CN107024549B - 一种标识化合物庆大霉素残留的分析方法 - Google Patents
一种标识化合物庆大霉素残留的分析方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107024549B CN107024549B CN201610540113.XA CN201610540113A CN107024549B CN 107024549 B CN107024549 B CN 107024549B CN 201610540113 A CN201610540113 A CN 201610540113A CN 107024549 B CN107024549 B CN 107024549B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gentamicin
- solution
- boric acid
- derivatization
- column
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 title claims abstract description 51
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 title claims abstract description 51
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 title claims abstract description 49
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title claims abstract description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 title abstract description 4
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 claims abstract description 28
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 claims abstract description 18
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 18
- IRXSLJNXXZKURP-UHFFFAOYSA-N fluorenylmethyloxycarbonyl chloride Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)Cl)C3=CC=CC=C3C2=C1 IRXSLJNXXZKURP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 15
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 9
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims abstract description 9
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 18
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 claims description 17
- 239000008267 milk Substances 0.000 claims description 17
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 claims description 17
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 claims description 12
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 8
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 7
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 6
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 5
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 5
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims description 4
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 claims description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 4
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 claims description 4
- -1 polypropylene Polymers 0.000 claims description 4
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 claims description 4
- 238000001868 liquid chromatography-fluorescence detection Methods 0.000 claims description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 3
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 claims description 3
- KDQPSPMLNJTZAL-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogenphosphate dihydrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O KDQPSPMLNJTZAL-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 claims description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 238000002414 normal-phase solid-phase extraction Methods 0.000 claims description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 2
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims 3
