CN113866287A - 基于hplc-uv法同时测定赤松茸中黄嘌呤、鸟嘌呤、腺嘌呤和次黄嘌呤含量的方法 - Google Patents
基于hplc-uv法同时测定赤松茸中黄嘌呤、鸟嘌呤、腺嘌呤和次黄嘌呤含量的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113866287A CN113866287A CN202111031133.1A CN202111031133A CN113866287A CN 113866287 A CN113866287 A CN 113866287A CN 202111031133 A CN202111031133 A CN 202111031133A CN 113866287 A CN113866287 A CN 113866287A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- adenine
- tricholoma matsutake
- purine
- xanthine
- hypoxanthine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 100
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 98
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 98
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 87
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 title claims abstract description 81
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 title claims abstract description 81
- 241000121220 Tricholoma matsutake Species 0.000 title claims abstract description 73
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 53
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 title claims abstract description 48
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 47
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 118
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 claims abstract description 24
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 20
- 238000012937 correction Methods 0.000 claims abstract description 18
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 16
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 claims description 24
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 24
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 16
- 239000012085 test solution Substances 0.000 claims description 14
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 claims description 13
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 12
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 claims description 12
- 238000010812 external standard method Methods 0.000 claims description 11
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 claims description 11
- 239000013558 reference substance Substances 0.000 claims description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 claims description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 9
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N perchloric acid Chemical compound OCl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 7
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 5
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 4
- 239000003513 alkali Substances 0.000 claims description 4
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000008213 purified water Substances 0.000 claims description 4
