CN102253207A

CN102253207A - 一种检测饲用木聚糖酶活力的方法及其应用

Info

Publication number: CN102253207A
Application number: CN2011101592900A
Authority: CN
Inventors: 高向阳; 吴端楷; 陈权军
Original assignee: Guangzhou Boshiao Biochemical Technology Research Co Ltd
Current assignee: Guangzhou Boshiao Biochemical Technology Research Co Ltd
Priority date: 2011-06-14
Filing date: 2011-06-14
Publication date: 2011-11-23
Anticipated expiration: 2031-06-14
Also published as: CN102253207B

Abstract

本发明公开了一种检测饲用木聚糖酶活力的方法及其应用。本发明所述的方法首先是用ELSA检测待测样品中木聚糖酶水解后剩余生物素标记木聚糖的吸光度值；然后根据酶活力梯度曲线计算出待测样品中木聚糖酶的活力；酶活力梯度曲线是用ELSA测得的酶解后剩余生物素标记木聚糖的吸光度值与已知的不同木聚糖酶活力对应关系的曲线。由于本发明对ELSA的条件均进行优化，使用本发明的方法，能对饲料中的木聚糖酶活力进行微量检测，灵敏度能达到1×10^-5U/g。本发明所述的方法不仅能对饲料中木聚糖酶的活力进行检测，而且由于其灵敏高，检测时采用的酶解温度同畜禽的肠道温度一致，因此，根据此方法得到酶活力能更好地对饲料中的木聚糖酶进行活力评价。

Description

一种检测饲用木聚糖酶活力的方法及其应用

技术领域

本发明涉及酶活力的检测方法，特别涉及一种检测饲用木聚糖酶活力的方法及其应用。

背景技术

从国际范围来看，大约已有65％～75％的谷物饲料中添加了以木聚糖酶为主的非淀粉多糖酶，在饲料中添加木聚糖酶对于提高动物的生产性能和降低料肉比有着明显的效果。配合饲料中木聚糖酶活性的分析与检测在饲料工业中具有重要的作用：①它是酶制剂生产企业用于检验监控产品质量的重要手段；②添加于饲料中的酶制剂在与饲料一起混合经过加工过程后，势必会造成一定酶活性的损失，因此对混合成品饲料中酶制剂活性的测定(即饲料中酶的存活率)，可直接反映成品饲料中酶制剂的添加效果和品质；③它是合理制定木聚糖酶加工、储存、运输、使用(添加剂量)标准的重要依据。

但是，饲料中木聚糖酶的分析测定一直是困扰木聚糖酶应用的主要难题。这主要是由于饲料中添加的木聚糖酶量少，使得终产品酶活力低难以检出；而且饲料中存在很多干扰木聚糖酶活力测定的因素，譬如饲料本身含有的还原糖量很高，使得常用的木聚糖酶检测方法——DNS法无法应用在饲料中检测木聚糖酶的活力。

酶联免疫吸附法(ELISA)是一种检测抗原抗体的高灵敏度的方法，主要是通过抗原抗体的特异性识别排除其他干扰，通过酶级联反应将检测信号放大以提高检测的灵敏度。ELISA在医学和科研上已是一种常规的检测手段，常用于待测物的微量检测，但不能直接用于检测酶活力。将ELISA法用于木聚糖酶活力测定需要对方法进行改造。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种检测饲用木聚糖酶活力的方法。该方法采用酶联吸附法(ELSA)来测定木聚糖酶活力。

本发明的另一目的在于提供所述检测饲用木聚糖酶活力方法的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种检测饲用木聚糖酶活力的方法，包括以下步骤：

(1)将待测样品和生物素标记木聚糖混合，反应，通过待测样品中的木聚糖酶降解生物素标记木聚糖中的木聚糖；再通过ELSA检测剩余生物素标记木聚糖的吸光度值；

(2)根据酶活力梯度曲线计算出待测样品中木聚糖酶的活力；酶活力梯度曲线是用ELSA测得的酶解后剩余生物素标记木聚糖的吸光度值与已知的不同木聚糖酶活力对应关系的曲线；

