BRPI0910457B1

BRPI0910457B1 - variante de fitase, usos da mesma, composição enzimática, alimento e métodos de produção do mesmo, bem como para redução dos níveis de fósforo em estrume animal

Info

Publication number: BRPI0910457B1
Application number: BRPI0910457-7A
Authority: BR
Inventors: Jayarama Shetty; Michael J. Pepsin; Oliver Kensch; Klaus Schulze Pellengahr; Birgitta Leuthner; Soren Dalsgaard; Mai Faurschou Isaksen
Original assignee: Danisco Us Inc.
Priority date: 2008-04-18
Filing date: 2009-04-17
Publication date: 2020-12-29
Also published as: BRPI0910457A2; WO2009129489A9; CN102007211B; EP3118309A2; CA2721691C; PL3118309T3; MX2010010982A; EP3118309A3; HUE052318T2; ES2835955T3; US9999238B2; JP5273686B2; US20140234490A1; US8673609B2; EP2283124B1; JP2011519274A; DK2283124T3; WO2009129489A2; CA2721691A1; MX364988B

Abstract

VARIANTE DE FITASE, ÁCIDO NUCLEICO, VETOR CELULA HOSPEDEIRA, MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UMA VARIANTE DE FITASE, COMPOSIÇÃO ENZIMÁTICA, USOS, MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UM ALIMENTO OU RAÇÃO PARA ANIMAL E RESPECTIVOS ALIMENTO OU COMPOSIÇÃO DE RAÇÃO PARA ANIMAL E MÉTODO DE REDUÇÃO DOS NÍVEIS DE FÓSFORO EM ESTRUME ANIMAL. A presente invenção refere-se a variantes de fitase de Buttiauxella sp. que podem ser usadas em aplicações industriais, incluindo métodos para liquefação de amido, fermentações de álcool e para intensificação de digestão de fosfato em alimentos e rações para animais.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA

[0001] O presente pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório US No 61/046.324, depositado em 18 de abril de 2008, a descrição do qual é incorporada aqui por referência na íntegra para todas as finalidades.

CAMPO DA DESCRIÇÃO

[0002] A tecnologia fornecida aqui refere-se a variantes aprimoradas de fitases de Buttiauxella sp., ácidos nucleicos que codificam as fitases, vetores, células hospedeiras contendo os ácidos nucleicos e métodos para produção das fitases. As fitases abrangidas pela presente descrição podem ser usadas em numerosas aplicações incluindo, por exemplo, métodos para liquefação de amido, fermentações de álcool e para intensificação da digestão de fosfato em alimentos e rações para animais.

ANTECEDENTES

[0003] A fitase é a principal forma de armazenamento de fósforo em cereais e legumes. Contudo, animais monogástricos, tais como porco, ave e peixe não são capazes de metabolizar ou absorver a fitase (ou ácido fítico) e, portanto, ela é excretada, levando a uma poluição por fósforo em áreas de intensa criação de animais. Além disso, o ácido fítico também atua como um agente antinutricional em animais monogástricos mediante quelação de agentes metálicos, tais como cálcio, cobre e zinco.

[0004] De forma a fornecer fosfatos suficientes para crescimento e saúde desses animais, fosfato inorgânico é adicionado às suas dietas. Tal adição pode ser cara e aumenta adicionalmente os problemas de poluição.

[0005] Através da ação da fitase, o fitato é, em geral, hidrolisado para proporcionar inositol-fosfatos inferiores e fosfato inorgânico. Fitases são úteis como aditivos a rações para animais onde elas aprimoram a disponibilidade de fósforo orgânico ao animal e diminuem a poluição por fosfato do ambiente (Wodzinski R J, Ullah A H. Adv Appl Microbiol. 42, 263-302 (1996)).

[0006] Uma série de fitases de origem fúngica (Wyss M. et al., Appl. Environ. Microbiol. 65 (2), 367-373 (1999); Berka R. M. et al., Appl. Environ. Microbiol. 64 (11), 4423-4427 (1998); Lassen S. et al., Appl. Environ. Microbiol. 67 (10), 4701-4707 (2001)) e bacterianas (Greiner R. et al., Arch. Biochem. Biophys. 303 (1), 107-113 (1993); Kerovuo et al., Appl. Environ. Microbiol. 64 (6), 2079-2085 (1998); Kim H. W. et al., Biotechnol. Lett. 25, 1231-1234 (2003); Greiner R. et al., Arch. Biochem. Biophys. 341 (2), 201-206 (1997); Yoon S. J. et al., Enzyme and microbial technol. 18, 449-454 (1996); Zinin N. V. et al., FEMS Microbiol. Lett. 236, 283-290 (2004))) foram descritas na literatura.

SUMÁRIO DA DESCRIÇÃO

[0007] Em um primeiro aspecto, modalidades da presente descrição proporcionam variantes de fitase as quais têm uma sequência de aminoácido que varia daquela da fitase de Buttiauxella sp. d tipo silvestre (SEQ ID NO: 1) e as quais têm uma ou mais propriedades vantajosas. Tais propriedades podem incluir, mas não estão limitadas a: termoestabilidade; perfil de temperatura/atividade; perfil de pH/atividade; atividade específica; e sensibilidade ao pH/protease favoráveis.

[0008] Em um outro aspecto, modalidades da presente descrição referem-se a uma variante de fitase compreendendo uma fitase que contém uma substituição em uma ou mais posições selecionadas do grupo consistindo em: 75, 76 e 374, em que cada posição corresponde à posição da sequência de aminoácido da fitase de Buttiauxella sp. d tipo silvestre (SEQ ID NO: 1).

[0009] Em ainda outro aspecto, modalidades da presente descrição proporcionam ácidos nucleicos que codificam variantes de fitase, conforme divulgado aqui, bem como vetores e células hospedeiras compreendendo tais ácidos nucleicos. Em ainda outras modalidades, as sequências são empregadas em processos que proporcionam as variantes de fitase.

[00010] Ainda, modalidades da presente descrição referem-se, de modo geral, ao uso das variantes de fitase para liberação de fósforo de qualquer substrato de fitase, em particular fosfato inorgânico a partir de fitase ou ácido fítico. Vantajosamente, variantes de fitase da presente descrição podem ser usadas em aplicações industriais incluindo, por exemplo, métodos para liquefação de amido e para intensificação da digestão de fosfato em alimentos e rações para animais. Vantajosamente, as variantes de fitase de acordo com as modalidades da presente descrição são úteis e usadas em processos de fermentação e/ou produção de álcool.

[00011] Em outros aspectos, a presente descrição refere-se a composições enzimáticas compreendendo uma variante de fitase conforme descrito aqui, em que a composição enzimática é útil para ou usada em aplicações comerciais. Em uma modalidade, a composição enzimática pode ser uma composição de ração para animal. Em outras modalidades, a composição enzimática pode ser usada em processos de hidrólise de amido (por exemplo, liquefação). Em uma modalidade vantajosa, as variantes e/ou composição enzimática pode ser usada em processos de fermentação de álcool. Em outras modalidades, uma composição enzimática compreendendo uma fitase abrangida pela presente descrição incluirá enzimas adicionais, tais como glucoamilases, alfa amilases, protease, celulases, hemicelulases, lipases, pectinases, pululanases, oxidases de glicose, beta glucosidases, lacases, oxidases, cutinases, fosfatases, outras fitases e combinações das mesmas.

[00012] Em um outro aspecto, modalidades da presente descrição referem-se a métodos para produção das variantes de fitase em uma célula hospedeira mediante transformação da célula hospedeira com um construto de DNA, vantajosamente incluindo um promotor tendo atividade transcricional na célula hospedeira, cultura da célula hospedeira transformada em um meio de cultura adequado para permitir expressão da referida fitase e produção da fitase. O método pode também incluir recuperação da fitase produzida. Em uma modalidade, a célula hospedeira é uma célula bacteriana ou de planta ou uma célula fúngica (tal como uma célula de Trichoderma, tal como T. reesei) ou um levedo. Em modalidades descritas aqui, a sequência de aminoácido da variante de fitase compartilha uma identidade de sequência mínima com a identidade de sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1, por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% de identidade de sequência de aminoácido com SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade vantajosa da presente descrição, a fitase tem a sequência de SEQ ID NO: 2.