- 239000012088 reference solution Substances 0.000 claims description 4
- 229940065721 systemic for obstructive airway disease xanthines Drugs 0.000 claims description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 3
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000005457 ice water Substances 0.000 claims description 3
- 238000010829 isocratic elution Methods 0.000 claims description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000010992 reflux Methods 0.000 claims description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 3
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical group O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N sulfuric acid Substances OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 2
- 125000000561 purinyl group Chemical group N1=C(N=C2N=CNC2=C1)* 0.000 claims 2
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 abstract description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 abstract description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 21
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 17
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 13
- LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N Uric Acid Chemical compound N1C(=O)NC(=O)C2=C1NC(=O)N2 LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N Uric acid Natural products N1C(=O)NC(=O)C2NC(=O)NC21 TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 8
- 229940116269 uric acid Drugs 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 201000005569 Gout Diseases 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 4
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 3
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 3
- 235000000405 Pinus densiflora Nutrition 0.000 description 3
- 240000008670 Pinus densiflora Species 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 3
- 241000958510 Stropharia rugosoannulata Species 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 2
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 2
- 101710186708 Agglutinin Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 235000018782 Dacrydium cupressinum Nutrition 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 101710146024 Horcolin Proteins 0.000 description 1
- 101710189395 Lectin Proteins 0.000 description 1
- 101710179758 Mannose-specific lectin Proteins 0.000 description 1
- 101710150763 Mannose-specific lectin 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710150745 Mannose-specific lectin 2 Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 235000013697 Pinus resinosa Nutrition 0.000 description 1
- 241000534656 Pinus resinosa Species 0.000 description 1
