CN113376270A - 一种血清中脂溶维生素质谱快速检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种血清中脂溶维生素质谱快速检测试剂盒及检测方法，包括如下，取一定体积的血清样本，加入到试剂包C中的96孔板蛋白沉淀板孔内，加入试剂包A中的一定体积的沉淀剂，涡旋混匀，使用负压装置，将96孔板蛋白沉淀板中样本转移至96孔板进样板中，进样分析，应用超高效液相色谱系统，在硅胶基质C18反相色谱柱上，在特定的流动相组成、流动相梯度、流速和进样体积条件下，实现6种脂溶维生素在硅胶基质C18反相色谱柱上的分离，经分离的6种脂溶维生素进入质谱系统检测，正离子模式，特定的离子源参数及MRM参数，实现6种脂溶维生素的质谱检测，本发明提供了一种检测准确高效的血清中脂溶维生素质谱快速检测试剂盒及检测方法。

Description

一种血清中脂溶维生素质谱快速检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及质谱检测技术领域，具体为一种血清中脂溶维生素质谱快速检测试剂盒及检测方法。
背景技术
脂溶维生素是维持身体健康的基本要素，如果没有足够的维生素，器官无法正常运作、皮肤快速老化、视力减退等。与脂溶性抗氧化维生素不足的症状有免疫功能失调、反复感染、神经系统疾病、消化与吸收障碍、心血管疾病、慢性疲劳症和氧化压力增加等。平衡与适量的抗氧化维生素浓度有助于防止自由基的伤害及慢性病形成。维生素A有促进生长、繁殖，维持骨骼、上皮组织、视力和粘膜上皮正常分泌等多种生理功能，维生素A及其类似物有阻止癌前期病变的作用，缺乏时表现为生长迟缓、暗适应能力减退而形成夜盲症。维生素D还有促进皮肤细胞生长、分化及调节免疫功能作用，缺乏维生素D儿童可患佝偻病，成人患骨质软化症。维生素E具有抗氧化保护机体细胞免受自由基的毒害，改善血液循环、保护组织、降低胆固醇、预防高血压。维生素K1是肝脏合成因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ所必须的物质，主要用于各种维生素K缺乏引起的出血性疾病的治疗，还具有镇痛、缓解支气管痉挛的作用，对内脏平滑肌绞痛、胆管痉挛、肠痉挛引起的绞痛有明显的效果。维生素K2具有预防骨质疏松，改善凝血功能等作用。维生素K2中有骨蛋白质，可以和钙生成钙质，从而增加骨密度；维生素K2还能够促进血液中的钙沉积入骨，还能够强化肝脏的解毒功能以及利尿，并且还能够降血压。脂溶维生素摄入量过多易引起中毒现象，若摄入量过少则缓慢出现缺乏症状。
目前，在临床实验室中用于血清中脂溶性维生素分析的常用方法有免疫分析法、高效液相色谱法、高效液相色谱法串联质谱法。与传统的高效液相色谱法和免疫分析法相比，超高效液相色谱串联质谱法具有更好的分离能力、更高特异性和更高灵敏度。血清中25-(OH)VD2和VK1含量低，大部分为2ng/mL左右,因此为提高检测灵敏度，前处理需要液液萃取进行富集，同时使用APCI离子源才能实现准确定量。而ESI离子源是最为常用的电离模式，有的质谱仪只配有ESI离子源，同时配备ESI和APCI离子源的仪器，使用过程中针对不同检测项目，需要两种离子源进行切换。因此目前的检测方法对仪器提出更高要求。目前检测方法使用传统的离心管和进样瓶，离心管和进样瓶的标记，离心和液液萃取后两次样本转移，均为人工操作，过程繁琐费时，影响检测重复性准确性的因素较多。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种检测准确高效的血清中脂溶维生素质谱快速检测试剂盒及检测方法，解决了上述背景技术中提出的问题。
(二)技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种血清中脂溶维生素质谱快速检测试剂盒，包括作为校准品制备和样本制备使用的试剂包A、作为质控的试剂包B和作为前处理沉淀蛋白和进样分析使用的试剂包C。
进一步的，所述试剂包A为乙醇沉淀剂。
