CN107290517A - 一种人体毛发褪黑素含量的测量方法 - Google Patents

一种人体毛发褪黑素含量的测量方法 Download PDF

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肖静
孙晴
张琼
徐苗苗
彭美娟
金云霞
周云薇
姜海悦
张宵月
毛伟明
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Abstract

本发明提供一种人体毛发褪黑素含量的测量方法，包括如下步骤：S1、取人体毛发，并去角质；S2、萃取去角质后人体毛发，提取褪黑素；S3、酶联免疫吸附法测试褪黑素的含量。本发明提供的测量人毛发中的褪黑素水平，对于研究褪黑素与毛发生理学、病理学之间关系提供了一种新的方法。本次实验提供了人体毛发中的褪黑素测试方法的可行性研究。

Description

一种人体毛发褪黑素含量的测量方法
技术领域
本发明涉及一种人体毛发褪黑素含量的测量方法领域。
背景技术
褪黑素能够调节人体生物节律、睡眠、情绪、免疫功能、生殖、 衰老以及毛发生长等多种生理功能。现有利用血液、唾液及尿液等生 物样品中褪黑素检测受到人体生理节律影响以及无法真正反映皮肤 毛囊中的褪黑素水平。
发明内容
本发明的目的是提供一种人体毛发褪黑素含量的测量方法，解决 上述技术问题中的一个或者多个。
本发明提供一种人体毛发褪黑素含量的测量方法，包括如下步 骤：
S1、取人体毛发，并去角质；
S2、萃取去角质后人体毛发，提取褪黑素；
S3、酶联免疫吸附法测试褪黑素的含量。
除了松果腺这个主要分泌器官分泌褪黑素外，皮肤毛囊也可分 泌，其对于人体毛发在生长、色素沉着、脱毛等生理具有重要调节功 能。基于此，本发明提供一种人体毛发褪黑素含量的测量方法，测量 结果更加稳定，为明确褪黑素对于毛发生理功能以及毛发相关疾病如 脱发、色素性疾病的治疗提供研究基础。
在一些实施方式中，S1中去角质的步骤为：将人体毛发加入异 丙醇浸泡，人体毛发与异丙醇的重量比为1:30～40；浸泡时间为4分 钟以上。
去除角质蛋白，便于后续萃取，并有利于清理毛发。
在一些实施方式中，还包括位于S1与S2之间的步骤S1.1、蒸 发去除异丙醇，粉碎去角质后的人体毛发。
在一些实施方式中，粉碎去角质后的人体毛发的步骤为液氮冷冻 去角质后人体毛发6小时以上，再将冷冻后人体毛发研磨粉碎。
在一些实施方式中，S2、萃取去角质后人体毛发的步骤中，萃取 溶剂为体积比5:3的甲醇和乙醚的混合液。
在一些实施方式中，萃取温度为50.8℃，萃取时间为12小时以 上。
在一些实施方式中，S2、提取褪黑素的步骤中，离心分离萃取后 混合液，提取离心分离后混合液的上层液相，再去除上层液相的溶剂， 得到褪黑素固相。
本发明采用上层液相，上层液相中褪黑素含量稳定，进而检出水 平较稳定。
在一些实施方式中，离心分离的转速为3000～4000转/分钟，时 间为10min以上。
在一些实施方式中，S3、酶联免疫吸附法测试褪黑素的含量的步 骤中，将褪黑素固相加入PH为7.35的PBS溶液，再采用酶联免疫 吸附法测试褪黑素。
具体的，S3利用非提取性褪黑素ELISA试剂盒，具体的操作方 法严格按说明书进行。
附图说明
图1为酶联免疫吸附法褪黑素浓度与吸光度关系标准曲线图。
具体实施方式
本发明提供一种人体毛发褪黑素含量的测量方法，
首先选择年龄22-23岁的2名健康成年女性，
采集唾液与头发，各检测其褪黑素水平，用唾液收集管收集三名 女生一天中1am、4am、7am、8am、9am、10am、3pm、16pm、19pm、 20pm、21pm、22pm十二个时间点的唾液，离心，-20℃保存。
同时在采样前一天上午十点，2名女性每次各取头枕部发根头发50mg。
包括如下步骤：
S1、将50mg人体毛发加入异丙醇浸泡，2～3ml异丙醇浸泡时间 5分钟以上；
S1.1、蒸发去除异丙醇，液氮冷冻去角质后人体毛发6小时以上， 再将冷冻后人体毛发研磨粉碎；
S2、萃取去角质后人体毛发，萃取溶剂为体积比5ml甲醇和3ml 乙醚的混合溶剂，萃取温度为50.8℃，萃取时间为12小时以上，
离心分离萃取后混合液；离心分离的转速为3000～4000转/分钟， 时间为10min以上；提取离心分离后混合液的上层液相，使用氮吹仪 去除上层液相的溶剂，得到褪黑素固相；
S3、将褪黑素固相加入PH为7.35的PBS溶液，采用酶联免疫 吸附法测试褪黑素的含量。
本发明的S3中酶联免疫吸附法采用德国IBL公司ELISA试剂 盒，具体包括如下成分：
实验步骤：
考虑到褪黑素水平分泌个体间还存在着广泛的差异以及分泌节 律性模式也不同，本实验以比较成熟的唾液褪黑素测量作为参照，唾 液采样时间点：1:00、4:00、7:00、8:00、9:00、10:00、13:00、16:00、 19:00、20:00、21:00、22:00，按照时间顺序101-112为第1人，201-212 为第2人。