- 229930182558 Sterol Natural products 0.000 description 1
- GAMYVSCDDLXAQW-AOIWZFSPSA-N Thermopsosid Natural products O(C)c1c(O)ccc(C=2Oc3c(c(O)cc(O[C@H]4[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O4)c3)C(=O)C=2)c1 GAMYVSCDDLXAQW-AOIWZFSPSA-N 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 239000000910 agglutinin Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000005485 electric heating Methods 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 229930003944 flavone Natural products 0.000 description 1
- 150000002212 flavone derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 235000011949 flavones Nutrition 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007102 metabolic function Effects 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol group Chemical group C1(=CC=CC=C1)O ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013824 polyphenols Nutrition 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 229930002161 purine alkaloid Natural products 0.000 description 1
- 230000004144 purine metabolism Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012087 reference standard solution Substances 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000007873 sieving Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 150000003432 sterols Chemical class 0.000 description 1
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- VHBFFQKBGNRLFZ-UHFFFAOYSA-N vitamin p Natural products O1C2=CC=CC=C2C(=O)C=C1C1=CC=CC=C1 VHBFFQKBGNRLFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
- G01N30/06—Preparation
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/86—Signal analysis
- G01N30/8624—Detection of slopes or peaks; baseline correction
- G01N30/8631—Peaks
- G01N30/8634—Peak quality criteria
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
- G01N2030/042—Standards
- G01N2030/047—Standards external
Landscapes
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Quality & Reliability (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
Abstract
本发明公开了一种基于HPLC法同时测定赤松茸干品中黄嘌呤、鸟嘌呤、腺嘌呤和次黄嘌呤含量的方法。通过HPLC‑UV联用检测技术，建立了一测多评含量测定的方法，实现了仅采用其中一种嘌呤标准品，确定该嘌呤标品与赤松茸供试样品中其它三种嘌呤成分之间的相对校正因子和相对保留时间，通过计算便捷地对赤松茸供试样品中的四个嘌呤成分的含量进行了测定。本发明操作简单，灵敏度高，降低了标准品成本，简化了实验步骤，能够准确地评价赤松茸产品的品质。目前还赤松茸及其相关产品还没有检测标准，本发明可以用于赤松茸的质量控制，对赤松茸的研究与产业发展具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明属于赤松茸中嘌呤类成分含量测定技术领域，具体涉及一种基于HPLC-UV法同 时测定赤松茸及其衍生物中黄嘌呤、鸟嘌呤、腺嘌呤和次黄嘌呤含量的方法。
背景技术
赤松茸(Stropharia rugoso-annulata)，又名皱环球盖菇、大球盖菇、皱球盖菇、酒红色 球盖菇、斐氏球盖菇、斐氏假黑伞，因其口感鲜美，营养丰富，是联合国粮农组织向发展中 国家推荐的菇种之一，该菇种1980年在我国成功人工引种栽培，目前已成为国际菇类交易 市场上的十大品种之一。现有文献报道，赤松茸中含有多糖、甾醇、黄酮、酚类物质、凝集 素等生物活性成分，具有抗氧化、抑菌、抑制肿瘤、降血糖等药理作用。
