CN114813989A - 毛发中褪黑素、n-乙酰血清素、6-羟基褪黑素、皮质醇和可的松同时提取和检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了毛发中褪黑素、N‑乙酰血清素、6‑羟基褪黑素、皮质醇和可的松同时提取和检测方法，步骤包括：(1)采集人体毛发样本并清洗；(2)孵育、萃取样本以提取样本中的目标物；(3)使用高效液相色谱串联质谱法实现目标物的含量检测。本发明基于高效液相色谱串联电喷雾离子化源质谱，建立了一种同时提取和检测毛发基质中褪黑素、N‑乙酰血清素、6‑羟基褪黑素、皮质醇和可的松的新方法，并且该方法操作简便、灵敏度高、特异性好，是一种全新的尝试。
Description
技术领域
本发明涉及化合物的提取和检测方法，特别涉及毛发中褪黑素、N-乙酰血清素、6-羟基褪黑素、皮质醇和可的松同时提取和检测方法。
背景技术
睡眠是人体重要的生理过程，长期睡眠状况对人的身体和精神健康都有着重大影响。褪黑素和皮质醇是能够调节人体的睡眠、生物节律、免疫等多种生理功能的激素，并且它们的内源性分泌均遵从昼夜节律。松果体分泌的褪黑素呈现白天分泌少、夜间分泌多的规律，午夜时分在人类体内循环系统中的浓度最高；皮质醇则是夜间分泌极少，晨醒后半小时分泌达到峰值，而后逐渐下降。褪黑素和皮质醇与睡眠之间存在紧密关联，可作为睡眠状态的生物标志物。然而，褪黑素和皮质醇在人体内易快速代谢，这导致这两者具有含量低，且个体间差异巨大的缺陷。由于6-羟基褪黑素、N-乙酰血清素及可的松分别作为褪黑素和皮质醇的主要代谢物，其含量相对稳定，个体差异较小，且在人体内的分泌和它们的前体一样存在昼夜节律性，因此也有可能成为睡眠状态的生物标志物，弥补褪黑素和皮质醇的局限性。
在实际应用中，广泛地采用血清、血浆、唾液或尿液作为生物基质进行褪黑素、皮质醇及其代谢物的检测，但这些基质也有一定的局限性。其中血液中的激素含量波动大，容易受到环境因素干扰，且采集血样的过程有可能引起受试者应激，使结果不可靠；唾液和尿液则可以避免应激，但二者与血液同样为流体基质，有着即时性强的特点，都只能反映某个时间点的激素水平或过去较短时间段内的激素总量。如果希望通过此类基质反映长期状况，就需要对受试者进行长期的连续重复采样，过程繁琐、操作复杂。
相较于流体基质，毛发作为固体基质，其中的激素含量更稳定，更能反映激素的长期累积水平，而且毛发样本采集简便、保存要求低、生长速度均匀，便于匹配发段位置和期待的时间窗口。毛发中的内源性物质主要来源于血液中游离物质的被动扩散，所反映的是血液中游离的内源性物质的长期水平。
当前检测褪黑素、皮质醇及他们的代谢物的主要手段有免疫法、高效液相色谱法和高效液相色谱串联质谱法。免疫法虽然灵敏度高且经济便捷，但可能发生交叉反应影响结果，而且不能同时检测多种物质。高效液相色谱法常与紫外或荧光检测器联用，但此种方法往往需要预先进行富集和衍生化，操作复杂。考虑到毛发中的物质含量远低于流体基质，灵敏度高、特异性好的高效液相色谱串联质谱法或许更适合。此外，褪黑素及其代谢物的热稳定性相对较低。在以前单独分析头发皮质醇的样本提取中孵育温度往往较高，多在40度以上，以前的提取方法可能不适合褪黑素及其代谢物的提取。因此，本发明旨在建立一种同时提取和检测毛发中褪黑素、N-乙酰血清素、6-羟基褪黑素、皮质醇和可的松的液相色谱串联质谱法。
发明内容
