CN101477035A - 木聚糖酶活力的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种木聚糖酶活力的测定方法，其特征是；A.制作用MBTH法测得的木糖吸光度值与木糖浓度的标准对应关系曲线；B.用MBTH法检测待测木聚糖酶水解木聚糖后产生的相当于木糖的吸光度值；根据上一步骤制作的木糖浓度与测得的木糖吸光度值之间的标准对应关系曲线确定待查木聚糖酶的酶解产物中在单位时间内所产生的相当于木糖的还原糖的含量，以此来推算木聚糖酶的活力。本发明用MBTH法对木聚糖酶水解木聚糖后所产生的木糖端基的数量进行检测以此来确定木聚糖酶的活力。该方法测木糖的检测限和工作浓度范围都明显低于DNS法和铁氰化钾法，所以本方法的灵敏度明显高于DNS法和铁氰化钾法。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种测定木聚糖酶活力的方法，具体涉及用MBTH法测定木聚糖酶活力的方法尤其涉及测定过程中关键参数的选择。
背景技术
木聚糖酶是可将木聚糖降解成低聚木糖和木糖的水解酶。近年来，因其在造纸工业、食品工业、饲料工业、能源工业和环境科学等方面都具有较大的应用价值而引起科研工作者的广泛关注，并对其进行了相关研究。酶活力是衡量酶生物活力的重要指标。木聚糖酶属多糖水解酶，目前常用DNS法测定其酶活力，具体方法是分别取具有一定浓度梯度的木糖溶液2mL于试管中，加入1.5-2.5mL DNS试剂，混匀，在沸水浴中加热5-15分钟，立即用冷水冷却至室温，加水定容至10-25ml，混匀，在540nm处测吸光度A值。回收率测定：以木糖样品采用标准品随行对照法分别加入不同量的标准木糖溶液，方法同上，测定木糖含量并计算回收率。虽然此法简便、快捷，但灵敏度相对较低，不利于某些科学研究和产品质量控制。
3-甲基-2-苯并噻唑酮腙(MBTH)可以与不同类型的有机化合物反应，例如含有亚甲基的化合物，芳族胺类，羰基化合物，Schiff碱，糖类，苯酚类，甾类化合物等。测定不受低浓度醋酸盐和琥珀酸盐缓冲液的干扰，对于不同聚合度的同类还原糖，其还原端的显色吸光系数基本相同。因此MBTH法的应用面不同，所采用的各项测定条件也有所不同。3-甲基-2-苯并噻唑酮腙(MBTH)法常用于微量甲醛含量的测定，如果将此法用于木聚糖酶活力测定需要选择适宜的酶活力测定条件，提高测定结果的准确性。
发明内容
针对已有技术的不足，本发明提供一种木聚糖酶活力的测定方法，该方法采用3-甲基-2-苯并噻唑酮腙(MBTH)法来测定木聚糖酶活力。
以下详细介绍本发明一种木聚糖酶活力的测定方法，A，制作用MBTH法测得的木糖吸光度值与木糖浓度的标准对应关系曲线；B，用MBTH法检测待测木聚糖酶水解木聚糖后产生的相当于木糖的吸光度值；根据上一步骤制作的木糖浓度与测得的木糖吸光度值之间的标准对应关系曲线确定待查木聚糖酶的酶解产物中在单位时间内所产生的相当于木糖的还原糖的含量，以此来推算木聚糖酶的活力。
优化地；上述步骤A的具体步骤是；作用MBTH法测得的木糖吸光度值与木糖浓度标准对应关系曲线；分别取6-15组不同浓度(0-0.032mg/mL)的木糖标准溶液2mL，加入2mL0.5当量的NaOH溶液，混匀，取1.2mL加入到试管中(做三个平行样)，再加入MBTH试剂0.6mL于75-85℃水浴加热15-30min后趁热加入硫酸铁铵试剂1.2mL，室温冷却后于波长620-680nm处测定木糖的吸光度值；根据每组木糖浓度与测得的木糖吸光度值之间的关系绘制标准对应关系曲线；