嘌呤广泛存在于植物和动物体内，是构成生命密码-核酸的重要物质。许多食用菌类含 有嘌呤类化学成分，但不同品种的菌类含有的嘌呤含量差别比较大。尿酸(Uricacid，结构 见图1)，作为嘌呤代谢的终产物，是一种三氧基嘌呤，微溶于水，易形成晶体。如果体内 产生的尿酸过多来不及排泄或者尿酸排泄机制退化，则体内尿酸滞留过多，当血液尿酸浓度 大于7毫克/分升时会导致人体体液变酸，长期置之不理将会引发痛风。另外，血液中尿酸 盐浓度增高达到过饱和状态，尿酸盐结晶沉积于肾脏还有可能引起痛风肾病。所以高嘌呤饮 食，不利于我们身体健康，尤其对痛风患者，更应该控制饮食中嘌呤的摄入。常见的嘌呤有 四种，即黄嘌呤、鸟嘌呤、腺嘌呤、次黄嘌呤(结构见图1)。但赤松茸中是否含嘌呤类成 分还未见诸报道。因此，随着赤松茸种植面积的不断扩大，赤松茸作为食材进入越来越多家 庭的餐桌，甚至被用于商业食品的原材料，测定嘌呤的含量对赤松茸产业的发展具有重要的 意义。
我们通过研究发现黄嘌呤、鸟嘌呤、腺嘌呤、次黄嘌呤这四种嘌呤结构式相近，极性都 很大，且在赤松茸中的含量很低，常规的色谱方法很难实现四者的基线分离。目前还没有针 对赤松茸及其衍生物中嘌呤类成分的检测方法和质量控制方法见诸报道。其它食用菌虽然有 嘌呤含量的检测方法，但多存在样品前处理方法繁琐、检测操作过程复杂等缺陷。同时针对 每一种嘌呤都需要与其相同的高纯度标准品，而符合含量测定的高纯度标准品很难获得，因 此检测成本很高。本发明公开了一种基于HPLC法同时测定赤松茸及其衍生物中黄嘌呤、鸟 嘌呤、腺嘌呤和次黄嘌呤定性定量检测的技术方法，通过HPLC-UV联用检测技术，建立了 一测多评含量测定的方法，实现了仅采用其中一种嘌呤标准品，便捷地同时对赤松茸及其衍 生物供试样品中具有代表性的四个嘌呤成分的定性定量测定。本发明所提供的检测方法操作 简单，灵敏度高，只需要一种标准品，降低了标准品成本，简化了实验步骤，能够准确地评 价赤松茸产品的品质。针对目前还没有定性定量检测赤松茸及其相关产品中嘌呤类物质的方 法的现状，本发明可以用于赤松茸的鉴别与质量控制，对赤松茸的研究与产业发展具有重要 的意义。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术缺陷，针对目前还没有针对赤松茸及其衍生物中嘌呤类 成分的检测方法和质量控制方法的现状，提供一种仅需要一种标准品同时定性定量测定赤松 茸干品中黄嘌呤、鸟嘌呤、腺嘌呤和次黄嘌呤等四种嘌呤的方法，该方法基于HPLC-UV联 用检测技术，建立了一测多评含量测定的方法，通过仅采用其中一种嘌呤标准品，得到该嘌 呤标准品与赤松茸或其衍生物供试样品中其它三种嘌呤成分之间的相对校正因子和相对保留 时间，最后通过计算便捷地同时对赤松茸供试样品中的四个嘌呤成分进行了定性定量。
为了实现上述目的，本发明的技术方案主要包含以下内容：
一种基于HPLC-UV法同时测定赤松茸及其衍生物中黄嘌呤、鸟嘌呤、腺嘌呤和次黄嘌 呤含量的方法，其具体包括如下步骤：
1)对照品标准溶液的配制：以甲醇为溶剂，分别配制获得一系列不同浓度的黄嘌呤、 鸟嘌呤、腺嘌呤和次黄嘌呤对照品标准溶液；
2)供试品溶液的配制：
取0.2g经烘干、粉碎、过筛的赤松茸或其衍生物样品，置于50ml圆瓶烧瓶中，加入8- 12ml、60-70％的强氧化性酸，90-110℃水浴加热回流水解20-40min，迅速置于冰水浴中冷 却，再用碱液调至中性，过滤，滤液调pH至3.8-4.2，离心，取上清液，用纯化水定容至50ml 棕色容量瓶中，即得供试品溶液，保存于4℃冰箱中备用；
3)相对校正因子和相对保留时间的计算：
精密吸取步骤1)制备所得不同浓度的黄嘌呤、鸟嘌呤、腺嘌呤和次黄嘌呤对照品溶液 进行液相色谱测定，获得HPLC-UV色谱图，测量并记录各嘌呤色谱峰的峰面积，以腺嘌呤 作为标准品，分别计算黄嘌呤、鸟嘌呤、和次黄嘌呤对腺嘌呤的相对校正因子(fs/x)和相对 保留时间(tRx)；
所述相对校正因子(fs/x)计算公式为：
式中：fs/x为待测嘌呤x的相对校正因子，As为腺嘌呤色谱峰峰面积，Cs为腺嘌呤质量浓 度，Ax为待测嘌呤x的色谱峰峰面积，Cx为待测嘌呤x的质量浓度；
所述相对保留时间(tRx)计算公式为：
式中：
表示待测嘌呤x色谱峰的保留时间与腺嘌呤色谱峰保留时间的比值，即待测 嘌呤x的相对保留时间；tx表示待测嘌呤x色谱峰的保留时间；ts表示腺嘌呤色谱峰的保留时 间；
4)供试品中嘌呤的检测：
取步骤1)制备得到的一系列不同浓度的腺嘌呤对照品标准溶液进行液相色谱测定，获 得HPLC-UV色谱图，测量并记录腺嘌呤色谱峰的峰面积，采用外标法以腺嘌呤的峰面积为 纵坐标，以腺嘌呤的浓度为横坐标，绘制标准曲线并计算获得腺嘌呤的线性方程；
取步骤2)制备得到的供试品溶液进行液相色谱测定，获得HPLC-UV色谱图，测量并记录腺嘌呤、鸟嘌呤、黄嘌呤及次黄嘌呤色谱峰的峰面积，将腺嘌呤的峰面积代入腺嘌呤的线性方程，计算获得供试品中的腺嘌呤含量；
其中，鸟嘌呤、黄嘌呤及次黄嘌呤的含量按下述公式进行计算：
式中：
表示待测嘌呤x在赤松茸或其衍生物样品中的质量浓度；C′x表示待测嘌呤x在 供试品溶液中的质量浓度；C0表示供试品溶液中赤松茸或其衍生物样品的质量浓度；A′x表示 供试品溶液中待测嘌呤x的色谱峰峰面积。
进一步的，测定过程中，所用液相色谱测定条件为：
反相C18填料色谱柱；流动相由98-100％流动相A和0-2％流动相B组成，以0.02±0.001 mol/L的KH2PO4-H3PO4缓冲溶液(pH 4.0±0.2)为流动相A，以甲醇或乙腈为流动相B，进 行等度洗脱；柱温：25-35℃；流速：0.8-1.2mL/min；紫外检测器波长：254±2nm；进样量：2-20μL。
键合不同基团的反相C18填料色谱柱，对嘌呤类成分的分离效果影响非常显著。鉴于嘌 呤类成分极性比较大、呈弱碱性的理化特性，优选使用对低pH且低浓度有机相有一定耐受 性的反相C18填料色谱柱：Waters Sunfire C18；Waters Atlantis T3，WatersSunfier C18色谱 柱。
进一步的，步骤1)中，配制获得0.05、0.50、5.00、20.00、30.00μg/ml不同浓度的黄嘌 呤、鸟嘌呤、腺嘌呤和次黄嘌呤对照品标准溶液。具体的，可以先分别取黄嘌呤、鸟嘌呤、腺嘌呤和次黄嘌呤适量，精密称定，加甲醇分别制成每毫升含100μg的溶液，作为标准品 储备液。精密量取黄嘌呤、鸟嘌呤、腺嘌呤和次黄嘌呤标准品储备液适量，以甲醇稀释，制 得每毫升含0.05、0.50、5.00、20.00、30.00μg黄嘌呤、鸟嘌呤、腺嘌呤和次黄嘌呤的对照品 溶液。
具体的，步骤2)中，所述强氧化稀酸优选为硝酸、高氯酸或浓硫酸等。
