CN107024549B - 一种标识化合物庆大霉素残留的分析方法 - Google Patents

一种标识化合物庆大霉素残留的分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于兽药残留分析技术领域，具体涉及一种标识化合物庆大霉素残留的分析方法。本发明利用9‑芴甲基氯甲酸酯为衍生试剂与庆大霉素通过柱前衍生化方法，建立一种高效液相色谱‑荧光方法检测，判定待测动物制品中标识化合物庆大霉素的残留水平。所述的分析方法包括：在pH 9.0的硼酸缓冲液介质中，以9‑芴甲基氯甲酸酯溶液作为衍生化试剂，与庆大霉素进行衍生化反应，然后通过高效液相色谱分离。本发明的衍生产物的荧光检测波长为Ex 260nm，Em 315nm，最小检出量为50μg/L，在50～12000μg/L范围内对峰面积呈线性响应，结果重现性良好。

Description

一种标识化合物庆大霉素残留的分析方法
技术领域
本发明属于兽药残留分析技术领域，具体涉及一种标识化合物庆大霉素残留的分析方法。本发明利用9-芴甲基氯甲酸酯为衍生试剂与含氨基的庆大霉素药物通过柱前衍生化，然后通过高效液相色谱-荧光方法检测，判定待测动物制品中标识化合物庆大霉素的残留水平。
背景技术
庆大霉素(Geniamycin)是由小单孢菌属(MicromonosporaPurpurea)发酵产生的一组结构相近的多组分氨基糖昔类抗生素。它的主要活性成分是C组分，C组分具有较强的广谱抗菌作用，目前临床中广泛使用。
庆大霉素及其残留对人、畜均有明显的毒副作用，主要毒性反应为第八对脑神经的损害，引起耳鸣，头昏，眩晕等，若用量较大可致听力减退，重听，甚至有耳聋的可能，还会造成肾脏损害，心肌损伤，过敏反应等。
欧盟颁布的关于庆大霉素在组织中的最大残留量(庆大霉素C1、C1a、C2和C2a总和)，猪、牛的肌肉和肾脏组织中分别为50μg/kg、750μg/kg，牛奶100μg/kg。食品法典委员会(CAC)规定庆大霉素在猪、牛肌肉和肾脏组织中最高残留限分别为100μg/kg、5000μg/kg、牛奶为200μg/kg。我国农业部对牛和猪肌肉、肾脏和牛奶中庆大霉素的最高残留限量规定同CAC。
庆大霉素残留检测方法主要有微生物学法和高效液相色谱法。目前国内关于庆大霉素残留的检测方法主要为微生物法，国外大部分采用柱前衍生或柱后衍生荧光检测的方法。美国FSIS(1991)推荐的猪可食性组织中庆大霉素残留检测的高效液相色谱-柱后衍生法，组织中庆大霉素用1N硫酸提取，IRC-50氨基固相柱萃取，液-液分配净化，柱后衍生，高效液相色谱荧光检测器测定，Ex为335nm，Em为418nm，OPT(o-phthalaldehyde)为衍生试剂，方法的最低检出限为400μg/kg。Posyniak(2001)采用液相色谱柱前衍生同时检测庆大霉素和新霉素在组织中的残留，样品采用磷酸缓冲液提取，三氯乙酸沉淀蛋白，SPE净化，方法的最低检测限为500μg/kg，其回收率为76％～86％。Heller(2005)建立了弱阳离子交换离子阱质谱检测牛奶中新霉素和庆大霉素的残留的分析方法，牛奶样品经过酸化，离心，除去脂肪层，用柠檬酸调节pH至中性，弱阳离子交换，酸化甲醇洗脱，离子对液相色谱分离，选择离子进行定性和定量。庆大霉素柱后衍生，需要特殊的柱后衍生仪器设备，许多检测单位可能不具备此仪器设备，带来检测困难。庆大霉素柱前衍生，具备所需试验条件简单，不需要附加的衍生仪器设备，操作简便等特点，可以用于庆大霉素残留测定。但是目前还未有柱前衍生测定庆大霉素的检测方法。
9-芴甲基氯甲酸酯与庆大霉素的氨基发生衍生反应，衍生产物具有荧光基团，可采用高效液相色谱-荧光检测。但是目前还未有采用9-芴甲基氯甲酸酯与庆大霉素衍生，液相色谱-荧光检测方法测定动物性产品中庆大霉素残留的报道。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术的不足，提供一种标识化合物庆大霉素残留的分析方法。本发明利用9-芴甲基氯甲酸酯为衍生试剂与含氨基的庆大霉素药物通过柱前衍生化，产生较强的荧光，然后通过高效液相色谱-荧光方法检测，判定待测动物制品中标识化合物庆大霉素的残留水平。本发明灵敏度高，反应快速高效，操作简便；与柱后衍生相比较，不需要附加的衍生仪器设备。
本发明的总体技术方案如下：
技术流程为：确立庆大霉素与9-芴甲基氯甲酸酯进行衍生化反应的条件→衍生产物高效液相色谱检测方法的建立→样本的分析检测
具体步骤如下所述：
1.庆大霉素与9-芴甲基氯甲酸酯的衍生化反应
将庆大霉素样本吹干后，用0.4mL的硼酸缓冲液溶解，加0.6mL衍生化试剂9-芴甲基氯甲酸酯，在衍生化反应体系中室温下反应30min，得到混合液，将混合液过0.25μm滤膜，取上清液供高效液相色谱分析；
反应方程式如下所示：
Figure GDA0002466701310000021
其中：
衍生化反应体系中庆大霉素与9-芴甲基氯甲酸酯的摩尔比为1∶50～100；硼酸缓冲液浓度为0.5mol/L；反应中所述的混合液的pH值为8.5～9.5；反应温度为20～35℃；反应时间为25～35min；
硼酸缓冲液的配制：称取硼酸3.1g，用适量水溶解后用10mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至9.0，用水溶解并稀释至100mL。
2.高效液相色谱-荧光检测方法的技术条件：
色谱柱：Thermo BDS C18(250mm×4.6mm×5μm)；
流动相：乙腈:水＝88:12；
检测波长：Ex：260nm，Em：315nm；
进样量：25μL；
柱温：30℃；
流速：1.0mL/min。