进一步的，所述试剂包B包括低质控和高质控，所述低质控和高质控均为牛血清白蛋白缓冲液中加入6种脂溶维生素的混合标准溶液制备而成，所述低质控浓度控制在线性S3浓度，所述高质控浓度控制在线性S5浓度，校准为6种脂溶维生素的混合标准溶液，浓度控制在S1a-S7a之间。
进一步的，所述牛血清白蛋白缓冲液中的缓冲液为PBS缓冲液，其pH在7.2～7.4之间,牛血清白蛋白浓度为5％。
进一步的，所述试剂包C包括96孔板蛋白沉淀板和96孔板进样板一种血清中脂溶维生素质谱快速检测方法，包括如下步骤：
(1)校准品制备：分别取一定体积的试剂包B中的校准S1a-S7a加入到试剂包C中的96孔板蛋白沉淀板孔内，加入一定体积超纯水，再加入试剂包A中的一定体积的沉淀剂，涡旋混匀，使用负压装置，将96孔板蛋白沉淀板中样本转移至96孔板进样板中；
(2)样本制备：取一定体积的血清样本，加入到试剂包C中的96孔板蛋白沉淀板孔内，加入试剂包A中的一定体积的沉淀剂，涡旋混匀，使用负压装置，将96孔板蛋白沉淀板中样本转移至96孔板进样板中，直接进样分析；
(3)超高效液相色谱分离：应用超高效液相色谱系统，在硅胶基质C18反相色谱柱上，在特定的流动相组成、流动相梯度、流速和进样体积条件下，实现6种脂溶维生素在硅胶基质C18反相色谱柱上的分离；
(4)串联四级杆质谱检测：经分离的6种脂溶维生素进入质谱系统检测，正离子模式，特定的离子源参数及MRM参数，实现6种脂溶维生素的质谱检测。
进一步的，步骤(1)中试剂包B中校准S1a-S7a的体积为10μL，分别加入190μL超纯水，再加入试剂包A中沉淀剂体积为400μL。
进一步的，步骤(1)和步骤(2)中涡旋时间为5min
进一步的，步骤(3)中硅胶基质C18反相色谱柱具体为Agilent ZORBAX EclipsePlus C182.1×100mm 1.8μm，流动相A为0.2mmol/L氟化铵水溶液，流动相B为0.2mmol/L氟化铵甲醇溶液，流动相梯度为流动相B，0-0.5min，80％；7min，100％；9.0-10min，80％；流速为0.3mL/min，进样体积为10μL，柱温为40℃。
进一步的，步骤(4)中质谱条件为正离子模式，毛细管电压3.00KV，雾化气温度500℃，离子源温度150℃，脱溶剂气1000L/h，采用MRM模式，每个化合物两个离子对，分别用于定量和定性。
(三)有益效果
综上所述，本发明利用沉淀剂将血清样本沉淀在96孔板进样板中，再使用氟化铵体系的流动相以及ESI源进行离子化，极大的提高了脂溶维生素灵敏度，高灵敏度脂溶维生素可通过超高效液相色谱系统在硅胶基质C18反相色谱柱上分离，从而可减少前期液液萃取富集的步骤，并且上述前处理均是定量处理可通过自动化设备自动处理，缩短了预处理时间，有效提高样本分析通量，进一步降低检测成本，最后分离的6种脂溶维生素依次流出进入三重四极杆质谱进行检测，最终实现6种脂溶维生素的质谱检测。
附图说明
图1为本发明方法步骤示意图；
图2为本发明中维生素A、25-羟基VD2、25-羟基VD3、维生素E、维生素K1和维生素K2的色谱图；
图3为本发明中VA的校准曲线图；
图4为本发明中25-(OH)VD2的校准曲线图；
图5为本发明中25-(OH)VD3的校准曲线图；
图6为本发明中VE的校准曲线图；
图7为本发明中VK1的校准曲线图；
图8为本发明中VK2的校准曲线图；
图9为本发明中血清样本中维生素A、25-羟基VD2、25-羟基VD3、维生素E、维生素K1和维生素K2的色谱图。
具体实施方式
参照图1至图9对本发明一种血清中脂溶维生素质谱快速检测试剂盒及检测方法的实施例作进一步说明。
本实施例中在进行血清中脂溶维生素质谱快速检测时，首先取出本发明的试剂盒进行校准品制备：分别取10μL的试剂包B中的校准S1a-S7a加入到试剂包C中的96孔板蛋白沉淀板孔内，加入190μL超纯水，再加入试剂包A中的400μL的沉淀剂，涡旋混匀5min，使用负压装置，将96孔板蛋白沉淀板中样本转移至96孔板进样板中，完成校准品的制备，本实施例中校准品是配制的待测物质的混合标溶液，浓度有定值，后续使用内标法定量。