具体的，步骤2)中，所述碱液优选为浓度8-12mol/L的氢氧钾或氢氧化钠水溶液。
具体的，步骤2)中，滤液中优选加入1mol/L的磷酸调pH至3.8-4.2。
本发明采用腺嘌呤为对照品进行赤松茸或其衍生物供试样品中嘌呤成分的一测多评方法 的构建，因为腺嘌呤是核酸和辅酶的组成成分，参与体内DNA和RNA的合成，为维持 生物体代谢功能的必要成分，广泛存在于自然界的生命体中，其结构稳定，且与黄嘌呤、鸟 嘌呤、次黄嘌呤相似，标准品价格相对低廉易得，因此最终优选腺嘌呤作为对照品。
针对所测定的嘌呤生物碱类成分结式极其相似、呈弱碱性、极性与水溶性极强且性质 相近，常规色谱条件很难有效分离，本发明优选出以0.02±0.001mol/L KH2PO4-H3PO4缓冲 溶液为水相(流动相A)，甲醇或乙腈为有机相(流动相B)组成流动相，流动相组成中极低 含量(0-2％)的流动相B。
本发明针对嘌呤类成分为赤松茸及其衍生物的负营养性成分，尤其对痛风和尿酸高的 食用人群，采用一测多评同时定性定量赤松茸及其衍生物中四种具有代表性嘌呤类成分黄嘌 呤、鸟嘌呤、腺嘌呤和次黄嘌呤。通过HPLC-UV联用检测技术，建立了一测多评的含量测 定方法，实现了仅采用其中一种嘌呤标准品，确定该嘌呤标品与赤松茸供试样品中其它三种 嘌呤成分之间的相对校正因子和相对保留时间，通过计算便捷地对赤松茸供试样品中的四个 嘌呤成分的定性定量检测。且不同套色谱系统(岛津LC-20AT，Agilent1260)及不同色谱 柱(Waters Atlantis T3 C18，4.6mm×250mm，5μm；Waters SunfireC18，4.6mm×250 mm，5μm；Waters X-Bridge C18，4.6mm×150mm，3.5μm)对本发明所提出的相对校正因 子(f，RSD<3％)和相对保留时间(tR，RSD<5％)耐用性良好。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明首次提出一项基于一测多评针对赤松茸及其衍生物同时定性定量四种具有代表性 嘌呤类成分黄嘌呤、鸟嘌呤、腺嘌呤和次黄嘌呤的技术方法，该检测技术操作简单，灵敏度 高，只需要一种标准品，降低了标准品成本，简化了实验步骤，能够准确、客观地评价赤松 茸产品的品质。本发明可以用于赤松茸的鉴别与质量控制，可解决赤松茸及其衍生物目前尚 无定性定量检测方法的瓶颈，对赤松茸及其衍生物的研究开发及产业发展具有重要的意义。
附图说明
图1为尿酸及嘌呤黄嘌呤、鸟嘌呤、腺嘌呤和次黄嘌呤的结构式；
图2为实施例1中嘌呤标准品(A)及赤松茸完整菌株(B)的液相色谱图；图中，1.鸟嘌 呤；2.次黄嘌呤；3.腺嘌呤；4.黄嘌呤；
图3为实施例1中黄嘌呤、鸟嘌呤、腺嘌呤和次黄嘌呤的标准曲线；
图4为实施例2中赤松茸菌盖供试品溶液的液相色谱图；
图5为实施例3中赤松茸菌柄供试品溶液的液相色谱图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局 限于此。
下述实施例中所用供试样品及材料包括：
赤松茸购自博爱赤松茸种植基地；
黄嘌呤(四川省维克奇生物科技有限公司，批号：wkq20080411)、
次黄嘌呤(四川省维克奇生物科技有限公司，批号：wkq20072809)、
鸟嘌呤(四川省维克奇生物科技有限公司，批号：wkq20080610)、
腺嘌呤(四川省维克奇生物科技有限公司，批号：wkq20061907)；
高氯酸、磷酸(分析纯，购自天津市光复精细化工研究所)；
氢氧化钾(分析纯，天津市恒兴化学试剂制造有限公司)；
乙腈(色谱级，购自Fisher公司)；娃哈哈纯净水。
下述实施例中所用仪器包括：
高速中药粉碎机(瑞安市永历制药机械有限公司，型号：111B，400w，220V/50Hz，25000r/m)；安捷伦1260高效液相色谱仪，DAD检测器；ME204万分之一天平 (METTLERTOLEDO)；AUW220D十万分之一天平(SHIMADZU)；色谱柱为Waters Sunfire C18，4.6mm×250mm，5μm；Waters X-Bridge C18，4.6mm×150mm，3.5μm； Waters Atlantis T3 C18，4.6mm×250mm，5μm；；离心机(Cence湘仪TDZ5-WS)；XMTD-7000电热恒温水浴锅(北京市光明医疗仪器公司)；KQ-500E超声波清洗器(昆山 市超声仪器有限公司)；DGX-9143B干燥箱(上海福玛实验设备有限公司)。
实施例1
一种基于HPLC-UV法同时测定赤松茸及其衍生物中黄嘌呤、鸟嘌呤、腺嘌呤和次黄嘌 呤含量的方法，包括以下步骤：
1.1对照品标准溶液的配制
取黄嘌呤、鸟嘌呤、腺嘌呤和次黄嘌呤适量，精密称定，加甲醇分别制成每毫升含100 μg的溶液，作为标准品储备液。精密量取黄嘌呤、鸟嘌呤、腺嘌呤和次黄嘌呤标准品储备 液适量，用甲醇稀释，分别制得一系列0.05、0.50、5.00、20.00、30.00μg/ml的黄嘌呤、鸟嘌呤、腺嘌呤和次黄嘌呤对照品标准溶液。
1.2供试品溶液的配制
赤松茸3批，烘干后，分别取完整菌株、菌盖、菌柄，适量，粉碎，过4号筛。称取赤 松茸的完整菌株0.2g，置于50ml圆瓶烧瓶中，加入10ml 70％高氯酸，采用100℃水浴加热回流的方法水解30min后，迅速置于冰水浴中冷却，再用10ml/L的KOH水溶液调至中性，滤纸真空过滤后，在滤液中加入1mol/L的磷酸调pH至3.8，3600r/min离心10min，取上清液，用纯化水定容至50ml棕色溶量瓶中，即得供试品溶液，保存于4℃冰箱中备用。
1.3色谱条件
反相C18填料色谱柱：Waters Sunfire C18，4.6mm×250mm，5μm；Waters X-BridgeC18，4.6mm×150mm，3.5μm；Waters Atlantis T3 C18，4.6mm×250mm，5μm；中的一 种；
流动相：以0.02mol/L KH2PO4-H3PO4缓冲溶液(pH为4.0)为流动相A：以甲醇为流动相B，进行等度洗脱；流动相A、流动相B的体积比99:1；柱温：30℃；流速：1.0mL /min；紫外检测器波长：254nm；进样量：10μL。
1.4系统适应性实验
取对照品标准溶液、供试品溶液进样分析，按照步骤1.3所示色谱条件，色谱柱为Waters X-Bridge C18柱，结果见图2。结果表明各待测组分分离效果良好(分离度>1.5)，拖尾因子在0.96-1.17，理论塔板数以各色谱峰计均在5000以上。
1.5.方法学考察
1.5.1校准曲线及其线性回归
色谱条件同步骤1.3，以各嘌呤对照品标准溶液的浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐 标，绘制标准曲线，拟合线性回归方程，并计算线性相关系数(r)，结果见表1。
1.5.2精密度试验
所有批次赤松茸完整菌株干品样品，按照1.2方法制备供试品溶液，按照1.3的色谱条 件，分别重复测定6次，对检测方法的精密度进行试验，结果见表2。
1.5..3稳定性试验
取同一供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24h进样，按照1.3的色谱条件，进行 HPLC含量测定，并分别计算四种嘌呤色谱峰面积的RSD值。
1.5.4加样回收率试验
赤松茸完整菌株粉末(过四号筛)约0.20g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，分别添加四 种嘌呤的0.50mg/ml对照品标准溶液0.1、0.2、0.3mL，按照1.3的色谱条件，每组进行5个平 行试验，分别计算加样回收率，结果见表3。
1.6.结果与分析
1.6.1线性方程
结果显示，在0.05-30.00μg/mL线性范围(标准曲线见图3)内，四种嘌呤得到完全分 离(四种嘌呤的液相色谱图见图2)，线性最低浓度信噪比(S/N)均大于10，线性关系详细结果见表1。
表1四种嘌呤的线性关系
1.6.2精密度试验
结果见表2，结果显示：同一样品平行测定6次，RSD％值均＜3.0％，说明精密度良好。
表2.赤松茸完整菌株嘌呤测定精密度试验结果
1.6.3稳定性试验
结果显示：黄嘌呤、鸟嘌呤、腺嘌呤和次黄嘌呤的色谱峰面积RSD分别为1.11％、1.43％、1.341％、1.03％、0.96％、2.55％(n＝6)，以腺嘌呤的保留时间和峰面积为参照，各共有峰相对保留时间和相对峰面积RSD均<3％，表明供试品溶液在24h内稳定。
1.6.4加样回收率试验
结果见表3，结果显示：四种嘌呤的平均回收率在98.91％—101.23％之间，表明本方法 的准确度良好。
表3.赤松茸完整菌株嘌呤测定精密度试验结果单位：％
1.7一测多评法测定四种嘌呤的含量
1.7.1相对校正因子(fs/x)的计算
精密吸取10μL步骤1.1制备所得不同浓度的黄嘌呤、鸟嘌呤、腺嘌呤和次黄嘌呤对照品 溶液进行液相色谱测定(色谱条件同1.3所示)，获得HPLC-UV色谱图，测量并记录各嘌呤色 谱峰的峰面积，以腺嘌呤作为标准品，分别计算黄嘌呤、鸟嘌呤、和次黄嘌呤的相对校正因 子(fs/x)。结果显示黄嘌呤、鸟嘌呤和次黄嘌呤相对于腺嘌呤的平均f分别为0.826、0.595和 5.213，RSD分别为1.31％，1.21％和1.03％。
所述相对校正因子(fs/x)计算公式为：
式中：fs/x为待测嘌呤x的相对校正因子，As为腺嘌呤色谱峰峰面积，Cs为腺嘌呤质量浓 度，Ax为待测嘌呤x的色谱峰峰面积，Cx为待测嘌呤x的质量浓度。
1.7.2高效液相色谱仪及色谱柱耐用性考察
考察了两套色谱系统(岛津LC-20AT，Agilent 1260)及不同色谱柱(WatersSunfire C18，4.6mm×250mm，5μm；Waters X-Bridge C18，4.6mm×150mm，3.5μm；WatersAtlantis T3 C18，4.6mm×250mm，5μm)对校正因子的影响，结果显示RSD均小于3％， 表明相对校正因子在不同色谱系统和不同色谱柱下耐用性良好，见表4。
表4应用不同色谱柱和色谱仪器所测定嘌呤成分的fs/x值
1.7.3嘌呤色谱峰的定位
参照1.8.1，按下述公式计算在两套色谱系统(岛津LC-20AT，Agilent 1260)以及三 种不同色谱柱中黄嘌呤、鸟嘌呤和次黄嘌呤成分色谱峰与腺嘌呤色谱峰的相对保留时间，对 各待测成分进行定位。结果(见表5)表明：相对保留时间的波动较小，其RSD均小于3％。
所述相对保留时间(tRx)计算公式为：
式中：
表示待测嘌呤x的相对保留时间；tx表示待测嘌呤x色谱峰的保留时间；ts表示 腺嘌呤色谱峰的保留时间。
表5应用不同色谱柱和色谱仪器所测定嘌呤成分的tRx值
1.7.4本发明一测多评法与外标法测定结果比较
按照1.3所示的色谱条件，采用一测多评和外标法分别对步骤1.2所述3批赤松茸菌株 样品中黄嘌呤、鸟嘌呤、腺嘌呤和次黄嘌呤含量进行测定，两种方法的测定结果见表6。
本发明一测多评法具体如下：
取步骤1.1制备得到的一系列不同浓度的腺嘌呤对照品标准溶液进行液相色谱测定，获 得HPLC-UV色谱图，测量并记录腺嘌呤色谱峰的峰面积，采用外标法以腺嘌呤的峰面积为 纵坐标，以腺嘌呤的浓度为横坐标，绘制标准曲线并计算获得腺嘌呤的线性方程(见图3和 表1)；
取步骤1.2制备得到的供试品溶液进行液相色谱测定，获得HPLC-UV色谱图，测量并记 录腺嘌呤、鸟嘌呤、黄嘌呤及次黄嘌呤色谱峰的峰面积，将腺嘌呤的峰面积代入腺嘌呤的线 性方程，计算获得供试品中的腺嘌呤含量；
其中，鸟嘌呤、黄嘌呤及次黄嘌呤的含量按下述公式进行计算：
式中：
表示待测嘌呤x在赤松茸或其衍生物样品中的质量浓度；C′x表示待测嘌呤x在 供试品溶液中的质量浓度；C0表示供试品溶液中赤松茸或其衍生物样品的质量浓度；A′x表示 供试品溶液中待测嘌呤x的色谱峰峰面积。
将两种方法的测定结果经t检验，P大于0.05，说明两种方法计算所得的结果不存在显 著性差异，且本发明一测多评法较外标法更为简便、易操作、低成本，在赤松茸样品中嘌呤 的质量控制中是可行的，见表6。
表6两种方法对不同批次赤松茸菌株中四种嘌呤含量测定结果(n＝3)(％)
注：a.外标法；b.一测多评法；RSD<2％。
实施例2
一种基于HPLC-UV法同时测定赤松茸菌盖中黄嘌呤、鸟嘌呤、腺嘌呤和次黄嘌呤含量的 方法，按照实施例1的步骤，不同之处在于：供试样品为赤松茸的菌盖部位(赤松茸菌盖供 试品溶液的液相色谱图见图4)，步骤1.3所示的色谱条件不同，色谱条件具体如下：
色谱柱：Waters Atlantis T3 C18，4.6mm×250mm，5μm；流动相：0.02mol/LKH2PO4- H3PO4缓冲溶液；柱温：30℃；流速：1.0mL/min；紫外检测器波长：254nm；进样量：10μL。