人体毛发样品如表1，发样为1a，2a，1a为第1人发样，2a为 第2人发样。
表1标准品及样品编号
编号 1 2 3 4 5
A 标A 101 109 205 1a
B 标B 102 110 206 2a
C 标C 103 111 207
D 标D 104 112 208
E 标E 105 201 209
F 标F 106 202 210
G 质控1 107 203 211
H 质控2 108 204 212
表2为上述各个标准品及样品的测得OD值，具体见表2。
表2测试样品OD值
采用四参数拟合曲线法。将所有的OD值(标准品、质控品和样 品)减去空白孔的平均值。以标准品的OD值(Y轴，线性)对其浓 度(X轴，对数)做一条标准曲线。在推算标准曲线时，应当充分利 用好每一个标准品数值(明显逸出的数值应当被忽略，再使用更加合 理的数值代替它)。样品的浓度可以从标准曲线上直接读取。从坐标 纸上读取结果时应当把起始的稀释倍数考虑进去。将稀释了的样品结 果乘以稀释因子即可得到其相应的结果。样品中抗体浓度高于最高标 准品的样品，应当按实验前准备说明所述的方法进行稀释，并重新检 测。
表3为各测试样品的浓度测试值，详见表3。
表3测试样品浓度(pg/ml)
1 2 3 4 7
A 0 7.184 0.945 2.367 0.540
B 0.500 9.617 1.274 3.171 0.609
C 1.500 2.675 0.680 1.861
D 5.000 2.356 2.041 2.099
E 15.000 2.482 29.339 1.974
F 50.000 1.763 13.421 2.210
G 2.253 1.106 7.599 1.127
H 20.093 1.496 3.064 2.745
实验结果发现被测试者两人唾液褪黑素水平为白天水平低，夜间 水平高，符合人体褪黑素分泌生理节律性，而褪黑素含量分别为0.540 和0.609pg/ml，并均低于唾液褪黑素最低水平。
本发明提供的测量人毛发中的褪黑素水平，对于研究褪黑素与毛 发生理学、病理学之间关系提供了一种新的方法。本次实验提供了人 体毛发中的褪黑素测试方法的可行性研究。实验结果中毛发褪黑素水 平与唾液褪黑素同时段水平的数量关系还需要后续进一步的研究探 讨。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术 人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形 和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种人体毛发褪黑素含量的测量方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、取人体毛发样品，并去角质；
S2、萃取去角质后人体毛发，提取褪黑素；
S3、酶联免疫吸附法测试褪黑素的含量。
2.根据权利要求1所述的一种人体毛发褪黑素含量的测量方法，其特征在于，S1中去角质的步骤为：将所述人体毛发加入异丙醇浸泡，人体毛发与异丙醇的重量比为1:30～40；浸泡时间为4分钟以上。
3.根据权利要求2所述的一种人体毛发褪黑素含量的测量方法，其特征在于，还包括位于S1与S2之间的步骤S1.1、蒸发去除异丙醇，粉碎去角质后的人体毛发。
4.根据权利要求3所述的一种人体毛发褪黑素含量的测量方法，其特征在于，粉碎去角质后的人体毛发的步骤为液氮冷冻去角质后人体毛发6小时以上，再将冷冻后人体毛发研磨粉碎。
5.根据权利要求1所述的一种人体毛发褪黑素含量的测量方法，其特征在于，S2、萃取去角质后人体毛发的步骤中，萃取溶剂为体积比5:3的甲醇和乙醚的混合液。
6.根据权利要求5所述的一种人体毛发褪黑素含量的测量方法，其特征在于，所述萃取温度为50.8℃，萃取时间为12小时以上。
7.根据权利要求5所述的一种人体毛发褪黑素含量的测量方法，其特征在于，S2、提取褪黑素的步骤中，离心分离萃取后混合液，提取离心分离后混合液的上层液相，再去除上层液相的溶剂，得到褪黑素固相。
8.根据权利要求7所述的一种人体毛发褪黑素含量的测量方法，其特征在于，所述离心分离的转速为3000～4000转/分钟，时间为10min以上。
9.根据权利要求1所述的一种人体毛发褪黑素含量的测量方法，其特征在于，S3、酶联免疫吸附法测试褪黑素的含量的步骤中，将褪黑素固相加入PH为7.35的PBS溶液，采用酶联免疫吸附法测试褪黑素。
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