优化地；上述步骤B的具体步骤是；用MBTH法检测木聚糖酶的活力；将9.9mL木聚糖溶液其浓度为2-4mg/mL，加入到锥形瓶中于25-40℃的水浴摇床中预热8-12min，加入预热至相应温度的木聚糖酶溶液0.1mL进行水解反应，水解时间为30min，取水解液2mL，迅速加入到2mL0.5当量的NaOH溶液中，混匀，取1.2mL加入到试管中(做三个平行样)，再加入MBTH试剂0.6mL于75—85℃水浴加热15-30min后趁热加入硫酸铁铵试剂1.2mL，室温冷却后于波长620-680nm处测定吸光度值，根据上一步骤制作的木聚糖酶的活力与测得的木糖吸光度值之间的标准对应关系曲线确定待查木聚糖酶的活力；木聚糖酶的活力单位可被定义为在上述条件下每分钟产生1nM相当于木糖的量为一个酶活力单位。其中MBTH试剂的制法是3mg/mL的3-甲基-2-苯并噻唑酮腙溶液和1mg/mL的二硫苏糖醇溶液等量混合即得，现用现配，一天内有效。
优化地；上述硫酸铁铵试剂的制法是0.5％(FeNH4(SO4)2)·12H2O，0.5％氨基磺酸，0.5当量盐酸。
优化地；上述木聚糖为桦木(birchwood)木聚糖或榉木(beechwood)木聚糖。
优化地；上述木聚糖以50mM的丁二酸缓冲溶液或醋酸缓冲溶液为溶剂。
优化地；上述测定吸光度值的最佳波长为650nm。
本发明的优点是本发明用MBTH法对木聚糖酶水解木聚糖后所产生的木糖端基的数量进行检测以此来确定木聚糖酶的活力；木糖以及低聚木糖是木聚糖酶水解的最终产物，因此对木糖端基含量检测的灵敏度直接决定着对木聚糖酶活力检测的灵敏度。该方法测木糖的检测限和工作浓度范围都明显低于DNS法，所以本方法的灵敏度明显高于DNS法。
具体实施方式
实施例1：
主要仪器：水浴恒温振荡器，SHZ-82型，国华电器有限公司；数字酸度计，上海大普仪器有限公司；721可见光分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司；UV-2550紫外可见分光光度计，SHIMADZU；木聚糖，来源于beechwood，sigma；木糖，sigma；木聚糖酶(标准酶)，宁夏和氏璧生物技术有限公司，武汉新华扬生物有限责任公司。
溶液配置
MBTH显色液：3mg/mL的3-甲基-2-苯并噻唑酮腙溶液和1mg/mL的二硫苏糖醇溶液等量混合即得，现用现配，一天内有效。
木糖标准溶液(0.032mg/mL)：精确称取干燥至恒质量的木糖0.3200g，用50mMpH5.5的醋酸缓冲溶液溶解、转移并定容至100mL，配成3.2mg/mL的木糖标准溶液；从中取1mL木糖溶液，如前法操作并定容至100mL，即得0.032mg/mL的木糖标准溶液。
硫酸铁铵试剂的制法是0.5％(FeNH4(SO4)2)·12H2O，0.5％氨基磺酸，0.5当量盐酸。
步骤A，制作用MBTH法测得的木糖吸光度值与木糖浓度的标准对应关系曲线；
分别加入8组不同浓度的木糖标准溶液2mL，加入2mL0.5当量的NaOH溶液，混匀，取1.2mL加入到试管中(做三个平行样)，再加入MBTH试剂0.6mL于80℃水浴加热15-20min后趁热加入硫酸铁铵试剂1.2mL，室温冷却后于波长650nm处测定木糖的吸光度值；根据每组木糖溶液浓度与测得的相应木糖吸光度值之间的关系绘制标准对应关系曲线；
B，用MBTH法检测木聚糖酶的活力；