步骤(1)中所述的ELSA的具体步骤优选为：

①将生物素标记木聚糖置于酶标板中，于20℃～30℃包被2h或4℃包被过夜，然后用PBST溶液洗涤酶标板；

②加入待测样品液，保鲜膜封住后置于40℃～41℃酶解30～90min，用PBST溶液洗涤酶标板，终止反应；

③在上一步的酶标板中加入质量体积比1％～2％的牛血清白蛋白(BSA)于37℃封闭1～2h，然后用PBST溶液洗涤酶标板；

④加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，在37℃温育30min，然后用PBST溶液洗涤酶标板；

⑤加入TMB-过氧化氢尿素底物显色溶液，于37℃反应10～30min；当显示蓝色时，加入硫酸溶液以终止反应，稳定3～5min用酶标仪测定波长为450nm处酶标板的各孔显色后的吸光度。

所述的生物素标记木聚糖为生物素通过乙二胺连接到木聚糖中木糖的羟基上，优选通过如下步骤制备得到：将75mg木聚糖溶于2mL蒸馏水；加入0.1mL100mmol/L NaIO₄，室温下混合0.5h(此过程避光)，得到混合物；在混合物中加入1mL乙二胺，反应2h；加入体积百分比95％乙醇溶液进行洗涤离心，取沉淀，除去未反应的部分(乙二胺)；用2mL蒸馏水溶解沉淀，加入5mg硼氢化钠，于4℃反应4h，再用乙醇洗涤离心，取沉淀；15mg BNHS(生物素-N-羟基琥珀酰亚胺酯)溶于0.2mL二甲亚砜中，再与得到的沉淀物在25℃～30℃下反应24h；加入乙醇进行洗涤离心，得到的沉淀物溶于3mL蒸馏水，得到生物素标记木聚糖；

所述的洗涤离心条件优选为0℃，10000g离心10min；

所述洗涤次数优选为3次；

上述得到的生物素标记木聚糖的最佳包被浓度为原液按体积稀释40000倍；

所述的生物素标记木聚糖优选通过pH9.6、0.05mol/L碳酸盐缓冲液进行稀释；

所述的PBST溶液的组成如下：pH7.2、0.05mol/L PBS溶液中加入Tween-20，Tween-20的终浓度为体积百分比0.05％；

所述PBST溶液洗涤次数优选为3～5次，更优选为3次；

所述的待测样品为饲料时，优选通过如下步骤进行处理：在饲料中加入pH4.7、25mmol/L的乙酸盐溶液进行抽提，离心，上清液为待测样品液；

所述的抽提条件优选为40℃，转速为250rpm，抽提30min；

所述的离心条件优选为5000rpm，离心5min；

所述的牛血清白蛋白的浓度更优选为质量体积比1％；

所述的TMB-过氧化氢尿素底物显色溶液的组成如下：底物显色液A：2mg/mL TMB无水乙醇溶液；底物显色液B：C₆H₈O₇·H₂O(柠檬酸合一水)0.930g，Na₂HPO₄·12H₂O 4.00g，0.64mL质量体积比0.75％过氧化氢尿素，定容到100mL；使用时底物显色液A和B按体积比1∶19混合即成TMB-过氧化氢尿素底物显色液，现配现用；

所述的硫酸溶液的浓度优选为2mol/L；

所述的步骤(1)更优选为包含如下步骤：

①制备生物素标记木聚糖：将75mg木聚糖溶于2mL蒸馏水；加入0.1mL100mmol/L NaIO₄，室温下混合0.5h(此过程避光)，得到混合物；在混合物中加入1mL乙二胺，反应2h；加入体积百分比95％乙醇溶液于0℃，10000g离心10min，取沉淀，除去未反应的部分(乙二胺)，重复3次洗涤离心；用2mL蒸馏水溶解沉淀，加入5mg硼氢化钠，于4℃反应4h，再用乙醇于0℃，10000g离心10min，取沉淀，重复3次洗涤离心；15mg BNHS(生物素-N-羟基琥珀酰亚胺酯)溶于0.2mL二甲亚砜中，再与得到的沉淀物在20℃～30℃下反应24h；加入乙醇于0℃，10000g离心10min，得到的沉淀物溶于3mL蒸馏水，得到生物素标记木聚糖；

