CN111912915A - 测定奶和血清及其制品中褪黑素的样品快速前处理方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种测定奶和血清及其制品中褪黑素的样品快速前处理方法。所述方法通过使用甲醇对样品进行稀释，使用高效液相色谱法测定褪黑素含量，以达到快速、准确测定奶和血清及其制品中褪黑素的目的。本发明所述方法将牛奶稀释成原样品体积的5倍时效果最佳，褪黑素回收率为91.5‑134.7％；羊血清稀释成原体积的2、3、4和5倍都能均得到较好的回收率，回收率为81.02％‑97.44％。成本低、步骤简单，节约时间，为进一步开展奶和血清中褪黑素相关的研究提供有益的参考。

Description

测定奶和血清及其制品中褪黑素的样品快速前处理方法
技术领域
本发明属于农业类畜牧兽医领域，研究对象为牛、羊、猪等家畜奶和血清及其制品，具体地涉及一种快速有效测定其中褪黑素含量的样品前处理方法。
背景技术
褪黑素(Melatonin，MT)是一种由松果体分泌的激素，目前研究表明褪黑素参与调节生物节律、睡眠和免疫细胞等，同时是一种重要的生殖激素。准确测定牛奶及其牛、羊、猪等家畜乳汁及其奶制品和血清及其制品中褪黑素含量为检测家畜生长状况和褪黑素的推广应用提供重要参考意义。
现有技术已公开了一些对奶和血清及其相关制品中褪黑素含量进行检测的方法，但其前处理方法步骤繁琐、耗材消耗量大、实验时间长；同时一部分检测方法要使用液相色谱-质谱联用方法，消耗成本高，不适用于普遍推广。
鉴于现有技术中存在的问题，本研究公开了一种使用高效液相色谱法测定奶和血清及其制品中褪黑素的样品快速前处理方法，这种样品前处理方法不仅快速准确，而且节约成本，适于普遍推广。
发明内容
针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的是提供一种使用高效液相色谱法测定奶和血清及其制品中褪黑素的样品快速前处理方法。
为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：
一种高效液相色谱法测定奶和血清及其制品中褪黑素的样品快速前处理方法，包括：使用甲醇稀释样品，将样品稀释成原样品体积的2倍、3倍、4倍和5倍，即稀释倍数分别为2倍、3倍、4倍和5倍，采用高效液相色谱法分别进行褪黑素测定。
在上述方案的基础上，所述方法具体包括：将待测样品取出，溶解后，吹打均匀，4℃保存备用；取200μL样品，分别添加200、400、600和800μL甲醇，将样品稀释成原样品体积的2、3、4和5倍；漩涡震荡30s；4℃，14000r/min，离心20min；最后用1mL注射器吸取上清，使用2μm过滤器过滤，分别吸取350μL液体储存在棕色上样瓶中，采用高效液相色谱法分别进行褪黑素测定。
在上述方案的基础上，所述样品中添加外源褪黑素。
在上述方案的基础上，所述样品为牛奶，猪等家畜乳汁，奶制品，血清或血清制品。
在上述方案的基础上，当样品为牛奶，猪等家畜乳汁或奶制品时，将样品稀释成原样品体积的5倍，褪黑素回收率最高，回收率为91.5-134.7％，效果最佳。
在上述方案的基础上，当样品为血清或血清制品时，使用甲醇稀释样品，稀释倍数为2、3、4和5倍时均可得到很好的回收率，回收率为81.02％-97.44％，将样品稀释成原样品体积的5倍时，褪黑素回收率最高，效果最佳。
本发明的优点在于：
(1)本发明提供一种使用高效液相色谱法测定奶和血清及其制品中褪黑素的样品快速前处理方法，并为进一步开展奶和血清中褪黑素含量与家畜的生长之间的关系提供直接数据。
(2)本发明方法中不仅适用于牛奶和羊血清中褪黑素含量检测，也适用于猪等家畜乳汁及奶制品、血清制品，这为褪黑素的实际使用和推广应用提供重要参考指标。
(3)本发明方法中，使用甲醇稀释样品，当样品为血清或血清制品时，稀释倍数为5倍时效果最佳，回收率为91.5-134.7％。当样品为血清或血清制品时，稀释倍数为2、3、4和5倍时均可得到很好的回收率，回收率为81.02％-97.44％，其中稀释倍数为5时效果最佳。
(4)用该方法可快速准确的检测奶和血清及其制品中褪黑素含量，成本低、步骤简单，节约时间。并且测定色谱图基线平直，没有杂峰，没有拖尾现象，对褪黑素测定没有干扰，可以普遍推广使用。
