CN102401786A - 木聚糖酶活力的测定方法 - Google Patents
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Abstract
一种木聚糖酶活力的测定方法，其特征在于步骤如下：(1)制作木糖吸光度-木糖浓度的标准对应曲线；(2)用待测木聚糖酶水解木聚糖，然后检测水解得到的木糖的吸光度值；(3)将步骤(2)所测水解得到的木糖的吸光度值用步骤(1)所述木糖吸光度-木糖浓度的标准对应曲线获得所述水解产物木糖的含量；(4)根据以下公式计算木聚糖酶的活力：
Description
技术领域
本发明属于木聚糖酶活力测定领域，特别涉及一种测定木聚糖酶活力的方法。
背景技术
木聚糖酶是可将木聚糖降解成低聚木糖和木糖的水解酶。近年来，因其在造纸工业、食品工业、饲料工业、能源工业和环境科学等方面都具有较大的应用价值，因而引起科研工作者的广泛关注，并对其进行了相关研究。酶活力是衡量酶生物活力的重要指标。木聚糖酶属多糖水解酶，目前常用DNS测定其酶活力，具体方法是分别取具有一定浓度梯度的木糖标准溶液各2.00mL于试管中，加入5mL DNS试剂，混匀，沸水浴加热5～15min，然后立即用冷水冷却至室温，加水定容至25mL。以标准空白样对照调零，在540nm处测定吸光度OD值。虽然此法简便、快捷，但由于DNS对还原性的单糖、寡糖都具有氧化能力，导致该方法中建立的单糖标准曲线与实际样品间存在误差，不利于产品质量的控制。
发明内容
本发明针对已有技术的不足，提供一种采用砷钼酸盐法来测定木聚糖酶活力的方法，该方法在检测酶活时产生的变异较小，干扰较少，准确性明显提高。
本发明所述木聚糖酶活力的测定方法，其步骤如下：
(1)制作木糖吸光度-木糖浓度的标准对应曲线；
(2)用待测木聚糖酶水解木聚糖，然后检测水解得到的木糖的吸光度值；
(3)将步骤(2)所测水解得到的木糖的吸光度值用步骤(1)所述木糖吸光度-木糖浓度的标准对应曲线获得所述水解产物木糖的含量；
(4)根据以下公式计算木聚糖酶的活力：
上式中，df＝稀释系数，10＝反应时间，0.1＝使用酶的体积。
本发明所述木聚糖酶活力的测定方法，制作木糖吸光度-木糖浓度的标准对应曲线时，在0～16.7ug/ml浓度范围配制5组不同浓度的木糖标准液，分别在各组标准液中加入硫酸铜混合液，沸水浴10min，冷却至室温，再加入砷钼酸混合液，离心后540nm下测上清液的吸光值。
本发明所述木聚糖酶活力的测定方法，用待测木聚糖酶水解木聚糖是将木聚糖溶液平衡到30℃再加入待测木聚糖酶溶液，混合均匀后，30℃静置10min，再加入硫酸铜混合液，沸水浴10min，然后冷却到室温时再加入砷钼酸混合液，摇动或涡漩直到试管停止起泡，所有的沉淀溶解后离心。
优化地：硫酸铜混合液的配制法是1.3M硫酸钠，226mM碳酸钠和43mM酒石酸钾钠溶于溶于500ml去离子水中。16mM硫酸铜溶于100ml去离子水中，再缓慢的加入到前者溶液中，避免产生沉淀。190mM碳酸氢钠先溶于去离子水中，再加入到上述溶液中。稀释溶液至1L，如果产生了沉淀，使用前需过滤除去。储存于棕色瓶中，避免阳光直射，室温保存。
优化地：上述木聚糖以50mM醋酸钠缓冲液，pH4.5的溶剂。
本发明的有益效果是：本发明利用碱性二价铜离子与还原性糖反应生成氧化亚铜，在浓硫酸存在下，将砷钼酸盐还原成兰色化合物，再进行比色分析。该法在检测酶活时产生的变异较小，干扰较少，避免了DNS对还原性的单糖、寡糖的氧化，减小了单糖标准曲线与实际样品间的误差，因而检测的准确性明显高于DNS法。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明所述木聚糖酶活力的测定方法作进一步说明。
主要仪器：恒温水浴锅，数字酸度计，紫外可见分光光度计，震荡器。
药品：木聚糖，木聚糖酶，木糖。
所用试剂和溶液的配制：
A、50mM醋酸钠缓冲液，pH＝4.5，30℃。
B、1.0％(w/v)木聚糖溶液：用A中的醋酸钠缓冲液配制5ml。
C、0.05％(w/v)牛血清白蛋白(原酶稀释)：用A中的醋酸钠缓冲液配制25ml。
D、木聚糖酶溶液：在使用前，用C中的牛血清白蛋白液配制5-10单位/ml的木聚糖酶溶液
E、将1.3M硫酸钠、226mM碳酸钠和43mM酒石酸钾钠溶于500ml去离子水中形成硫酸钠-碳酸钠-酒石酸钾钠混合液，将16mM硫酸铜溶于100ml去离子水中形成硫酸铜溶液，然后再将硫酸铜溶液加入到硫酸钠-碳酸钠-酒石酸钾钠混合液中(避免产生沉淀)形成硫酸钠-碳酸钠-酒石酸钾钠-硫酸铜混合液。将190mM碳酸氢钠溶于去100ml离子水中形成碳酸氢钠溶液，再将碳酸氢钠溶液加入到硫酸钠-碳酸钠-酒石酸钾钠-硫酸铜混合液中。稀释上述混合溶液至1L，如果产生了沉淀，过滤除去。储存于棕色瓶中，避免阳光直射，室温保存。