②使用ELSA进行检测：用pH9.6、0.05mol/L碳酸盐缓冲液将步骤①制备的生物素标记木聚糖按体积稀释40000倍，按每孔100μL加入酶标板，20℃～30℃包被2h或4℃包被过夜；用PBST溶液洗涤3次；加入待测样品液，每个标本设3个平行，保鲜膜封住后于40℃酶解30min，PBST溶液洗涤3次终止反应；每孔加入160μL的1％BSA在37℃封闭1～2h，用PBST溶液洗涤3次；将辣根过氧化物酶标记链霉亲和素用pH7.2、0.05mol/L PBS溶液按体积比1∶5000稀释后，按每孔100μL加入酶标板，在37℃孵育30min，用PBST溶液洗涤4次；孵育结束后，各反应孔中加入100μL现配现用的TMB-过氧化氢尿素底物显色溶液，置于37℃反应10～30min，当显示蓝色时，各反应孔中加入50μL2mol/L硫酸以终止反应，稳定3～5min后，用酶标仪测定待测样品在450nm处的吸光度值；

步骤(2)中所述的酶活力梯度曲线的操作步骤同待测样品的ELSA检测方法，区别仅在于将已知酶活力的木聚糖酶取代待测样品，其中已知酶活力的木聚糖酶用pH4.7、25mmol/L乙酸盐溶液进行稀释；根据测得的数据绘制木聚糖酶活力梯度曲线；具体步骤如下：

②加入已知酶活力的木聚糖酶，保鲜膜封住后于40℃～41℃孵育30～90min，用PBST溶液洗涤酶标板，终止反应；

③在上一步的酶标板中加入质量体积比1％～3％的牛血清白蛋白(BSA)于37℃封闭1～2h，然后用PBST溶液洗涤酶标板；

⑤加入TMB-过氧化氢尿素底物显色溶液，于37℃反应10～30min；当显示蓝色时，加入硫酸溶液以终止反应，稳定3～5min，用酶标仪测定波长为450nm处酶标板中各孔显色后的吸光度值；

⑥根据吸光度值和木聚糖酶的酶活值，绘制得到酶活梯度曲线。

所述的已知酶活力的木聚糖酶在进行稀释时优选通过pH4.7、25mmol/L乙酸盐溶液进行稀释；

所述检测饲用木聚糖酶活力方法用于木聚糖酶活力的检测，特别适用于饲料中木聚糖酶活力的检测和评价；

所述的评价为根据如表1所示的“饲料添加木聚糖酶活力评价分级表”对待测样品进行评价，将饲料进行分级。

表1

注：待测木聚糖酶液是按1.000g含木聚糖酶的饲料经pH4.7、25mmol/L乙酸盐缓冲液抽提后定容到100mL。所以饲料木聚糖酶活力100U/g相当于酶液活力为1U/mL。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明的优点是用酶联吸附法(ELSA)对木聚糖酶水解生物素标记木聚糖后剩余木聚糖的量进行检测，以此来确定木聚糖酶的活力；生物素标记木聚糖经木聚糖酶水解产生的低聚木糖和木糖通过洗涤去除，剩余木聚糖依然吸附在酶标板上，通过生物素与链霉亲和素的特异性识别和酶级联反应将检测信号放大，因此检测出剩余木聚糖量灵敏度直接决定着对木聚糖酶活力检测的灵敏度。该方法测木聚糖酶的检测限和工作浓度范围都比DNS法低几个数量级，所以本发明所述的方法的灵敏度显著高于DNS法。根据实际应用添加木聚糖酶的量将饲料终产品按不同范围进行分类，通检测计算出实际所测木聚糖酶活力，按照“饲料添加木聚糖酶活力评价分级表”对饲料终产品进行评价。由于该方法是通过生物素与链霉亲和素的特异性识别和酶级联反应将检测信号放大，在放大的同时也会将误差放大，所以检测结果稳定性不理想，这并不是检测方法精确度的问题，而是饲料比较难保证添加少量木聚糖酶混合均匀造成的。发明人发现检测结果虽然不够稳定，但数值在一定范围内波动。检测结果的波动范围基本在理论酶活力的数量级内。所以发明人针对这种情况和根据实际饲料中添加木聚糖酶的量建立了“饲料添加木聚糖酶活力评价分级表”来克服这种稳定性不足的缺陷。