本发明的优点：
本发明建立牛奶、猪和鸡肌肉样品中的庆大霉素残留的分析方法，方法的灵敏度、准确度和精密度均符合农业部规定的兽药残留检测要求。本发明的优势是通过衍生化，使庆大霉素用高效液相色谱荧光检测器就能检测出来，且肌肉组织中定量限为20μg/kg，牛奶中定量限为40μg/kg。
更详细的技术方案参见《具体实施方式》。
附图说明
图1：庆大霉素标准溶液衍生物液相色谱图(100μg/L)。
图2：牛奶空白试样液相色谱图。
图3：牛奶空白添加庆大霉素试样液相色谱图(200μg/kg。
图4：庆大霉素标准曲线图。
具体实施方式
实施例1：庆大霉素与9-芴甲基氯甲酸酯的衍生化反应
(1)庆大霉素与9-芴甲基氯甲酸酯的衍生化反应
准确称取相应质量庆大霉素标准品10.0mg，于10mL量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，得到1mg/mL的标准储备液。量取庆大霉素标准储备液1.0mL于100mL量瓶中，用硼酸缓冲液(配制方法：称取硼酸3.1g，用适量蒸馏水溶解后用10mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至9.0，用蒸馏水溶解并稀释至100mL)稀释至100mL，得到的标准工作液10μg/mL。用硼酸缓冲液稀释标准溶液得到庆大霉素浓度分别为50μg/L、100μg/L、200μg/L、500μg/L、1000μg/L、2000μg/L、5000μg/L、10000μg/L、12000μg/L系列梯度的标准工作液。准确移取标准工作液0.4mL，加衍生化试剂9-芴甲基氯甲酸酯0.6mL，室温下反应30min，得混合液，将混合液过0.25μm滤膜，取上清液供高效液相色谱分析。
(2)HPLC检测
色谱柱：Thermo BDS C18(250mm×4.6mm×5μm)；流动相：乙腈:水＝88:12；检测波长：Ex：260nm，Em：315nm；进样量：25μL；柱温：30℃；流速：1.0mL/min。
(3)衍生产物检测结果
每个浓度重复3次，将测得的峰面积与相对应浓度绘制标准曲线，求回归方程和相关系数。回归方程公式：Y＝30470X+1.0E+6，相关系数0.9998。
实施例2样本测定
(1)样本的前处理
提取步骤：称取试料(牛奶、猪和鸡肌肉)(5±0.05g)置于聚丙烯离心管中，加入磷酸盐缓冲液(配制方法：取氯化钠18g，二水磷酸氢二钠4.4g，磷酸二氢钠1.1g，用适量蒸馏水溶解，用10mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至7.4左右，加蒸馏水稀释至1 000mL)10mL，旋涡混匀3min，加入50％三氯乙酸(TCA)水溶液5mL，旋涡混匀1min，于12000r/min4℃离心15min，转移上清液至另一聚丙烯离心管中，加入磷酸盐缓冲液5mL和50％TCA水溶液2.5mL重复提取一次，合并两次提取液，加正己烷5mL，旋涡混匀2min，于4℃12000r/min离心15min，弃去正己烷层，水层备用。
净化步骤：固相萃取小柱依次用甲醇、水、2％甲酸水溶液各3mL活化，取备用液上柱，依次用2％浓度的甲酸水溶液3mL，甲醇3mL淋洗一次，再1％浓度的氨化甲醇溶液淋洗两次(每次3mL)，吹干柱子，最后用5％浓度的氨化甲醇4mL洗脱，收集洗脱液。在低于35℃水浴中用氮气吹干。
衍生化步骤：将庆大霉素样本吹干后，用0.4mL的硼酸缓冲液溶解，加0.6mL衍生化试剂9-芴甲基氯甲酸酯，在衍生化反应体系中室温下反应30min，得到混合液，将混合液过0.25μm滤膜，取上清液供高效液相色谱分析；
衍生化反应体系中庆大霉素与9-芴甲基氯甲酸酯的摩尔比为1∶50～100；硼酸缓冲液浓度为0.5mol/L；反应中所述混合液的pH值为8.5～9.5；反应温度为20～35℃；反应时间为25～35min；
硼酸缓冲液的配制：称取硼酸3.1g，用适量水溶解后用10mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至9.0，用水溶解并稀释至100mL。
(2)样本的测定
色谱柱参数：Thermo BDS C18(250mm×4.6mm×5μm)；流动相：乙腈:水＝88:12；检测波长：Ex：260nm，Em：315nm；进样量：25μL；柱温：30℃；流速：1.0mL/min。
(3)测定结果分析
对牛奶样品中庆大霉素进行添加回收试验。在空白样品中加入适量标准溶液(含庆大霉素标准品)，使样品中浓度分别为LOQ(肌肉组织中为20μg/kg，牛奶中为40μg/kg)、1MRL(肌肉组织中为100μg/kg，牛奶中为200μg/kg)、2MRL(肌肉组织中为200μg/kg，牛奶中为400μg/kg)三个浓度，样品预处理后进行检测。同一天内每个浓度重复5个样本，计算回收率，并取平均值，计算日内变异系数。庆大霉素在肌肉组织中残留量的定量限为20μg/kg，牛奶中残留量的定量限为40μg/kg。结果如下：回收率为79.8～89.2％；批内变异系数小于8.0％，批间变异系数小于9.6％。本实施例符合中国兽药残留检测规定。
主要参考文献
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[12]P.J.Claes,Y.Chaerani,H.Vanderhaeghe,J.Pharm.Belg.40(1985)95-99.
[13]E.Kaale,S.Leonard,A.Van Schepdael,E.Roets,J.Hoogmartens,J.Chromatogr.A 895(2000)67-79。

Claims (1)

1.牛奶、猪和鸡肌肉中标识化合物庆大霉素的残留分析方法，其特征在于：所述的方法包括以下步骤：
(1)样本的前处理步骤，称取牛奶、猪和鸡肌肉5±0.05g置于聚丙烯离心管中，加入磷酸盐缓冲液10mL，旋涡混匀3min，加入50％三氯乙酸水溶液5mL，旋涡混匀1min，于12000r/min 4℃离心15min，转移上清液至另一聚丙烯离心管中，加入磷酸盐缓冲液5mL和50％三氯乙酸水溶液2.5mL重复提取一次，合并两次提取液，加正己烷5mL，旋涡混匀2min，于4℃12000r/min离心15min，弃去正己烷层，水层备用；
磷酸盐缓冲液的配制：取氯化钠18g，二水磷酸氢二钠4.4g，磷酸二氢钠
1.1g，用适量蒸馏水溶解，最后用10mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至7.4，加蒸馏水稀释至1000mL；
(2)净化步骤：固相萃取小柱依次用甲醇、水、2％甲酸水溶液各3mL活化，取备用液上柱，依次用2％浓度的甲酸水溶液3mL，甲醇3mL淋洗一次，再用1％浓度的氨化甲醇溶液淋洗两次，每次3mL，吹干柱子，最后用5％浓度的氨化甲醇4mL洗脱，收集洗脱液；在低于35℃水浴中用氮气吹干；
(3)衍生化步骤：将庆大霉素样本吹干后，用0.4mL的硼酸缓冲液溶解，加0.6mL衍生化试剂9-芴甲基氯甲酸酯；衍生化反应体系中庆大霉素与9-芴甲基氯甲酸酯的摩尔比为1∶50～100；硼酸缓冲液浓度为0.5mol/L；反应中混合液的pH值为8.5～9.5，反应温度为20～35℃；反应时间为25～35min；
硼酸缓冲液的配制：称取硼酸3.1g，用适量水溶解后用10mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至9.0，用水溶解并稀释至100mL；
高效液相色谱-荧光检测的技术条件：
高效液相色谱柱：Thermo BDS C18柱，250mm×4.6mm×5μm；
流动相：乙腈:水＝88:12；
流速：1.0mL/min；
检测波长：Ex 260nm，Em 315nm。
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