CN114137105A

CN114137105A - 液相色谱串联质谱法分析样品中褪黑素含量的方法

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Publication number: CN114137105A
Application number: CN202111348295.8A
Authority: CN
Inventors: 丛慧敏; 水明; 苏燊; 吕行; 薛文强; 麻柱; 郭刚; 马慧; 张红涛; 刘林; 乔为仓; 白萨茹拉; 吴翠玲; 张雪林; 高星; 谢凯丽; 赵丽娟; 吴东冬; 李琪琪; 代晶晶
Original assignee: BEIJING DAIRY CATTLE CENTER
Current assignee: BEIJING DAIRY CATTLE CENTER
Priority date: 2021-11-15
Filing date: 2021-11-15
Publication date: 2022-03-04
Anticipated expiration: 2041-11-15
Also published as: CN114137105B

Abstract

本发明公开了液相色谱串联质谱法分析样品中褪黑素含量的方法，所述方法包括如下步骤：A)配制不同浓度的褪黑素标准品溶液，进行液相色谱串联质谱检测；并根据液相色谱串联质谱检测结果，确定定性离子和/或定量离子；B)以所述褪黑素标准品溶液的浓度作为横坐标，以所述定量离子的峰面积作为纵坐标，绘制标准曲线；C)对待测样品进行预处理，然后采用与步骤A)相同的方法进行液相色谱串联质谱检测；D)根据待测样品的检测结果，对照所述标准曲线，获得所述待测样品中褪黑素的浓度，从而实现对样品中褪黑素的定量检测。本发明还提供了该测定方法在测定牛奶中褪黑素含量的应用，所述方法中褪黑素定量限为10pg/g，褪黑素的检出限为5pg/g。

Description

液相色谱串联质谱法分析样品中褪黑素含量的方法

技术领域

本发明涉及褪黑素的测定方法，具体涉及液相色谱串联质谱法分析样品中褪黑素含量的方法。

背景技术

褪黑素是人体松果体分泌的一种重要激素，它的合成与分泌控制了人体的一系列生理活动，如生物节律、睡眠等。此外，在衰老过程中，褪黑素是体内一种重要的抗氧化剂，并被认为是“迄今发现的最有效的羟基自由基生理清除剂”。

随着人民生活水平提高以及健康理念的提升，对安全的食补方式越来越重视，而褪黑素作为重要的抗氧化剂，在食物中的含量测定越来越被关注。牛奶作为日常常见的饮品含有丰富的钙离子等矿物质元素、人体必需氨基酸、蛋白质等对人体有益的成分。近年来研究发现牛奶中含有褪黑素成分，从而有促进睡眠的功效。而牛奶中褪黑素含量的测定方法也被广泛关注，现行有效的团体标准(编号为T/BDAS001-2021)给出了液相色谱串联质谱测定牛奶中含量的方法，该方法的检出限为0.04μg/L，定量限为0.10μg/L。

发明内容

本发明的目的是提供检测灵敏度更高的牛奶中褪黑素的检测方法。

为实现上述目的，第一个方面本液相色谱串联质谱法测定褪黑素的方法，所述方法可包括如下步骤：

A)配制不同浓度的褪黑素标准品溶液，进行液相色谱串联质谱检测；并根据液相色谱串联质谱检测结果，确定定性离子和/或定量离子；

B)以所述褪黑素标准品溶液的浓度作为横坐标，以所述定量离子的峰面积作为纵坐标，绘制标准曲线；

C)对待测样品进行预处理，然后采用与步骤A)相同的方法进行液相色谱串联质谱检测；

D)根据待测样品的检测结果，对照所述标准曲线，获得所述待测样品中褪黑素的浓度，从而实现对样品中褪黑素的定量检测；

所述液相色谱串联质谱中的液相色谱所采用的的洗脱程序为梯度洗脱，所述梯度洗脱可包括如下三步洗脱：

1)用由流动相A和流动相B组成的名称为75％A+25％B的流动相进行第一步洗脱，所述75％A+25％B中，所述流动相A和所述流动相B的体积比为3:1，所述流动相A是溶质为甲酸和甲酸铵，溶剂为水的溶液，所述流动相A中甲酸的体积浓度为0.1％，甲酸铵的浓度为2mmol/L；所述流动相B为甲醇；