(2)本发明通过优化各种参数，对木聚糖酶的酶活力检测可达到1×10^-7U/mL。

附图说明

图1是本发明的流程图。

图2是木聚糖酶活力梯度曲线。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

(1)材料

①本发明所用的主要仪器和设备

精密天平，PB203-N型，METTLER TOLEDO；电热恒温培养箱，DPX-9082B2型，上海福玛实验设备有限公司；数字精密pH计，PHS-3C型，雷磁；磁力加热搅拌器，78-1型，金坛市富华仪器有限公司；全温型多振幅轨道摇床，ZHW-200B型，上海智城分析仪器制造有限公司；低温离心机，5415R型，Eppendorf；酶标仪，680型，BIO-RAD；移液器(100-1000μL、20-200μL和2-20μL)，Dragon；彩色多头移液器(50-300μL)，Thermo SCIENTIFIC。

②本发明涉及的主要试剂

木聚糖，来源于Oat spelts，Sigma公司；生物素-N-羟基琥珀酰亚胺酯(BNHS)，Sigma公司；牛血清白蛋白(BSA)，Roche公司；3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)，Sigma公司；辣根过氧化物酶标记链霉亲和素(Streptavidin/HRP)，上海碧云天生物技术有限公司；木聚糖酶粉，广州市博仕奥生化技术有限公司；其余化学试剂均为国产分析纯。

③本发明涉及的溶液配制方法

A、磷酸盐缓冲液(PBS，0.05mol/L、pH7.2)：4.39g NaCl，20.63gNa₂HPO₄·12H₂O，3.19g NaH₂PO₄·2H₂O，定容到1000mL；

B、洗涤酶标板用的缓冲液(PBST，pH7.2)：在A得到的磷酸盐缓冲液中加入Tween-20，其终浓度为0.05％(v/v)；

C、乙酸盐缓冲液(25mmol/L，pH4.7)：3.375g CH₃COONa溶于800mL蒸馏水中，用CH₃COOH滴定至pH4.7，定容到1000mL；

D、碳酸盐缓冲液(0.05mol/L，pH9.6)：1.59g Na₂CO₃，2.93g NaHCO₃溶于800mL蒸馏水中，然后定容到1000mL，用作包被液；

E、底物显色液A：20mg TMB溶于10mL的无水乙醇；

F、底物显色液B(pH5.5)：底物液B：0.930g C₆H₈O₇·H₂O(柠檬酸合一水)，4.00g Na₂HPO₄·12H₂O，0.64mL质量体积比0.75％过氧化氢尿素，溶解与80mL蒸馏水中，然后定容到100mL；

G、TMB-过氧化氢尿素底物显色液：底物显色液A和B按体积比1∶19混合即得，现配现用。

H、样品酶液：称取1.000g木聚糖酶粉，加入60mL 25mmol/L、pH4.7乙酸盐缓冲液，在磁力搅拌器中搅拌抽提30min，然后用乙酸盐缓冲液定容到100mL，过滤，滤液稀释10000倍为待测样品酶液。

I、饲料成分：玉米53wt％、棕榈6wt％、豆粕13wt％、菜粕4wt％、石粉1wt％、麸皮10wt％、脱脂米糠10wt％和预混料3wt％。

④制备生物素标记木聚糖：将75mg木聚糖溶于2mL蒸馏水；加入0.1mL100mmol/L NaIO₄，室温下混合0.5h(此过程避光)，得到混合物；在混合物中加入1mL乙二胺，反应2h；加入95％乙醇溶液于0℃，10000g离心10min，取沉淀，除去未反应的部分(乙二胺)，重复3次洗涤离心；用2mL蒸馏水溶解沉淀，加入5mg硼氢化钠，于4℃反应4h，再用乙醇于0℃，10000g离心10min，取沉淀，重复3次洗涤离心；15mg BNHS溶于0.2mL二甲亚砜中，再与得到的沉淀物在室温(20℃～30℃)下反应24h；加入乙醇于0℃，10000g离心10min，得到的沉淀物溶于3mL蒸馏水，得到生物素标记木聚糖。

