KR20110120390A

KR20110120390A - 기체크로마토그래피-질량분석기를 이용한 멜라토닌 및 이의 전구체의 동시 분석방법

Info

Publication number: KR20110120390A
Application number: KR1020100039780A
Authority: KR
Inventors: 백만정; 안영환; 이광; 김경례; 조은영; 웬뜩도안; 윤재환; 김남; 최형도; 이윤실; 이재선
Original assignee: 아주대학교산학협력단
Priority date: 2010-04-29
Filing date: 2010-04-29
Publication date: 2011-11-04
Also published as: KR101145057B1

Abstract

본 발명은 기체크로마토그래피-질량분석기를 이용하여, 생체시료로부터 멜라토닌 및 이의 전구체를 동시에 분석하는 방법을 제공하는 것으로, 구체적으로 멜라토닌 및 이의 전구체를 두 번 유도체화 하고 이 때의 반응조건을 조절하여, 생체내에 미량으로 존재하고 있어서 분석이 어려운 멜라토닌과 산화되고 분해되기 쉬운 멜라토닌의 전구체들을 동시에 분석할 수 있는 방법을 제공한다.

Description

기체크로마토그래피-질량분석기를 이용한 멜라토닌 및 이의 전구체의 동시 분석방법{Method for simultaneous analysis of melatonin and its precursor by using gas chromatography-mass spectrometry}

본 발명은 기체크로마토그래피-질량분석기를 이용하여, 생체시료로부터 멜라토닌 및 이의 전구체를 동시에 분석하는 방법에 관한 것이다.

호르몬의 일종으로 포유류의 송과선에서 만들어지는 멜라토닌은, 이의 전구체인 세로토닌과 아세틸세로토닌으로부터 두 단계를 거쳐서 만들어진다. 특히, 멜라토닌은 수면의 조절 기능을 포함하여 생체 리듬, 뇌의 성숙, 면역기능, 항산화, 스트레스, 우울증 및 각종 성인병을 포함한 다양한 질환과 연관성이 있는 것으로 알려져 있다. 이에 따라, 임상 분야에서 생체시료, 예컨대 소변, 혈액 또는 조직으로부터 멜라토닌과 질병과의 체계적이고 복합적인 연구를 위해서는 멜라토닌 이의 전구체들에 대한 정확한 분석이 요구된다.

이러한 멜라토닌 및 이의 전구체에 대한 분석방법과 관련하여, 기체크로마토그래피 또는 기체크로마토그래피-질량분석기를 이용하되, PFP(pentafluoropropionyl) 또는 TMS(trimetylsilyl) 유도체화로 전환한 후, 분석하는 방법이 보고되었다. 예컨대, PFP 유도체로 전환한 후, 크로마토그래피-질량분석기를 사용하거나(Biomedical Chromatography, Covaci A, Doneanu C, Aboul-Enein HY, Schepens P, (1999) 13:431-436; Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, Simonin G, Bru L, LeliE, Jeanniot JP, Bromet N, Walther B, Boursier-Neyret C, (1999) 21:591-601, Biochemical Journal, Zhang H, Akbar M, Kim HY (1999), 344:487-493; Journal of Mass Spectrometry, Eckstein JA, Ammerman GM, Reveles JM, Ackermann BL (2008) 43:782-790), 또는 TMS 유도체로 전환한 후, 크로마토그래피-질량분석기를 사용하는 방법이 보고되었다 (Biomedical Chromatography, Aboul-Enein HY, Doneanu C, Covaci A, (1999) 13:24-26; Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, NLJ, Squella JA, Sturm JC, Baez H, Camargo C, (2001) 26:929-938).

그러나, PFP 유도체를 이용하는 방법의 경우, 멜라토닌과 이의 전구체를 분리하여 각각 분석하는 것으로서 동시 분석방법이 아니므로, 분석이 번거롭고, 시간이 많이 소요되는 문제점을 갖고 있다. 또한 TMS를 이용하는 경우, TMS 유도체가 수분에 약하여 정량분석이 정확하지 않다는 문제점이 있다. 그리고 두 방법 모두 수용액에서 하는 반응이 아니므로, 멜라토닌의 전구체가 시료 전처리 과정에서 산화되거나 분해될 수 있는 문제점이 있다.