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 claims 3
- 238000002386 leaching Methods 0.000 claims 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 claims 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 claims 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims 1
- 239000000463 material Substances 0.000 claims 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 abstract description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 abstract description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 5
- 239000000273 veterinary drug Substances 0.000 abstract description 4
- 238000002795 fluorescence method Methods 0.000 abstract description 3
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 abstract description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 238000001121 post-column derivatisation Methods 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 3
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 3
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010011878 Deafness Diseases 0.000 description 2
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000012496 blank sample Substances 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- DNYGXMICFMACRA-UHFFFAOYSA-N gentamicin C1A Natural products O1C(CNC)CCC(N)C1OC1C(O)C(OC2C(C(NC)C(C)(O)CO2)O)C(N)CC1N DNYGXMICFMACRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000016354 hearing loss disease Diseases 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 2
- 229940054441 o-phthalaldehyde Drugs 0.000 description 2
- ZWLUXSQADUDCSB-UHFFFAOYSA-N phthalaldehyde Chemical compound O=CC1=CC=CC=C1C=O ZWLUXSQADUDCSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000005084 renal tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- CEAZRRDELHUEMR-CAMVTXANSA-N (2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2r,3r,6s)-3-amino-6-[(1r)-1-(methylamino)ethyl]oxan-2-yl]oxy-2-hydroxycyclohexyl]oxy-5-methyl-4-(methylamino)oxane-3,5-diol Chemical compound O1[C@H]([C@@H](C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-CAMVTXANSA-N 0.000 description 1
- XUFIWSHGXVLULG-BSBKYKEKSA-N (2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2r,3r,6s)-3-amino-6-[(1s)-1-aminoethyl]oxan-2-yl]oxy-2-hydroxycyclohexyl]oxy-5-methyl-4-(methylamino)oxane-3,5-diol Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H](CC[C@H](O2)[C@H](C)N)N)[C@@H](N)C[C@H]1N XUFIWSHGXVLULG-BSBKYKEKSA-N 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 206010048865 Hypoacusis Diseases 0.000 description 1
- 231100000703 Maximum Residue Limit Toxicity 0.000 description 1
- 241000187722 Micromonospora echinospora Species 0.000 description 1
- 208000009205 Tinnitus Diseases 0.000 description 1
- 208000012886 Vertigo Diseases 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002647 aminoglycoside antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 231100000895 deafness Toxicity 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 208000002173 dizziness Diseases 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 229930076781 gentamycin C1 Natural products 0.000 description 1