结果见表7，说明两种方法计算所得的结果不存在显著性差异，且一测多评法较外标法 更为简便、易操作、低成本，在赤松茸的多指标成分质量控制中是可行的。
表7两种方法对不同批次赤松茸菌盖中四种嘌呤含量测定结果(n＝3)(％)
注：a.外标法；b.一测多评法；RSD<2％。
实施例3
一种基于HPLC-UV法同时测定赤松茸菌盖中黄嘌呤、鸟嘌呤、腺嘌呤和次黄嘌呤含量 的方法，按照实施例2的步骤，不同之处在于：供试样品为赤松茸的菌柄部位(赤松茸菌柄 供试品溶液的液相色谱图见图5)。
表8两种方法对不同批次赤松茸菌柄中四种嘌呤含量测定结果(n＝3)(％)
注：a.外标法；b.一测多评法；RSD<2％。
结果见表8，说明两种方法计算所得的结果不存在显著性差异，且一测多评法较外标法 更为简便、易操作、低成本，在赤松茸菌盖的多指标成分质量控制中是可行的。
Claims (6)
1.一种基于HPLC-UV法同时测定赤松茸中黄嘌呤、鸟嘌呤、腺嘌呤和次黄嘌呤含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）对照品标准溶液的配制：以甲醇为溶剂，分别配制获得一系列不同浓度的黄嘌呤、鸟嘌呤、腺嘌呤和次黄嘌呤对照品标准溶液；
2）供试品溶液的配制：
取0.2g经烘干、粉碎、过筛的赤松茸或其衍生物样品，加入8-12ml、60-70%的强氧化性酸，90-110℃水浴加热回流水解20-40min，置于冰水浴中冷却，再用碱液调至中性，过滤，滤液调pH至3.8-4.2，离心，取上清液，用纯化水定容至50ml棕色容量瓶中，即得供试品溶液；
3）相对校正因子和相对保留时间的计算：
精密吸取步骤1）制备所得不同浓度的黄嘌呤、鸟嘌呤、腺嘌呤和次黄嘌呤对照品溶液进行液相色谱测定，获得HPLC-UV色谱图，测量并记录各嘌呤色谱峰的峰面积，以腺嘌呤作为标准品，分别计算黄嘌呤、鸟嘌呤、和次黄嘌呤对腺嘌呤的相对校正因子（f s/x ）和相对保留时间（t Rx ）；
所述相对校正因子（f s/x ）计算公式为：
式中：f s/x 为待测嘌呤x的相对校正因子，A s 为腺嘌呤色谱峰峰面积，C s 为腺嘌呤质量浓度，A x 为待测嘌呤x的色谱峰峰面积，C x 为待测嘌呤x的质量浓度；
所述相对保留时间（t Rx ）计算公式为：
式中：t Rx 表示待测嘌呤x的相对保留时间；t x 表示待测嘌呤x色谱峰的保留时间；t s 表示腺嘌呤色谱峰的保留时间；
4）供试品中嘌呤的检测：
取步骤1）制备得到的一系列不同浓度的腺嘌呤对照品标准溶液进行液相色谱测定，获得HPLC-UV色谱图，测量并记录腺嘌呤色谱峰的峰面积，采用外标法以腺嘌呤的峰面积为纵坐标，以腺嘌呤的浓度为横坐标，绘制标准曲线并计算获得腺嘌呤的线性方程；
取步骤2）制备得到的供试品溶液进行液相色谱测定，获得HPLC-UV色谱图，测量并记录腺嘌呤、鸟嘌呤、黄嘌呤及次黄嘌呤色谱峰的峰面积，将腺嘌呤的峰面积代入腺嘌呤的线性方程，计算获得供试品中的腺嘌呤含量；
其中，鸟嘌呤、黄嘌呤及次黄嘌呤的含量按下述公式进行计算：
2.如权利要求1所述基于HPLC-UV法同时测定赤松茸中黄嘌呤、鸟嘌呤、腺嘌呤和次黄嘌呤含量的方法，其特征在于，液相色谱测定条件为：
反相C18填料色谱柱；流动相由98-100%流动相A和0-2%流动相B组成，以0.02±0.001mol /L的KH2PO4-H3PO4缓冲溶液为流动相A，以甲醇或乙腈为流动相B，进行等度洗脱；柱温：25-35 ℃; 流速：0.8-1.2 mL /min；紫外检测器波长：254±2nm。
3.如权利要求1所述基于HPLC-UV法同时测定赤松茸中黄嘌呤、鸟嘌呤、腺嘌呤和次黄嘌呤含量的方法，其特征在于，步骤1）中，配制获得0.05、0.50、5.00、20.00、30.00 μg/ml不同浓度的黄嘌呤、鸟嘌呤、腺嘌呤和次黄嘌呤对照品标准溶液。
4.如权利要求1所述基于HPLC-UV法同时测定赤松茸中黄嘌呤、鸟嘌呤、腺嘌呤和次黄嘌呤含量的方法，其特征在于，步骤2）中，所述强氧化稀酸为硝酸、高氯酸或浓硫酸。
5.如权利要求1所述基于HPLC-UV法同时测定赤松茸中黄嘌呤、鸟嘌呤、腺嘌呤和次黄嘌呤含量的方法，其特征在于，步骤2）中，所述碱液为浓度8-12mol/L的氢氧钾或氢氧化钠水溶液。
6.如权利要求1至5任一所述基于HPLC-UV法同时测定赤松茸中黄嘌呤、鸟嘌呤、腺嘌呤和次黄嘌呤含量的方法，其特征在于，步骤2）中，滤液中加入1mol/L的磷酸调pH至3.8-4.2。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111031133.1A CN113866287A (zh) | 2021-09-03 | 2021-09-03 | 基于hplc-uv法同时测定赤松茸中黄嘌呤、鸟嘌呤、腺嘌呤和次黄嘌呤含量的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111031133.1A CN113866287A (zh) | 2021-09-03 | 2021-09-03 | 基于hplc-uv法同时测定赤松茸中黄嘌呤、鸟嘌呤、腺嘌呤和次黄嘌呤含量的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113866287A true CN113866287A (zh) | 2021-12-31 |
Family
ID=78989391
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111031133.1A Pending CN113866287A (zh) | 2021-09-03 | 2021-09-03 | 基于hplc-uv法同时测定赤松茸中黄嘌呤、鸟嘌呤、腺嘌呤和次黄嘌呤含量的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113866287A (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1980000454A1 (en) * | 1978-08-18 | 1980-03-20 | Kyowa Hakko Kogyo Kk | Method of measuring substrate of xanthine oxidase,and composition for the determination |