发明目的：本发明提供一种灵敏度高、特异性好、准确可靠的，基于高效液相色谱串联质谱技术的涉及毛发中褪黑素、N-乙酰血清素、6-羟基褪黑素、皮质醇和可的松同时提取和检测方法。
技术方案：本发明的毛发中褪黑素、N-乙酰血清素、6-羟基褪黑素、皮质醇和可的松同时提取和检测方法包括以下步骤：
(1)采集人体毛发样本并预处理；
(2)孵育、萃取样本以提取样本中的目标物；
(3)使用高效液相色谱串联质谱法实现目标物含量的检测。
进一步地，所述步骤(1)中预处理的步骤为：将采集得到的毛发样本，在室温下加入小分子有机溶剂进行清洗。清洗所使用的小分子有机溶剂为甲醇。所述步骤(2) 中孵育、萃取的步骤为：向预处理后的头发碎段中加入孵育溶剂孵育12～36h，再将孵化后的溶液离心，取上清液，在氮气流下蒸发后，再重新用流动相溶液溶解。孵育温度和氮气流蒸发温度均为20～30℃。孵育溶剂由50μL的含2.5～10ng内标物的内标溶液和950uL的甲醇构成，内标物为四氘代褪黑素、四氘代N-乙酰血清素、四氘代6-羟基褪黑素、二氘代皮质醇或八氘代可的松。所述步骤(3)中目标物含量的检测步骤为：重溶液经高效液相色谱串联质谱仪分离后，通过质谱仪进行检测，并由内标法定量。
高效液相色谱串联质谱仪的色谱分离条件包括如下：
(1)色谱柱：C18色谱柱；
(2)流动相：甲醇和水的体积比为95∶5，其中每100mL流动相中含约0.0019g乙酸铵，溶液配制后用0.22μm微孔滤膜过滤，并进行15min的超声脱气处理；
(3)流速：200μL/min；
(4)进样量：10μL。
高效液相色谱串联质谱仪的质谱检测条件包括如下：
(1)离子模式：正离子模式；
(2)离子化方法：电喷雾；
(3)离子化参数：电喷雾电压，5500伏特；离子源温度，450℃；雾化气压，20psi；卷帘气压，20psi；碰撞气压，Medium；驻留时间，100ms；
(4)监测模式：多反应监测模式。
高效液相色谱串联质谱仪的定量方法为内标法，内标法所用标准曲线包括如下：
(1)头发空白基质：远离头皮12厘米的发梢，或连续在甲醇中浸泡7天以上的发根，其中的褪黑素、N-乙酰血清素、6-羟基褪黑素、皮质醇和可的松含量低于本方法的检测限；
(2)标准曲线纵坐标：标准品的峰面积与相对应氘化物的峰面积比值；
(3)标准品：褪黑素、N-乙酰血清素、6-羟基褪黑素、皮质醇和可的松的同时提取和检测方法；
(4)氘化内标：四氘代褪黑素、四氘代N-乙酰血清素、四氘代6-羟基褪黑素、二氘代皮质醇和八氘代可的松。
作为优选方案：
(1)采集人体毛发样本并预处理；
将采集得到的毛发样本，在室温下加入2mL小分子有机溶剂进行清洗，共振摇清洗2次，每次2min，清洗后发样在50℃下风干，再用洁净的剪刀剪为1mm左右的碎段；
(2)孵育、萃取样本以提取样本中的目标物；
向头发碎段中加入孵育溶剂孵育12～36h，再将孵化后的溶液用离心机以12000转/ 分钟的速度离心5min，取上清液，取得的上清液在氮气流下蒸发后，再重新用50μL 的流动相溶液溶解，其中孵育温度和氮气流蒸发温度均为室温(20～30℃)，孵育溶剂由50μL的含2.5～10ng内标物的内标溶液和950μL的甲醇构成，内标物为四氘代褪黑素、四氘代N-乙酰血清素、四氘代6-羟基褪黑素、二氘代皮质醇和八氘代可的松；
(3)使用高效液相色谱串联质谱法实现目标物的含量检测；
