CN116699003A - 昼夜节律体液标志物组合及其uplc-ms/ms检测方法 - Google Patents

昼夜节律体液标志物组合及其uplc-ms/ms检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了昼夜节律体液标志物组合及其UPLC‑MS/MS检测方法，该方法可以对人类尿液中褪黑素及其代谢产物/皮质醇及其上游和下游代谢产物进行量化，为昼夜节律异常者提供早期检测信息，并提供昼夜节律数据支持用于民航空勤人员和空中交通管制员群体。

Description

昼夜节律体液标志物组合及其UPLC-MS/MS检测方法
技术领域
本发明涉及一种标志物组合和检测方法，特别是昼夜节律体液标志物组合及其UPLC-MS/MS的检测方法。
背景技术
昼夜节律与人类健康息息相关，并已演变成一个不容忽视的社会问题。据报道，轮班工作后出现健康问题的风险增加(Straif K,Baan R,Grosse Y,et al.Carcinogenicityof shift-work,painting,and fire-fighting.Lancet Oncol.2007；8(12):1065-1066.)。许多行业要求人们在夜间长时间工作，暴露在人造光下，或在不同时区之间短时间旅行，导致身体无法适应正常的外部节律，并致使激素水平的变化，产生相关疾病，如代谢紊乱、情绪紊乱、精神病、精神疾病、抑郁(例如双相抑郁和季节性情感障碍)，甚至癌症(例如乳腺癌症)。前期，我们将匹兹堡睡眠质量指数(PSQI)应用于85名随机选择的空中交通管制员，使用PSQI>7作为识别睡眠障碍的阈值，结果显示，其中40％的人有不同程度的睡眠障碍(数据未显示)。考虑到他们的工作性质，民航空中交通管制员必须长时间、高强度轮班工作，并且容易出现昼夜节律异常，这可能导致一系列其他疾病。如果不及时评估和干预，可能会威胁空中交通管制员的健康，并对民航飞行安全构成严重的安全风险。一般来说，专业的睡眠医生主要根据睡眠量表指数的结果来诊断昼夜节律性睡眠障碍，并在必要时监测经典的昼夜节律生物标志物(褪黑素或皮质醇)。通常，只监测一种激素，且监测过程必须在医生的监督下进行。考虑到昼夜节律失常对身体健康有严重影响，需要系统治疗才能恢复到正常节律，并且容易复发，对节律失常敏感的空中交通管制员进行早期检测和早期干预对于促进民航安全至关重要(Potter GD,Skene DJ,Arendt J,Cade JE,Grant PJ,Hardie LJ.CircadianRhythm and Sleep Disruption:Causes,Metabolic Consequences,andCountermeasures.Endocr Rev.2016；37(6):584-608.)。
许多研究表明，松果体和垂体参与了人类生物节律的调节。人类昼夜节律的主要调节因素和决定因素包括体力活动强度，包括清醒和睡眠的昼夜节律、松果体褪黑素合成、自主神经和中枢神经、下丘脑-垂体-肾上腺、下丘脑-脑垂体-甲状腺和肾素-血管紧张素-醛固酮系统。褪黑素是一种松果体激素，可转化为6-羟基褪黑素、6-羟基硫酸褪黑素，并通过尿液排出体外。根据科学研究，与健康成年人相比，睡眠问题患者的夜间血浆褪黑素峰值较低，而睡眠较少或上夜班的人的血浆褪黑素峰值较低。此外，皮质醇是一种肾上腺皮质衍生的糖皮质激素，存在于下丘脑-垂体-肾上腺轴，它也有节律地产生，使身体能够适应压力环境。
血浆、唾液或尿液中褪黑素的分泌模式是人体中枢节律的外部体现。褪黑素在尿液中以6-羟基硫酸褪黑素的形式排出，是公认的血浆褪黑素的替代指标，与血浆褪黑素密切相关。随着研究技术的进步，越来越多的研究人员开始关注尿液样本。尿液样本比头发、血浆和唾液有一些优势(Arendt J,Bojkowski C,Franey C,Wright J,MarksV.Immunoassay of 6-hydroxymelatonin sulfate in human plasma and urine:abolition of the urinary24-hour rhythm with atenolol.J Clin EndocrinolMetab.1985；60(6):1166-1173.)，例如，尿液生物标志物通常可以体现特定时间点的日内峰值或短时间内的含量，可用于研究血浆测量不便时的替代。尿液样本的收集使用非侵入性方法，该方法容易被昼夜节律异常者所接受，且安全、简单、合规。而毛发样本主要用于追溯记录内源性物种的长期积累，毛发无法快速反应激素产生节律的信息。血浆样本采集具有一定的侵入性，因此不便于持续用于特定人群，如民航空勤人员群体。