| JP2018064503A (ja) * | 2016-10-19 | 2018-04-26 | アサヒビール株式会社 | ビール様発泡性飲料の製造方法 |
| CN112881550A (zh) * | 2021-01-14 | 2021-06-01 | 广东省科学院测试分析研究所(中国广州分析测试中心) | 一种测定饮料饮品中四种嘌呤的超高效液相色谱-串联质谱分析方法 |
-
2021
- 2021-09-03 CN CN202111031133.1A patent/CN113866287A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1980000454A1 (en) * | 1978-08-18 | 1980-03-20 | Kyowa Hakko Kogyo Kk | Method of measuring substrate of xanthine oxidase,and composition for the determination |
| JP2018064503A (ja) * | 2016-10-19 | 2018-04-26 | アサヒビール株式会社 | ビール様発泡性飲料の製造方法 |
| CN112881550A (zh) * | 2021-01-14 | 2021-06-01 | 广东省科学院测试分析研究所(中国广州分析测试中心) | 一种测定饮料饮品中四种嘌呤的超高效液相色谱-串联质谱分析方法 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| 刘少林 等: "HPLC法测定大豆中嘌呤含量的研究", vol. 36, no. 04, pages 674 - 676 * |
| 刘镇 等: "反相高效液相色谱法同时测定黄酒中4种游离嘌呤", no. 04, pages 100 - 102 * |
| 吕铎 等: "大豆种子中嘌呤含量的HPLC测定方法", vol. 35, no. 04, pages 655 - 659 * |
| 宋晶萍 等: "HPLC测定鹿胎软胶囊中4种嘌呤的含量", vol. 37, no. 01, pages 19 - 21 * |
| 杨海斌 等: "高效液相色谱法同时测定肉类食品中的嘌呤和尿酸", 卫生研究, vol. 41, no. 02, pages 303 - 306 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107561172B (zh) | 一种同时检测营养素软胶囊中多种维生素含量的方法 | |
| CN110632208B (zh) | 一种用于清肺化痰、止咳平喘的中药组合物的主要成分的检测方法 | |
| CN109632997B (zh) | 一种百合药材中王百合苷b的提取及测定方法 | |
| CN113866287A (zh) | 基于hplc-uv法同时测定赤松茸中黄嘌呤、鸟嘌呤、腺嘌呤和次黄嘌呤含量的方法 | |
| CN112708573A (zh) | 特殊医学用途食品中叶酸、生物素、维生素b12检测方法 | |
| CN111912916A (zh) | 一种佛手制剂中指标成分含量的测定方法 | |
| Chen et al. | A LC/UV/Vis method for determination of cyanocobalamin (VB 12) in multivitamin dietary supplements with on-line sample clean-up | |
| Zhu et al. | Dissolution of bioactive components from dried fruiting bodies of the culinary-medicinal shiitake mushroom, Lentinus edodes (Agaricomycetes), during cleaning, soaking, and cooking | |
| CN112666302B (zh) | 一种大麦苗中活性黄酮成分群鉴定及其快速检测方法 | |
| CN102749394A (zh) | 一种果蔬组织及其相关制品中还原型抗坏血酸和异抗坏血酸的分离测量的方法 | |
| CN114910583A (zh) | 一种桔贝合剂的检测方法 | |
| CN111896637B (zh) | 一种金青中间体的检测方法及其指纹图谱构建方法 | |
| CN111579684B (zh) | 一种胶囊剂的囊材中辣椒总碱的含量测定方法 | |
| CN110487938B (zh) | 罗汉松实药材的质量控制方法 | |
| Trevelyan | Determination of uric acid precursors in dried yeast and other forms of single‐cell protein | |
| CN111208227A (zh) | 一种同时测定卷烟爆珠中8种羰基化合物含量的方法 | |
| CN113024419A (zh) | 一种氧化三甲胺和甜菜碱的提取和检测方法 | |
| CN109680035B (zh) | 一种肌醇缺陷型菌株的筛选方法及其应用 | |
| CN114152702B (zh) | 一种测定注射用炎琥宁含量的方法 | |
| CN112305105B (zh) | 一种李子中化学成分含量的测定方法 | |
| CN111983042B (zh) | 一种虫草头孢菌粉药物制剂中核苷类成分的含量测定方法 | |
| CN107796684B (zh) | 一种叶绿素铜钠含量的检测方法 | |
| CN118112142A (zh) | 一种测定高蛋白食品中β-羟基-β-甲基丁酸钙的方法 | |
| CN117054562A (zh) | 一种食品中新食品原料含量的检测方法 | |
| CN113341002A (zh) | 一种五味祛脂颗粒中三种活性成分含量同时测定的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20211231 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |