CN104698191B - Sfta3在肺鳞癌和腺癌病理诊断鉴别中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及CALML3、MLPH、TMC5、SFTA3四种基因或其检测试剂的用途，用于制备肺鳞癌和腺癌的鉴别诊断试剂。本发明通过对TCGA数据库中肺鳞癌和腺癌的mRNA测序结果进行统计分析，共纳入490例肺鳞癌和490例肺腺癌的数据，发现CALML3、MLPH、TMC5、SFTA3基因表达在肺鳞癌和腺癌中差距十分显著，适合应用于肺鳞癌和腺癌的鉴别诊断。随后采用免疫组化的方法在肺鳞癌和腺癌组织病理切片中检测CALML3、MLPH、TMC5、SFTA3基因表达，确定了这些基因在肺鳞癌和腺癌中的表达差异以及在鉴别诊断中的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及临床诊断技术领域，具体地说，是CALML3、MLPH、TMC5、SFTA3基因在肺癌病理诊断中用于鉴别诊断肺鳞癌和腺癌。
背景技术
肺癌作为最常见和最致命的肿瘤，发病率和死亡率均排名所有肿瘤第一位。鳞癌和腺癌作为肺癌最主要的两种类型，占所有肺癌病例中的绝大部分，但它们的分子生物学特征有着明显差别，治疗方式也有着很大的不同。因此，准确的区分患者肺癌的类型，对于提高患者的治疗效果、减轻社会的负担有着极为重要的意义。
目前主要采用光镜下观察苏木素-依红(HE)染色的肿瘤组织切片进行鉴别肺癌类型。但在肿瘤低分化、坏死、挤压导致结构不清，或者穿刺取样导致样本量稀少等情况下时，仅根据HE染色切片难以做出准确的病理诊断。此时，采用免疫组化等方法检测在肺鳞癌和腺癌中差异表达的基因，对明确诊断肿瘤病理类型就非常重要。
目前，常用于肺鳞癌和腺癌病理诊断的基因有：肺鳞癌：TP63、HCK、P40等；肺腺癌：TTF1、CK7、NAPSA等。这些基因在区分肺鳞癌和腺癌时有着较高的敏感性和特异性，已长期在临床应用。但由于目前缺乏对肺癌不同类型基因组全面系统的分析，仍可能有着具备更高敏感性、特异性和应用价值的基因可以应用于肺鳞癌和腺癌的鉴别诊断。
中国专利文献CN201210208193.0，公开了一种辅助诊断肺腺癌患者的试剂盒，其包括用于检测蛋白标志物IDH1的产品、用于检测蛋白标志物CA125的产品、以及用于检测蛋白标志物CYFRA21-1的产品，所述的试剂盒用于辅助诊断肺腺癌和肺鳞癌患者，具有灵敏度高、特异性强的特点。目前，关于CALML3、MLPH、TMC5或SFTA3基因在肺癌病理诊断中用于鉴别诊断肺鳞癌和腺癌还未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供CALML3、MLPH、TMC5、SFTA3基因或其检测试剂的用途。
本发明的再一的目的是，提供一种用于肺鳞癌和腺癌的鉴别诊断的试剂盒。
本发明的另一的目的是，提供上述肺鳞癌和腺癌的鉴别诊断试剂盒的用途。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
CALML3、MLPH、TMC5、SFTA3基因或其检测试剂的用途，用于制备肺鳞癌和腺癌的鉴别诊断试剂。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
一种用于肺鳞癌和腺癌的鉴别诊断的试剂盒，所述试剂盒含有测定样本中基因表达量的试剂；所述基因为CALML3、MLPH、TMC5或SFTA3中的任意一种或多种。
所述检测CALML3表达量的试剂为CALML3的特异性抗体；所述检测MLPH表达量的试剂为MLPH的特异性抗体；所述检测TMC5表达量的试剂为TMC5的特异性抗体；所述检测SFTA3表达量的试剂为SFTA3的特异性抗体。
对于基因表达量的测定，可以使用本领域公知的标准方法。一般基因表达量典型的是将mRNA量或者蛋白质量作为标准来测定。本发明中也可以同样的将CALML3、MLPH、TMC5或SFTA3基因的mRNA量或者蛋白质量作为标准进行相应的基因表达量的测定。
本发明中，可以选取CALML3、MLPH、TMC5、SFTA3这四种基因的任意一种或多种基因的任意组合进行测定。利用本发明提供的试剂盒检测样本中CALML3、MLPH、TMC5、SFTA3的一种或多种的表达，如果样本中CALML3表达高，而MLPH、TMC5、SFTA3表达低，则样本为肺鳞癌。如果样本中CALML3表达低，而MLPH、TMC5、SFTA3表达高，则样本为肺腺癌。
所述的样本为肺癌组织、肺癌患者血液、血浆、血清、体液或细胞中的一种或多种。
在获得了本发明的试剂盒后，还可以利用多种免疫学相关方法来检测样本中CALML3、MLPH、TMC5或SFTA3基因的表达量，这些方法均包含在本发明中。
所述的试剂盒中还包括免疫组化试剂。
所述的免疫组化试剂包括：显色试剂、二甲苯、乙醇、H2O2甲醇液、抗原修复液、封闭液、PBS、中性树脂。
为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：
所述的肺鳞癌和腺癌的鉴别诊断试剂盒的用途，用于制备肺鳞癌和腺癌的 鉴别的诊断试剂或试剂盒。
发明人通过对TCGA数据库中的肺鳞癌、腺癌组织各490例的mRNA测序数据进行分析，首先采用生物信息学方法在全基因组中确定了在肺鳞癌和腺癌中特异性表达的基因。随后采用ROC曲线(receiver operating characteristic curve)的方法对这些特意表达的基因及目前常用于肺鳞癌和腺癌鉴别诊断基因进行分析研究，发现CALML3、MLPH、TMC5、SFTA3等基因相较于目前常用的诊断基因可能具有更大的优势。随后我们通过免疫组化的方法检测了肺鳞癌和腺癌组织各50例中的CALML3、MLPH、TMC5、SFTA3表达，进一步确定了它们在肺鳞癌和腺癌鉴别诊断中的应用价值及它们较部分常用的诊断基因在敏感性和特异性上的优势。因此CALML3、MLPH、TMC5、SFTA这四种基因适合应用于肺鳞癌和腺癌鉴别诊断
本发明优点在于：
本发明通过对肺鳞癌和腺癌基因组全面系统的分析和验证，发现了四种基因calmodulin-like 3(CALML3)、melanophilin(MLPH)、transmembrane channel-like 5(TMC5)、surfactant associated 3(SFTA3)可以在肺癌组织病理诊断中用于鉴别诊断肺鳞癌和腺癌，这四种基因较部分目前常用的肺鳞癌和腺癌诊断基因在敏感性和特异性上具有一定优势。
附图说明
附图1的(A)为CALML3在诊断肺鳞癌时的ROC曲线；(B)为MLPH、TMC5、SFTA3在诊断肺腺癌时的ROC曲线。图(B)中ROC曲线下面积由高到低依次为MLPH、TMC5、SFTA3。
附图2为CALML3、MLPH、TMC5、SFTA3的表达分布情况。
附图3为CALML3、MLPH、TMC5、SFTA3的免疫组化检测结果。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例
一、肺鳞癌和腺癌全基因组表达数据分析
首先从TCGA数据库中获得肺鳞癌和腺癌的mRNA测序数据，共包含490例肺鳞癌和肺腺癌样本的数据。计算每种基因的表达量，以RSEM值表示。
基于以下标准初步筛选出可应用于肺鳞癌和腺癌鉴别诊断的基因。
(1)Mean(S)≥1000并且Mean(S)/Mean(A)≥4；
(2)Mean(A)≥1000并且Mean(A)/Mean(S)≥4。
此处，Mean表示某种基因在肺鳞癌或腺癌组织中的平均表达量，(S)表示肺鳞癌，(A)表示肺腺癌。满足(1)或者(2)二者之一的基因进入下一步的研究，通过这一标准我们筛选了那些在肺鳞癌和腺癌中表达差别显著的基因，同时这些基因在肺鳞癌或者肺腺癌二者之一中表达量高以利于检测。一共筛选出基因228个，其中肺鳞癌中表达显著高于腺癌的基因118个，肺腺癌中表达远高于肺鳞癌的基因110个。
采用ROC曲线对所筛选出的228个基因进行分析，在诊断肺鳞癌和肺腺癌时的ROC曲线下面积值分别排名前20位的基因表达情况和ROC分析结果见表1和表2
表1在肺鳞癌中特异性表达的基因表达情况及ROC分析
表2在肺腺癌中特异性表达的基因表达情况及ROC分析
因为SFTA2的抗体目前尚无法获得、KRT5的编码产物是目前常用的诊断标志物CK5/6成分之一、而DSG3和DSC3在肺鳞癌和肺腺癌的表达情况已有研究，所以我们对CALML3、MLPH、TMC5、SFTA3进行进一步研究，这四种基因在肺鳞癌和肺腺癌中的表达情况及其用于鉴别诊断肺鳞癌和肺腺癌鉴别诊断中的应用目前尚未见报道。由表1及表2可知，CALML3、MLPH、TMC5、SFTA3这四种基因的ROC曲线下面积值高于目前常用的诊断基因TTF-1(即NKX2-1)和TP63等，说明这四种基因在肺鳞癌和肺腺癌鉴别诊断中的敏感性和特异性优于这些常用的诊断基因。CALML3的ROC曲线图见图1(A)，MLPH、TMC5、SFTA3的ROC曲线图见图1(B)，它们的表达分布情况见图2。
由图1可知，CALML3、MLPH、TMC5、SFTA3在鉴别诊断肺鳞癌和肺腺癌时有着较高的敏感性和特异性；由图2可知，CALML3、MLPH、TMC5、SFTA3 在肺鳞癌和腺癌中表达分布差别十分显著。
二、在肺鳞癌和肺腺癌组织病理切片检测CALML3、MLPH、TMC5、SFTA3表达以及与部分常用诊断基因的比较
我们在50例肺鳞癌和50例肺腺癌组织病理切片上检测CALML3、MLPH、TMC5、SFTA3的表达，并将其与常用的肺鳞癌和肺腺癌诊断基因相比较。具体步骤如下：
(1)采用凯基公司的即用型MaxVisionTM免疫组化试剂盒在肺鳞癌和肺腺癌组织病理切片上检测CALML3、MLPH、TMC5、SFTA3的表达，具体步骤如下。
①石蜡切片二甲苯脱蜡、梯度酒精水化后，用PBS冲洗3次，每次3分钟。
②将切片浸泡在枸橼酸钠抗原修复液中，煮沸加热20分钟，自然冷却至室温。
③每张切片加50微升3％过氧化氢溶液，室温下孵育5分钟。用PBS洗涤3次，每次3分钟。
④每张切片加50微升1:100浓度的一抗，4℃孵育过夜。PBS冲洗3次，每次3分钟。
⑤每张切片加50微升即用型MaxVisionTM试剂，室温下孵育15分钟。PBS冲洗3次，每次3分钟。
⑥每张切片加100微升新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察5分钟。
⑦自来水冲洗，苏木素复染，自来水冲洗返蓝。梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封片。
(2)采用以下标准对免疫组化结果半定量评分。
①染色强度：0(无着色)，1(轻度着色)，2(中度着色)，3(强烈着色)。
②染色细胞百分比：0(无着色)，1(1～10％细胞着色)，2(11～50％细胞着色)，3(51～80％细胞着色)，4(大于80％细胞着色)。
③总评分＝染色强度×染色细胞百分比。
④免疫组化结果：－(总评分0～1)，+(总评分2～4)，++(总评分6～8)，+++(总评分9～12)。
(3)采用ROC曲线计算CALML3、MLPH、TMC5、SFTA3用于诊断肺鳞癌和肺腺癌的敏感性和特异性。
(4)从患者的病理报告中获取常用肺鳞癌和肺腺癌诊断基因的免疫组化 结果，采用ROC曲线计算敏感性和特异性。
其中步骤1中所用的CALML3、MLPH、TMC5、SFTA3抗体均由Sigma-Aldrich公司提供。
图3为CALML3、MLPH、TMC5、SFTA3的免疫组化结果。其中A、C、E、G分别为CALML3、MLPH、TMC5、SFTA3的肺鳞癌切片免疫组化结果；B、D、F、H分别为CALML3、MLPH、TMC5、SFTA3的肺腺癌切片免疫组化结果。
表3为CALML3、MLPH、TMC5、SFTA3以及常用肺鳞癌和腺癌诊断基因的表达情况、敏感性和特异性。
表3
由表3可知，CALML3、MLPH、TMC5、SFTA3在鉴别诊断肺鳞癌和肺腺癌时有较高的敏感性和特异性，较部分常用肺鳞癌和肺腺癌诊断基因有一定的优势。随着这四种基因的检测方法细节在应用中的改善，它们的敏感性和特异性还可以进一步提高。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (2)
1.SFTA3基因或其检测试剂的用途，其特征在于，用于制备肺鳞癌和腺癌的鉴别诊断试剂。
2.检测试剂盒的用途，所述试剂盒含有测定样本中SFTA3基因表达量的试剂，所述样本为肺癌组织，其特征在于，所述试剂盒用于制备肺鳞癌和腺癌的鉴别的诊断试剂。
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