(2)木聚糖酶酶解时间优化

将生物素标记木聚糖用包被液按体积稀释40000倍，每孔加100μL，25℃～30℃包被2h；用PBST洗涤3次，将配制好的已知酶活力的系列木聚糖酶溶液(10、1、10^-1、10^-2、10^-3和10^-4U/mL)，加入酶标孔中，每孔100μL，每个标本设3个重复，选择30、60、90和120min进行酶解，对木聚糖酶酶解时间进行优化，以酶解后获得的趋势线性相关性为评价标准，相关性越高越好；酶解结束后，甩干，用PBST洗涤3次，加入1％BSA封闭2h；封闭结束后用PBST洗涤3次，每孔加入100μL稀释5000倍辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，37℃孵育30min；孵育结束后，甩干用PBST洗涤4次，每孔加入100μL现配的TMB-过氧化氢尿素底物显色溶液，置于37℃反应10min，每孔加入50μL 2mol/L硫酸以终止反应，稳定5min后，用酶标仪测定待测样品在450nm处的吸光度值。将不同酶解时间获得的木聚糖酶活力梯度曲线进行线性拟合，线性相关越高越好。酶解30min的酶活力梯度曲线的R²＝0.9894，酶解60min的酶活力梯度曲线的R²＝0.9901；酶解90min的酶活力梯度曲线的R²＝0.9989；酶解120min的酶活力梯度曲线的R²＝0.8923。酶解时间在30～90min之间可以保证酶活力梯度曲线较好的线性。分别用酶解30、60、90和120min检测样品酶液的酶活力，样品重复数为6。酶解30min，实测样品酶液活力为0.0227±0.030，相对误差为9.20％，批内变异系数(CV)为13.22％；酶解60min，实测样品酶液活力为0.0234±0.021，相对误差为6.40％，批内变异系数(CV)为8.97％；酶解90min，实测样品酶液活力为0.0252±0.017，相对误差为0.80％，批内变异系数(CV)为6.75％。酶解30～90min，检测结果的准确度和精确度都是比较高的。

(3)封闭液浓度优化

将生物素标记木聚糖用包被液按体积稀释40000倍，每孔加100μL，25℃～30℃包被2h；用PBST洗涤3次，将配制好0.5、0.05和0.005U/mL的三种不同酶活力木聚糖酶溶液，加入酶标孔中，每孔100μL，每个样本设12个重复，40℃酶解30min；酶解结束后，甩干，用PBST洗涤3次，加入质量体积比0.5％、1％、2％和3％不同浓度BSA封闭60min，对封闭液浓度进行优化；封闭结束后用PBST洗涤3次，每孔加入100μL稀释5000倍辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，37℃孵育30min；孵育结束后，甩干用PBST洗涤4次，每孔加入100μL现配的TMB-过氧化氢尿素底物显色溶液，置于37℃反应10min，每孔加入50μL 2mol/L硫酸以终止反应，稳定5min后，用酶标仪测定待测样品在450nm处的吸光度值。以批内变异系数来评价封闭效果。0.5％BSA封闭60min，批内平均变异系数为22.47％；1％BSA封闭60min，批内平均变异系数为8.32％；2％BSA封闭60min，批内平均变异系数为10.72％；3％BSA封闭60min，批内平均变异系数为15.45％。用1％BSA封闭60min可以保证批内变异系数在10％以下。

(4)封闭时间优化

将生物素标记木聚糖用包被液按体积稀释40000倍，每孔加100μL，25℃～30℃包被2h；用PBST洗涤3次，将配制好0.5、0.05和0.005U/mL的三种不同酶活力木聚糖酶溶液，加入酶标孔中，每孔100μL，每个样本设12个重复，40℃酶解30min；酶解结束后，甩干，用PBST洗涤3次，加入质量体积比1％BSA封闭0、30、60、90和120min，对封闭时间进行优化；封闭结束后用PBST洗涤3次，每孔加入100μL稀释5000倍辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，37℃孵育30min；孵育结束后，甩干用PBST洗涤4次，每孔加入100μL现配的TMB-过氧化氢尿素底物显色溶液，置于37℃反应10min，每孔加入50μL 2mol/L硫酸以终止反应，稳定5min后，用酶标仪测定待测样品在450nm处的吸光度值。以批内变异系数来评价封闭效果。封闭0min，批内平均变异系数为62.45％；封闭30min，批内平均变异系数为46.32％；封闭60min，批内平均变异系数为9.72％；封闭90min，批内平均变异系数为8.65％；封闭120min，批内平均变异系数为9.35％。用质量体积比1％BSA封闭60～120min可以保证批内变异系数在10％以下。