2)用由所述流动相A和所述流动相B组成的名称为2％A+98％B的流动相进行第二步洗脱，所述2％A+98％B中，所述流动相A和所述流动相B的体积比为1:49；

3)用所述75％A+25％B进行第三步平衡；

所述液相色谱串联质谱中的质谱条件可包括：

1)定量离子对m/z为233.2和174.1，去簇电压90V，碰撞能11eV；

2)定性离子对m/z为233.2和174.1，去簇电压90V，碰撞能11eV；定性离子对m/z为233.2和159.1，去簇电压90V，碰撞能30eV。

进一步地，上述的方法中，所述液相色谱的固定相可为C18反相色谱柱；所述梯度洗脱的流速可为0.4ml/min；柱温可为40℃。

进一步地，上述方法中所述液相色谱的进样量可为2μL。

进一步地，上述方法中所述液相色谱的预平衡时间可为1.5min。

进一步地，上述的方法中，所述液相色谱的第一步洗脱从0分钟至2.00分钟，所述第二步洗脱从大于2.00分钟至3.10分钟，所述第三步平衡从大于3.10分钟4.00分钟。

进一步地，上述的方法中，所述质谱可采用电喷雾离子源；和/或，扫描方式可为正离子扫描；和/或，检测方式可为多反应离子监测(MRM)；和/或，脱溶剂气、锥孔气和碰撞气包括但不限于高纯氮气或其他合适气体。

其他合适气体可为高纯氩气。

进一步地，上述的方法中，C)中所述预处理可包括如下步骤：

C1)褪黑素提取：所述待测样品均质处理后取5-10g和乙腈10ml混匀，超声5min；加入4g硫酸镁、1g氯化钠、1g柠檬酸钠、0.5g三水合二柠檬酸二钠，混匀；离心取上清液；

C2)将C1)收获的上清液与0.15g乙二胺-N丙基硅烷化硅胶、0.15g十八烷基硅烷键合硅胶和0.9g硫酸镁混合，离心取上清液；

C3)将C2)收获的上清液用氮气吹干，甲醇复溶，过滤。

进一步地，C1)所述混匀方式可为涡旋1min。

进一步地，C1)所述超声的条件参数可为超声频率59KHz，提取5min。

进一步地，C1)所述离心的离心条件可为8000r/min 4℃离心5min。

进一步地，C2)所述离心的离心条件可为5000r/min 4℃离心5min。

进一步地，C3)所述氮气吹干的氮气温度可为40℃。

进一步地，C3)所述过滤可用微孔滤膜过滤，所述微孔滤膜的规格可为：尼龙微孔滤膜，13mm×0.22μm。

进一步地，上述的方法中，所述待测样品中褪黑素定量限为10pg/g，褪黑素的检出限为5pg/g。

更近一步地，上述的方法中所述待测样品包括但不限于牛奶。

为实现上述目的，本发明的第二个目的是提供上述任一方法在待测样品中褪黑素定量检测中的应用。

为实现上述目的，本发明的第三个目的是提供上述任一方法在待测样品中褪黑素定性检测中的应用。

进一步地，上述的应用中，所述待测样品包括但不限于牛奶。

本发明所取得的有益效果主要为：

1)本发明优化了样品前处理的流程，通过上述C1)-C3)所述的处理步骤可有效去除牛乳中的脂肪类杂质、沉淀蛋白更彻底，降低对仪器和色谱柱的污染；去除极性干扰物质，提高检测灵敏度。

2)本发明通过优化液相色谱条件和质谱条件，提高了液相色谱串联质谱测定褪黑素含量的灵敏度。

相比于现有技术，本发明的褪黑素检出限提高了8倍，定量限提高了10倍。

3)本发明所述方法可应用于多种样品，在褪黑素定性和定量检测方面、尤其是微量或痕量褪黑素定性和定量检测方面具有重要的产业价值。

附图说明

图1为本发明100pg/ml褪黑素标准溶液总离子流图。

图2为本发明100pg/ml褪黑素标准溶液多反应监测图。

图3为本发明样品中褪黑素总离子流图。

图4为本发明样品中褪黑素多反应监测图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。本发明中，所用水为符合GB/T 6682规定的一级水。

本发明中主要试剂及纯度如表1所示：

表1：主要试剂及纯度

试剂名称	纯度级别	试剂名称	纯度级别
				甲醇	色谱纯	氯化钠	分析纯
乙腈	色谱纯	硫酸镁	分析纯
				甲酸	色谱纯	柠檬酸钠	分析纯
甲酸铵	色谱纯	三水合二柠檬酸二钠	分析纯

本发明中溶液配置方法为：

1)流动相A为0.1％甲酸+2mmol/L甲酸铵水溶液配置方法为：取甲酸铵0.154g，用200mL水溶解；加入1mL甲酸，用水稀释至1000mL。

2)流动相B为甲醇。

本发明中主要的实验器材及仪器包括：

1)乙二胺-N丙基硅烷化硅胶(PSA)：40μm-60μm。

2)十八烷基硅烷键合硅胶(C18)：40μm-60μm。

3)陶瓷均质子：2cm(长)×1cm(外径)。

3)尼龙微孔滤膜：13mm×0.22μm。

5)天平：感量0.01g、0.001g和0.00001g。

6)多管涡旋混匀仪。

7)超声波清洗器。

8)冷冻离心机：转速≥8000r/min。

9)氮吹仪。

10)液相色谱-串联质谱仪：配备电喷雾离子源(ESI)。

11)聚丙烯离心管：15mL、50mL。

标准溶液的制备

褪黑素(Melatonin,C₁₃H₁₆N₂O₂,CAS:73-31-4)，含量≥98.0％，购自Sigma公司，货号为M5250。

采用梯度稀释法配制标准溶液，具体制备方法如下：

1)标准储备溶液(1mg/mL)：精密称取褪黑素标准品10.00mg，于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成浓度为1mg/mL的标准贮备液。-20℃冷冻保存。

2)10μg/mL褪黑素标准工作液：精密量取标准贮备液1mL，于100mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成浓度为10μg/mL的褪黑素标准工作液。-20℃保存。

3)100ng/mL褪黑素标准工作液：精密量取10μg/L的褪黑素标准工作液1mL，于100mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成浓度为100ng/mL的褪黑素标准工作液。-20℃保存。

4)1ng/mL褪黑素标准工作液：精密量取100ng/mL的褪黑素标准工作液1mL，于100mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成浓度为1ng/mL的褪黑素标准工作液。-20℃保存。

实施例1、褪黑素萃取

待测牛奶作为供试试料，于-18℃保存。用于下述实验：

1.1、提取

准确称取10g待测牛奶于50mL聚丙烯离心管中，加入陶瓷均质子涡旋1min。加入10mL乙腈，涡旋1min，超声5min。加入4g硫酸镁、1g氯化钠、1g柠檬酸钠、0.5g三水合二柠檬酸二钠，盖上离心管盖，多管涡旋混匀仪转速2800rpm，涡旋振荡1min，8000r/min 4℃低温离心5min。

1.2.净化

取6mL上清液于15mL聚丙烯离心管中，加入0.15g乙二胺-N丙基硅烷化硅胶、0.15g十八烷基硅烷键合硅胶、0.9g硫酸镁，涡旋振荡1min，4℃低温5000r/min离心5min。

1.3.浓缩

准确吸取4mL上清液于15mL聚丙烯离心管中，40℃氮气吹至近干，甲醇复溶，定容1mL，13mm×0.22μm尼龙微孔滤膜过滤，用于测定。

实施例2.样品测定

2.1.标准曲线溶液制备

溶剂标准溶液：准确量1ng/mL褪黑素标准工作液适量，用甲醇稀释配制成褪黑素浓度为10、20、40、60、100pg/mL，供液相色谱-串联质谱测定。

2.2.测定

2.2.1.液相色谱参考条件

a)液相色谱柱：C18柱(柱长50mm，柱内径2.1mm；填料粒径1.8μm)。

b)柱温：40℃。

c)流动相：A：0.1％甲酸+2mmol/L甲酸铵水溶液，B：甲醇。

d)流速：0.4mL/min。

e)进样量：2μL。

f)预平衡时间：1.5min。

g)流动相梯度洗脱程序见表2。

表2：梯度洗脱程序

时间，min	A，％	B，％
			0	75	25
2	2	98
			3	2	98
3.10	75	25

2.2.2.质谱条件

a)离子源：电喷雾离子源；

b)扫描方式：正离子扫描；

c)检测方式：多反应离子监测(MRM)；

d)脱溶剂气、锥孔气、碰撞气均为高纯氮气；

e)去簇电压、碰撞能等参数优化至最优灵敏度见表3；

f)监测离子参数情况见表3。

表3：褪黑素特征离子参考质谱条件

2.2.3.定性测定

通过试样色谱图的保留时间与相应标准品的保留时间、各色谱峰的特征离子与相应浓度标准溶液各色谱峰的特征离子相对照定性。

试样与标准品保留时间的相对偏差不大于5％；试样特征离子的相对丰度与浓度相当标准溶液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过表4的规定，则可判定样品中存在对应的被测物。

表4：定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差

相对离子丰度	＞50％	＞20％至50％	＞10％至20％	≤10％
					允许的相对偏差	±20％	±25％	±30％	±50％

2.2.4.定量测定

取试样溶液、溶剂标准溶液或基质匹配标准溶液，作单点或多点校准，按外标法以峰面积比定量，标准溶液及试样溶液中褪黑素峰面积均应在仪器检测的线性范围内。

表5：使用不同浓度褪黑素标准品测定对应的色谱峰面积

褪黑素标准品浓度(pg/ml)	峰面积
		10	893.1
20	1895.1
		40	4056.6
60	6259.1
		100	10335.6

以y表示峰面积，x表示褪黑素浓度(pg/ml)，用EXCEL软件处理数据，求得回归方程。待测样品浓度在10pg/ml-100pg/ml之间，线性回归方程为y＝105.47x-163.54,线性相关系数为0.9998。

100pg/ml褪黑素标准溶液总离子流图(TIC)如图1所示，100pg/ml褪黑素标准溶液多反应监测图如图2所示,图1和图2的横坐标为采集时间，纵坐标为响应强度。

2.3.精密度检验

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20％。

回收率(％)＝加标样品测定浓度÷加标浓度×100％

精密度(％)＝标准偏差(SD)÷平均回收率×100％

表6：牛奶中褪黑素添加回收率和精密度结果

结果表明，牛奶中褪黑素实验回收率为96.5％-104.1％，褪黑素在三个添加水平上的精密度分别为1.36％、0.66％、0.57％。

样品中褪黑素总离子流图(TIC)如图3所示，样品中褪黑素多反应监测图如图4所示,图1和图2的横坐标为采集时间，纵坐标为响应强度。

2.4.结论

当样品取样量为10mL时，以信噪比S/N≥3，褪黑素的检出限为5pg/g；以信噪比S/N≥10，褪黑素的定量限为10pg/g。

酶联免疫法属于半定量方法，处理好的试剂盒在酶标仪450nm波长测定吸光值。其优势是测定成本较低，且适合大批量样本的测定。牛褪黑素(MT)试剂盒标准曲线线性范围较窄，检测范围达到1.2-45pg/ml。在实验过程中，发现该法标准曲线线性关系不理想，样品测定受不同PBS稀释度的影响，样品测定值在几十pg/ml左右。

液相色谱-荧光法为《GB/T 5009.170-2003保健食品中褪黑素含量的测定》的国标方法，通过对前处理方法的改进，可以测定牛乳中含量大于1ng/ml褪黑素样本，测定回收率较为稳定，但其分析时间较长，单个样本测定时间达到25分钟。由于保健品中褪黑素多为人工合成，而生牛乳中所含有的为内源性褪黑素，在相同色谱条件下，使用液相色谱-荧光法测定的褪黑素，与其生物化学性质相近的内源性物质，存在在色谱分析柱相同保留时间出现叠加的可能性，造成测定结果偏高。

液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)，灵敏度较好，但要求液相色谱串联质谱仪基础性能参数较高。优化的前处理过程，以及完善的色谱条件，可减小杂质与内源性物质对待测物质的干扰，提高测定的准确性。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本发明欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

Claims

1.液相色谱串联质谱法测定褪黑素的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

所述液相色谱串联质谱中的液相色谱所采用的的洗脱程序为梯度洗脱，所述梯度洗脱包括如下三步：

3)用所述75％A+25％B进行第三步平衡；

所述液相色谱串联质谱中的质谱条件包括：

1)定性离子对的m/z为233.2和174.1，定量离子对的m/z为233.2和174.1，去簇电压90V，碰撞能11eV；

2)定性离子对m/z为233.2和159.1，去簇电压90V，碰撞能30eV。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液相色谱的固定相为C18反相色谱柱；所述梯度洗脱的流速为0.4ml/min；柱温为40℃。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述液相色谱的第一步洗脱从0分钟至2.00分钟，所述第二步洗脱从大于2.00分钟至3.10分钟，所述第三步平衡从大于3.10分钟4.00分钟。

4.如权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，所述质谱采用电喷雾离子源；和/或，扫描方式为正离子扫描；和/或，检测方式为多反应离子监测(MRM)；和/或，脱溶剂气、锥孔气和碰撞气包括但不限于高纯氮气或其他合适气体。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，C)中所述预处理包括如下步骤：

C3)将C2)收获的上清液用氮气吹干，甲醇复溶，过滤。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述待测样品中褪黑素定量限为10pg/g，褪黑素的检出限为5pg/g。

7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述待测样品包括但不限于牛奶。

8.利要求1-7中任一项所述的方法在待测样品中褪黑素定量检测中的应用。

9.利要求1-7中任一项所述的方法在待测样品中褪黑素定性检测中的应用。

10.如权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述待测样品包括但不限于牛奶。