校准品是用与后期定量的，接着进行样本制备，具体为取200μL的血清样本，加入到试剂包C中的96孔板蛋白沉淀板孔内，加入试剂包A中的400μL的沉淀剂，涡旋混匀5min，使用负压装置，将96孔板蛋白沉淀板中样本转移至96孔板进样板中，直接进样分析，然后应用超高效液相色谱系统在硅胶基质C18反相色谱柱(具体为Agilent ZORBAX Eclipse Plus C182.1×100mm 1.8μm)上且在流动相A为0.2mmol/L氟化铵水溶液，流动相B为0.2mmol/L氟化铵甲醇溶液，流动相梯度为流动相B，0-0.5min，80％；7min，100％；9.0-10min，80％；流速为0.3mL/min，进样体积为10μL，柱温为40℃的条件下实现6种脂溶维生素在硅胶基质C18反相色谱柱上的分离。
液相色谱流出的6种脂溶维生素进入Waters Xevo TQS质谱进行检测，具体的检测条件为：正离子模式，毛细管电压3.00KV，雾化气温度500℃，离子源温度150℃，脱溶剂气1000L/h，采用MRM模式，每个化合物两个离子对，分别用于定量和定性，具体如表4所示。
本发明利用质谱三重四级杆多反应监测模式特异性地检测6种脂溶维生素，根据不同的色谱保留时间，设置不同的检测窗口以及参数，根据相关实验得出VA保留时间为3.37min，25-(OH)VD2保留时间为3.28min，25-(OH)VD3保留时间为3.07min,VE保留时间为7.47min，VK1保留时间为8.66min，VK2保留时间为7.34min。6种脂溶维生素经色谱柱分离后流出顺序依次为25-(OH)VD3、25-(OH)VD2、VA、VK2、VE、VK1。具体如表5所示，其中表5中的*为定量离子对。
目前现有的超高效液相色谱串联质谱法检测脂溶性维生素也需要通过液液萃取进行富集，才能达到检测灵敏度，实现准确定量，本发明利用沉淀剂将血清样本沉淀在96孔板进样板中，再使用氟化铵体系的流动相以及ESI源进行离子化，极大的提高了脂溶维生素灵敏度，高灵敏度脂溶维生素可通过超高效液相色谱系统在硅胶基质C18反相色谱柱上分离，从而可减少前期液液萃取富集的步骤，并且上述前处理均是定量处理可通过自动化设备自动处理，缩短了预处理时间，有效提高样本分析通量，进一步降低检测成本，最后分离的6种脂溶维生素依次流出进入三重四极杆质谱进行检测，最终实现6种脂溶维生素的质谱检测。
本实施例中的梯度洗脱如表1所示：
时间(min) A相百分比％ B相百分比％
0.0 20 80
0.5 20 80
7 0 100
9 0 100
10 20 80
表1
本实施例中的校准S1a-S7a浓度如表2所示：
脂溶性维生素 S1a S2a S3a S4a S5a S6a S7a
25-(OH)-VD2(<u>ng</u>/<u>mL</u>) 20 40 80 200 400 800 2000
25-(OH)-VD3(<u>ng</u>/<u>mL</u>) 50 100 200 500 1000 2000 5000
维生素A(<u>ng</u>/<u>mL</u>) 400 800 1600 4000 8000 1600 40000
维生素E(μg/<u>mL</u>) 5 10 20 50 100 200 500
维生素K1(<u>ng</u>/<u>mL</u>) 1 2 4 10 20 40 100
维生素K2(<u>ng</u>/<u>mL</u>) 1 2 4 10 20 40 100
表2
本实施例中的标准曲线线性S1-S7浓度如表3所示：
脂溶性维生素 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7
25-(OH)-VD2(<u>ng</u>/<u>mL</u>) 1 2 4 10 20 40 100
25-(OH)-VD3(<u>ng</u>/<u>mL</u>) 2.5 5 10 25 50 100 250
维生素A(<u>ng</u>/<u>mL</u>) 20 40 80 200 400 800 2000
维生素E(μg/<u>mL</u>) 0.25 0.5 1 2.5 5 10 25
维生素K1(<u>ng</u>/<u>mL</u>) 0.05 0.1 0.2 0.5 1 2 5
维生素K2(<u>ng</u>/<u>mL</u>) 0.05 0.1 0.2 0.5 1 2 5