步骤(2)中的重溶液经高效液相色谱分离后，通过质谱仪进行检测，并由内标法对毛发中褪黑素、N-乙酰血清素、6-羟基褪黑素、皮质醇和可的松进行定量；
高效液相色谱串联质谱仪的色谱分离条件包括如下：
(1)色谱柱：C18色谱柱；
(2)流动相：甲醇和水的体积比为95∶5，其中每100mL流动相中含约0.0019g乙酸铵，溶液配制后用0.22μm微孔滤膜过滤，并进行15min的超声脱气处理；
(3)流速：200μL/min；
(4)进样量：10μL。
高效液相色谱串联质谱仪的质谱检测条件包括如下：
(1)离子模式：正离子模式；
(2)离子化方法：电喷雾；
(3)离子化参数：电喷雾电压，5500伏特；离子源温度，450℃；雾化气压，20psi；卷帘气压，20psi；碰撞气压，Medium；驻留时间，100ms；
(4)监测模式：多反应监测模式。
优选地，所述步骤(3)中质谱质荷比和质谱条件如表1所示：
表1待测目标物的母离子、子离子质荷比和质谱条件
本发明基于高效液相色谱串联质谱技术，建立了一种样本处理和提取过程简便、能够同时提取和检测人体毛发中褪黑素、N-乙酰血清素、6-羟基褪黑素、皮质醇和可的松的新方法。先利用高效液相色谱分离待测物质，后通过Qtrap四级线性质谱进行检测，使用内标法对物质含量定量。内标法建立时所用的头发空白基质为远离头皮12厘米的发梢，或连续在甲醇中浸泡7天以上的发根，其中的褪黑素、N-乙酰血清素、6-羟基褪黑素、皮质醇和可的松含量低于本方法的检测限。高效液相色谱测得的图谱显示，内标峰的滞留时间在12.5-17分钟，目标峰的滞留时间在12.5-17分钟，和干扰峰完全分开。
有益效果：本发明与现有技术相比，具有如下优势：本发明方法采用室温孵育，实现了毛发中褪黑素、N-乙酰血清素、6-羟基褪黑素、皮质醇和可的松的分离和同时检测，这些物质的定量限为0.1-1.0pg/mg，线性范围宽，上限为1000pg/mg；回收率为 85.3-111.7％，日内标准偏差为1.3-12.7％，日间标准偏差为4.9-11.5％。这些验证参数证明本发明的检测方法灵敏度高、特异性好、准确可靠。
附图说明
图1为各物质标准品加入毛发基质后的色谱质谱图；
图2为各物质氘代物标准品加入毛发基质后的色谱质谱图；
图3为真实毛发样本中的各物质的色谱质谱图。
具体实施方式
本实施例针对年龄18-24岁的65名健康大学生受试者毛发中的褪黑素、N-乙酰血清素、6-羟基褪黑素、皮质醇和可的松进行了检测
包括如下步骤：
(1)采集人体毛发样本并预处理：
尽可能地贴近头皮剪取受试者脑后枕部贴近发根的头发，长度需大于1cm，剪取的发样保存于室温下干燥洁净的离心管中，取20mg发样在室温下用2mL甲醇清洗2次，每次2min，洗净后在50℃下风干，再用洁净的剪刀将发样剪为1mm左右的碎段；
(2)孵育、萃取样本以提取样本中的目标物：
向头发碎段中加入50μL的含2.5～10ng内标物的内标溶液和950μL的甲醇混匀，在室温(26～27℃)下孵育24h，孵化完成后将孵育液用离心机以12000转/分钟的速度离心5min，取上清液，取得的上清液在室温(26～27℃)氮气流下吹干后，重新用 50μL的流动相溶液溶解；
(3)使用高效液相色谱串联质谱法实现目标物的含量检测：
高效液相色谱使用Dikma C18色谱柱，95∶5(v∶v)的甲醇∶水作为流动相，其中每100mL流动相溶液含有0.0019g乙酸铵，流动相配制完成后用0.22μm微孔滤膜过滤并超声脱气15min，流速为200μL/min，进样量为10μL；质谱的检测参数如表1所示。在得到的标准品色谱质谱图中，褪黑素色谱峰约在14.4分钟出现，N-乙酰血清素色谱峰约在12.8分钟出现，6-羟基褪黑素色谱峰约在13.3分钟出现，皮质醇色谱峰约在16.8 分钟出现，可的松色谱峰约在15.7分钟出现，见附图1。
取标准储备液用甲醇按比例稀释，配成系列浓度梯度的标准溶液(褪黑素浓度梯度为400、200、100、80、40、20、8、4、2、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.02ng/mL，其余物质浓度梯度为400、200、100、80、40、20、8、4、2、0.8、0.4、0.2、0.1ng/mL)，取剪碎的头发空白基质20mg，分别加入各浓度的标准溶液，混匀，室温下孵育24h，得到的孵育液处理和检测过程与步骤(2)、(3)一致。
在浓度梯度范围内，以待测物质的浓度为横坐标、质谱峰面积比为纵坐标进行线性回归分析，得到各待测物的回归方程，其中褪黑素的回归方程为y＝0.00785x-0.00053，N-乙酰血清素的回归方程为y＝0.00678x-0.00006，6-羟基褪黑素的回归方程为y＝0.01366x-0.01890，皮质醇的回归方程为y＝0.03296x+0.02356，可的松的回归方程为 y＝0.02800x-0.00700。
头发中褪黑素的检测限和定量限为0.05和0.1pg/mg，N-乙酰血清素的检测限和定量限为0.1和0.4pg/mg，皮质醇的检测限和定量限为0.1和0.5pg/mg，6-羟基褪黑素和可的松的检测限和定量限均为0.3和1.0pg/mg，回收率为85.3-111.7％，日内标准偏差为1.3-12.7％，日间标准偏差为4.9-11.5％。
经回归方程换算得到，65名健康大学生毛发中褪黑素的含量在0.05～0.82pg/mg，N-乙酰血清素的含量在0.1～13.9pg/mg，6-羟基褪黑素的含量在0.3～19.6pg/mg，皮质醇的含量在0.0～8.8pg/mg，可的松的含量在10.0～70.2pg/mg。
本实施例中所使用的水均为三蒸去离子水，色谱纯级甲醇购自美国SigmaAldrich 公司，色谱纯级乙酸铵购自美国Tedia公司，褪黑素、N-乙酰血清素、6-羟基褪黑素及对应氘代物购自上海甄准生物科技有限公司，皮质醇和可的松及对应氘代物购自美国Sigma Aldrich公司。
高效液相色谱系统为Agilent 1200系列液相色谱仪。质谱为Applied Biosystems公司的Qtrap 3200四级线性质谱系统。数据分析使用质谱附带的Analyst 1.6.2软件。色谱柱为Dikma的PLATISIL ODS-C18色谱柱(5μm，150×4.6mm)，并由C18预柱(5 μm，10×4.6mm)进行保护。流动相为95∶5(v∶v)的甲醇∶水，其中水中含有5mM乙酸铵，流动相配制完成后用0.22μm微孔滤膜过滤并超声脱气15min，流速为200 μL/min，进样量为10μL。
Claims (10)
1.一种毛发中褪黑素、N-乙酰血清素、6-羟基褪黑素、皮质醇和可的松同时提取和检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)采集人体毛发样本并预处理；
(2)孵育、萃取样本以提取样本中的目标物；
(3)使用高效液相色谱串联质谱法实现目标物含量的检测。
2.根据权利要求1所述的毛发中褪黑素、N-乙酰血清素、6-羟基褪黑素、皮质醇和可的松同时提取和检测方法，其特征在于：所述步骤(1)中预处理的步骤为：将采集得到的毛发样本，在室温下加入小分子有机溶剂进行清洗。
3.根据权利要求2所述的毛发中褪黑素、N-乙酰血清素、6-羟基褪黑素、皮质醇和可的松同时提取和检测方法，其特征在于：清洗所使用的小分子有机溶剂为甲醇。
4.根据权利要求1所述的毛发中褪黑素、N-乙酰血清素、6-羟基褪黑素、皮质醇和可的松同时提取和检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中孵育、萃取的步骤为：向预处理后的头发碎段中加入孵育溶剂孵育12～36h，再将孵化后的溶液离心，取上清液，在氮气流下蒸发后，再重新用流动相溶液溶解。
5.根据权利要求4所述的毛发中褪黑素、N-乙酰血清素、6-羟基褪黑素、皮质醇和可的松同时提取和检测方法，其特征在于：孵育温度和氮气流蒸发温度均为20～30℃。
6.根据权利要求4所述的毛发中褪黑素、N-乙酰血清素、6-羟基褪黑素、皮质醇和可的松同时提取和检测方法，其特征在于：孵育溶剂由50μL的含2.5～10ng内标物的内标溶液和950μL的甲醇构成，内标物为四氘代褪黑素、四氘代N-乙酰血清素、四氘代6-羟基褪黑素、二氘代皮质醇或八氘代可的松。
7.根据权利要求1所述的毛发中褪黑素、N-乙酰血清素、6-羟基褪黑素、皮质醇和可的松的同时提取和检测方法，其特征在于：所述步骤(3)中目标物含量的检测步骤为：重溶液经高效液相色谱串联质谱仪分离后，通过质谱仪进行检测，并由内标法定量。
8.根据权利要求7所述的毛发中褪黑素、N-乙酰血清素、6-羟基褪黑素、皮质醇和可的松同时提取和检测方法，其特征在于：高效液相色谱串联质谱仪的色谱分离条件包括如下：
(1)色谱柱：C18色谱柱；
(2)流动相：甲醇和水的体积比为95∶5，其中每100mL流动相中含约0.0019g乙酸铵；
(3)流速：200μL/min；
(4)进样量：10μL。
9.根据权利要求7所述的毛发中褪黑素、N-乙酰血清素、6-羟基褪黑素、皮质醇和可的松同时提取和检测方法，其特征在于：高效液相色谱串联质谱仪的质谱检测条件包括如下：
(1)离子模式：正离子模式；
(2)离子化方法：电喷雾；
(3)离子化参数：电喷雾电压，5500伏特；离子源温度，450℃；雾化气压，20psi；卷帘气压，20psi；碰撞气压，Medium；驻留时间，100ms；
(4)监测模式：多反应监测模式。
10.根据权利要求7所述的毛发中褪黑素、N-乙酰血清素、6-羟基褪黑素、皮质醇和可的松同时提取和检测方法，其特征在于：高效液相色谱串联质谱仪的定量方法为内标法，内标法所用标准曲线包括如下：
(1)头发空白基质：远离头皮12厘米的发梢，或连续在甲醇中浸泡7天以上的发根，其中的褪黑素、N-乙酰血清素、6-羟基褪黑素、皮质醇和可的松含量低于本方法的检测限；
(2)标准曲线纵坐标：标准品的峰面积与相对应氘化物的峰面积比值；
(3)标准品：褪黑素、N-乙酰血清素、6-羟基褪黑素、皮质醇和可的松的同时提取和检测方法；
(4)氘化内标：四氘代褪黑素、四氘代N-乙酰血清素、四氘代6-羟基褪黑素、二氘代皮质醇和八氘代可的松。
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