한편, ECF(ethyl chlorofomate)와 PFPA(pentafluoropropionic anhydride)를 이용하여 폴리아민의 EOC(ethoxylcarbonyl)/PFP 유도체를 제조하여 이의 정량분석방법(M. J. Paik, D. Kuon, J. Cho K.-R. Kim, Amino Acids (2009) 37:407-413; Man-Jeong Paik, Sunmie Lee, Kyung-Hea Cho, Kyoung-Rae Kim,Analytica Chimica Acta 576 (2006) 55-60)이 보고되었다. EOC 유도체의 경우 정량분석에서 보다 정확한 분석이 가능하다. 그러나, 상기 방법은 ECF로 폴리아민의 유도체를 제조하기 위하여 강염기의 조건에서 수행되어야 하는데, 멜라토닌의 전구체인 세로토닌 및 아세틸세로토닌의 경우 강염기에서 쉽게 산화 또는 분해되므로, 상기의 방법을 그대로 적용할 수 없다.

이에 본 발명자들은, 멜라토닌 및 이의 전구체를 두 번 EOC 유도체화 하는 반응 조건을 최적화하고, 이어서 PFP 유도체를 할 경우, 생체내에 미량으로 존재하고 있어서 분석이 어려운 멜라토닌과 산화되고 분해되기 쉬운 멜라토닌의 전구체들을 동시에 안정적으로 분석할 수 있는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

발명은 기체크로마토그래피-질량분석기를 이용하여, 소변으로부터 멜라토닌 및 이의 전구체를 동시에 분석하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

상기의 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 생체시료를 포함하는 혼합물을 에틸 클로로포메이트(ethyl chloroformate)와 pH 6-8에서 반응시키는 단계(단계 1); 상기 반응물을 에틸 클로로포메이트(ethyl chloroformate)와 pH 11-13에서 반응시키는 단계(단계 2); 상기 반응물을 디에틸 에테르(diethyl ether) 및 에틸 아세테이트(ethyl acetate)를 포함하는 용매로 추출하여 추출물을 제조하는 단계(단계 3); 상기 추출물을 펜타플루오로프로피오닉 앤하이드라이드(pentafluoropropionic anhydride)와 반응시키는 단계(단계 4); 및 상기 반응물을 분석하는 단계(단계 5)를 포함하는 멜라토닌 및 이의 전구체의 동시 분석방법을 제공한다.

상기 단계 1은 생체시료에 포함된 세로토닌, 아세틸세로토닌을 pH 6-8에서 유도체로 전환하는 단계이다. 본 발명에서 사용되는 생체시료는 멜라토닌의 분석이 가능한 시료를 의미하며, 예컨대 소변, 혈액 또는 조직 등을 의미한다. 생체시료에는 멜라토닌과 그 전구체인 세로토닌, 아세틸세로토닌이 포함되어 있는데, 세로토닌과 아세틸세로토닌은 산화되거나 분해되기 쉬우므로, 이를 에틸 클로로포메이트와 반응시켜 유도체로 전환하기 위한 단계이다. 특히, 세로토닌과 아세틸세로토닌을 중성이 아닌 환경, 특히 염기성의 환경에서 전환할 경우에는 산화 또는 분해가 일어나기 때문에, 중성의 환경하에서 수행되는 것이 바람직하다. 바람직하게는 pH 6.5-7.5에서 수행되는 것이 바람직하다.

또한, 상기 단계 1에서 생체시료를 포함하는 혼합물에는 6-클로로멜라토닌(6-chloromelatonin) 및 1,6-디아미노헥산(1,6-diaminohexane) 중 어느 하나 이상이 추가로 포함될 수 있다. 이러한 물질은 최종적으로 정량분석시 내부표준물질로 사용되도록 첨가되는 것이다. 따라서, 최종 분석시 6-클로로멜라토닌 및 1,6-디아미노헥산을 표준물질로 하여, 멜라토닌 및 이의 전구체를 정량분석할 수 있다.

상기 단계 1의 반응은 메틸렌 클로라이드(methylene chloride) 용매하에서 수행되는 것이 바람직하다.

상기 단계 2는, 상기 단계 1에서 반응된 반응물을 에틸렌 클로로포메이트와 pH 11-13에서 반응시켜 세로토닌을 한 번 더 유도화하는 단계이다. 상기 단계 1에서 멜라토닌의 전구체인 세로토닌 및 아세틸 세로토닌이 유도체화 되었기 때문에 염기 조건하에서도 산화 또는 분해가 되지 않는다. 이에 따라 세로토닌이 한 번 더 유도체화되므로, 멜라토닌 및 다른 전구체와 더욱더 구분되어 이후 정확한 정량분석이 가능하다. 상기 단계 2의 반응은 염기조건하에 수행되며, pH 11.5-12.5에서 반응시키는 것이 바람직하다. 상기 염기조건은 NaOH를 첨가하여 조절할 수 있다.

상기 단계 2는 메틸렌 클로라이드 용매하에서 수행되는 것이 바람직하다.

상기 단계 3은, 상기 단계 2에서 반응된 반응물을 디에틸 에테르 및 에틸 아세테이트를 포함하는 용매로 추출하여 추출물을 제조하는 단계이다. 추출에 의하여 반응 후 남아있는 부산물과 불순물을 제거할 수 있어, 보다 정확한 정량분석이 가능하다.

상기 단계 4는, 상기 단계 3에서 제조된 추출물을 펜타플루오로프로피오닉 앤하이드라이드와 반응시키는 단계이다. 상기 반응에 의하여 각 물질들이 PFP 유도체가 되므로, 이후 정확한 정량분석에 사용할 수 있다. 상기 반응은 에틸 아세테이트 용매하에 수행되는 것이 바람직하다.

정확한 정량분석을 위하여, 부산물과 불순물을 제거하기 위하여, 상기 반응 후 0.01M HCl을 넣은 후, 상기 단계 3과 동일한 방법으로 추출하는 것이 바람직하다.

상기 단계 5는, 상기 단계 4에서 제조된 반응물을 분석하는 단계로서, 기체크로마토그래피-질량분석기를 사용하여 멜라토닌 및 이의 전구체를 정확하게 정량분 석할 수 있다.

본 발명에 따른 멜라토닌 및 이의 전구체의 동시 분석방법은, 분석과정에서 산화 또는 분해되기 쉬운 멜라토닌의 전구체인 세로토닌, 아세틸세로토닌을 유도체화 함으로서 안정한 물질로 만들 수 있다는 특징이 있다. 이에 따라, 생체내에 존재하는 미량의 멜라토닌 및 산화 또는 분해되기 쉬운 이의 전구체를 정확하게 정량분석할 수 있으므로, 임상분야에서 유용하게 적용할 수 있다.

도 1은, 본 발명의 분석방법을 화학반응식으로 전체적으로 나타낸 것이다.
도 2는, 본 발명에 따른 분석방법에 의한 아세틸세로토닌 및 세로토닌에 대한 질량스펙트라를 나타낸 것이다.
도 3은, 본 발명에 따른 분석방법에 의하여, 각 성분들에 대한 표준품으로 얻어진 SIM 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 4는, 본 발명에 따른 분석방법에 의하여, 쥐 소변에 대한 SIM 크로마토그램을 나타낸 것이다. 도 4에서 1은 1,6-디아미노헥산을, 2는 멜라토닌을, 3은 6-클로로멜라토닌을, 4는 아세틸세로토닌을, 5는 세로토닌을 의미한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 더욱 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의하여 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

이하에서 제공되는 멜라토닌 및 이의 전구체의 동시 분석방법의 전체적인 과정을 도 1에 나타내었다.

실시예 1 : 첫 번째 EOC 유도체화 반응

ECF(ethyl chloroformate; 50 μL)를 포함하고 있는 메틸렌클로라이드(methylene chloride; 1 mL)에 쥐의 소변(1 mL)과 pH 7.5의 포스페이트 버퍼(phosphate buffer; 1 mL)를 넣어서 소변을 중성의 수용액으로 만들었다.

다음으로, 멜라토닌의 정량분석을 위하여 사용하는 6-클로로멜라토닌(6-chloromelatonin; 500 ng)과, 멜라토닌의 전구체인 세로토닌과 아세틸세로토닌의 정량분석을 위한 1,6-디아미노헥산(1,6-diaminohexane; 200 ng)을 내부표준물질로 첨가하였다. 이 과정에서는 세로토닌과 아세틸세로토닌의 페놀릭 히드록실기를 메틸렌클로라이드층에 들어있는 ECF와 10분간 교반하여 첫 번째 EOC 유도체화를 수행하였다.

실시예 2 : 두 번째 EOC 유도체화 반응

상기 실시예 1에서 반응된 반응물을, 5M NaOH(200 μL)를 사용하여 pH를 12이상으로 높이고, 10% ECF(v/v)가 용해되어 있는 메틸렌클로라이드(0.5 mL)를 넣고 다시 10 분간 교반하여 아민 그룹을 EOC 유도체화 하였다.

실시예 3 : 추출

상기 실시예 2에서 반응된 반응물을, NaCl로 포화시켜 디에틸 에테르(diethyl ether; 2 mL)와 에틸 아세테이트(ethyl acetate; 2 mL)를 이용하여 추출한 후, 40℃ 질소 기류하에서 건조하여 추출물을 수득하였다.

실시예 4 : PFP 유도체화 반응

상기 실시예 3에서 수득한 추출물에, 펜타플루오로프로피오닉 앤하이드라이드(pentafluoropropionic anhydride; 30 μL) 및 에틸 아세테이트(ethyl acetate; 30 μL)를 혼합한 후, 60℃에서 30분간 반응시켜 유도체화함으로서 반응을 완결시켰다. 최종적으로, 멜라토닌은 mono-N-PFP, 아세틸세로토닌은 mono-O-EOC-mono-N-PFP, 세로토닌은 di-(N,O)-EOC/di-N-PFP, 1,6-디아미노헥산은 di-N-EOC/di-N-PFP, 그리고 6-클로로멜라토닌은 mono-N-PFP로 되었다.

실시예 5 : 정량분석

실시예 4에서 제조된 반응물로부터, 반응 후에 남아 있는 부산물과 불순물이 컬럼과 분석에 영향을 주기 때문에 제거시키는 추출과정을 실시하였다. 즉, 0.01M HCl(200 μL)을 넣고 NaCl로 포화시킨 후, 디에틸 에테르(2 mL)와 에틸 아세테이트(2 mL)를 이용하여 실시하였다. 반응된 물질을 포함하고 있는 추출물을 40℃ 질소 기류하에서 완전히 건조하여 톨루엔(40 μL)에 용해시켜 기체크로마토그래피-질량분석기에 주입할 시료를 완성 하였다.

상기 정제된 멜라토닌과 그것의 전구체들인 세로토닌 및 아세틸세로토닌 유도체의 분석은 기체 크로마토그래피-질량분석기를 사용하여 수행하였다. 사용된 분석 장비는 에이질런트(Aiglent)사의 5975B 질량분석기와 여기에 연결된 6890N 기체 크로마토그래프이다. 사용된 이온화 방법은 전자충격법(electron impact, EI)이며 이온원의 온도는 230 ℃이었다. 컬럼은 길이가 25 m, 내경이 0.20 ㎜, 필름 두께가 0.11 μm인 Ultra 2 컬럼을 사용하였고, 이동상 기체로는 헬륨을 사용하였으며, 유속은 0.5 mL/min이었고, 주입 방식은 1:10의 분할 형식(split mode)을 이용하였다. 컬럼의 온도는 초기에 140 ℃에서 1분간 머무른 후, 20 ℃/min 속도로 200℃까지 승온시키고, 이어서 260℃까지 10 ℃/min으로 승온시켰다. 최종적으로 300℃까지 30 ℃/min으로 승온 시켜 5분 동안 머물게 하였다. 시료 주입구의 온도는 260℃이었으며, 연결 장치의 온도는 300℃이었다. 정량을 위하여 SIM(Selected Ion Monitoring) 모드를 사용하였다. 특히 SIM 모드를 이용하여 검출하면 감응도가 더욱 증가하게 되고 시료 중의 다른 방해 물질들에 의한 영향도 줄어들기 때문에 상기 방법을 이용하였다.

상기 분석결과를 하기 표 1에 나타내었으며, 선택된 이온들 중에서 진하게 표시한 이온은 정량이온으로 사용되었다. 특히 아세틸세로토닌 및 세로토닌에 대한 질량스펙트라를 도 2에 자세히 나타내었으며, 본 발명에 의하여 세로토닌과 아세틸세로토닌의 질량스펙트럼이 새롭게 구축되었다. 또한 각 성분들에 대한 표준품으로 얻어진 SIM 크로마토그램을 도 3에 나타내었다.

성분	선택된 이온 (m/z)
멜라토닌	317, 360, 361
아세틸세로토닌	346, 374, 418
세로토닌	292, 305, 333
1,6-diaminohexame (내부표준물질)	244, 289, 433
6-chloromelatonin (내부표준물질)	375, 394, 396

실시예 6 : 정량분석의 신뢰도 측정

멜라토닌 및 이의 전구체에 대한 소변 중의 농도를 측정하기 위해서, 검정 곡선을 작성하였다.

소변 시료에 각 표준 용액을 농도별로 첨가하고, 이를 본 발명의 방법에 따라 분석하여 각각에 대하여 검정 곡선을 얻었다. 구체적으로 검정 곡선의 작성 방법은 다음과 같다. 멜라토닌의 소변 중 농도가 0.05-10.0 ng/mL, 아세틸세로토닌은 0.25-100.0 ng/mL, 세로토닌은 0.25-500 ng/mL이 되도록 표준물 혼합 용액을 소변 시료에 첨가하고, 내부표준물질인 6-클로로멜라토닌(500 ng)과 1,6-디아미노헥산(200 ng)을 첨가한 후, 실시예 1 내지 4의 방법에 따라 처리하였다. 이를 기체크로마토그래피-질량분석기로 분석하여 검정 곡선을 얻은 결과, 멜라토닌은 상관계수 r이 0.998 이었고 아세틸세로토닌과 세로토닌의 경우는 각각 0.996과 0.997로 모든 성분에서 신뢰할 수 있는 결과를 얻었다. 검출 한계는 멜라토닌의 경우는 0.005 ng/mL이었고, 아세틸세로토닌과 세로토닌은 각각 0.03 ng/mL과 0.02 ng/mL로 나타나서 소변 시료에 존재하는 각 성분들을 검출하기 위하여 충분한 감도를 나타내었다. 시료 전처리 과정에서 모든 성분들에 대한 재현성은 %RSD(relative standard deviation)가 9.4%이하였고, 정확도에서 %RE(relative error)는 -8.8 내지 7.5로 나타났다. 따라서, 본 발명에 따른 분석방법이 신뢰할 수 있음을 확인하였다.

실시예 7 : 쥐 소변에 대한 분석

본 발명의 분석방법을 11마리의 쥐 소변에 적용하였다. 소변에서 모든 성분에 대한 분리된 SIM 크로마토그램을 도 4에 나타내었다. 도 4에서 1은 1,6-디아미노헥산을, 2는 멜라토닌을, 3은 6-클로로멜라토닌을, 4는 아세틸세로토닌을, 5는 세로토닌을 의미한다.

도 4에 나타난 바와 같이, 멜라토닌은 24시간 동안 채취한 소변으로 환산하여 계산한 결과, 총 1.33±0.83 ng임을 확인할 수 있었으며, 멜라토닌의 전구체인 세로토닌과 아세틸세로토닌은 각각 52.5±11.8 μg과 0.7±0.3 μg임을 확인할 수 있었다. 따라서 본 발명에 따라 소변으로부터 멜라토닌 및 이의 전구체를 동시에 선택적이고 정확하게 검출할 수 있음을 확인할 수 있었다.

Claims

생체시료를 포함하는 혼합물을 에틸 클로로포메이트와 pH 6-8에서 반응시키는 단계(단계 1);
상기 반응물을 에틸 클로로포메이트와 pH 11-13에서 반응시키는 단계(단계 2);
상기 반응물을 디에틸 에테르 및 에틸 아세테이트를 포함하는 용매로 추출하여 추출물을 제조하는 단계(단계 3);
상기 추출물을 펜타플루오로프로피오닉 앤하이드라이드와 반응시키는 단계(단계 4); 및
상기 반응물을 분석하는 단계(단계 5)를 포함하는 멜라토닌 및 이의 전구체의 동시 분석방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 1은 pH 6.5-7.5에서 반응시키는 것을 특징으로 하는 동시 분석방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 2는 pH 11.5-12.5에서 반응시키는 것을 특징으로 하는 동시 분석방법.
제3항에 있어서, 상기 단계 2는 NaOH를 첨가하여 pH를 조절하는 것을 특징으로 하는 동시 분석방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 1은 메틸렌 클로라이드 용매하에서 수행되는 것을 특징으로 하는 동시 분석방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 2는 메틸렌 클로라이드 용매하에서 수행되는 것을 특징으로 하는 동시 분석방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 4의 반응은 에틸 아세테이트 용매하에 수행되는 것을 특징으로 하는 동시 분석방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 4의 반응 후 디에틸 에테르 및 에틸 아세테이트를 포함하는 용매로 추출하여 추출물을 제조하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 동시 분석방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 5는 기체 크로마토그라피-질량분석기로 분석하는 것을 특징으로 하는 동시 분석방법.
제1항에 있어서, 상기 생체시료는 소변, 혈액 또는 조직인 것을 특징으로 하는 동시분석방법.
제1항에 있어서, 상기 생체시료를 포함하는 혼합물은 6-클로로멜라토닌 및 1,6-디아미노헥산 중 어느 하나 이상을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 동시분석방법.