(5)显色时间优化

将生物素标记木聚糖用包被液按体积稀释40000倍，每孔加100μL，25℃～30℃包被2h；用PBST洗涤3次，加入质量体积比1％BSA封闭2h；封闭结束后用PBST洗涤3次，每孔加入100μL按体积稀释5000倍辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，37℃孵育30min；孵育结束后，甩干用PBST洗涤4次，每孔加入100μL现配的TMB-过氧化氢尿素底物显色溶液，置于37℃反应5、10、20、30和40min，每个时间点做9个重复，对显色时间进行优化；显色结束，每孔加入50μL 2mol/L硫酸以终止反应，稳定5min后，用酶标仪测定待测样品在450nm处的吸光度值。5min显色后450nm读数为0.657±0.014；10min显色后450nm读数为1.058±0.016；20min显色后450nm读数为1.086±0.023；30min显色后450nm读数为1.020±0.025；40min显色后450nm读数为0.442±0.019。显色10～30min可以保证450nm读数在1.000以上，而且较稳定。

实施例2

ELISA检测木聚糖酶活力的方法的操作流程如图1所示：

(1)将已知酶活力的木聚糖酶(2500U/g)按质量百分比2％、0.2％和0.02％的量添加到饲料小麦基础日粮中混匀；取1g样品用100mL pH4.7、25mmol/L乙酸盐缓冲液在40℃、250rpm的摇床上抽提30min，取1mL抽提液5000rpm离心5min，上清液为待测样品液，待测样品液的理论酶活力分别为0.5、0.05和0.005U/mL；

(2)用pH9.6、0.05mol/L碳酸盐缓冲液将生物素标记木聚糖按体积稀释40000倍，按每孔100μL加入酶标板，室温包被2h或4℃包被过夜；用PBST溶液洗涤3次；加入待测样品液，每个标本设3个平行，保鲜膜封住后于40℃孵育30min，PBST洗3次终止反应；每孔加入160μL的质量体积比1％BSA在37℃封闭1h，用PBST溶液洗3次；将辣根过氧化物酶标记链霉亲和素用PBS按体积比1∶5000稀释后，按每孔100μL加入酶标板，在37℃孵育30min，用PBST溶液洗4次；孵育结束后，各反应孔中加入100μL现配的TMB-过氧化氢尿素底物显色溶液，置于37℃反应10min，当显示蓝色时，各反应孔中加入50μL 2mol/L硫酸以终止反应，稳定5min后，用酶标仪测定待测样品在450nm处的吸光度值；

酶活力梯度曲线的操作步骤同待测样品的ELSA检测方法，区别仅在于将已知酶活力的木聚糖酶取代待测样品，其中已知酶活力的木聚糖酶用pH4.7、25mmol/L乙酸盐溶液进行稀释；根据测得的数据绘制木聚糖酶活力梯度曲线；以“450nm处的吸光度值”为纵坐标，以“-log(酶活)”为横坐标绘制木聚糖酶活力梯度曲线，如图2所示。

(3)根据酶活力梯度曲线计算出待测样品中木聚糖酶的活力，如表2所示。

根据表1所示的“饲料添加木聚糖酶活力评价分级表”对待测样品进行评估。检测评定结果见表2，实测酶活力与理论酶活力存在一定的偏差，但基本在同一个活力级别。所以本发明适用于检测评定饲料终产品木聚糖酶的活力，对饲料木聚糖酶活力进行评价。

表2

实施例3

酶联吸附法(ELSA)与DNS法检测木聚糖酶活力比较

用已知酶活力的木聚糖酶粉(2500U/g)配制成10、1、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8和10^-9U/mL。分别用常规的木聚糖酶检测法——DNS法和优化后的酶联吸附法进行检测。

(1)DNS检测步骤：

A、制作木糖标准曲线：配制系列梯度的木糖标准溶液(0、40、30、20、10、5μmol/mL的木糖标准溶液)；吸取1mL的木糖标准溶液，加1mL的pH4.70.1mol/L的乙酸盐缓冲液，再加3mL DNS试剂，振荡3～5s，沸水浴加热5min。然后用自来水冷却至室温，再用蒸馏水定容至10mL。用1mL蒸馏水替代1mL的木糖标准溶液作为标准空白。以标准空白为对照调零，在分光光度计上于540nm处测定吸光度值。以木糖浓度为Y轴，吸光度值为X轴，绘制木糖标准曲线。