- VEGXETMJINRLTH-BOZYPMBZSA-N gentamycin C1a Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H](CC[C@@H](CN)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N VEGXETMJINRLTH-BOZYPMBZSA-N 0.000 description 1
- XUFIWSHGXVLULG-JYDJLPLMSA-N gentamycin C2 Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H](CC[C@H](O2)[C@@H](C)N)N)[C@@H](N)C[C@H]1N XUFIWSHGXVLULG-JYDJLPLMSA-N 0.000 description 1
- 231100000888 hearing loss Toxicity 0.000 description 1
- 230000010370 hearing loss Effects 0.000 description 1
- 238000004188 ion pair liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000534 ion trap mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000000622 liquid--liquid extraction Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000013048 microbiological method Methods 0.000 description 1
- 230000003680 myocardial damage Effects 0.000 description 1
- 238000007781 pre-processing Methods 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 231100000886 tinnitus Toxicity 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 231100000889 vertigo Toxicity 0.000 description 1
- 210000000752 vestibulocochlear nerve Anatomy 0.000 description 1
- 238000012784 weak cation exchange Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N2030/022—Column chromatography characterised by the kind of separation mechanism
- G01N2030/027—Liquid chromatography
Landscapes
- Physics & Mathematics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明属于兽药残留分析技术领域，具体涉及一种标识化合物庆大霉素残留的分析方法。本发明利用9‑芴甲基氯甲酸酯为衍生试剂与庆大霉素通过柱前衍生化方法，建立一种高效液相色谱‑荧光方法检测，判定待测动物制品中标识化合物庆大霉素的残留水平。所述的分析方法包括：在pH 9.0的硼酸缓冲液介质中，以9‑芴甲基氯甲酸酯溶液作为衍生化试剂，与庆大霉素进行衍生化反应，然后通过高效液相色谱分离。本发明的衍生产物的荧光检测波长为Ex 260nm，Em 315nm，最小检出量为50μg/L，在50～12000μg/L范围内对峰面积呈线性响应，结果重现性良好。
Description
技术领域
本发明属于兽药残留分析技术领域，具体涉及一种标识化合物庆大霉素残留的分析方法。本发明利用9-芴甲基氯甲酸酯为衍生试剂与含氨基的庆大霉素药物通过柱前衍生化，然后通过高效液相色谱-荧光方法检测，判定待测动物制品中标识化合物庆大霉素的残留水平。
背景技术
庆大霉素(Geniamycin)是由小单孢菌属(MicromonosporaPurpurea)发酵产生的一组结构相近的多组分氨基糖昔类抗生素。它的主要活性成分是C组分，C组分具有较强的广谱抗菌作用，目前临床中广泛使用。
庆大霉素及其残留对人、畜均有明显的毒副作用，主要毒性反应为第八对脑神经的损害，引起耳鸣，头昏，眩晕等，若用量较大可致听力减退，重听，甚至有耳聋的可能，还会造成肾脏损害，心肌损伤，过敏反应等。
欧盟颁布的关于庆大霉素在组织中的最大残留量(庆大霉素C1、C1a、C2和C2a总和)，猪、牛的肌肉和肾脏组织中分别为50μg/kg、750μg/kg，牛奶100μg/kg。食品法典委员会(CAC)规定庆大霉素在猪、牛肌肉和肾脏组织中最高残留限分别为100μg/kg、5000μg/kg、牛奶为200μg/kg。我国农业部对牛和猪肌肉、肾脏和牛奶中庆大霉素的最高残留限量规定同CAC。
庆大霉素残留检测方法主要有微生物学法和高效液相色谱法。目前国内关于庆大霉素残留的检测方法主要为微生物法，国外大部分采用柱前衍生或柱后衍生荧光检测的方法。美国FSIS(1991)推荐的猪可食性组织中庆大霉素残留检测的高效液相色谱-柱后衍生法，组织中庆大霉素用1N硫酸提取，IRC-50氨基固相柱萃取，液-液分配净化，柱后衍生，高效液相色谱荧光检测器测定，Ex为335nm，Em为418nm，OPT(o-phthalaldehyde)为衍生试剂，方法的最低检出限为400μg/kg。Posyniak(2001)采用液相色谱柱前衍生同时检测庆大霉素和新霉素在组织中的残留，样品采用磷酸缓冲液提取，三氯乙酸沉淀蛋白，SPE净化，方法的最低检测限为500μg/kg，其回收率为76％～86％。Heller(2005)建立了弱阳离子交换离子阱质谱检测牛奶中新霉素和庆大霉素的残留的分析方法，牛奶样品经过酸化，离心，除去脂肪层，用柠檬酸调节pH至中性，弱阳离子交换，酸化甲醇洗脱，离子对液相色谱分离，选择离子进行定性和定量。庆大霉素柱后衍生，需要特殊的柱后衍生仪器设备，许多检测单位可能不具备此仪器设备，带来检测困难。庆大霉素柱前衍生，具备所需试验条件简单，不需要附加的衍生仪器设备，操作简便等特点，可以用于庆大霉素残留测定。但是目前还未有柱前衍生测定庆大霉素的检测方法。
9-芴甲基氯甲酸酯与庆大霉素的氨基发生衍生反应，衍生产物具有荧光基团，可采用高效液相色谱-荧光检测。但是目前还未有采用9-芴甲基氯甲酸酯与庆大霉素衍生，液相色谱-荧光检测方法测定动物性产品中庆大霉素残留的报道。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术的不足，提供一种标识化合物庆大霉素残留的分析方法。本发明利用9-芴甲基氯甲酸酯为衍生试剂与含氨基的庆大霉素药物通过柱前衍生化，产生较强的荧光，然后通过高效液相色谱-荧光方法检测，判定待测动物制品中标识化合物庆大霉素的残留水平。本发明灵敏度高，反应快速高效，操作简便；与柱后衍生相比较，不需要附加的衍生仪器设备。
本发明的总体技术方案如下：
技术流程为：确立庆大霉素与9-芴甲基氯甲酸酯进行衍生化反应的条件→衍生产物高效液相色谱检测方法的建立→样本的分析检测
具体步骤如下所述：
1.庆大霉素与9-芴甲基氯甲酸酯的衍生化反应
将庆大霉素样本吹干后，用0.4mL的硼酸缓冲液溶解，加0.6mL衍生化试剂9-芴甲基氯甲酸酯，在衍生化反应体系中室温下反应30min，得到混合液，将混合液过0.25μm滤膜，取上清液供高效液相色谱分析；
反应方程式如下所示：
其中：
衍生化反应体系中庆大霉素与9-芴甲基氯甲酸酯的摩尔比为1∶50～100；硼酸缓冲液浓度为0.5mol/L；反应中所述的混合液的pH值为8.5～9.5；反应温度为20～35℃；反应时间为25～35min；
硼酸缓冲液的配制：称取硼酸3.1g，用适量水溶解后用10mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至9.0，用水溶解并稀释至100mL。
2.高效液相色谱-荧光检测方法的技术条件：
色谱柱：Thermo BDS C18(250mm×4.6mm×5μm)；
流动相：乙腈:水＝88:12；
检测波长：Ex：260nm，Em：315nm；
进样量：25μL；
柱温：30℃；
流速：1.0mL/min。
本发明的优点：
本发明建立牛奶、猪和鸡肌肉样品中的庆大霉素残留的分析方法，方法的灵敏度、准确度和精密度均符合农业部规定的兽药残留检测要求。本发明的优势是通过衍生化，使庆大霉素用高效液相色谱荧光检测器就能检测出来，且肌肉组织中定量限为20μg/kg，牛奶中定量限为40μg/kg。
更详细的技术方案参见《具体实施方式》。
附图说明
图1：庆大霉素标准溶液衍生物液相色谱图(100μg/L)。
图2：牛奶空白试样液相色谱图。
图3：牛奶空白添加庆大霉素试样液相色谱图(200μg/kg。
图4：庆大霉素标准曲线图。
具体实施方式
实施例1：庆大霉素与9-芴甲基氯甲酸酯的衍生化反应
(1)庆大霉素与9-芴甲基氯甲酸酯的衍生化反应
准确称取相应质量庆大霉素标准品10.0mg，于10mL量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，得到1mg/mL的标准储备液。量取庆大霉素标准储备液1.0mL于100mL量瓶中，用硼酸缓冲液(配制方法：称取硼酸3.1g，用适量蒸馏水溶解后用10mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至9.0，用蒸馏水溶解并稀释至100mL)稀释至100mL，得到的标准工作液10μg/mL。用硼酸缓冲液稀释标准溶液得到庆大霉素浓度分别为50μg/L、100μg/L、200μg/L、500μg/L、1000μg/L、2000μg/L、5000μg/L、10000μg/L、12000μg/L系列梯度的标准工作液。准确移取标准工作液0.4mL，加衍生化试剂9-芴甲基氯甲酸酯0.6mL，室温下反应30min，得混合液，将混合液过0.25μm滤膜，取上清液供高效液相色谱分析。
(2)HPLC检测
色谱柱：Thermo BDS C18(250mm×4.6mm×5μm)；流动相：乙腈:水＝88:12；检测波长：Ex：260nm，Em：315nm；进样量：25μL；柱温：30℃；流速：1.0mL/min。
(3)衍生产物检测结果
每个浓度重复3次，将测得的峰面积与相对应浓度绘制标准曲线，求回归方程和相关系数。回归方程公式：Y＝30470X+1.0E+6，相关系数0.9998。
实施例2样本测定
(1)样本的前处理
提取步骤：称取试料(牛奶、猪和鸡肌肉)(5±0.05g)置于聚丙烯离心管中，加入磷酸盐缓冲液(配制方法：取氯化钠18g，二水磷酸氢二钠4.4g，磷酸二氢钠1.1g，用适量蒸馏水溶解，用10mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至7.4左右，加蒸馏水稀释至1 000mL)10mL，旋涡混匀3min，加入50％三氯乙酸(TCA)水溶液5mL，旋涡混匀1min，于12000r/min4℃离心15min，转移上清液至另一聚丙烯离心管中，加入磷酸盐缓冲液5mL和50％TCA水溶液2.5mL重复提取一次，合并两次提取液，加正己烷5mL，旋涡混匀2min，于4℃12000r/min离心15min，弃去正己烷层，水层备用。
净化步骤：固相萃取小柱依次用甲醇、水、2％甲酸水溶液各3mL活化，取备用液上柱，依次用2％浓度的甲酸水溶液3mL，甲醇3mL淋洗一次，再1％浓度的氨化甲醇溶液淋洗两次(每次3mL)，吹干柱子，最后用5％浓度的氨化甲醇4mL洗脱，收集洗脱液。在低于35℃水浴中用氮气吹干。
衍生化步骤：将庆大霉素样本吹干后，用0.4mL的硼酸缓冲液溶解，加0.6mL衍生化试剂9-芴甲基氯甲酸酯，在衍生化反应体系中室温下反应30min，得到混合液，将混合液过0.25μm滤膜，取上清液供高效液相色谱分析；
衍生化反应体系中庆大霉素与9-芴甲基氯甲酸酯的摩尔比为1∶50～100；硼酸缓冲液浓度为0.5mol/L；反应中所述混合液的pH值为8.5～9.5；反应温度为20～35℃；反应时间为25～35min；
硼酸缓冲液的配制：称取硼酸3.1g，用适量水溶解后用10mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至9.0，用水溶解并稀释至100mL。
(2)样本的测定
色谱柱参数：Thermo BDS C18(250mm×4.6mm×5μm)；流动相：乙腈:水＝88:12；检测波长：Ex：260nm，Em：315nm；进样量：25μL；柱温：30℃；流速：1.0mL/min。
(3)测定结果分析
对牛奶样品中庆大霉素进行添加回收试验。在空白样品中加入适量标准溶液(含庆大霉素标准品)，使样品中浓度分别为LOQ(肌肉组织中为20μg/kg，牛奶中为40μg/kg)、1MRL(肌肉组织中为100μg/kg，牛奶中为200μg/kg)、2MRL(肌肉组织中为200μg/kg，牛奶中为400μg/kg)三个浓度，样品预处理后进行检测。同一天内每个浓度重复5个样本，计算回收率，并取平均值，计算日内变异系数。庆大霉素在肌肉组织中残留量的定量限为20μg/kg，牛奶中残留量的定量限为40μg/kg。结果如下：回收率为79.8～89.2％；批内变异系数小于8.0％，批间变异系数小于9.6％。本实施例符合中国兽药残留检测规定。
主要参考文献
[1]A.Posyniak,J.Zmudzki,J.Niedzielska；J Chromatogr A.914(2001):59-66.
[2]S.K.Maitra,T.Y.Yoshikawa,J.L.Hansen,I.Nilsson-Ehle,W.J.Palin,M.C.Schotz,L.B.Guze,Clin.Chem.23(1977)2275-2278.
[3]J.P.Anhalt,Antimicrob.Agents Chemother.11(1977)651-655.
[4]G.W.Peng,M.A.F.Gadalla,A.Peng,V.Smith,W.L.Chiou；Clin.Chem.23(1977)1838-1844.
[5]G.Seidl,H.P.Nerad；Chromatographia 25(1988)169-171.
[6]P.Gambardella,R.Punziano,M.Gionti,C.Guadalupi,G.Mancini,A.Mangia；J.Chromatogr.348(1985)229-240.
[7]L.O.White,A.Lovering,D.S.Reeves；Ther.Drug Monit.5(1983)123-126.
[8]P.J.Claes,R.Busson,H.Vanderhaeghe；J.Chromatogr.298(1984)445-457.
[9]J.H.Albracht,M.S.De Wit；J.Chromatogr.389(1987)306-311.
[10]M.Freeman,P.A.Hawkins,J.S.Loran,J.A.Stead；J.Chromatogr.2(1979)1305-1317.
[11]K.Kraisintu,R.T.Parfitt,M.G.Rowan,Int.J.Pharm.10(1982)67-75.
[12]P.J.Claes,Y.Chaerani,H.Vanderhaeghe,J.Pharm.Belg.40(1985)95-99.
[13]E.Kaale,S.Leonard,A.Van Schepdael,E.Roets,J.Hoogmartens,J.Chromatogr.A 895(2000)67-79。
Claims (1)
1.牛奶、猪和鸡肌肉中标识化合物庆大霉素的残留分析方法，其特征在于：所述的方法包括以下步骤：
(1)样本的前处理步骤，称取牛奶、猪和鸡肌肉5±0.05g置于聚丙烯离心管中，加入磷酸盐缓冲液10mL，旋涡混匀3min，加入50％三氯乙酸水溶液5mL，旋涡混匀1min，于12000r/min 4℃离心15min，转移上清液至另一聚丙烯离心管中，加入磷酸盐缓冲液5mL和50％三氯乙酸水溶液2.5mL重复提取一次，合并两次提取液，加正己烷5mL，旋涡混匀2min，于4℃12000r/min离心15min，弃去正己烷层，水层备用；
磷酸盐缓冲液的配制：取氯化钠18g，二水磷酸氢二钠4.4g，磷酸二氢钠
1.1g，用适量蒸馏水溶解，最后用10mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至7.4，加蒸馏水稀释至1000mL；
(2)净化步骤：固相萃取小柱依次用甲醇、水、2％甲酸水溶液各3mL活化，取备用液上柱，依次用2％浓度的甲酸水溶液3mL，甲醇3mL淋洗一次，再用1％浓度的氨化甲醇溶液淋洗两次，每次3mL，吹干柱子，最后用5％浓度的氨化甲醇4mL洗脱，收集洗脱液；在低于35℃水浴中用氮气吹干；
(3)衍生化步骤：将庆大霉素样本吹干后，用0.4mL的硼酸缓冲液溶解，加0.6mL衍生化试剂9-芴甲基氯甲酸酯；衍生化反应体系中庆大霉素与9-芴甲基氯甲酸酯的摩尔比为1∶50～100；硼酸缓冲液浓度为0.5mol/L；反应中混合液的pH值为8.5～9.5，反应温度为20～35℃；反应时间为25～35min；
硼酸缓冲液的配制：称取硼酸3.1g，用适量水溶解后用10mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至9.0，用水溶解并稀释至100mL；
高效液相色谱-荧光检测的技术条件：
高效液相色谱柱：Thermo BDS C18柱，250mm×4.6mm×5μm；
流动相：乙腈:水＝88:12；
流速：1.0mL/min；
检测波长：Ex 260nm，Em 315nm。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610540113.XA CN107024549B (zh) | 2016-07-10 | 2016-07-10 | 一种标识化合物庆大霉素残留的分析方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610540113.XA CN107024549B (zh) | 2016-07-10 | 2016-07-10 | 一种标识化合物庆大霉素残留的分析方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN107024549A CN107024549A (zh) | 2017-08-08 |
| CN107024549B true CN107024549B (zh) | 2020-06-26 |
Family
ID=59524404
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610540113.XA Active CN107024549B (zh) | 2016-07-10 | 2016-07-10 | 一种标识化合物庆大霉素残留的分析方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN107024549B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110988196B (zh) * | 2019-12-27 | 2022-07-19 | 无锡福祈制药有限公司 | 庆大霉素b含量的分析方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103109928A (zh) * | 2011-11-16 | 2013-05-22 | 李洪梅 | 牛奶抗生素残留综合控制技术研究 |
| CN105548412A (zh) * | 2016-03-07 | 2016-05-04 | 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 一种同时测定食品中5种氨基糖苷类药物残留量的方法 |
| CN105699529A (zh) * | 2016-02-18 | 2016-06-22 | 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所 | 制药固体废弃物中庆大霉素的检测方法 |
-
2016
- 2016-07-10 CN CN201610540113.XA patent/CN107024549B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103109928A (zh) * | 2011-11-16 | 2013-05-22 | 李洪梅 | 牛奶抗生素残留综合控制技术研究 |
| CN105699529A (zh) * | 2016-02-18 | 2016-06-22 | 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所 | 制药固体废弃物中庆大霉素的检测方法 |
| CN105548412A (zh) * | 2016-03-07 | 2016-05-04 | 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 一种同时测定食品中5种氨基糖苷类药物残留量的方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| FMOC-Cl柱前衍生高效液相色谱法测定乳中庆大霉素;赵静等;《中国乳品工业》;20141231;全文 * |
| 柱前衍生．HPLC法测定硫酸庆大霉素注射液的含量;陈咏等;《海峡药学》;20091231;全文 * |
| 高效液相色谱法测定牛肌肉中庆大霉素残留的研究;高效液相色谱法测定牛肌肉中庆大霉素残留的研究;《中国农学通报》;20080630;摘要、第1.1-1.2部分 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN107024549A (zh) | 2017-08-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Moreno-González et al. | Evaluation of hydrophilic interaction liquid chromatography–tandem mass spectrometry and extraction with molecularly imprinted polymers for determination of aminoglycosides in milk and milk-based functional foods | |
| JP7399214B2 (ja) | 液体クロマトグラフィー質量分析による体液中のアミノ酸分析 | |
| Hermo et al. | Improved determination of quinolones in milk at their MRL levels using LC–UV, LC–FD, LC–MS and LC–MS/MS and validation in line with regulation 2002/657/EC | |
| Wu et al. | Sample normalization methods in quantitative metabolomics | |
| Wang et al. | Optimization and application of parallel solid-phase extraction coupled with ultra-high performance liquid chromatography–tandem mass spectrometry for the determination of 11 aminoglycoside residues in honey and royal jelly | |
| Posyniak et al. | Sample preparation for residue determination of gentamicin and neomycin by liquid chromatography | |
| CN109856271A (zh) | 同时测定牛奶中磺胺类、喹诺酮类、四环素类、氯霉素类、大环内酯类抗生素残留量的方法 | |
| CN107167539A (zh) | 一种快速筛查鱼肉中多种兽药残留的检测方法 | |
| Ishii et al. | Multi-residue quantitation of aminoglycoside antibiotics in kidney and meat by liquid chromatography with tandem mass spectrometry | |
| Zhu et al. | Development of a liquid chromatography tandem mass spectrometric method for simultaneous determination of 15 aminoglycoside residues in porcine tissues | |
| CN103293243A (zh) | 食品中羧甲基赖氨酸成分的检测方法及应用 | |
| CN113804746B (zh) | 一种对尿液中的合成卡西酮类毒品进行快速定量的方法 | |
| CN107632090A (zh) | 一种快速检测畜禽粪便中多种抗生素残留的方法 | |
| CN107024549B (zh) | 一种标识化合物庆大霉素残留的分析方法 | |
| Martínez‐Huelamo et al. | Determination of penicillins in milk using LC‐UV, LC‐MS and LC‐MS/MS | |
| Cheng et al. | On-line solid-phase extraction coupled liquid chromatography-ESI-ion trap-mass spectrometry for analysis of abamectin and ivermectin residues in milk | |
| CN108872425A (zh) | 亲水作用色谱-串联质谱法快速测定蜂蜜中链霉素和双氢链霉素的方法 | |
| Laki et al. | Determination of gentamicin released from orthopedic carrier system by a novel HPLC method | |
| CN116718699A (zh) | 一种牛奶及其制品和鸡、猪肉中八种四环素类药物及三种代谢物残留的定量检测方法 | |
| KR20160004733A (ko) | 마보플록사신의 혈중 농도 정량분석 방법 | |
| Asea et al. | Determination of flunixin residues in bovine muscle tissue by liquid chromatography with UV detection | |
| CN114813990A (zh) | 一种化妆品中乌洛托品的检测方法 | |
| CN115266998A (zh) | 一种钠盐类分子中钠离子含量的检测方法 | |
| Hidau et al. | LC-MS/MS Assay for Quantification of a Novel Antitubercular Molecule S006-830: Pharmacokinetic and plasma protein binding studies in rats | |
| Ragab et al. | Validation of a RP-HPLC method for estimation of Gentamycin sulfate in poultry meat using UV detector |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |