CN102519896A

CN102519896A - 一种饲料中木聚糖酶活力的测定方法

Info

Publication number: CN102519896A
Application number: CN2011103134220A
Authority: CN
Inventors: 张永勤; 王斐; 张�杰; 常海燕; 詹志春; 张菁
Original assignee: WUHAN SUNHY BIOLOGY CO Ltd; Qingdao University of Science and Technology
Current assignee: WUHAN SUNHY BIOLOGY CO Ltd; Qingdao University of Science and Technology
Priority date: 2011-10-17
Filing date: 2011-10-17
Publication date: 2012-06-27
Anticipated expiration: 2031-10-17
Also published as: CN102519896B

Abstract

本发明公开了一种饲料中木聚糖酶活力的测定方法，包括如下步骤：(1)绘制木糖吸光度值与木糖浓度的标准对应关系曲线；(2)饲料中木聚糖酶浸提液的制备；(3)酶解反应；(4)根据标准曲线计算饲料中木聚糖酶的酶活力。本发明的优点是木聚糖酶在饲料中提取的整个过程的活力损失较小，在10％以下，可实现高通量分析，操作简便易行。该活力测定方法的灵敏度明显高于DNS法。

Description

一种饲料中木聚糖酶活力的测定方法

技术领域

本发明涉及的是一种测定饲料中木聚糖酶活力的方法，具体涉及饲料中酶的提取方法，具体的测定手段及测定关键参数的选择。

背景技术

木聚糖酶可提高动物对饲料的利用率，因而已广泛应用于饲料工业。酶活力是衡量酶生物活力的重要指标。木聚糖酶属多糖水解酶，目前企业一般采用DNS法来测定该酶的活力，国家也颁布了《GB-T 23874-2009饲料添加剂木聚糖酶活力的测定分光光度法》，该法由于其灵敏度较低已很难满足当前具有微量酶含量的配合饲料的酶活力测定，只适用于单一的饲料添加剂木聚糖酶活力测定。虽然此法简便、快捷，但灵敏度相对较低，不适于饲料中酶的定量分析，因而不利于相关科学研究和产品质量控制。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测饲料中木聚糖酶活力的方法，该方法可以将饲料中的木聚糖酶完全浸提出来，同时成功地解决了背景干扰的问题，具有检测周期短、比DNS法具有更高灵敏度的优点。

为了实现本发明的目的，发明人针对已有技术的不足，通过大量的试验摸索，最终获得了如下技术方案：

一种饲料中木聚糖酶活力的测定方法，包括如下步骤：

(1)绘制木糖吸光度值与木糖浓度的标准对应关系曲线：分别取6-15组不同浓度的木糖标准溶液与具有相同木聚糖浓度的木聚糖溶液等体积混合而得浓度0-0.03mg/mL(试管法)或0-0.08mg/mL(微孔板法)的木糖溶液，其中0-0.03mg/mL的木糖溶液用于试管法测定体系，0-0.08mg/mL的木糖溶液用于微孔板法测定体系，然后根据测得的木糖吸光度值与木糖浓度之间的关系绘制标准对应关系曲线；对于木聚糖和饲料本身还原性物质含量较高的情况，在测定时使用较短光程的比色皿进行测定，或者用水将不同浓度的所有木糖的显色产物进行按比例稀释到1-3倍，从而得到相应的木糖吸光度值与木糖浓度之间的对应关系曲线，以此作为酶活力测定的计算依据；

(2)饲料中木聚糖酶浸提液的制备：以下操作均要求在0-10℃进行，粉碎含木聚糖酶的饲料使其全部通过40-80目筛，充分混合，从中精密称取1.0000-2.0000g饲料样品于锥形瓶中，加入50ml缓冲液，于60-150rpm的摇床中振摇或用混合器间歇混匀30-60分钟，取出在8000rpm离心15分钟得上清液即为样品的木聚糖酶浸提液，将浸提液按比例稀释至一定浓度即可用于酶活力测定，对于饲料本身还原性物质较高的情况，将浸提液透析或超滤截留分子量在1万道尔顿以上后再稀释至一定浓度用于测定；

(3)酶解反应：将预热至所设定酶解温度25-40℃的木聚糖溶液与预热至同一温度的木聚糖酶浸提液等体积充分混匀，起始酶解反应，准确计时，酶解时间为30-60分钟，取水解液迅速加入到等体积的0.5N NaOH溶液中，充分混匀至终止反应，进行还原糖浓度的测定，此酶活力测定过程在试管法测定体系或微孔板法测定体系中完成，试管法的用量是微孔板法的10-20倍；

(4)根据从步骤(1)中所得到的标准曲线计算木聚糖酶的酶活力，木聚糖酶的活力单位被定义为在上述条件下，每毫升反应液中，每分钟产生1nmol相当于木糖所需的酶量为一个酶活力单位，计算公式如下：

U / g = \frac{50 \times c}{m \times t} \times N;

其中：U-样品木聚糖酶的活力，U/g；

C-样品溶液实测吸光度值在标准曲线中对应的还原糖浓度，nmol/mL；

50-用于溶解饲料的缓冲液的体积，mL

N-样品溶液在酶解体系中的总稀释倍数；

m-样品质量，g；

t-反应时间，min。

优化的，所使用的木聚糖为桦木、榉木、燕麦、小麦或玉米中的木聚糖。

优化的，所述的水为蒸馏水或去离子水。

优化的，所述的木聚糖溶液的配制方法为，先将木聚糖溶于水中，于80℃条件下溶解后，用50mL容量瓶定容至刻度，然后将该溶液转移到100mL容量瓶中，用0.1mol/L的缓冲溶液定容至刻度，充分混合，移入试剂瓶中于4℃冰箱保藏备用；酶活力测定体系中的溶剂为0.05mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液或丁二酸-丁二酸钠缓冲溶液，缓冲溶液的pH视所测木聚糖酶的最适pH而定。

优化的，所述的酶解反应可以采用多点测定法或终点法。

优化的，步骤(3)所述的试管法测定体系包括试管、恒温水浴摇床、恒温水浴锅和紫外可见分光光度计。

优化的，步骤(3)所述的微孔板法测定体系包括96孔微孔板、恒温振荡器和酶标仪。

本发明的优点是木聚糖酶在饲料中提取的整个过程是在低温下进行的，因此，活力损失小(在10％以下)，且操作简便易行。该活力测定方法明显低于目前国家标准所采用的DNS法，所以本方法的灵敏度明显高于DNS法。

具体实施方式

以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。

实施例1

试管法测定饲料中木聚糖酶活力

试剂中：木聚糖为榉木木聚糖，来源于西格玛奥里奇公司(sigma-aldrich)；木糖来源于西格玛奥里奇公司(sigma-aldrich)；木聚糖酶来源于武汉新华扬生物股份有限公司；含木聚糖酶的配合饲料，来源于青岛正大饲料有限公司；其它试剂均为分析纯；实验所用水为蒸馏水。

1终点法测定饲料中木聚糖酶活力

(1)配制8mg/mL木聚糖溶液：先将0.8000g木聚糖溶于水中，于80℃条件下溶解后，用50mL容量瓶定容至刻度，然后，将该溶液转移到100mL容量瓶中，用0.1mol/L的缓冲溶液定容至刻度，充分混合，移入试剂瓶中待用；

(2)配制0.06mg/mL木糖标准溶液：精密称取干燥至恒质量的木糖0.6000g，用0.05mol/LpH5.5的醋酸缓冲溶液溶解、转移并定容至100mL，配成6mg/mL的木糖标准溶液；从中取1mL木糖溶液，如前法操作并定容至100mL，即得0.06mg/mL的木糖标准溶液；

(3)含有相同浓度4mg/mL木聚糖、0-0.03mg/mL木糖的标准溶液的配制：将上述配制好的木糖溶液用缓冲溶液按比例稀释成不同浓度的木糖溶液，然后分别与配制好的8mg/mL木聚糖溶液等体积混合即可；

(4)饲料中木聚糖酶浸提液的制备：以下操作均要求在0-10℃下进行。粉碎含木聚糖酶的饲料使其全部通过60目筛，充分混合，从中精密称取1.0000g饲料于锥形瓶中至少取3个平行样，加入50ml 0.05mol/L的醋酸缓冲液，用混合器每隔5分钟混匀5秒的间隔方式混匀40分钟，取出在8000rpm离心15min得上清液，将其稀释到4倍得5mg/ml木聚糖酶浸提液，用于酶活力测定；

(5)含有木聚糖的木糖标准曲线的绘制：取8组不同浓度(0，0.003，0.006，0.009，0.015，0.021，0.027，0.03mg/mL)的木糖溶液(其中各含有木聚糖4mg/mL)测得的木糖吸光度值与木糖浓度之间的关系绘制标准对应关系曲线，以此作为酶活力测定的计算依据；木糖标准曲线如图1：

(6)酶解反应：将预热至所设定酶解温度30℃的0.5mL木聚糖溶液与预热至同一温度的0.5mL木聚糖酶浸提液充分混匀，起始酶解反应，准确计时，酶解30分钟后，迅速加入1mL 0.5N NaOH溶液，充分混匀以终止反应，进行还原糖浓度的测定，每个样品至少做3个平行样；

(7)酶活力计算：根据(5)中得到的标准曲线计算木聚糖酶的酶活力：木聚糖酶的活力单位可被定义为在上述条件下，每毫升反应液中，每分钟产生1nmol相当于木糖所需的酶量为一个酶活力单位，计算公式如下：

U / g = \frac{50 \times c}{m \times 30} \times 8

其中：U-样品木聚糖酶的活力，U/g；

m-样品质量，g。

所测饲料中木聚糖酶活力的实验数据如下表：

平行样	1	2	3
				饲料质量/g	1.0000	1.0000	1.0000
吸光度	0.210	0.214	0.205
				还原糖浓度(nmol/ml)	49.7	50.7	48.5
U/g	663	676	647

由终点法测的饲料中木聚糖酶平均酶活力为662U/g。

2.多点法测饲料中木聚糖酶活力

(1)配制5mg/mL木聚糖溶液：先将0.5000g木聚糖溶于水中，于80℃条件下溶解后，用50mL容量瓶定容至刻度，然后，将该溶液转移到100mL容量瓶中，用0.1mol/L的缓冲溶液定容至刻度，充分混合，移入试剂瓶中待用；

(2)饲料中木聚糖酶浸提液的制备：以下操作均要求在0-10℃下进行。粉碎含木聚糖酶的饲料使其全部通过60目筛，充分混合，从中精密称取1.2500g饲料于锥形瓶中至少取3个平行样，加入50ml 0.05mol/L的醋酸缓冲液，用混合器每隔5分钟混匀5秒的间隔方式混匀(每40分钟，取出在8000rpm离心15min得25mg/mL上清液，将其稀释到两倍得12.5mg/mL木聚糖酶浸提液，用于酶活力测定；

(3)含有木聚糖的木糖标准曲线的绘制：与终点法测饲料中木聚糖酶活力”中步骤(5)所述相同；

(4)酶解反应：将预热至所设定酶解温度30℃的9.6mL木聚糖溶液与预热至同一温度的2.4mL木聚糖酶浸提液充分混匀，起始酶解反应，准确计时，分别在酶解0，10，20，30，40分钟时取2ml酶解液于已装有2ml 0.5N NaOH溶液的离心管中，充分混匀以终止反应，分别取1ml混合液于试管中(3个平行样)进行还原糖浓度的测定。动力学曲线如图2所示，此动力学曲线为选取其中一个平行样；

(5)酶活力计算：根据(3)(4)中得到的木糖标准曲线和动力学曲线计算木聚糖酶的酶活力：木聚糖酶的活力单位被定义如“终点法测饲料中木聚糖酶活力”，计算公式如下：

U / g = \frac{50 \times v}{m} \times 10

其中：U-样品木聚糖酶的活力，U/g；

v-样品溶液酶解速度，即动力学曲线的斜率，nmol/mL/min；

m-样品质量，g。

所测饲料中木聚糖酶活力的实验数据如下表：

平行样1

平行样2

平行样3

由多点法测得得饲料中木聚糖酶平均酶活力为671U/g

实施例2

微孔板法测定饲料中木聚糖酶活力

试剂中：木聚糖为榉木木聚糖，来源于西格玛奥里奇公司(sigma-aldrich)；木糖来源于西格玛奥里奇公司(sigma-aldrich)；木聚糖酶来源于武汉新华扬生物股份有限公司；配合饲料来源于青岛六和集团；其它试剂均为分析纯；实验所用水为蒸馏水。

(2)配制0.12mg/mL木糖标准溶液：精密称取干燥至恒质量的木糖1.0000g，用0.05mol/LpH5.5的醋酸缓冲溶液溶解、转移并定容至100mL，配成10mg/mL的木糖标准溶液；从中取1.2mL木糖溶液，如前法操作并定容至100mL，即得0.12mg/mL的木糖标准溶液；

(3)含有浓度4mg/mL木聚糖、0-0.06mg/mL木糖的标准溶液的配制：将上述配制好的木糖溶液用缓冲溶液按比例稀释成不同浓度的木糖溶液，然后分别与上述中所配制的木聚糖溶液等体积混匀即可；

(4)饲料中木聚糖酶浸提液的制备：以下操作均要求在温度0-10℃下进行：粉碎含木聚糖酶的饲料使其全部通过40目筛，充分混合，从中精密称取1.0000g饲料于锥形瓶中(至少取3个平行样)，加入50ml 0.05mol/L的醋酸缓冲液，于100rpm摇床中振摇30分钟，取出在8000rpm离心15min，20mg/mL上清液，将其稀释到两倍得10mg/mL木聚糖酶浸提液用于酶活力测定；

(5)含有木聚糖的木糖标准曲线的绘制：取10组不同浓度(0，0.006，0.012，0.018，0.024，0.030，0.036，0.048，0.060mg/mL)的木糖溶液(其中各含有木聚糖4mg/mL)测得的木糖吸光度值与木糖浓度之间的关系绘制标准对应关系曲线，以此作为酶活力测定的计算依据；操作于微孔板中进行，加热混匀通过恒温混匀仪，酶标仪读取吸光度值.木糖标准曲线如图3：

(6)酶解反应：将96孔微孔板中预热至所设定酶解温度37℃的0.05mL木聚糖溶液与预热至同一温度的0.05mL木聚糖酶浸提液充分混匀，于恒温混匀仪上起始酶解反应，准确计时，酶解30分钟后，迅速用12道移液枪加入0.1mL 0.5N NaOH溶液，充分混匀以终止反应，进行还原糖浓度的测定，每个样品至少做3个平行样；

(7)酶活力计算：根据(5)中所得到的标准曲线计算木聚糖酶的酶活力。木聚糖酶的活力单位可被定义为在上述条件下，每毫升反应液中，每分钟产生1nmol相当于木糖所需的酶量为一个酶活力单位，计算公式如下：

U / g = \frac{50 \times c}{m \times 30} \times 4

其中：U-样品木聚糖酶的活力，U/g；

m-样品质量，g。

所测饲料中木聚糖酶活力的实验数据如下表：

平行样	1	2	3
				饲料质量/g	1.0000	1.0000	1.0000
吸光度	0.188	0.191	0.196
				还原糖浓度(mol/ml)	119	121	124
U/g	793	807	828

由微孔板法测得木聚糖酶活力为809U/g。

当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不限于上述操作，所有在本发明的实质范围内作出的变化、改型、添加或替换，都属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种饲料中木聚糖酶活力的测定方法，包括如下步骤：

U / g = \frac{50 \times c}{m \times t} \times N;

其中：U-样品木聚糖酶的活力，U/g；

50-用于溶解饲料的缓冲液的体积，mL

N-样品溶液在酶解体系中的总稀释倍数；

m-样品质量，g；

t-反应时间，min。

2.根据权利要求1所述的木聚糖酶活力的测定方法，其特征在于：所使用的木聚糖为桦木、榉木、燕麦、小麦或玉米中的木聚糖。

3.根据权利要求1所述的木聚糖酶活力的测定方法，其特征在于：所述的水为蒸馏水或去离子水。

4.根据权利要求1所述的木聚糖酶活力的测定方法，其特征在于：所述的木聚糖溶液的配制方法为：先将木聚糖溶于水中，于80℃条件下溶解后，用50mL容量瓶定容至刻度，然后将该溶液转移到100mL容量瓶中，用0.1mol/L的缓冲溶液定容至刻度，充分混合，移入试剂瓶中于4℃冰箱保藏备用；酶活力测定体系中的溶剂为0.05mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液或丁二酸-丁二酸钠缓冲溶液，缓冲溶液的pH视所测木聚糖酶的最适pH而定。

5.根据权利要求1所述的木聚糖酶活力的测定方法，其特征在于：所述的酶解反应采用多点测定法或终点法。

6.根据权利要求1所述的木聚糖酶活力的测定方法，其特征在于：步骤(3)所述的试管法测定体系包括试管、恒温水浴摇床、恒温水浴锅和紫外可见分光光度计。

7.根据权利要求1所述的木聚糖酶活力的测定方法，其特征在于：步骤(3)所述的微孔板法测定体系包括96孔微孔板、恒温振荡器和酶标仪。