KR100745098B1 - 가스크로마토그래피/이온포획검출기를 이용한클로티아제팜의 분석방법 - Google Patents

가스크로마토그래피/이온포획검출기를 이용한클로티아제팜의 분석방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 가스크로마토그래피/이온포획검출기를 이용한 클로티아제팜의 분석방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 클로티아제팜이 포함된 시료에 내부표준물질을 가하고 시료의 pH를 알칼리성으로 조절하고 디에틸에테르를 가하여 추출한 후, 디에틸에테르층을 농축한 잔사에 메탄올 또는 에틸아세테이트를 가하여 가스크로마토그래피/이온포획검출기(gas chromatography/ion-trap detactor)에 주입하는 단계를 포함하는 클로티아제팜의 분석방법에 대한 것이다.
본 발명의 클로티아제팜 분석방법은 종전의 방법과 비교하여 매우 신속, 간편하고 정확하게 시료 내 극미량 존재하는 클로티아제팜을 측정할 수 있어서, 안티도핑 및 임상분야, 약리학, 약제학 또는 약물체내동태학 분야 등에 유용하게 사용될 수 있다.
클로티아제팜

Description

가스크로마토그래피/이온포획검출기를 이용한 클로티아제팜의 분석방법{Analytical method for clotiazepam by using gas chromatography/ion-trap detector}
도 1은 클로티아제팜 및 내부표준물질로 사용된 다이아제팜의 이온 크로마토그램을 나타낸 것이다 (CTP, clotiazepam (m/z 289); DIP, diazepam (m/z 256)). A) 피험자 공 시료(blank sample)
B) 클로티아제팜 및 디아제팜의 표준품 (각 50 ng)을 공 시료에 첨가하여 얻은 이온 크로마토그램
C) 피험자에게 클로티아제팜 5 mg을 복용하게 하고 0.5시간 후 얻은 혈액시료
도 2는 본 발명의 분석방법에 따라서 내부 표준물질에 대한 클로티아제팜의 피크 면적비를 클로티아제팜 농도 5-200 ng/ml의 범위에서 측정한 결과 얻은 검량선이다.
도 3에는 클로티아제팜 5 mg을 단회 경구투여 투여한 8명의 피험자로부터 얻은 시료를 본 발명의 분석방법에 의하여 분석하여 시간에 따른 클로티아제팜의 평균 혈중 농도(평균 ± 표준편차)를 도시하였다.
본 발명은 가스크로마토그래피/이온포획검출기를 이용한 클로티아제팜의 분석방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 클로티아제팜이 포함된 시료에 내부표준물질을 가하고 시료의 pH를 알칼리성으로 조절하고 디에틸에테르를 가하여 추출한 후, 디에틸에테르층을 농축한 잔사에 메탄올 또는 에틸아세테이트를 가하여 가스크로마토그래피/이온포획검출기(gas chromatography/ion-trap detactor)에 주입하는 단계를 포함하는 클로티아제팜의 분석방법에 대한 것이다.
클로티아제팜 (clotiazepam; 1-Methyl-5-o-chlorophenyl-7-ethyl- 1,2-dihydro-3H-thieno[2,3-e],[1,4]-diazepin-2-one)은 최근에 개발된 티에노디아제핀(thienodiazepine) 계열의 안정제, 항우울제 또는 수면제로서, 벤젠핵 대신에 티오펜(thiophene)핵이 디아제핀 고리에 연결되어 있다는 점에서 기존에 널리 사용되어 왔던 디아제핀 계열 약물과 구조상 차이가 있다. 클로티아제팜은 불안, 긴장, 우울, 불면, 또는 간질 등에 광범위하게 사용되고 있으나, 투여용량이 1 회 5-10 mg으로 매우 작고, 환자의 혈중농도 또한 매우 낮아서, 약물 분석을 위해서 고감도 분석방법이 필요하다.
종래에 개발된 클로티아제팜 분석 방법으로는 고성능 액체크로마토그래피/다 이오드 어레이 검출기(HPLC/DAD)(Shimamine, M., Masunari, T., and Nakahara, Y., Eisei Shikenjo Hokoku, 111, 47-56, 1993) 및 박층 밀도측정기(thin-layer densitometry) (Busch, M., Ritter, W., and Mohrie, H., Arzneimittelfirschung, 35(2), 547-551, 1985)를 이용한 연구가 보고된 바 있다.
또한, 가스크로마토그래피를 이용한 방법으로는, 가스크로마토그래피/전자-포획검출기(gas chromatography (GC)/electron-capture detector) 또는 가스크로마토그래피/질소-인 검출기(GC/nitrogen-phosphorus detector)를 이용한 방법들이 알려져 있다(Gaillard, Y., Gay-Montchamp, J. P., and Ollagnier, M., J. Chromatogr. 622(2), 197-208, 1993; Arendt, R., Ochs, H. R., and Greenblatt, D.J., Arzneimittelfirschung, 32(4), 453-455, 1982).
한편, 가일라드 등은 고상추출법으로 C8 캐트리지에 시료를 넣고 0.5% 초산 메탄올용액으로 유리시켜 가스크로마토그래피/질량분석기로 분석하는 방법을 개시한 바 있으나(Gaillard, Y., Gay-Montchamp, J. P., and Ollagnier, M., J. Chromatogr. 622(2), 197-208, 1993), 추출단계가 복잡한 단점이 있다.
가스크로마토그래피/질량분석기를 이용한 다른 방법으로, 카르발호 등이 개시한 방법에서는, 시료에 0.1 M 수산화나트륨, 0.1 M 붕산 및 포타슘 클로라이드를 넣고 증류수로 희석한 후 tert-부틸메틸 에테르로 추출하고 유기용매층에 2 M 염산용액을 가하여 산성용액을 취한 후 여기에 다시 에테르를 넣고 진탕하였다. 그 후, 2 M 수산화나트륨으로 수용액 층을 알칼리성으로 한 후 에테르로 추출하고 잔사를 에틸아세테이트로 녹여서 가스크로마토그래피/질량분석기로 분석하였다. (Carvalho, L. M. L., Linhares, A. X., and Trigo, J. R., Forensic Science International 120, 140-144, 2001). 또한, 마우러 등은 뇨 시료를 염산용액으로 가수분해시켜 알칼리성 pH에서 디클로로메탄/이소프로파놀/에틸아세테이트(1:1:3) 혼합용액 10 ml로 추출하고 증발시킨 잔사에 아세틸레이션 반응을 시켜 가스크로마토그래피/질량분석기로 클로티아제팜의 농도를 분석하였다(Maurer, H. and Pfleger, K., J. Chromatogr. 422, 85-101, 1987). 그러나, 이 방법들은 가수분해 및 유도체화 반응을 포함하여 매우 복잡한 여러 단계를 포함하고 있고, 혈중농도 분석에 응용하기에는 감도에 문제가 있다.
특히, 종래에 알려진 클로티아제팜의 분석방법들을 분석감도 측면에서 살펴보면, 상기 아렌트 등(Arendt et al)은 5 ng/ml을, 피르네이 등(Pirnay, S., Ricordel, I., Libong, D., and Bouchonnet, S., J. Chromatogr. A, 954, 235-245, 2002)은 100 ng/ml을 검출한계 농도로 보고하고 있어서 클로티아제팜의 체내동태연구를 위해서 극미량의 클로티아제팜을 측정할 수 있는 고감도의 분석방법 개발이 당업계에서 요구되어 왔다.