B、酶活力测定：1mL待测木聚糖酶溶液加入1mL质量体积比1％木聚糖中混匀，40℃精确反应10min；加入3mL DNS试剂终止酶促反应，混匀沸水浴加热5min；加热结束后用自来水冷却至室温，定容至10mL，混匀后，以空白管进行调零，测定540nm处的吸光值，根据木糖标准曲线计算测定液的酶活力。

结果显示，DNS法只能检测出10^-2U/mL以上的木聚糖酶溶液的活力。

(2)酶联吸附法检测步骤

A、将生物素标记木聚糖用包被液稀释40000倍，每孔加100μL，25℃～30℃包被2h；用PBST洗涤3次，将配制好的已知酶活力的系列木聚糖酶溶液(10、1、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8和10^-9U/mL)，加入酶标孔中，每孔100μL，每个标本设3个重复，选择30min进行酶解；酶解结束后，甩干，用PBST溶液洗涤3次，加入质量体积比1％BSA封闭2h；封闭结束后用PBST溶液洗涤3次，每孔加入100μL按体积稀释5000倍辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，37℃孵育30min；孵育结束后，甩干用PBST溶液洗涤4次，每孔加入100μL现配的TMB-过氧化氢尿素底物显色溶液，置于37℃反应10min，每孔加入50μL 2mol/L硫酸以终止反应，稳定5min后，用酶标仪测定待测样品在450nm处的吸光度值。

检测结果显示10、1、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7U/mL具有较好的线性，R²＝0.9901，酶活力梯度曲线见图2。

两种方法对比，酶联吸附法比DNS法灵敏5个数量级。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种检测饲用木聚糖酶活力的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)将待测样品和生物素标记木聚糖混合反应，接着通过ELSA检测剩余生物素标记木聚糖的吸光度值；

(2)根据酶活力梯度曲线计算出待测样品中木聚糖酶的酶活；酶活梯度曲线是用ELSA测得的酶解后剩余生物素标记木聚糖的吸光度值与已知的不同木聚糖酶活力对应关系的曲线。

2.根据权利要求1所述的检测饲用木聚糖酶活力的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的ELSA法的具体步骤为：

②加入待测样品液，保鲜膜封住后放入于40℃～41℃孵育30～90min，用PBST溶液洗涤酶标板，终止反应；

③在步骤②得到的酶标板中加入质量体积比1％～2％的牛血清白蛋白于37℃封闭1～2h，然后用PBST溶液洗涤酶标板；

⑤加入TMB-过氧化氢尿素底物显色溶液，于37℃反应10～30min；当显示蓝色时，加入硫酸溶液以终止反应，稳定3～5min，用酶标仪测定波长为450nm处酶标板的各孔显色后的吸光度值。

3.根据权利要求2所述的检测饲用木聚糖酶活力的方法，其特征在于：所述的生物素标记木聚糖为生物素通过乙二胺连接到木聚糖中的木糖的羟基上，通过如下步骤制备得到：将75mg木聚糖溶于2mL蒸馏水；加入0.1mL100mmol/L NaIO₄，避光、室温条件下混合0.5h，得到混合物；在混合物中加入1mL乙二胺，反应2h；加入体积百分比95％乙醇溶液进行洗涤离心，取沉淀；用2mL蒸馏水溶解沉淀，加入5mg硼氢化钠，于4℃反应4h，再用乙醇洗涤离心，取沉淀；15mg生物素-N-羟基琥珀酰亚胺酯溶于0.2mL二甲亚砜中，再与得到的沉淀物在25℃～30℃下反应24h；加入乙醇进行洗涤离心，得到的沉淀物溶于3mL蒸馏水，得到生物素标记木聚糖。