F、将40mM钼酸溶解于300ml去离子水中，然后加入756mM硫酸(注意，这是一个放热的反应)，形成钼酸-硫酸混合液。将19mM砷酸溶于300ml去离子水中形成砷酸溶液，将砷酸溶液加入到钼酸-硫酸混合液中。将所获混合液稀释到1L，37℃静置48-72小时(如果产生沉淀，过滤除去)。棕色瓶室温保存，避免阳光直射。
G、1mg/ml木糖标准液(木糖Std)：用去离子水配制10ml D(+)木糖溶液。
测定步骤：
(1)制作木糖吸光度-木糖浓度的标准对应曲线
取5组具有不同浓度的木糖标准液2ml：浓度为0ug/ml、浓度为2ug/ml、浓度为5ug/ml、浓度为10ug/ml、浓度为15ug/ml，然后分别向各组木糖标准液中加入硫酸铜混合液2.0ml，沸水浴10min，待冷却至室温，分别向各组木糖标准液中加入砷钼酸混合液2.0ml，继后离心，测上清液在540nm下的吸光值(DA540nm Std＝A540nm Std-A540nm Std Blank)，用各组木糖标准液的浓度及对应的吸光值制作木糖吸光度-木糖浓度的标准对应曲线。
(2)用待测木聚糖酶水解木聚糖，然后检测水解得到的木糖的吸光度值；
将1.90ml浓度为1.0％(w/v)的木聚糖溶液震荡混匀，平衡到30℃，再加入0.1ml上述B中的木聚糖酶溶液，混匀后，30℃静置10min，再加入上述E中硫酸铜混合液2.0ml，沸水浴10min，冷却到室温时再加入上述F中的砷钼酸混合液2.0ml，涡漩直到试管停止起泡，所有的沉淀溶解，离心。在540nm下测定上清液的吸光度值(DA540nm样品＝A540nm实验组-A540nm对照组)。
(3)将步骤(2)所测水解得到的木糖的吸光度值用步骤(1)所述木糖吸光度-木糖浓度的标准对应曲线获得所述水解产物木糖的含量；
(4)根据以下公式计算木聚糖酶的活力：
上式中，df＝稀释系数，10＝反应时间，0.1＝使用酶的体积。
木聚糖酶的活力单位可被定义为在上述条件下每分钟水解1.0μmol木聚糖所需要的酶量为一个酶单位。
Claims (3)
1.一种木聚糖酶活力的测定方法，其特征在于步骤如下：
(1)制作木糖吸光度-木糖浓度的标准对应曲线；
(2)用待测木聚糖酶水解木聚糖，然后检测水解得到的木糖的吸光度值；
(3)将步骤(2)所测水解得到的木糖的吸光度值用步骤(1)所述木糖吸光度-木糖浓度的标准对应曲线获得所述水解产物木糖的含量；
(4)根据以下公式计算木聚糖酶的活力：
上式中，df＝稀释系数，10＝反应时间，0.1＝使用酶的体积。
2.根据权利要求1所述的木聚糖酶活力的测定方法，其特征在于制作木糖吸光度-木糖浓度的标准对应曲线时，在0～16.7ug/ml浓度范围配制5组不同浓度的木糖标准液，分别在各组标准液中加入硫酸铜混合液，沸水浴10min，冷却至室温，再加入砷钼酸混合液，离心后在540nm下测上清液的吸光值。
3.根据权利要求1或2所述的木聚糖酶活力的测定方法，其特征在于用待测木聚糖酶水解木聚糖是将木聚糖溶液平衡到30℃再加入待测木聚糖酶溶液，混合均匀后，30℃静置10min，再加入硫酸铜混合液，沸水浴10min，然后冷却到室温时再加入砷钼酸混合液，摇动或涡漩直到试管停止起泡，所有的沉淀溶解后离心。
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103499546A (zh) * | 2013-02-04 | 2014-01-08 | 中国科学院沈阳应用生态研究所 | 一种有机磷农药降解酶活力检测方法 |
| CN106153615A (zh) * | 2016-06-21 | 2016-11-23 | 华南理工大学 | 一种木糖试纸及其制备方法 |
| CN111269958A (zh) * | 2020-02-28 | 2020-06-12 | 广东溢多利生物科技股份有限公司 | 添加在饲料中木聚糖酶的测定方法 |
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2010
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| CN103499546A (zh) * | 2013-02-04 | 2014-01-08 | 中国科学院沈阳应用生态研究所 | 一种有机磷农药降解酶活力检测方法 |
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| CN106153615B (zh) * | 2016-06-21 | 2019-01-15 | 华南理工大学 | 一种木糖试纸及其制备方法 |
| CN111269958A (zh) * | 2020-02-28 | 2020-06-12 | 广东溢多利生物科技股份有限公司 | 添加在饲料中木聚糖酶的测定方法 |
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|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20120404 |