이에, 본 발명자들은 가스크로마토그래피/이온포획검출기를 이용하여 극미량의 클로티아제팜을 간편한 방법으로 신속, 정확하게 분석할 수 있음을 확인하고 이를 이용하여 피험자로부터 얻은 시료를 분석하여 체내동태 파라미터를 구하는데 성공함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 극미량의 클로티아제팜을 간편한 방법으로 신속, 정확하게 분석하기 위하여 디에틸에테르를 이용한 액체-액체 추출법을 사용하여 아세틸레이션 유도체 등을 거치지 아니하고 직접 가스크로마토그래피/이온포획검출기(gas chromatography/ion-trap detactor)를 이용한 클로티아제팜의 분석방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 클로티아제팜의 분석방법을 이용하여 클로티아제팜의 농도와 피크 면적비간의 검량선식을 구하고 이를 이용하여 시료 중의 클로티아제팜의 농도 및 체내동태 파라미터를 구하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 클로티아제팜이 포함된 시료에 내부표준물질을 가하는 단계, 시료의 pH를 알칼리성으로 조절하고 추출용매로 디에틸에테르를 가하여 추출하는 단계, 디에틸에테르층를 취하여 농축시키는 단계 및 농축된 잔사에 메탄올 또는 에틸아세테이트를 가하여 가스크로마토그래피/이온포획검출기(gas chromatography/ion-trap detactor)에 주입하는 단계를 포함하는 클로티아제팜의 분석방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 기지 농도의 클로티아제팜이 포함된 시료를 이용하여 상기 분석방법에 따라서 클로티아제팜 및 내부표준물질의 이온 크로마토그램을 얻는 단계, 클로티아제팜의 농도와 내부표준물질에 대한 클로티아제팜의 피크 면적비간의 검량선식을 구하는 단계, 미지 농도의 클로티아제팜이 포함된 시료를 상기 분석방법에 따라서 처리하여 클로티아제팜 및 내부표준물질의 이온 크로마토그램을 얻는 단계 및 얻어진 내부표준물질에 대한 클로티아제팜의 피크 면적비를 검량선식에 대입하여 시료 중의 클로티아제팜 농도 및 체내동태 파라미터를 구하는 단계를 포함하는 미지 시료 중의 클로티아제팜 농도 및 체내동태 파라미터의 산출 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 클로티아제팜 분석방법은,
1) 클로티아제팜이 포함된 시료에 내부표준물질을 가하는 단계,
2) 시료의 pH를 알칼리성으로 조절하고 추출용매로 디에틸에테르를 가하여 추출하는 단계,
3) 디에틸에테르층을 취하여 농축시키는 단계, 및
4) 농축된 잔사에 메탄올 또는 에틸아세테이트를 가하여 가스크로마토그래피/이온포획검출기(gas chromatography/ion-trap detactor)에 주입하는 단계를 포함한다.
본 발명에서 클로티아제팜이 포함된 시료는 클로티아제팜이 포함된 모든 시료가 가능하며 바람직하게는 혈액 또는 뇨이다. 상기 시료는 시료에 따라서 적절한 전처리를 행하는 것이 바람직한데, 특히 시료가 혈액인 경우 혈청을 분리하여 냉동 보관하는 것이 바람직하다.
구체적으로 시료가 혈액인 경우 헤파린을 미리 넣어놓은 원심분리 튜브에 채취한 혈액을 넣고 3000 rpm에서 15분간 원심분리하여 얻은 혈청을 혈청분리관에 옮겨 담아 분석시까지 -20℃에 보관한 후, 혈청을 녹여서 1ml 정도를 취하여 분석에 사용할 수 있다.
상기 단계 1)에서 내부표준물질로는 클로티아제팜과 유사한 구조를 갖는 여러 가지 벤조디아제핀 계열의 약물이 모두 사용될 수 있으나, 검출기에 대한 반응 및 칼럼유지시간을 고려할 때 디아제팜이 가장 바람직하다.
상기 단계 2)에서 시료의 pH를 알칼리성으로 조절하기 위한 염기로는 다양한 무기 염기들이 사용될 수 있으나, 바람직하게는 소디움 바이카보네이트가 사용된다. 시료의 pH는 바람직하게는 pH9.5~10으로 조절된다.
본원 발명의 분석방법에 따르면, 시료는 그 pH를 알칼리성으로 조절하면서 직접 디에틸에테르로 추출된다. 상기 추출은 당업계에 알려져 있는 다양한 방법에 의하여 행하여질 수 있으며, 예를 들면 진탕기(shaker)가 이용될 수 있다.
단계 3)에서는 추출 후 디에틸에테르층을 취하여 농축시킨다. 디에틸에테르는 예를 들면, 원심분리를 통하여 분리될 수 있지만 이에 한정되지는 아니한다. 원심분리를 이용하는 경우, 원심분리를 마친 튜브를 냉동고에 넣어 수층을 얼린 후 분리한 유기용매 층을 질소-증발기(N2-Evaporator)에서 질소기류 하에서 농축시킬 수 있다. 바람직하게는, 상기 튜브를 P2O5/KOH가 들어있는 데시케이터에서 적어도 3 시간 방치하여 튜브에 남아있는 미량의 수분을 제거한다.
단계 4)에서는 농축된 잔사에 메탄올 또는 에틸아세테이트를 가하고 가스크 로마토그래피/이온포획검출기(gas chromatography/ion-trap detector)에 주입한다.
농축된 잔사를 용해시키기 위하여 메탄올 또는 에틸아세테이트가 사용될 수 있으나, 바람직하게는 메탄올이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 미지 시료 중의 클로티아제팜 농도 및 체내동태 파라미터의 산출 방법은,
1)기지 농도의 클로티아제팜이 포함된 시료를 이용하여 상기 분석방법에 따라서 클로티아제팜 및 내부표준물질의 이온 크로마토그램을 얻는 단계;
2)클로티아제팜의 농도와 내부표준물질에 대한 클로티아제팜의 피크 면적비간의 검량선식을 구하는 단계;
3)미지 농도의 클로티아제팜이 포함된 시료를 상기 분석방법에 따라서 처리하여 클로티아제팜 및 내부표준물질의 이온 크로마토그램을 얻는 단계; 및
4)얻어진 내부표준물질에 대한 클로티아제팜의 피크 면적비를 검량선식에 대입하여 시료 중의 클로티아제팜 농도 및 체내동태 파라미터를 구하는 단계를 포함한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> GC/ITD 조건 확립
클로티아제팜이 들어있지 않는 혈청시료 1 ㎖을 15 ㎖ 튜브(Corning disposable tube)에 넣었다. 여기에 표준물질인 클로티아제팜(Sigma, St.Louis, MI, USA)을 0, 2, 5, 10, 20, 50, 100 또는 200 ng/㎖로 첨가한 후, 분석을 보다 정확하고 정밀하게 하기 위해 내부표준물질로 디아제팜 (10 ㎍/㎖)을 20 ㎕를 넣어 200 ng이 되도록 혼합하였다.
상기 혼합용액에 디에틸에테르 (J.T.Baker, Phillipsburg, NJ, USA)을 5 ㎖ 첨가하여 혼합한 후 20분 동안 진탕기(7400 Tubingen, Edmund Buchler, Germany)에서 혼합하고, 3000 rpm에서 원심분리(Varifuge 3.0, Heraeus, Germany)하였다. 상기 원심분리 후 이 튜브를 냉동고(-30℃, Ecoline REIII2, Lauda, Germany)에 넣어 수층을 얼린 후 상등액을 취하여 질소-증발기(Zymark, USA)에서 질소 가스를 이용해 상기 용출된 용액을 증발, 농축시켰다.
얻어진 잔사에 메탄올 용액 50 ㎕를 넣어 용해시켰다. 이 용액을 파스퇴르 피펫(pasteure pippette)을 사용하여 조심스럽게 자동샘플러(autosampler)용 바이알(vial)에 옮겨 넣었다. 상기 바이알에 옮겨진 용액 1-2 ㎕를 자동샘플러(autosampler)를 사용하여 하기와 같은 조건에서 가스크로마토그래피/이온포획검출기(GC/ITD)에 주입하여 시료 중 클로티아제팜의 농도를 분석하였다.
<GC/ITD 조건>
GC/ITD 기기: Poralis Q/Trace GC (Thermo Finnigan, Austin, TX, USA)
검출기: Ion-trap detector, SIM mode
Autosampler: AI 3000 (Thermo Finnigan, Austin, TX, USA)
ChemStation : Thermo Finnigan사의 X-Calibur
칼럼: Ultra-1 (Part # 19091A-105; 50 m length x 0.2 mm inner diameter x 0.33 ㎛ film thickness, Agilent Technologies, USA)
칼럼 오븐 온도: 120℃/(30℃/min)/220℃ (1 min)/(10℃/min)/300℃ (2 min)
주입구 온도: 310℃ (Splitless mode)
Transferline 온도: 300℃
검출기 온도: 250℃
이동상: He (99.999%)
유속: 0.8 ㎖/min
이온화 에너지 및 mode: 70 eV, Electron impact
<실시예 2: 검량선 작성 및 검량선식 계산>
실시예 1에 따른 조건으로 GC/IFD 분석을 행하여 클로티아제팜 및 내부표준물질로 사용된 디아제팜의 이온크로마토그램을 얻었다(도 1). 그 결과, 표준물질 및 내부표준물질의 피크가 기타 혈청성분과 잘 분리되어 나타나서 본 발명의 분석 방법이 클로티아제팜의 분석에 특이성이 있음을 확인할 수 있었다.
또한, 이온크로마토그램 상의 피크를 이용해 내부표준물질(diazepam)의 특정이온 (m/z 256) 크로마토그램의 피크(peak) 면적에 대한 표준물질(clotiazepam)의 특정이온 (m/z 289) 크로마토그램의 피크 면적비를 가지고 검량선을 작성하였다(도 2).
검량선식은 하기 수학식 1과 같이 계산되었으며, 5∼200 ng/㎖의 클로티아제팜 농 도 범위에서 직선에 대한 상관계수(relative coefficient, r2)가 0.9993으로 매우 높게 나타나서 본 발명의 분석방법이 정량분석에 적절함을 알 수 있었다.
<수학식 1>
Y=0.0091 X - 0.0157
(상기에서, X= 클로티아제팜의 농도, Y= 내부표준물질(diazepam)의 특정이온 크로마토그램의 피크(peak) 면적에 대한 표준물질(clotiazepam)의 특정이온 크로마토그램의피크 면적비)
<실시예 3: 분석방법의 정밀성 및 정확성 확인>
실시예 1에 따라서, 하루에 실험을 5번 시행하여 일내 재현성을 구하였고 5일간 실험을 행하여 일간 재현성을 구하였다.
표 1에서 알 수 있듯이, 분석방법의 정밀성 변동계수(Coefficient of variation, CV)%는 일내 정밀성이 8.2% 이하(정량한계농도에서의 일내 정밀성 8.2%)이였고, 일간 정밀성은 7.0% 이하(정량한계농도에서의 일간 정밀성은 7.0%)이였으며, 일내 정확성은 10.2%이하, 일간 정확성은 13.8% 이하로 나타나서, 본 발명의 분석방법이 정밀성 및 정확성이 우수함을 확인할 수 있었다.
[표 1] 혈청 중 클로티아제팜 농도 분석에 있어서 정밀도와 정확도
Figure 112004060742401-pat00001
<실험예 1> 혈액 시료 내 클로티아제팜 농도 측정
1) 클로티아제팜 복용 및 혈액시료 채취
의사 및 연구책임자의 관리하에 8명의 피험자에게 클로티아제팜(clotiazepam) 5 ㎎을 경구 복용시키고 0, 0.17, 0.33, 0.5, 1, 1.5, 2, 4, 8, 12, 24 및 36시간에 걸쳐 각각 혈액 약 8 ㎖을 채취하였다. 채취한 혈액을 3000 rpm에서 15분간 원심분리한 후 혈청을 취하여 측정할 때까지 -20℃에서 보관하였다.
2) 혈청시료의 처리 및 혈청 중 클로티아제팜의 농도 계산
상기 1)에서 피험자로부터 각 시간별로 채취하여 -20℃에 보관했던 혈청시료를 실온에 방치하여 녹인 후 진탕한 다음 이 혈청 시료를 1 ㎖ 취하여 상온에서 30분간 방치하였다. 이 시료는 상기 실시예 1에서 확인한 최적 조건으로 GC/IFD에 주입한 후 혈청 시료 중의 클로티아제팜의 농도를 계산하였다. 혈청 시료 중 클로 티아제팜의 농도 계산은 GC/IFD에서 얻은 이온 크로마토그램으로부터 내부표준물질의 이온크로마토그램의 피이크면적에 대한 클로티아제팜의 이온크로마토그램의 피이크 면적비를 구하여 미리 작성한 검량선(수학식 1 참조)을 이용하여 혈청 중 클로티아제팜의 농도를 구하였다.
3) 분석방법의 감도 확인 및 체내동태 파라미터 계산
2)에서 클로티아제팜의 농도를 구한 결과, 클로티아제팜을 투여한 후 모든 시료에서 클로티아제팜을 분석하는 것이 가능함을 알 수 있었다. 즉, 36시간까지의 시간에 따른 혈중농도 곡선하에서의 면적(AUCt→36 hr)은 무한대 시간까지의 시간에 따른 혈중농도 곡선하에서의 면적(AUC∞)의 88.7% 정도로 나타나서, 현재의 정량한계 농도 범위에서는 채혈시간을 36시간까지 하는 것이 충분함을 알 수 있었다.
또한, 정량한계농도는 5 ng/㎖ (검출한계농도 약 1 ng/ml) 나타나서 기존의 방법보다 감도가 우수함을 알 수 있었다(도 3).
한편, 클로티아제팜의 농도로부터 체내동태 파라미터를 계산한 결과, 최대 혈중농도가 나타나는 시간(Tmax)는 0.56시간이었고, 제거 또는 배설이 되는 시간의 반감기(t1/2)는 11.52시간이며, 최대 혈중농도(Cmax)는 158.6 ng/㎖로 계산되었다(표 2).
[표 2]클로티아제팜 5 mg을 투여한 피험자에서 얻은 생체이용률 파라미터 (n=8 피험자)
Figure 112004060742401-pat00002
AUCt=36hr: 0에서 36시간까지의 시간에 따른 혈중농도 곡선하의 면적(Area Under the Curve from 0 to 36 hr)
AUC∽: 0에서 무한대(∽)시간까지의 시간에 따른 혈중농도 곡선하의 면적(Area Under the Curve from 0 to ∽hr)
Cmax: 최대혈중농도(Maximum concentration)
Tmax: 최대혈중농도가 나타나는 시간(Time at the maximum concentration)
Ke : 제거(배설)가 일어나는 상에서의 배설속도 상수(Excretion rate constant)
t1/2: 제거 반감기(Half-life)
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 GC/IFD 측정방법을 이용하면 신속, 정확하게 극미량의 클로티아제팜 혈중농도를 측정할 수 있어 안티도핑, 임상학, 약리학, 약제학 및 약물체내동태학 분야등에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (5)

1) 클로티아제팜이 포함된 시료에 내부표준물질을 가하는 단계,
2) 시료의 pH를 알칼리성으로 조절하고, 추출용매로 디에틸에테르를 가하여 추출하는 단계,
3) 디에틸에테르층을 분리하여 농축시키는 단계, 및
4) 농축된 잔사에 메탄올 또는 에틸아세테이트를 가하여 가스크로마토그래피/이온포획검출기(gas chromatography/ion-trap detactor)에 주입하는 단계를 포함하는 클로티아제팜의 분석방법.
제1항에 있어서, 상기 시료가 뇨 또는 혈액인 것을 특징으로 하는 클로티아제팜의 분석방법.
제1항에 있어서, 상기 내부표준물질이 디아제팜(diazepam)인 것을 특징으로 하는 클로티아제팜의 분석방법.
제1항에 있어서, 상기 2)단계의 pH 조절이 1M 소디움 카보네이트를 이용하여 pH 9.5~10으로 조절되는 것임을 특징으로 하는 클로티아제팜의 분석방법.
1) 기지 농도의 클로티아제팜이 포함된 시료를 이용하여 제1항의 분석방법에 따라서 클로티아제팜 및 내부표준물질의 이온 크로마토그램을 얻는 단계;
2) 클로티아제팜의 농도와 내부표준물질에 대한 클로티아제팜의 피크 면적비간의 검량선식을 구하는 단계;
3) 미지 농도의 클로티아제팜이 포함된 시료를 제1항의 분석방법에 따라서 처리하여 클로티아제팜 및 내부표준물질의 이온 크로마토그램을 얻는 단계; 및
4) 상기 3)단계에서 얻은 내부표준물질에 대한 클로티아제팜의 피크 면적비를 2)단계에서 얻은 검량선식에 대입하여 시료 중의 클로티아제팜 농도 및 체내동태 파라미터를 구하는 방법.
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