虽然唾液样本具有直接、无痛和无损伤的优点，但需要采集拭子样本，且口腔并不十分卫生，口腔中的微生物会产生和代谢大量化学物质。唾液腺中存在混合功能氧化酶和其他几种酶，它们会产生多种化学反应。因此，检测尿液样本中的节律性激素相对于样本而言，对昼夜节律异常者有更大的优势。
同时，仅仅检测单个生物标志物不足以充分描述生物标志物与昼夜节律状态之间的联系。它们的大多数相关代谢产物也显示出具有昼夜节律的分泌，如皮质酮、可的松、睾酮和雄酮。目前对尿液激素的研究存在一些局限性，例如尿液激素的定量研究主要局限于传统的节律激素，如褪黑素和皮质醇，也有尿6-羟基硫酸褪黑素以及少量类固醇激素(如睾酮或可的松测试)的研究。因此，对皮质醇代谢途径上游和下游物质(如可的松、皮质酮、睾酮和雄酮)以及褪黑素下游代谢产物(如6-羟基褪黑素和6-羟基硫酸褪黑素)的全面检查可能为昼夜节律紊乱的研究提供潜在的昼夜节律分泌特征信息。
在大多数情况下，褪黑素和6-羟基褪黑素以及类固醇激素分别通过免疫测定法测定，主要是酶联免疫吸附测定法(ELISA)或放射免疫测定法(RIA)，其方法可能对结构相似的分子具有干扰性。也有报道将液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)技术用于褪黑素或类固醇激素的定量研究，但大多数的检测基质是血浆或唾液，对尿液样本的检测研究较少。然而，由于褪黑素和6-羟基褪黑素在白天的排泄量较低，具有显著的个体间变异性和极低的量(pg/mL-ng/mL)以及生物基质相互作用，因此测量尿液样本中的此类内源性化学物质更具挑战性，且很少有关于褪黑素及其代谢产物和类固醇激素之间的相关性研究。相比之下，液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)被认为是对生物流体中低水平内源性分析物进行特异性和灵敏性鉴定的最合适方法，也是最实用的技术之一。因此，筛选具有代表性的激素及其代谢产物作为生物标志物用于昼夜节律状态的评估将是一种有效的方法。然而，使用UPLC-MS/MS同时定量昼夜节律异常者尿液样本中褪黑素的代谢产物，以及皮质醇的上下游类固醇激素的研究尚不全面。
因此本发明的目的是开发一种精确的测量尿液候选昼夜节律激素的方法，以发现尿液样本中候选激素之间的潜在联系，从而作为潜在的生物节律指标，为昼夜节律异常者提供客观检测信息，并提供昼夜节律数据支持用于民航空勤人员群体。
发明内容
本发明的具体方面包括：
本发明第一方面提供体液昼夜节律标志物组合，包括：褪黑素、6-羟基褪黑素、6-羟基硫酸褪黑素、皮质醇、皮质酮、可的松、睾酮、表睾酮和雄酮。
本发明第二方面提供检测所述昼夜节律标志物组合的试剂在制备受试对象熬夜/疲劳检测试剂中的应用；优选地，所述受试对象为民航空勤人员和空中交通管制员。
本发明第三方面提供同步检测所述昼夜节律标志物组合的UPLC-MS/MS方法，所述方法包括：
1)从体液中提取所述的昼夜节律标志物组合；
2)对标志物组合进行UPLC-MS/MS分析，
UPLC条件：C18超高压液相色谱柱，流动相由0.1％(v/v)甲酸水溶液(A)和0.1％(v/v)甲酸甲醇溶液(B)组成；优选地，所述色谱柱规格为2.1mm×150mm，梯度方式如下：0–0.5min 40％B，0.5–5.0从40％到70％B，5.0–8.5从70％到80％B，8.5–9.0min从80％到95％B；
