，然后干燥60min，再用2000μl的甲醇洗脱；最后将所得到的洗脱液中的溶剂蒸发，再重新用100μl的甲醇溶解，然后将其用高效液相色谱进行分离，并使用质谱仪进行检测，并用内标法进行定量；

（3.2）指甲中目标物的萃取和检测：将步骤（2.2）中孵化后所取的上清液注入到固相萃取柱中，待流干后用30ml的去离子水冲洗，然后干燥5min，再用2000μl的甲醇洗脱；最后将所得到的洗脱液中的溶剂蒸发，再重新用100μl的甲醇溶解，然后将其用高效液相色谱进行分离，并使用质谱仪进行检测，并用内标法进行定量。

实施例2：

（1）样品的采集：采集唾液和指甲，所述唾液为晨起半小时后的唾液，唾液采集前不能进食和刷牙，但要漱口；所述指甲为已陈化的白色手指指甲或脚趾指甲。

（2）样品的前处理以及样品中睾酮、黄体酮的提取：

（2.1）对唾液的前处理和目标物提取：取100μl唾液，在唾液中加入100μl的0.05mol/l的高氯酸以及含有50ng四氘化皮质醇的四氘化皮质醇的溶液，除去唾液中的蛋白质，然后用水将流体样品稀释8倍减少盐分浓度，再加入2ml二氯甲烷萃取，涡旋震荡6min后在离心机中进行离心，取上清有机相；

（2.2）对指甲的前处理和目标物提取：取5mg指甲在室温下用0.1ml正辛烷溶剂清洗3次，每次1min，风干；然后加入1ml的甲醇以及1ng六氘化脱氢表雄酮的六氘化脱氢表雄酮溶液，在20℃条件下孵化10h，再将孵化后的溶液离心，取上清液；

（3）唾液以及指甲中睾酮、黄体酮的萃取和检测：

（3.1）唾液中目标物的萃取和检测：将步骤（2.1）中所取的上清有机溶液注入到固相萃取柱中，用1ml的去离子水冲洗，然后干燥5min，再用100μl的甲醇洗脱；最后将所得到的洗脱液中的溶剂蒸发，再重新用30μl的甲醇溶解，然后将其用高效液相色谱进行分离，并使用质谱仪进行检测，并用内标法进行定量；

（3.2）指甲中目标物的萃取和检测：将步骤（2.2）中孵化后所取的上清液注入到固相萃取柱中，用1ml的去离子水冲洗，然后干燥8min，再用100μl的甲醇洗脱；最后将所得到的洗脱液中的溶剂蒸发，再重新用30μl的甲醇溶解，然后将其用高效液相色谱进行分离，并使用质谱仪进行检测，并用内标法进行定量。

下面针对具体人群的检测：

本发明针对50个汉族人群尿液中皮质醇和可的松以及头发中的皮质醇、可的松、脱氢表雄酮和脱氢表雄酮硫酸酯进行了检测。

其检测步骤如下：

（1）样品的采集：采集晨尿质、采集脑后枕部的头发，尽量贴近头皮，剪取长度长于1cm的头发，在室温下保存于干燥的软管中；

（2）样品的前处理以及样品中目标物的提取：

（2.1）对尿液的前处理和皮质醇和可的松的提取：取100μl晨尿在其中加入100μl0.1mol/l的高氯酸，除去生物流体介质中的蛋白质，加入100μl20ng/ml四氘化皮质醇内标溶液混匀，然后用水将流体样品稀释5倍减少盐分浓度，再加入2ml乙酸乙酯，涡旋震荡2min后在离心机以12000转每分种的速度离心5min，静置5min，取上清有机相，；

（2.2）对头发的前处理和目标物提取：取20mg头发在室温下用5ml甲醇清洗2次，每次2min，然后剪碎至0.1cm的碎片，加入1.4ml的甲醇和100μl20ng/ml四氘化皮质醇和六氘化脱氢表雄酮混合标准溶液混匀，风干；在30℃条件下孵化72h；孵化完毕后将孵化溶液12000转每分钟离心5min，静置5min，取上清液；

（3）尿液以及头发中目标物的萃取和检测：

（3.1）尿液中目标物的萃取和检测：将步骤（2.1）中所取的上清有机溶液注入到固相萃取柱中，用3ml的去离子水冲洗，然后干燥60min，再用100μl的甲醇洗脱；最后将所得到的洗脱液中的溶剂蒸发，再重新用30μl的甲醇溶解，然后将其用高效液相色谱将其分离，使用安捷伦C18色谱柱(4.6×150mm,5μm)，使用流动相为80:20(V:V)甲醇：水，其中每100ml流动相溶液含0.1ml甲酸，用0.22μm的微孔滤膜过滤，超声脱气，流速为200μl/min；柱温:30℃；质谱仪的检测参数如表1所示；进样量为5μl。在所得到的质谱色图谱中，皮质醇的色谱峰约在10.8分钟出现，可的松的色谱峰约在10.2分钟出现，见附图1和附图2。

取标准储备液用甲醇倍比稀释配成终浓度0.05ng/ml、0.1ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml的系列浓度标准溶液。取萃取过目标物的下滤液200μl，分别加入上列浓度氢化可的松系列标准溶液100μl，混匀，30℃孵育72h。经过以上步骤的处理后，取100μl甲醇重新溶解的溶液进样。

在0.5～100ng/ml范围内，以待测物浓度为横坐标，样品/内标的色谱峰面积比为纵坐标进行线性回归分析，得到待测目标物的标准曲线方程。其中，皮质醇的回归方程为y=7.76×10^-2x+1.874×10^-2，可的松的回归方程为y=8.93×10^-2x-7.73×10^-2，见附图5。

尿液中皮质醇和可的松的检测限均为0.2ng/ml，定量限均为0.5ng/ml；在空白尿液添加20ng/ml皮质醇和可的松的条件下，方法日内、日间的变异系数均小于9%，加标回收率在95%以上；线性范围为0.5～100ng/ml。方法灵敏、准确，处理过程简单。

经换算得50个汉族正常人尿液中皮质醇的含量在0.20～27.42ng/ml之间，平均值为8.35±7.16ng/ml；可的松的含量在2.84～107.34ng/ml之间，平均值为33.00±25.10ng/ml。

（3.2）头发中目标物的萃取和检测：将步骤（2.2）中孵化后所取的上清液注入到固相萃取柱中，用3ml的去离子水冲洗，然后干燥10min，再用1000μl的甲醇洗脱；最后将所得到的洗脱液中的溶剂用纯N₂吹干，再重新用100μl的甲醇溶解，然后使用安捷伦C18色谱柱(4.6×150mm,5μm)，使用流动相为80:20(V:V)甲醇：水，其中每100ml流动相溶液含0.1ml甲酸，用0.22μm的微孔滤膜过滤，超声脱气，流速为200μl/min；柱温:30℃；质谱仪的检测参数如表1所示；进样量为5μl。在所得到的质谱色谱图谱中，皮质醇色谱峰约在10.6分钟出现，可的松峰约在9.8分钟出现，脱氢表雄酮峰约在17.1分钟出现，脱氢表雄酮硫酸酯峰在18.5分钟出现；皮质醇内标峰在10.6分钟出现，脱氢表雄酮内标峰在17.0分钟出现，见附图3。睾酮色谱峰约在16.9分钟出现，黄体酮色谱峰约在24.8分钟出现，见附图4。

取标准储备液用甲醇倍比稀释配成终浓度0.05ng/ml、0.1ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml的系列浓度标准溶液。取剪碎的头发20mg，分别加入上列浓度氢化可的松系列标准溶液100μl，混匀，30℃孵育72h。经过以上步骤的处理后，取100μl甲醇重新溶解的溶液进样。

在2～500pg/mg范围内，以待测物浓度为横坐标，样品峰/内标色谱峰面积比为纵坐标进行线性回归分析，得到目标物的回归方程。其中皮质醇的回归方程为y=1.01×10^-3x+8.32×10^-3；可的松的回归方程为y=1.40×10^-3x+3.24×10^-2；脱氢表雄酮的回归方程为y=3.67×10^-2x+3.97×10^-1；脱氢表雄酮的回归方程为y=1.63×10^-2x+1.50×10^-1，见附图6。

头发中皮质醇、可的松、脱氢表雄酮和脱氢表雄酮硫酸酯的检测限均为0.5pg/mg；线性范围为2～500pg/mg；回收率为98.1～105.8％；日内标准偏差小于6.5％；日间标准偏差小于7.7％。

经换算得50个汉族正常人头发中皮质醇的含量在4.57～54.29pg/mg，中值为16.02pg/mg；可的松的含量在19.73～542.22pg/mg，中值为60.84pg/mg；脱氢表雄酮的含量在21.51～2749.91pg/mg，中值为46.97pg/mg；脱氢表雄酮硫酸酯的含量在3.59～52.45pg/mg，中值为12.34pg/mg。

本实施例中所使用的水均为三蒸去离子水，色谱纯级甲醇购自美国Dikma公司，色谱纯级甲酸购自美国Tedia公司，分析纯级无水乙醇和乙酸乙酯购在上海化学试剂有限公司，四氘代皮质醇标准品（皮质醇的9,11,12,12氘代物；含量>98%）和六氘代脱氢表雄酮（脱氢表雄酮的2,2,3,4,4,5氘代物；含量>98%）购自美国Sigma-Aldrich公司。

高效液相色谱系统为Agilent1200系列液相色谱仪。质谱仪为Applied Biosystems公司的3200QTRAP四级线性质谱系统。数据分析使用随质谱仪附带的Analyst Software1.5软件。实验使用的色谱柱为ZORBAX Eclipse XDB-C18(5μm,150mm×4.6mm)并使用C18预柱(5μm,10mm×4.6mm,Dikma)进行保护。用Pro Elut C18(20mg,Dikma)固相萃取柱进行固相萃取。流动相为适当体积配比的甲醇与水的混合溶剂，其中水中含0.1%（V/V）的甲酸，用0.22μm微孔滤膜过滤，超声脱气。流速为200μl/min，进样量为5μl，柱温为30℃。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种同时提取和检测生物介质中多种激素及其代谢物的方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）样品的采集：采集检测目标的生物流体介质和生物固体介质；

（2）样品的前处理以及样品中目标物的提取：

（2.1）对生物流体介质的前处理和目标物提取：取100～500μl生物流体介质，在生物流体介质中加入100～500μl0.05～0.2mol/l的高氯酸以及含1～50ng内标物的内标溶液，然后用水将流体样品稀释5～10倍，再加入2～5ml有机溶剂，涡旋震荡2～10min后在离心机中进行萃取，取上清有机相；

（2.2）对生物固体介质的前处理和目标物提取：取5～500mg生物固定介质在室温下用0.1～5ml小分子有机溶剂，清洗2～5次，每次1～10min，风干；然后加入1～3ml的甲醇以及含1～50ng内标物的内标溶液，在20～60℃条件下孵化10～72h，再将孵化后的溶液离心，取上清液；

（3）生物流体介质以及生物固体介质中目标物的萃取和检测：

（3.1）生物流体介质中目标物的萃取和检测：将步骤（2.1）中所取的上清有机溶液注入到固相萃取柱中，待流干后用1～30ml的去离子水冲洗，然后干燥5～60min，再用100～2000μl的甲醇洗脱；最后将所得到的洗脱液中的溶剂蒸发，再重新用30～100μl的甲醇溶解，然后将其用高效液相色谱进行分离，并使用质谱仪进行检测，并用内标法进行定量；

（3.2）生物固体介质中目标物的萃取和检测：将步骤（2.2）中孵化后所取的上清液注入到固相萃取柱中，待流干后用1～30ml的去离子水冲洗，然后干燥5～60min，再用100～2000μl的甲醇洗脱；最后将所得到的洗脱液中的溶剂蒸发，再重新用30～100μl的甲醇溶解，然后将其用高效液相色谱进行分离，并使用质谱仪进行检测，并用内标法进行定量。

2.权利要求1所述的同时提取和检测生物介质中多种激素及其代谢物的方法，其特征在于：所述步骤（1）中的生物流体介质包括血液、尿液和唾液中的一种或者多种。

3.权利要求1所述的同时提取和检测生物介质中多种激素及其代谢物的方法，其特征在于：所述步骤（1）中的生物固体介质包括毛发和指甲中的一种或者两种。

4.权利要求1所述的同时提取和检测生物介质中多种激素及其代谢物的方法，其特征在于：所述步骤（2）中的目标物包括皮质醇、可的松、睾酮、黄体酮、脱氢表雄酮和脱氢表雄酮硫酸酯中的一种或者多种。

5.权利要求1所述的同时提取和检测生物介质中多种激素及其代谢物的方法，其特征在于：所述步骤（2.1）中有机溶剂包括乙酸乙酯和二氯甲烷中的一种或者两种，所述步骤（2.2）中的小分子有机溶剂为甲醇、异丙烷、正辛烷中的一种或者多种。

6.权利要求1所述的同时提取和检测生物介质中多种激素及其代谢物的方法，其特征在于：所述步骤（2.1）中离心机进行离心时，以5000～12000转/分钟的速度离心5～10min，静置5～10min。

7.权利要求1或者3所述的同时提取和检测生物介质中多种激素及其代谢物的方法，其特征在于：所述步骤（2.2）中清洗完毕后，将生物固体介质剪碎至0.1～0.5cm的碎片或研磨成150～300目的碎末。

8.权利要求1所述的同时提取和检测生物介质中多种激素及其代谢物的方法，其特征在于：所述步骤（3.1）和（3.2）中使用固相萃取柱前，先用1～10ml的甲醇活化，然后用适量1～30ml的水洗。

9.权利要求1所述的同时提取和检测生物介质中多种激素及其代谢物的方法，其特征在于：所述步骤（2.1）和（2.2）中加入的内标溶液中内标物为四氘化皮质醇和六氘化脱氢表雄酮的一种或两种。

10.权利要求1或者3所述的同时提取和检测生物介质中多种激素及其代谢物的方法，其特征在于：所述步骤（3）中高效液相色谱的检测条件包括如下：

（1）色谱柱：C18色谱柱；

（2）流动相：甲醇：水的体积比为50:50～95:5，其中每100ml流动相含0.1～1.0ml甲酸，用0.22μm的微孔滤膜过滤，超声脱气；

（3）流速：0.2～0.5ml/min；

（4）进样量：2～20μl；

（5）柱温：25～40℃。

Images