将9.9mL木聚糖溶液其浓度为4mg/mL，pH值为5.5，加入到锥形瓶中于30℃的水浴摇床中预热10min，加入待测的木聚糖酶溶液0.1mL进行水解反应，为确定合适的待测木聚糖酶浓度可以将待测的木聚糖酶溶液稀释成不同浓度梯度逐个检测，水解时间为60min以内，取水解液2mL，迅速加入2mL 0.5当量的NaOH溶液中(做三个平行样)，混匀，取1.2mL加入到试管中，再加入MBTH试剂0.6mL于75—85℃水浴加热20-25min后趁热加入硫酸铁铵试剂1.2mL，室温冷却后于波长650nm处测定吸光度值，根据上一步骤制作的木糖浓度与测得的木糖吸光度值之间的标准对应关系曲线确定待测的木聚糖酶的酶解产物中所含有的相当于木糖的还原糖的量。木聚糖酶的活力单位可被定义为在上述条件下每分钟产生1nM相当于木糖的量为一个酶活力单位，从而根据酶活力定义来推算木聚糖酶活力。
当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不限于上述操作，所有在本发明的实质范围内作出的变化、改型、添加或替换，都应属于本发明的保护范围。
Claims (7)
1、一种木聚糖酶活力的测定方法，其特征是；
A，制作用MBTH法测得的木糖吸光度值与木糖浓度的标准对应关系曲线；
B，用MBTH法检测待测木聚糖酶水解木聚糖后产生的相当于木糖的吸光度值；根据上一步骤制作的木糖浓度与测得的木糖吸光度值之间的标准对应关系曲线确定待测木聚糖酶的酶解产物中在单位时间内所产生的相当于木糖的还原糖的含量，以此来推算木聚糖酶的活力。
2、根据权利要求1所述的木聚糖酶活力的测定方法，其特征是；上述步骤A的具体步骤是；分别取6-15组具有不同浓度的木糖标准溶液2mL，浓度范围在0-32微克/毫升之间，加入2mL 0.5当量的NaOH溶液，混匀，取1.2mL加入到试管中(做三个平行样)，再加入MBTH试剂0.6mL于75-85℃水浴加热15-25min后趁热加入硫酸铁铵试剂1.2mL，室温冷却后于波长620-680nm处测定吸光度值；根据每组木糖浓度与测得的吸光度值之间的关系绘制标准对应关系曲线；。
3、根据权利要求1或2所述的木聚糖酶活力的测定方法，其特征是；上述步骤B的具体步骤是；将9.9mL木聚糖溶液其浓度为2-4mg/mL，加入到锥形瓶中于30-40℃的水浴摇床中预热8-12min，加入预热至相应温度的木聚糖酶溶液0.1mL进行水解反应，水解时间为60min以内，取水解液2mL，迅速加入到2mL0.5当量的NaOH溶液中，混匀，取1.2mL加入到试管中(做三个平行样)，再加入MBTH试剂0.6mL于75—85℃水浴加热20-30min后趁热加入硫酸铁铵试剂1.2mL，室温冷却后于波长620-680nm处测定吸光度值，根据步骤A制作的木糖浓度与测得的木糖吸光度值之间的标准对应关系曲线确定酶解产物中所含有的相当于木糖的还原糖浓度，以此来推算木聚糖酶的活力；木聚糖酶的活力单位可被定义为在上述条件下每分钟产生1nM相当于木糖的量为一个酶活力单位；其中MBTH试剂的制法是3mg/mL的3-甲基-2-苯并噻唑酮腙溶液和1mg/mL的二硫苏糖醇溶液等量混合即得，现用现配，一天内有效。
4、根据权利要求3所述的木聚糖酶活力的测定方法，其特征是；上述硫酸铁铵试剂的制法是0.5％(FeNH4(SO4)2)·12H2O，0.5％氨基磺酸，0.5当量盐酸。
5、根据权利要求3所述的木聚糖酶活力的测定方法，其特征是；上述木聚糖来源为桦木(birchwood)、榉木(birchwood)等。
6、根据权利要求3所述的木聚糖酶活力的测定方法，其特征是；上述木聚糖溶液以50mM的丁二酸或醋酸溶液为溶剂。
7、根据权利要求3所述的木聚糖酶活力的测定方法，其特征是；上述测定吸光度值的最佳波长为650nm。
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