4.根据权利要求3所述的检测饲用木聚糖酶活力的方法，其特征在于：所述的洗涤离心条件为0℃，10000g离心10min；所述洗涤的次数为3次。

5.根据权利要求2所述的检测饲用木聚糖酶活力的方法，其特征在于：

所述的生物素标记木聚糖为通过pH9.6、0.05mol/L的碳酸盐缓冲液稀释后再进行包被；

所述的PBST溶液的组成如下：pH7.2、0.05mol/L的PBS溶液中加入Tween-20，Tween-20的终浓度为体积百分比0.05％；

所述PBST溶液洗涤次数为3～5次；

所述的待测样品为饲料时，通过如下步骤进行处理：在饲料中加入pH4.7、25mmol/L乙酸盐溶液进行抽提，离心，上清液为待测样品液；

所述的牛血清白蛋白的浓度为质量体积比1％；

所述的TMB-过氧化氢尿素底物显色溶液的组成如下：底物显色液A：2mg/mL TMB无水乙醇溶液；底物显色液B：C₆H₈O₇·H₂O 0.930g，Na₂HPO₄·12H₂O4.00g，0.64mL质量体积比0.75％过氧化氢尿素溶于80mL蒸馏水中，然后定容到100mL；使用时底物显色液A和B按体积比1∶19混合即成TMB-过氧化氢尿素底物显色液。

6.根据权利要求5所述的检测饲用木聚糖酶活力的方法，其特征在于：

所述的抽提条件为温度为40℃，转速为250rpm，抽提时间为30min；

所述的离心条件为5000rpm离心5min；

所述的硫酸溶液的浓度为2mol/L。

7.根据权利要求2所述的检测饲用木聚糖酶活力的方法，其特征在于：所述的步骤(1)为包含如下步骤：

①制备生物素标记木聚糖：将75mg木聚糖溶于2mL蒸馏水；加入0.1mL100mmol/L NaIO₄，避光、室温下混合0.5h，得到混合物；在混合物中加入1mL乙二胺，反应2h；加入体积百分比95％乙醇溶液于0℃，10000g离心10min，取沉淀，重复3次洗涤离心；用2mL蒸馏水溶解沉淀，加入5mg硼氢化钠，于4℃反应4h，再用乙醇于0℃，10000g离心10min，取沉淀，重复3次洗涤离心；15mg生物素-N-羟基琥珀酰亚胺酯溶于0.2mL二甲亚砜中，再与得到的沉淀物在20℃～30℃下反应24h；加入乙醇于0℃，10000g离心10min，得到的沉淀物溶于3mL蒸馏水，得到生物素标记木聚糖；

②使用ELSA法进行检测：用pH9.6、0.05mol/L碳酸盐缓冲液将步骤①制备的生物素标记木聚糖按体积稀释40000倍，按每孔100μL加入酶标板，20℃～30℃包被2h或4℃包被过夜；用PBST溶液洗涤3次；加入待测样品液，每个标本设3个平行，保鲜膜封住后于40℃孵育30min，PBST溶液洗3次终止反应；每孔加入160μL的质量体积比1％BSA在37℃封闭1～2h，用PBST溶液洗3次；将辣根过氧化物酶标记链霉亲和素用pH7.2、0.05mol/L PBS溶液按体积比1∶5000稀释后，按每孔100μL加入酶标板，在37℃孵育30min，用PBST溶液洗4次；孵育结束后，各反应孔中加入100μL现配的TMB-过氧化氢尿素底物显色溶液，置于37℃反应10～30min，当显示蓝色时，各反应孔中加入50μL 2mol/L硫酸以终止反应，稳定3～5min后，用酶标仪测定待测样品在450nm处的吸光度值。

8.根据权利要求1所述的检测饲用木聚糖酶活力的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的酶活梯度曲线的操作步骤如下：

②加入已知酶活的木聚糖酶，保鲜膜封住后置于40℃～41℃孵育30～90min，用PBST溶液洗涤酶标板，终止反应；

③在步骤②得到的酶标板中加入质量体积比1％～3％的牛血清白蛋白于37℃封闭1～2h，然后用PBST溶液洗涤酶标板；

⑤加入TMB-过氧化氢尿素底物显色溶液，于37℃反应10～30min；当显示蓝色时，加入硫酸溶液以终止反应，稳定3～5min，用酶标仪测定波长为450nm处酶标板的各孔显色后的吸光度值；

9.根据权利要求8所述的检测饲用木聚糖酶活力的方法，其特征在于：所述的已知酶活的木聚糖酶在进行稀释时为通过pH4.7、25mmol/L乙酸盐溶液进行稀释。

10.权利要求1～9任一项所述的检测饲用木聚糖酶活力的方法用于检测和评价饲料中的木聚糖酶活力。