表3
本实施例中的Waters Xevo TQS质谱检测条件如表4所示：
Parameter Value(+)
Positive Ion(KV) 3.00
<u>Desolvation</u> Temp(℃) 500
Ion Temp(℃) 150
<u>Desolvation</u>(L/Hr) 1000
Cone(L/H) 150
表4
本实施例中的6种脂溶维生素经色谱柱分离后流出时间顺序如表5所示：
Figure BDA0003070545420000091
表5
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种血清中脂溶维生素质谱快速检测试剂盒，其特征在于：包括作为校准品制备和样本制备使用的试剂包A、作为质控的试剂包B和作为前处理沉淀蛋白和进样分析使用的试剂包C。
2.根据权利要求1所述的一种血清中脂溶维生素质谱快速检测试剂盒，其特征在于：所述试剂包A为乙醇沉淀剂。
3.根据权利要求1所述的一种血清中脂溶维生素质谱快速检测试剂盒，其特征在于：所述试剂包B包括低质控和高质控，所述低质控和高质控均为牛血清白蛋白缓冲液中加入6种脂溶维生素的混合标准溶液制备而成，所述低质控浓度控制在线性S3浓度，所述高质控浓度控制在线性S5浓度，校准为6种脂溶维生素的混合标准溶液，浓度控制在S1a-S7a之间。
4.根据权利要求3所述的一种血清中脂溶维生素质谱快速检测试剂盒，其特征在于：所述牛血清白蛋白缓冲液中的缓冲液为PBS缓冲液，其pH在7.2～7.4之间,牛血清白蛋白浓度为5％。
5.根据权利要求1所述的一种血清中脂溶维生素质谱快速检测试剂盒，其特征在于：所述试剂包C包括96孔板蛋白沉淀板和96孔板进样板。
6.一种血清中脂溶维生素质谱快速检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)校准品制备：分别取一定体积的试剂包B中的校准S1a-S7a加入到试剂包C中的96孔板蛋白沉淀板孔内，加入一定体积超纯水，再加入试剂包A中的一定体积的沉淀剂，涡旋混匀，使用负压装置，将96孔板蛋白沉淀板中样本转移至96孔板进样板中；
(2)样本制备：取一定体积的血清样本，加入到试剂包C中的96孔板蛋白沉淀板孔内，加入试剂包A中的一定体积的沉淀剂，涡旋混匀，使用负压装置，将96孔板蛋白沉淀板中样本转移至96孔板进样板中，直接进样分析；
(3)超高效液相色谱分离：应用超高效液相色谱系统，在硅胶基质C18反相色谱柱上，在特定的流动相组成、流动相梯度、流速和进样体积条件下，实现6种脂溶维生素在硅胶基质C18反相色谱柱上的分离；
(4)串联四级杆质谱检测：经分离的6种脂溶维生素进入质谱系统检测，正离子模式，特定的离子源参数及MRM参数，实现6种脂溶维生素的质谱检测。
7.根据权利要求6所述的一种血清中脂溶维生素质谱快速检测方法，其特征在于：步骤(1)中试剂包B中校准S1a-S7a的体积为10μL，分别加入190μL超纯水，再加入试剂包A中沉淀剂体积为400μL。
8.根据权利要求6所述的一种血清中脂溶维生素质谱快速检测方法，其特征在于：步骤(1)和步骤(2)中涡旋时间为5min。
9.根据权利要求6所述的一种血清中脂溶维生素质谱快速检测方法，其特征在于：步骤(3)中硅胶基质C18反相色谱柱具体为Agilent ZORBAX Eclipse Plus C182.1×100mm 1.8μm，流动相A为0.2mmol/L氟化铵水溶液，流动相B为0.2mmol/L氟化铵甲醇溶液，流动相梯度为流动相B，0-0.5min，80％；7min，100％；9.0-10min，80％；流速为0.3mL/min，进样体积为10μL，柱温为40℃。
10.根据权利要求6所述的一种血清中脂溶维生素质谱快速检测方法，其特征在于：步骤(4)中质谱条件为正离子模式，毛细管电压3.00KV，雾化气温度500℃，离子源温度150℃，脱溶剂气1000L/h，采用MRM模式，每个化合物两个离子对，分别用于定量和定性。
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