MS/MS模式：电喷雾离子(ESI)源，正离子模式下操作；优选的参数为：毛细管电压为1kV，锥孔气体流量30L/h；脱溶剂气温度为500℃；脱溶气体流量为800L/h，在多反应监测(MRM)模式下进行定量分析，通过比较保留时间和匹配MS/MS离子来实现峰识别。
本发明第四方面提供检测所述昼夜节律标志物组合的试剂盒，包括：
1)提取试剂，优选地，所述提取试剂为蛋白沉淀剂或固相萃取剂；
2)色谱试剂，优选地，色谱试剂包括0.1％(v/v)甲酸水溶液(A)和0.1％(v/v)甲酸甲醇溶液(B)；
3)分析物储备溶液，优选地为：褪黑素10ng/mL、6-羟基褪黑素50ng/mL、6-羟基硫酸褪黑素200ng/mL，皮质醇1μg/mL、皮质酮1μmg/mL、可的松4μg/mL，睾酮50ng/mL、表睾酮50ng/mL和雄酮200ng/mL；
4)内标储备溶液(IS)，优选地为：褪黑素-D46 ng/mL、6-羟基褪黑素-D415 ng/mL、6-羟基硫酸褪黑素-D430 ng/mL、皮质醇-D4600 ng/mL、皮质酮-D8300 ng/mL、可的松D81200ng/mL、睾酮-13C330 ng/mL、表睾酮-13C330 ng/mL和60ng/mL雄酮D460 ng/mL。
本发明第五方面提供同步检测体液中多种激素或其代谢物或上述两者内标物的UPLC-MS/MS方法，包括：
1)从体液中提取多种激素或其代谢物；
2)对多种激素或其代谢物或上述两者内标物进行UPLC-MS/MS检测，
UPLC条件：C18超高压液相色谱柱；流动相由0.1％(v/v)甲酸水溶液(A)和0.1％(v/v)甲酸甲醇溶液(B)组成；优选地，所述色谱柱规格为2.1mm×150mm，梯度方式如下：0–0.5min 40％B，0.5–5.0从40％到70％B，5.0–8.5从70％到80％B，8.5–9.0min从80％到95％B；
MS/MS模式：电喷雾离子(ESI)源，正离子模式下操作；优选的参数为：毛细管电压为1kV，锥孔气体流量30L/h；脱溶剂气温度为500℃；脱溶气体流量为800L/h，在多反应监测(MRM)模式下进行定量分析，通过比较保留时间和匹配MS/MS离子来实现峰识别；
所述多种激素或其代谢物或上述两者内标物选自如下组合的一种或多种：皮质醇、皮质醇-D4、皮质酮、皮质酮-D8、可的松、可的松-D8、睾酮、睾酮-13C3、表睾酮、表睾酮-13C3、雄酮、雄酮-D4、褪黑素、褪黑素-D4、6-羟基褪黑素、6-羟基褪黑素-D4、6-羟基硫酸褪黑素和6-羟基硫酸褪黑素-D4。
在本发明一个具体的实施方式中，所述激素或其代谢物为褪黑素、6-羟基褪黑素、6-羟基硫酸褪黑素、皮质醇、皮质酮、可的松、睾酮、表睾酮和雄酮的组合。
在本发明一个具体的实施方式中，所述多种激素或其代谢物或上述两者内标物为如下组合：皮质醇、皮质醇-D4、皮质酮、皮质酮-D8、可的松、可的松-D8、睾酮、睾酮-13C3、表睾酮、表睾酮-13C3、雄酮、雄酮-D4、褪黑素、褪黑素-D4、6-羟基褪黑素、6-羟基褪黑素-D4、6-羟基硫酸褪黑素和6-羟基硫酸褪黑素-D4。
在本发明一个具体的实施方式中，多反应监测(MRM)模式的参数为：
本发明第一方面所述的标志物组合、本发明第二方面所述的应用、本发明第四方面所述的试剂盒，本发明第三方面或第五方面所述的方法，其中的体液为尿液。
有益效果
本发明提供了一种精确测量尿液候选昼夜节律激素的方法，可以发现尿液样本中候选激素之间的潜在联系，为昼夜节律异常者尤其是空中交通管制员提供早期检测信息，并提供昼夜节律数据支持用于未来研究。
附图说明
图1，UPLC–MS/MS分析志愿者尿液样本中分析物及其内标的色谱图
图2，志愿者23:00-9:00尿液样本中昼夜节律激素分泌的关系(A.类固醇激素之间的关系；B.褪黑素与代谢物之间的关系。C.类固醇激素与褪黑激素代谢产物之间的关系)
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明解释本发明而非限制本发明的范围。实施例中无特殊说明的均为常规方法。
实施例1材料和方法
1、试剂
褪黑素(纯度>98％)、6-羟基硫酸褪黑素(纯度>98％)和皮质醇(纯度>98％)购于上海源叶生物有限公司(中国上海)，6-羟基褪黑素购自Toronto Research Chemicals公司。皮质酮、睾酮、表睾酮(纯度>98％)和雄酮(纯度>98％)购自天津阿尔塔科技有限公司。可的松(纯度>98％)购自国家食品药品监督管理局(中国北京)。睾酮-2,3,4-13C3、表睾酮-2,1,4,13C3、皮质酮-D8、皮质醇-D4、雄酮-D4、可的松-D8购自天津阿尔塔科技有限公司。褪黑素-D4、6-羟基褪黑素D4和6-羟基硫酸褪黑素-D4(纯度>98％)购自成都克洛玛生物科技有限公司。同位素标记化合物作为内标(IS)。LC-MS级甲醇购自默克公司(德国达姆施塔特)，LC-MS等级甲酸购自赛默飞世尔科技公司。实验室使用Milli-Q水净化系统(Millipore，Bedford，USA)制备超纯水。
2、仪器
UPLC-MS/MS分析使用Waters acquity超高效液相色谱系统进行，该系统连接到Waters Xevo TQ-S串联四极杆(三重四极杆)质谱仪(Waters Corp.，Milford，MA，USA)，该质谱仪配备有电喷雾离子(ESI)源，并在正离子模式下操作，用于多反应监测(MRM)。该系统使用Masslynx 4.1软件(Waters Corp.，Milford，MA，USA)进行数据采集和分析。分析物在Waters ACQUITY UPLC HSS C18柱(2.1mm×150mm，1.8μm)上分离。流动相由0.1％(v/v)甲酸水溶液(A)和0.1％(v/v)甲酸甲醇溶液(B)组成。以400μL/min的流速进行梯度洗脱，梯度方式如下：0–0.5min 40％B，0.5–5.0从40％到70％B，5.0–8.5从70％到80％B，8.5–9.0min从80％到95％B。柱温保持在30℃，样品注入体积设置为5μL。每种分析物和内标(IS)(前体离子>产物碎片离子)监测到的转变为：褪黑素(233.2>174.1，233.2>159.0)，褪黑素D4(237.0>177.9)，6-羟基褪黑素(249.1>190.1，249.1>157.9)，6-羟基褪黑素-D4(253.0>193.2)，6-羟基硫酸褪黑素(327.0>160.9，327.0>175.9)，6-羟基硫酸褪黑素-D4(330.9>162.8)，皮质醇(363.3>121.1，363.3>327.2)、皮质醇-D4(367.3>331.1)、皮质酮(347.3>121.0，347.3>311.3)、皮质酮-D8(355.0>337.1)、可的松(361.2>163.1，361.2>121.0)、可的松-D8(369.4>169.2)、睾酮(289.3>109.1，289.3>97.1)、睾酮-13C3(292.3>100.1)、表睾酮(289.3>109.1，289.3>97.1，表睾酮-13C3(292.0>96.9)，雄酮(273.2>147.1，273.2>105.0)，雄酮-D4(277.1>259.1)；同时优化了参数：毛细管电压为1kV，锥孔气体流量30L/h；脱溶剂气温度为500℃；脱溶气体流量为800L/h。在多反应监测(MRM)模式下进行定量分析，通过比较保留时间和匹配MS/MS离子来实现峰识别。MS/MS的优化MRM参数如表1所示。
3、储备液、标准液和质控样品的制备
分析物的原始储备溶液的浓度为褪黑素10ng/mL、6-羟基褪黑素50ng/mL、6-羟基硫酸褪黑素200ng/mL，皮质醇1μg/mL、皮质酮1μmg/mL、可的松4μg/mL，睾酮50ng/mL、表睾酮50ng/m L和雄酮200ng/mL。内标储备溶液(IS)的制备浓度为：褪黑素-D46 ng/mL、6-羟基褪黑素-D415 ng/mL、6-羟基硫酸褪黑素-D430 ng/mL、皮质醇-D4600 ng/mL、皮质酮-D8300ng/mL、可的松D81200 ng/mL、睾酮-13C330 ng/mL、表睾酮-13C330 ng/mL和60ng/mL雄酮D460 ng/mL。
在300μL水中制备校准标准浓度：褪黑素为0.0002、0.001、0.002、0.01、0.02、0.1、0.2和1ng/mL；6-羟基褪黑素为0.0025、0.005、0.025、0.05、0.25、0.5和2.5ng/mL；6-羟基硫酸褪黑素为0.02、0.04、0.2、0.4、2、4和20ng/mL；皮质醇为0.02、0.1、0.2、1、2、10、20和100ng/mL；皮质酮为0.05、0.1、0.5、1、5、10和50ng/mL；可的松为0.2、0.4、2、4、20、40和200ng/mL；雄酮为0.02、0.1、0.2、1、2和10ng/mL；睾酮和表睾酮为0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1和5ng/mL。
以相同的方式，制备每个分析物(定量下限(LLOQ)、中浓度和高浓度)的三种不同浓度的质量控制(QC)样品。在本发明中，所有工作溶液和储备溶液均保持在-80℃，并在检测前加热至室温。
4、样本的制备
使用蛋白质沉淀法和固相萃取法处理尿液样品。
蛋白质沉淀法：向300μL尿液或MilliQ水样等分试样中加入10μL内标溶液并涡旋30秒。然后，将300μL蒸馏水添加到蒸馏水(空白)或尿液(样品)混合物中，涡旋15秒并1500g离心3分钟。使用300μL尿液样品的等分试样，使用固相萃取板(Waters Oasis PRiME HLB洗脱板)提取分析物和内标。
固相萃取法：用200μL甲醇和400μL蒸馏水处理洗脱板。然后将样品加载到预处理的Waters Oasis PRiME HLBμElution提取板上。用200μL溶液A(甲醇：水＝1:3)洗涤后，用40μL溶液B(乙腈：甲醇＝9:1)洗脱样品，并与40μL蒸馏水混合，取5μL所得样品用于LC-MS/MS分析。
实施例2实验结果验证
按照美国食品药品监督管理局(FDA)指南和欧洲药品管理局(EMA)法规，通过检验其特异性、线性、准确性和精密度，来验证LC-MS/MS技术的效果。还检验了提取回收率和基质效应，以及短期和长期样品的储存稳定性。
1、特异性
为了评估这一开发的UPLC-MS/MS分析的特异性，对志愿者(n＝6)的不同批次尿液样本进行了处理。制备蒸馏水(无添加的分析物，无内标)、空白对照(低背景值样品中无添加分析物，添加内标)和阳性对照(添加内标)，以评估在化合物和内标的相应保留时间内基质组分的干扰。
2、提取回收率和基质效应
通过比较提取前后分析物的平均浓度，配制三种不同浓度(低、中、高)分析物和内标的质控样品评估提取回收率。
通过比较提取后尿液样品中分析物的峰面积比和水中峰面积比，三种不同浓度(低、中和高)分析物和内标的相对空白尿液样品测定基质效应。
3、标准曲线的线性度和精度
通过使用加权(1/x2)最小二乘线性回归，以分析物与内标峰面积之比和分析物与内标物质量浓度之比作线性回归分析。测定的定量下限(LLOQ)被确定为标准曲线上的最低浓度，其可在标称浓度的20％内准确定量，相对标准偏差(RSD)小于20％。
在同一天以及连续三天，使用四个浓度水平的QC样品测试了日内和日间测定的测定准确度和精密度。准确度表示为RE(％)，一般应85％～115％范围内，在最低定量限LLOQ附近，精度应在80％-120％之间，精密度表示为RSD(％)一般在±15％范围，在最低定量限LLOQ附近，相对标准差(RSD)应小于20％。
4、稳定性
使用在不同温度下保持不同时间的五份质控样品检查尿液样品中分析物的稳定性。对质控样品的处理前、处理后和长期稳定性进行了评估。通过将质控样品在室温下保持4小时来评估处理前稳定性，通过使质控样品通过自动取样器12小时来评估处理后稳定性，通过将质控样品在-80℃下保持至少20天来测试长期稳定性。
5、样本收集和统计分析
在这项研究中，招募了94名男性空中交通管制员志愿者来进行本检测，他们的平均年龄为29岁(23-47岁)。连续四天，每晚23:00至9:00采集志愿者尿液样本。记录总体积后，收集50mL尿液样本并储存在-20度冰箱中。每天实验结束后，样本被运送到实验室，并储存在-80度冰箱中，直到处理完毕。由于实验过程中提取了一些尿样信息记录或中途丢失等问题，有84名志愿者完成了实验，最终共采集了596份尿样。这项研究获得了中国民航局民航总医院伦理委员会的批准，并与每位参与者签署了知情同意书。
实施例3样品制备、分析和结果
1、样品制备
使用96孔固相萃取(SPE)板进行样品自动化净化，其具备高通量的同时，能从尿液样品中的生物基质中去除许多干扰成分。在这项研究中，相较Oasis MAXμElution提取板或Oasis WCXμElution提取板，使用含亲水-亲酯固相萃取柱的Oasis WCXμElution提取板对类固醇激素、褪黑激素和6-羟基褪黑激素的分离取得了最佳结果。
另外，除6-羟基硫酸褪黑素外，目的分析物用溶液B有效洗脱。应当注意的是，由于6-羟基硫酸褪黑素的极性，该化合物主要保留在第一步洗脱液(溶液A)中，并且在检测溶液A中的6-巯基褪黑激素时没有观察到干扰。因此，6-羟基硫酸褪黑素在溶液A中得到评估和验证，其余化合物在溶液B中得到评估并验证。该方法允许在一定范围内适当提取类固醇激素、褪黑素及其代谢产物。
2、色谱法
正离子模式(ESI+)用于评估褪黑素、6-羟基褪黑素、皮质醇、皮质酮、可的松、睾酮、表睾酮、雄酮及其各自的内标；在优化的LC条件下，褪黑素和褪黑素D4的保留时间分别为2.85和2.83分钟，6-羟基褪黑素与6-羟基褪黑素D4的停留时间分别为1.76和1.74分钟，6-羟基硫酸褪黑素及6-羟基硫酸褪黑素D4的停留时间分别为1.33分钟，皮质酮和皮质酮-D8的停留时间为5.35和5.30分钟，皮质醇和皮质醇-D4的停留时间均为4.68分钟，可的松和可的松-D8的滞留时间分别为4.35和4.32分钟，雄酮和雄酮D4分别为7.86和7.88分钟，睾酮和睾酮-13C3分别为6.33和6.32分钟，表睾酮和表睾酮-13C3分别是6.92和6.90分钟。图1显示了提取的尿液样本的代表性色谱图。两种分析物及其内标在无干扰峰的区域中均可检测到。
3、特异性
在评估九种分析物的相关保留期内从水中收集的空白样品时，未发现干扰。对于来自六种不同来源的人类尿液中的选择性，未发现褪黑素D4、6-羟基褪黑素D4、6-羟基硫酸褪黑素D4、皮质醇-D4、皮质酮-D8、可的松D8、睾酮-13C3、表睾酮-13C3和雄酮D4存在实质性干扰。且在保留时间内没有出现共洗脱峰。进样前和进样后使用强洗涤溶液和弱洗涤溶液清洗针头或泵，每次分析10个检测样本后都使用甲醇洗针，以排除任何潜在的干扰影响。
4、回收率和基质效应
使用同位素内标用于调整干扰物质和基质效应的影响。分析物的基质效应和回收率数据如表2所示。
在低、中和高水平下，两种化合物的提取回收率均在86.67-112.96％范围内，符合要求。
在任意浓度下，分析物的基质效应值为85.93-111.10％，RSD小于15％，因此没有显著的基质影响。
5、校准曲线的线性度以及精密度和准确度
校准标准溶液掺入水中以制作校准曲线，因为尿液中不可避免地存在内源性激素。以分析物与内标峰面积之比和分析物与内标物质量浓度之比作线性回归分析，得到回归方程和相关系数。使用具有1/x2加权因子的最小二乘线性回归模型来拟合曲线。相关系数均大于0.99，表明线性关系良好。数据如表3所示。
表3分析物的标准曲线及LLOQ
分析物 范围(ng/mL) 回归方程 相关性(r2) LLOQ(ng/mL)
褪黑素 0.0002～1 Y＝32.48X-0.0028 0.9957 0.0002
6-羟基褪黑素 0.0025～2.5 Y＝2.26X-0.0002 0.9985 0.0025
6-羟基硫酸褪黑素 0.02～20 Y＝2.58X+0.0026 0.9995 0.02
皮质醇 0.02～100 Y＝1.84X-0.0016 0.9993 0.02
皮质酮 0.05～50 Y＝0.24X+0.0019 0.9914 0.05
可的松 0.2～200 Y＝3.01X+0.0998 0.9939 0.2
睾酮 0.001～5 Y＝1.31X+0.0002 0.9994 0.001
表睾酮 0.001～5 Y＝1.45X+0.0070 0.9991 0.001
雄酮 0.02～10 Y＝0.07X+0.0007 0.9990 0.02
表4表明，所有分析物的日内准确度和日间准确度统计数据均在85％-115％之间：分别为87.50-113.96％和92.50-113.12％。所有质控样品的日间和日间精密度值均小于15％：分别为0.46％至13.75％和1.17％至14.83％。说明方法的准确度和精密度良好。
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6、稳定性
表5总结了褪黑素、6-羟基褪黑素、6-硫酸氧基褪黑素、皮质醇、皮质酮、可的松、睾酮、表睾酮和雄酮在尿液样本中的稳定性。所有分析物在室温保存4小时稳定，在进样器中稳定保存12小时稳定，并在-80℃下长期冷冻储存，无明显变化。
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实施例4结果和讨论
根据记录的排尿量，我们通过测量尿液样本中9种潜在昼夜节律激素的浓度，计算了23:00至9:00之间空中交通管制员的分析物的含量。提取的尿液样本的色谱图如图2所示。在内标保留期间没有观察到干扰峰。在10小时内，9种潜在昼夜节律激素的含量为：皮质醇5801.7±4764.9ng/10h，可的松19743.1±12430.4ng/10h；皮质酮775.8±928.3ng/10h，6-羟基褪黑素28.3±28.5ng/10h，6-羟基硫酸褪黑素5584.9±3394.1ng/10h。皮质醇含量与可的松(r＝0.795，p<0.01)、皮质酮(r＝0.344，p<0.01)和睾酮(r＝0.438，p<0.01)显著正相关；睾酮含量与雄酮(r＝0.574，p<0.01)和表睾酮(r＝0.646，p<0.01)显著正相关；雄酮含量与表睾酮显著正相关(r＝0.750，p<0.01)；褪黑素含量与6-羟基硫酸褪黑素(r＝0.748，p<0.01)和6-羟基褪黑素显著正相关(r＝0.597，p<0.01)；6-羟基硫酸褪黑素含量与6-羟基褪黑素显著正相关(r＝0.604，p<0.01)；此外，6-羟基褪黑素含量与皮质醇(r＝0.386，p<0.01)和可的松(r＝0.377，p<0.01)显著正相关；6-羟基硫酸褪黑素含量与皮质醇呈显著正相关(r＝0.262，p<0.05)；
相关分析结果表明，皮质醇与可的松、睾酮、6-羟基褪黑素和6-羟基硫酸褪黑素显著相关；可的松与6-羟基褪黑素和睾酮显著相关；23:00至9:00之间，空中交通管制员的尿样中皮质酮与睾酮显著相关，6-羟基褪黑素与褪黑素和6-硫酸氧基褪黑素显著相关。这些结果证明了本发明的LC-MS/MS方法对人类尿液中褪黑素及其代谢产物/皮质醇及其上游和下游代谢产物进行量化的可行性。
实施例5建模和预测
数据来源：本研究总共收集到了84名北京地区民航空中交通管制员佩戴飞利浦acti-wa tch睡眠腕表，每日23:00至次日9：00(连续4个工作日收集)之间的尿液样本，对尿液中9种昼夜节律激素进行上述UPLC-MS检测定量分析，并使用肌酐校准法对尿液激素浓度进行校正，即得到原始数据共596条数据。
预测模型建立：将以上596条尿液激素数据进行整理，根据民航空中交通管制员每日的睡眠腕表数据，对其夜班后(熬夜后)尿液样本标记为1、非夜班(正常睡眠)后尿液样本标记为0。将以上数据以2分列方式进行XGboot决策树模型进行训练，随机以80％数据作为训练集，20％数据作为验证集，得到预测模型。实验结果显示，对随机某一数据进行20次验证，模型表明使用上述9种昼夜节律激素作为指标对于该个体前一晚是否夜班(熬夜)预测正确率均为80％-90％之间，曲线下面积在60-70之间。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.体液昼夜节律标志物组合，包括：褪黑素、6-羟基褪黑素、6-羟基硫酸褪黑素、皮质醇、皮质酮、可的松、睾酮、表睾酮和雄酮。
2.检测权利要求1所述昼夜节律标志物组合的试剂在制备受试对象熬夜/疲劳检测试剂中的应用；优选地，所述受试对象为民航空勤人员和空中交通管制员。
3.同步检测权利要求1所述昼夜节律标志物组合的UPLC-MS/MS方法，所述方法包括：
1)从体液中提取权利要求1所述的标志物组合；
2)对标志物组合进行UPLC-MS/MS分析，
UPLC条件：C18超高压液相色谱柱；流动相由0.1％(v/v)甲酸水溶液(A)和0.1％(v/v)甲酸甲醇溶液(B)组成；优选地，所述色谱柱规格为2.1mm×150mm，梯度方式如下：0–0.5min40％B，0.5–5.0从40％到70％B，5.0–8.5从70％到80％B，8.5–9.0min从80％到95％B；
MS/MS模式：电喷雾离子(ESI)源，正离子模式下操作；优选的参数为：毛细管电压为1kV，锥孔气体流量30L/h；脱溶剂气温度为500℃；脱溶气体流量为800L/h，在多反应监测(MRM)模式下进行定量分析，通过比较保留时间和匹配MS/MS离子来实现峰识别。
4.检测权利要求1所述昼夜节律标志物组合的试剂盒，包括：
1)提取试剂，优选地，所述提取试剂为蛋白沉淀剂或固相萃取剂；
2)色谱试剂，优选地，所述色谱试剂包括0.1％(v/v)甲酸水溶液(A)和0.1％(v/v)甲酸甲醇溶液(B)；
3)分析物储备溶液；优选地为：褪黑素10ng/mL、6-羟基褪黑素50ng/mL、6-羟基硫酸褪黑素200ng/mL，皮质醇1μg/mL、皮质酮1μmg/mL、可的松4μg/mL，睾酮50ng/mL、表睾酮50ng/mL和雄酮200ng/mL；
4)内标储备溶液(IS)；优选地为：褪黑素-D46 ng/mL、6-羟基褪黑素-D415 ng/mL、6-羟基硫酸褪黑素-D430 ng/mL、皮质醇-D4600 ng/mL、皮质酮-D8300 ng/mL、可的松-D81200ng/mL、睾酮-13C330 ng/mL、表睾酮-13C330 ng/mL和60ng/mL雄酮-D460 ng/mL。
5.同步检测体液中多种激素或其代谢物或上述两者内标物的UPLC-MS/MS方法，包括：
1)从体液中提取多种激素或其代谢物；
2)对多种激素或其代谢物或上述两者内标物进行UPLC-MS/MS检测；
UPLC条件：C18超高压液相色谱柱；流动相由0.1％(v/v)甲酸水溶液(A)和0.1％(v/v)甲酸甲醇溶液(B)组成；梯度方式如下：0–0.5min 40％B，0.5–5.0从40％到70％B，5.0–8.5从70％到80％B，8.5–9.0min从80％到95％B；
MS/MS模式：电喷雾离子(ESI)源，正离子模式下操作；优选的参数为：毛细管电压为1kV，锥孔气体流量30L/h；脱溶剂气温度为500℃；脱溶气体流量为800L/h，在多反应监测(MRM)模式下进行定量分析，通过比较保留时间和匹配MS/MS离子来实现峰识别；
所述多种激素或其代谢物或上述两者内标物选自如下组合的一种或多种：皮质醇、皮质醇-D4、皮质酮、皮质酮-D8、可的松、可的松-D8、睾酮、睾酮-13C3、表睾酮、表睾酮-13C3、雄酮、雄酮-D4、褪黑素、褪黑素-D4、6-羟基褪黑素、6-羟基褪黑素-D4、6-羟基硫酸褪黑素和6-羟基硫酸褪黑素-D4。
6.如权利要求5所述的UPLC-MS/MS方法，所述激素或其代谢物为褪黑素、6-羟基褪黑素、6-羟基硫酸褪黑素、皮质醇、皮质酮、可的松、睾酮、表睾酮和雄酮的组合。
7.如权利要求5所述的UPLC-MS/MS方法，所述多种激素或其代谢物或上述两者内标物为如下组合：皮质醇、皮质醇-D4、皮质酮、皮质酮-D8、可的松、可的松-D8、睾酮、睾酮-13C3、表睾酮、表睾酮-13C3、雄酮、雄酮-D4、褪黑素、褪黑素-D4、6-羟基褪黑素、6-羟基褪黑素-D4、6-羟基硫酸褪黑素和6-羟基硫酸褪黑素-D4。
8.如权利要求7所述的UPLC-MS/MS方法，多反应监测(MRM)模式的参数为：
9.权利要求1所述的组合、权利要求2所述的应用、权利要求4所述的试剂盒，权利要求3、5-8任一项所述的方法，其中的体液为尿液。
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