(5)样品前处理仅用了甲醇，可以同时完成除去蛋白质和溶解褪黑素；不必使用吸附柱吸附褪黑素，也不需要使用氮吹仪挥发完甲醇再定体积，操作简单，节省时间。
附图说明
本发明有如下附图：
图1第一次使用高效液相色谱法测定标准品4ppb对应的色谱峰图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例中使用的试剂和材料均为市售商品。
实施例1
1.实验样品
采集的牛奶储存在离心管中，低温运输，样品在-80℃中保存。
2.褪黑素标准品配制
称取褪黑素0.05g(品牌：sigma)，首先用5mL甲醇溶解，再用甲醇依次稀释成4、10、20、50、100ng/mL(即ppb)，储存在棕色上样瓶中，-20℃保存。
3.样品前处理
将待测牛奶样品取出，溶解后，吹打均匀，4℃保存备用；取200μL牛奶，分别添加200、400、600和800μL甲醇，将牛奶稀释成原样品体积的2、3、4和5倍；漩涡震荡30s；4℃，14000r/min，离心20min；最后用1mL注射器吸取上清，使用2μm过滤器过滤，分别吸取350μL液体储存在棕色上样瓶中，待检测。
4.高效液相色谱法检测
使用1200HPLC系统(品牌：Agilent)进行检测。流动相A和B分别由超纯水和乙腈组成，流动相的流速为1.0mL/min；荧光检测器用于检测褪黑素，激发波长285nm，发射波长345nm。所得结果为每个样品的峰面积。
5.实验结果
5.1标准曲线的绘制
使用高效液相色谱法进行检测，褪黑素出现吸收峰时间在9-12min之间。由表1可知，设置横坐标为褪黑素标准品浓度，纵坐标为机器所得样品峰面积，绘制曲线，y＝2.1642x+3.3133(相关系数R2＝0.9987)。
表1第一次使用高效液相色谱法测定不同浓度褪黑素标准品对应的峰面积
配制褪黑素标准品浓度 峰面积
4ppb 9.98
10ppb 23.6
20ppb 51.9
50ppb 109.3
100ppb 220
5.2牛奶稀释不同倍数褪黑素含量测定
由表2可知，在牛奶中不添加外源褪黑素时，吹打均匀分别取出200微升，使用甲醇将牛奶稀释，稀释倍数分别为2、3、4和5倍，通过峰面积代入y＝2.1642x+3.3133得到上样瓶中液体褪黑素浓度，再分别乘以样品稀释倍数2、3、4和5，最终得出每个牛奶样品中褪黑素的浓度。每个牛奶样品中褪黑素的浓度求平均值，结果表明：选取的牛奶样品中褪黑素的平均浓度为199.0ppb。
表2牛奶稀释不同倍数褪黑素含量测定
Figure BDA0002509323890000051
5.3牛奶中添加100ppb褪黑素后稀释不同倍数褪黑素含量测定
由表3可知，在上述选取的牛奶中添加100ppb褪黑素后，分别取出200微升，使用甲醇将牛奶稀释，稀释倍数分别为2、3、4和5倍，通过峰面积代入y＝2.1642x+3.3133得到上样瓶中液体褪黑素浓度，再分别乘以样品稀释倍数2、3、4和5，最终得出样品中褪黑素的浓度。选取的这个奶牛样品中褪黑素的平均浓度为199.0ppb，回收率＝(样品中褪黑素浓度-样品中褪黑素的平均浓度)/外源褪黑素添加浓度。计算结果表明：牛奶中添加100ppb褪黑素后，样品稀释倍数为5时测得褪黑素回收率最高，为91.8％。
表3牛奶中添加100ppb褪黑素后稀释不同倍数褪黑素含量测定
Figure BDA0002509323890000052
5.4牛奶中添加不同浓度褪黑素后稀释倍数为5时褪黑素含量测定
为了进一步验证用牛奶稀释倍数为5时是最佳的，本申请又选取了另一个牛奶样品并且添加一系列更高浓度褪黑素进行验证，并且重新绘制标准曲线，由表4可得，本次标准品曲线方程为y＝0.2265x+6.2832(相关系数R2＝0.9908)。
由表5可知，在第二次选取的牛奶中添加不同浓度褪黑素后，混匀分别取出200微升，使用甲醇将牛奶稀释，稀释倍数为5，通过峰面积代入y＝0.2265x+6.2832得到上样瓶中液体褪黑素浓度，再分别乘以样品稀释倍数5，最终得出每个牛奶样品中褪黑素的浓度。不添加外源褪黑素时按照上述步骤进行检测，得到第二次选取的奶牛样品中褪黑素的浓度为768.6ppb，计算结果表明：牛奶中添加不同浓度褪黑素，用甲醇稀释5倍后，平均回收率为105.7％。
表4第二次使用高效液相色谱法测定不同浓度褪黑素标准品对应的峰面积
配制褪黑素标准品浓度 峰面积
10ppb 29.5
20ppb 63.9
50ppb 168.1
100ppb 422.3
表5牛奶中添加不同浓度褪黑素后稀释倍数为5时褪黑素含量测定
Figure BDA0002509323890000061
5.5牛奶制品稀释倍数为5时褪黑素含量测定
购买常温液态奶(全脂灭菌)，按照稀释倍数为5时进行褪黑素含量测定。由表6可知，同样能检测到褪黑素含量。
表6牛奶制品稀释倍数为5时褪黑素含量测定
牛奶制品 牛奶制品中褪黑素浓度(ppb)
牛奶制品1 16.59
牛奶制品2 14.58
牛奶制品3 17.82
牛奶制品4 12.58
牛奶制品5 13.46
牛奶制品6 17.92
牛奶制品7 14.69
牛奶制品8 12.18
牛奶制品9 31.95
牛奶制品10 15.05
牛奶制品11 84.20
牛奶制品12 84.02
牛奶制品13 19.30
牛奶制品14 12.10
牛奶制品15 17.85
牛奶制品16 12.51
牛奶制品17 15.90
牛奶制品18 11.25
牛奶制品19 13.70
综上可知，牛奶及其外源添加褪黑素的牛奶样品，通过使用甲醇进行样品稀释，混匀离心后所得样品，直接使用液相色谱法进行检测，可以检测到褪黑素含量，其中，当使用稀释倍数为5时(即待测牛奶样品：甲醇＝1：4体积比)，褪黑素回收率最好，回收率为91.5-134.7％。使用本方法还能检测到牛奶制品中褪黑素含量。因此，可以使用此样品前处理方法，快速准确的测定牛奶及其制品中的褪黑素含量，可操作性强，成本低，并且有很好的回收率。
实施例2
1.实验样品处理
通过静脉采血的方式采集羊的血液。血液在室温静置30min后，5000r/min离心10min，吸取血清到干净的离心管中，编号标记后置于-80℃冻存，冰上短距离运输。
2.褪黑素标准品配制
称取褪黑素0.05g(品牌：sigma)，首先用5mL甲醇溶解，再用甲醇依次稀释成2、4、10、20、50、100ng/mL(即ppb)制成标准品，储存在棕色上样瓶中，-20℃保存，标准品在配制后一个月内有效。
3.样品前处理
将待测样品取出，溶解后，吹打均匀；取200μL待测样品，分别添加200、400、600和800μL甲醇，将待测样品稀释成原样品体积的2、3、4和5倍；漩涡震荡30s；4℃，12000r/min，离心20min；最后用1mL注射器缓慢吸取上清，使用2μm过滤器过滤。分别吸取350μL液体储存在棕色上样瓶中，-20℃保存。
4.褪黑素回收率测定
随机选取一个血清样品，溶解后吹打均匀，在处理前添加浓度褪黑素至整体到一定浓度，依照步骤3中的方法再进行样品前处理。
5.高效液相色谱法检测
使用1200HPLC系统(品牌：Agilent)进行检测。流动相A和B分别由超纯水和乙腈组成，流动相的流速为1.0mL/min；荧光检测器用于检测褪黑素，激发波长285nm，发射波长345nm。所得结果为每个样品的峰面积。
6.实验结果
6.1标准曲线的绘制
使用高效液相色谱法进行检测，褪黑素出现吸收峰时间在9-12min之间。由表7可知，设置横坐标为褪黑素标准品浓度，纵坐标为机器所得样品峰面积，绘制曲线，y＝0.9914x-0.4009，相关系数R2＝0.9979。
表7使用高效液相色谱法测定不同浓度褪黑素标准品对应的峰面积
Figure BDA0002509323890000081
Figure BDA0002509323890000091
6.2血清稀释不同倍数测定褪黑素含量
随机选取一只羊的血清，分别取出200微升，使用甲醇稀释血清，稀释倍数分别为2、3、4和5倍，上机检测后，通过对应峰面积代入y＝0.9914x-0.4009得到上样瓶中液体褪黑素浓度，再分别乘以样品稀释倍数2、3、4和5，最终得出血清中褪黑素的浓度。由表8可知，选取的这个血清样品稀释不同倍数后，计算得到的褪黑素浓度部分组间有差异，但没有明显的倍数差异。四组血清样品中褪黑素的浓度求平均值得到褪黑素的平均浓度为57.59ppb。
表8血清稀释不同倍数褪黑素含量测定
Figure BDA0002509323890000092
注：肩标不同字母代表差异显著P<0.05，肩标含有相同字母代表差异不显著P>0.05，表2中组别1、2、3差异不显著，组别2、3、4差异不显著，组别1和4差异显著。
6.3血清中添加400ppb褪黑素后褪黑素含量测定
为了排除血清本身含有的褪黑素干扰，取1mL上述实验血清，添加400ng褪黑素，吹打混匀，取出200微升，分别添加200、400、600和800μL甲醇，稀释2、3、4和5倍，继续操作检测。由表9结果得到，用不同体积甲醇稀释血清后，最后换算出待测血清样品中褪黑素浓度在381.69-447.35ppb之间，没有因稀释倍数不同而呈显著倍数差异。当选择57.59ppb为原本血清中含褪黑素的浓度计算时，回收率在81.02％-97.44％之间(回收率＝(样品中褪黑素浓度-样品中褪黑素的平均浓度)/外源褪黑素添加浓度)，回收率都能满足实验要求。
表9血清中添加400ppb褪黑素后稀释不同倍数褪黑素含量测定
Figure BDA0002509323890000101
6.4血清制品稀释倍数为5时褪黑素含量测定
胎牛血清(10091148，Gibco)，按照稀释倍数为5时进行褪黑素含量测定。由表10可知，同样能检测到褪黑素含量。
表10血清制品稀释倍数为5时褪黑素含量测定
胎牛血清 胎牛血清中褪黑素浓度(ppb)
胎牛血清1 12.80
胎牛血清2 14.30
胎牛血清3 15.30
胎牛血清4 12.30
胎牛血清5 12.30
胎牛血清6 22.32
胎牛血清7 9.79
胎牛血清8 13.30
胎牛血清9 10.79
胎牛血清10 14.30
综上可知，血清及其外源添加褪黑素的血清样品，通过使用甲醇进行2倍、3倍、4倍和5倍样品稀释后，混匀离心后所得样品，直接使用液相色谱法进行检测，可以检测到褪黑素含量，褪黑素含量没有因为用甲醇稀释倍数的不同呈现倍数差异，且回收率均在81.02％以上。使用本方法还能检测到血清制品(胎牛血清)中褪黑素含量。因此，可以使用此样品前处理方法，快速准确的测定血清中的褪黑素含量，可操作性强，成本低。
以上所述，仅是对本发明的一般性说明及具体实施方案的描述而已，并非是对本发明作其它形式的限制。任何熟悉本领域的技术人员均可以基于本申请公开的技术内容加以更改或变型为其等同实施例。在不背离本发明的构思和精神的前提下，对本发明进行的任何修改或变型均属于本发明技术方案的保护范围。
本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。

Claims (6)

1.一种高效液相色谱法测定奶和血清及其制品中褪黑素的样品快速前处理方法，其特征在于：包括：使用甲醇稀释样品，将样品稀释成原样品体积的2倍、3倍、4倍和5倍，采用高效液相色谱法分别进行褪黑素测定。
2.如权利要求1所述的高效液相色谱法测定奶和血清中褪黑素的样品快速前处理方法，其特征在于：所述方法具体包括：将待测样品取出，溶解后，吹打均匀，4℃保存备用；取200μL样品，分别添加200、400、600和800μL甲醇，将样品稀释成原样品体积的2、3、4和5倍；漩涡震荡30s；4℃，14000r/min，离心20min；最后用1mL注射器吸取上清，使用2μm过滤器过滤，分别吸取350μL液体储存在棕色上样瓶中，采用高效液相色谱法分别进行褪黑素测定。
3.如权利要求1所述的高效液相色谱法测定奶和血清中褪黑素的样品快速前处理方法，其特征在于：所述样品中添加外源褪黑素。
4.如权利要求1所述的高效液相色谱法测定奶和血清中褪黑素的样品快速前处理方法，其特征在于：所述样品为牛奶，猪家畜乳汁，奶制品，血清或血清制品。
5.如权利要求4所述的高效液相色谱法测定奶和血清中褪黑素的样品快速前处理方法，其特征在于：当样品为牛奶，猪家畜乳汁或奶制品时，将样品稀释成原样品体积的5倍，褪黑素回收率最高，回收率为91.5-134.7％，效果最佳。
6.如权利要求4所述的高效液相色谱法测定奶和血清中褪黑素的样品快速前处理方法，其特征在于：当样品为血清或血清制品时，使用甲醇稀释样品，稀释倍数为2、3、4和5倍时均可得到很好的回收率，回收率为81.02％-97.44％。
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