[00013] A enzima da presente invenção é aquela definida nas reivindicações e também aqui. A enzima da presente invenção também abrange polipeptídeos ativos que são co- ou pós-traducionalmente processos durante expressão, por exemplo, por meio de clivagem de peptídeo sinalizador. Clivagem pós-traducional pode também ocorrer no C-término. Portanto, em uma modalidade preferida, o fragmento eficaz da mesma (também referido como fragmento funcional da mesma) é o polipeptídeo maduro produzido pelo hospedeiro nativo ou um hospedeiro de expressão adequado.

[00014] Assim, em um aspecto, a fitase é caracterizada pelo fato de que ela compreende uma sequência de aminoácido que é expressa a partir de ou é expressível a partir de toda ou parte da sequência de nucleotídeo que codifica as variantes definidas aqui.

[00015] Em geral, em um aspecto, uma variante de fitase tendo atividade térmica aprimorada de pelo menos cerca de 5°C, quando comparado com a fitase de Buttiauxella sp. do tipo silvestre (SEQ ID NO: 1), é proporcionada. Em uma modalidade, a atividade térmica aprimorada da fitase é pelo menos cerca de 17°C quando comparado com a fitase SEQ ID NO: 1. Em outra modalidade, a atividade térmica aprimorada está em uma faixa de cerca de 17 a cerca de 21°C. Em uma outra modalidade, a atividade térmica aprimorada está em uma faixa de cerca de 17,4 a cerca de 20,2°C.

[00016] Em geral, em um outro aspecto, é proporcionada uma variante de fitase termoestável que é capaz de reter mais de 50% de sua atividade após exposição a uma temperatura elevada durante 10 minutos em um pH de 5,5 em tampão, em que a temperatura elevada é pelo menos cerca de 5°C maior do que uma temperatura na qual a fitase de Buttiauxella sp. do tipo silvestre (SEQ ID NO: 1) retém mais de 50% de sua atividade. Em um aspecto, a temperatura elevada é pelo menos cerca de 20,5°C maior. Em outro aspecto, a temperatura elevada está em uma faixa de cerca de 20,5°C a cerca de 27°C. Em um outro aspecto, a temperatura elevada está em uma faixa de cerca de 20,2°C a cerca de 26,8°C.

[00017] Em geral, em outro aspecto, é proporcionada uma variante de fitase tendo atividade de fitase e uma sequência de aminoácido que varia da sequência de aminoácido de fitase de Buttiauxella sp. do tipo silvestre (SEQ ID NO: 1), em que a sequência de aminoácido da variante de fitase compreende uma variação em uma ou mais posições correspondendo à posição 75, 76, 77, 198, 367 ou 374 of SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade, a variante de fitase ainda compreende uma ou mais variações adicionais, em que a variação é 92A, 164E/S, 171I/V, 192A ou 256A/E/P. Em outra modalidade, a variação em uma ou mais das posições 75, 76, 77, 198, 367 ou 374, respectivamente, é 75P, 76R, 77S, 198R, 367L ou 374P e a variante de fitase ainda compreende uma ou mais variações adicionais, em que a variação é 92A, 164E/S, 171V, 192A ou 256A/E/P. Em ainda outra modalidade, a variante de fitase ainda compreende uma ou mais variações adicionais, em que a uma ou mais posições de variação adicional são 26, 37, 89, 134, 160, 176, 178, 188, 190, 207, 209, 211, 235, 261, 270, 303 ou 318. Em uma outra modalidade, a uma ou mais variações adicionais na posição 26, 37, 89, 134, 160, 176, 178, 188, 190, 207, 209, 211, 235, 261, 270, 303 ou 318 são, respectivamente, 26E, 037Y, 089T, 1341/V, 160R, 176K, 178P, 188N, 190E, 207E/T, 209S, 211C, 235V, 261E, 270K, 303F ou 318D. Em outra modalidade, a variante de fitase ainda compreende uma ou mais variações adicionais, em que a uma ou mais posições de variação adicional são 1, 10, 11, 38, 66, 71, 81, 92, 109, 111, 119, 120, 121, 141, 142, 152, 155, 193, 214, 239, 245, 248, 255, 268, 277, 283, 285, 287, 288, 293, 296, 314, 337, 345, 350, 364, 371, 372, 396, 399, 406 ou 413. Em ainda outra modalidade, a uma ou mais variações adicionais na posição 1, 10, 11, 38, 66, 71, 81, 92, 109, 111, 119, 120, 121, 141, 142, 152, 155, 193, 214, 239, 245, 248, 255, 268, 277, 283, 285, 287, 288, 293, 296, 314, 337, 345, 350, 364, 371, 372, 396, 399, 406 ou 413 é, respectivamente, 1S, 10I, 11I, 38S, 66E, 71K, 81A, 92E, 109Q, 111G, 119N, 120L, 121E, 141R, 142L, 152M, 155E, 193Q, 211C, 214V, 235V, 239K, 245D, 248L, 255A, 261E, 268A/T, 270K, 277T, 283D, 285K, 287D, 288A, 293G ou 296S.

[00018] Em geral, em outro aspecto, é proporcionada uma variante de fitase tendo atividade de fitase e uma sequência de aminoácido que varia da sequência de aminoácido da fitase de Buttiauxella sp. do tipo silvestre (SEQ ID NO: 1), em que a sequência de aminoácido da variante de fitase compreende pelo menos uma variação quando comparado com SEQ ID NO: 1 e em que a variação de sequência da fitase compreende:

[00019] N37Y, S75P, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K198R, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P

[00020] N37Y, G77S, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K198R, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P

[00021] N37Y, S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171I, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P

[00022] N37Y, A89T, D92A, T134I, F164E, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256P, A261E, N270K, A374P

[00023] S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171I, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P

[00024] N37Y, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171I, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P

[00025] N37Y, Q76R, A89T, D92A, T134I, F164S, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256A, A261E, N270K, A374P

[00026] S75P, A89T, D92A, T134I, F164E, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P

[00027] S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, P367L, A374P

[00028] N37Y, A89T, D92A, T134I, F164E, T171I, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P

[00029] N37Y, Q76R, A89T, D92A, T134I, F164E, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P

[00030] N37Y, Q76R, A89T, D92A, T134I, F164E, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256A, A261E, N270K, A374P

[00031] N37Y, S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, F164E, T171V, T176K, A178P, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256A, A261E, N270K, A374P

[00032] N37Y, S75P, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P

[00033] N37Y, A89T, D92A, T134I, H160R, F164S, T171I, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256E, A261E, N270K, A374P

[00034] A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P

[00035] N37Y, S75P, A89T, D92A, T134I, H160R, F164S, T171V, T176K, A178P, S188P, K207E, A209S, S248L, Q256H, A261E, N270K, A374P

[00036] N37Y, S75P, A89T, D92A, T134I, F164S, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256A, A261E, N270K, A374P

[00037] S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256A, A261E, N270K, A374P; ou

[00038] N37Y, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164S, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P.

[00039] Em uma modalidade, a variação de sequência de fitase compreende N37Y, S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171I, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P.

[00040] Também proporcionada é uma fitase a qual tem pelo menos uma identidade de sequência percentual mínima e/ou homologia percentual à(s) fitase(s) divulgada(s) aqui, em que a identidade e/ou homologia percentual mínima é pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 93%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%.

[00041] Em geral, em um aspecto, é proporcionada uma variante de fitase tendo atividade de fitase e uma sequência de aminoácido que varia da sequência de aminoácido da fitase de Buttiauxella sp. do tipo silvestre (SEQ ID NO: 1), em que a sequência de aminoácido da variante de fitase compreende pelo menos uma variação quando comparado com SEQ ID NO: 1 e em que a variante tem uma variação em pelo menos qualquer uma das seguintes posições: 70, 193, 197, 221 e 407. Em uma modalidade, a variante tem pelo menos as seguintes variações: N70Y, H193R, F197E, S221P e A407P.

[00042] Em geral, em outro aspecto, um ácido nucleico que codifica qualquer uma da(s) fitase(s) divulgada(s) aqui é proporcionado. Em outro aspecto, um vetor compreendendo o ácido nucleico que codifica qualquer uma da(s) fitase(s) divulgada(s) aqui é proporcionado. Em um outro aspecto, uma célula hospedeira compreendendo o ácido nucleico e/ou os vetores descritos aqui é proporcionada.

[00043] Em geral, em outro aspecto, é proporcionado um método de produção de uma variante de fitase, de acordo com as variantes divulgadas aqui, em uma célula hospedeira compreendendo:

[00044] transformação de uma célula hospedeira com um construto de DNA compreendendo o ácido nucleico que codifica qualquer uma das variantes de fitase divulgadas aqui e

[00045] cultura da célula hospedeira transformada em um meio de cultura adequado.

[00046] Em uma modalidade, a célula hospedeira é uma célula fúngica, uma célula bacteriana ou uma célula de planta.

[00047] Em um aspecto, uma fitase preparada por meio dos métodos divulgados aqui é proporcionada.

[00048] Em geral, em um aspecto, uma composição enzimática compreendendo pelo menos uma fitase conforme divulgado aqui inclui, adicionalmente, uma ou mais de uma glucoamilase, uma alfa-amilase, uma protease, uma pululanase, uma isoamilase, uma celulase, uma hemicelulase, uma xilanase, uma glicotransferase de ciclodextrina, uma lipase, uma lacase, uma oxidase, uma esterase, uma cutinase, outra fitase ou quaisquer combinações das mesmas. Em uma modalidade, a composição inclui, adicionalmente, uma alfa-amilase.

[00049] Em geral, em outro aspecto, é proporcionado o uso de uma fitase conforme descrito aqui ou uma composição enzimática conforme descrito aqui, em liquefação de amido, sacarificação, fermentação ou sacarificação-fermentação simultâneas. Em uma modalidade, a liquefação de amido, sacarificação, fermentação ou sacarificação- fermentação simultânea é para a produção de álcool de fermentação. Em outra modalidade, o álcool é etanol ou butanol. Em ainda outra modalidade, um substrato é submetido à liquefação de amido, sacarificação, fermentação ou sacarificação-fermentação simultâneas. Em uma modalidade, o substrato compreende amido. Em outra modalidade, o substrato compreende um grão ou cereal. Em uma outra modalidade, o grão ou cereal é trigo, cevada, centeio, aveias, milho verde, sorgo, farelo de glúten de milho, Solúveis de Grão Seco de Destilaria (Distillers Dried Grain Solubles - DDGS), farelo de trigo, fubá de trigo, semolina de trigo, arroz, cascas de aveia, semente de palma, polpa cítrica ou combinações dos mesmos. Em uma modalidade, o arroz compreende farelo de arroz ou cascas de arroz.

[00050] Em geral, em outro aspecto, é proporcionado o uso de pelo menos uma fitase, conforme divulgado aqui, como um aditivo a um alimento ou ração. Em outro aspecto, é proporcionado o uso de pelo menos uma fitase, conforme divulgado aqui, como um aditivo a um alimento ou ração contendo Solúveis de Grão Seco de Destilaria (DDGS).

[00051] Em geral, em um outro aspecto, é proporcionado um método para a produção de um alimento ou ração para animal compreendendo uma etapa de mistura de pelo menos uma fitase, conforme divulgado aqui ou uma composição enzimática, conforme divulgado aqui, com outro ingrediente para alimento ou ração a fim de formar o referido alimento ou ração para animal.

[00052] Em geral, em outro aspecto, é proporcionado um método para a produção de um alimento ou ração para animal compreendendo uma etapa de pulverização de pelo menos uma fitase, conforme divulgado aqui ou uma composição enzimática, conforme divulgado aqui, na forma líquida sobre o referido alimento ou ração para animal. Em um aspecto, é proporcionado um método para a produção de um alimento ou ração para animal compreendendo uma etapa de mistura de pelo menos uma fitase, conforme divulgado aqui ou uma composição enzimática, conforme divulgado aqui, como um produto seco com o referido alimento ou ração para animal.

[00053] Em outro aspecto, é proporcionado um método para a produção de uma ração para animal compreendendo uma etapa de mistura de pelo menos uma fitase, conforme divulgado aqui ou uma composição enzimática, conforme divulgado aqui, com outro ingrediente para alimento ou ração a fim de formar a referida ração para animal. Em um outro aspecto, é proporcionado um método para a produção de uma ração para animal compreendendo uma etapa de pulverização de pelo menos uma fitase, conforme divulgado aqui ou uma composição enzimática, conforme divulgado aqui, na forma líquida sobre a referida ração para animal. Em um outro aspecto, é proporcionado um método para a produção de uma ração para animal compreendendo uma etapa de mistura de pelo menos uma fitase, conforme divulgado aqui ou uma composição enzimática, conforme divulgado aqui, como um produto seco com a referida ração para animal.

[00054] Em geral, em outro aspecto, é proporcionado um alimento ou composição de ração para animal compreendendo i) pelo menos uma fitase, conforme divulgado aqui ou uma composição enzimática, conforme divulgado aqui e/ou ii) um alimento ou ração para animal produzida por meio do método conforme divulgado aqui. Em um outro aspecto, é proporcionada uma composição de ração para animal compreendendo i) pelo menos uma fitase, conforme divulgado aqui ou uma composição enzimática, conforme divulgado aqui e/ou ii) um alimento ou ração para animal produzida por meio do método conforme divulgado aqui.

[00055] Em um aspecto, é proporcionado o uso de pelo menos uma fitase, conforme divulgado aqui ou uma composição enzimática, conforme divulgado aqui, em alimento ou ração para animal. Em outro aspecto, é proporcionado o uso de pelo menos uma fitase, conforme divulgado aqui ou uma composição enzimática, conforme divulgado aqui, em uma ração para animal.

[00056] Em geral, em outro aspecto, é proporcionado um método de redução dos níveis de fósforo em estrume animal, caracterizado pelo fato de que um animal é alimentado com pelo menos uma fitase, conforme divulgado aqui ou uma composição enzimática, conforme divulgado aqui ou uma ração preparada por meio do método conforme divulgado aqui ou uma composição, conforme divulgado aqui e em que a referida fitase está em uma quantidade eficaz na conversão da fitase contida na referida ração para animal.

[00057] Em geral, em um aspecto, é proporcionado o uso de pelo menos uma fitase, conforme divulgado aqui ou uma composição enzimática, conforme divulgado aqui ou uma ração preparada por meio do método conforme divulgado aqui ou uma composição conforme divulgado aqui, na fabricação de uma ração para animal a fim de reduzir os níveis de fósforo no estrume do animal alimentado com o referido polipeptídeo de fitase.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00058] A figura 1 mostra a sequência de aminoácido de uma fitase P1-29 de Buttiauxella sp. do tipo silvestre ("BP-WT"), (SEQ ID NO: 1).

[00059] A figura 2 mostra a sequência de aminoácido de uma variante vantajosa de acordo com a presente descrição (SEQ ID NO: 2).

[00060] A figura 3 mostra a sequência de ácido nucleico de uma P1- 29 de Buttiauxella sp. do tipo silvestre (SEQ ID NO: 3).

[00061] A figura 4 mostra a sequência de ácido nucleico de uma variante vantajosa de acordo com a presente descrição mostrada na figura 2 (SEQ ID NO: 4).

[00062] A figura 5 apresenta as sequências de aminoácido para três enzimas de acordo com a presente invenção (BP 110, BP-111 e BP- 112), bem como as sequências para BP-17 e a sequência do tipo silvestre.

[00063] A figura 6 mostra a resistência das fitases originárias de Buttiauxella, variantes BP-17, BP-110, BP-111 e BP-112 e de Phyzyme XP, Natuphos e Ronozyme P contra concentrações crescentes de pepsina. Os dados são com relação à incubação em um pH de 2 sem pepsina. A: todos os pontos de dados, B: mesmos dados, mas mostrando apenas uma recuperação de mais de 70%.

[00064] A figura 7 mostra um diagrama esquemático do equipamento de processamento de ração (peletização de ração) usado no Exemplo 11.

[00065] A figura 8 mostra gráficos de dados.

[00066] A figura 9 mostra gráficos de dados.

[00067] A figura 10 mostra gráficos de dados.

[00068] A figura 11 mostra gráficos de dados.

[00069] A figura 12 mostra gráficos de dados.

[00070] A figura 13 mostra gráficos de dados.

[00071] A figura 14 mostra gráficos de dados.

[00072] A figura 15 mostra plotagens de dados de HPLC.

[00073] A figura 16 mostra plotagens de dados de HPLC.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA PRESENTE DESCRIÇÃO

[00074] São divulgadas aqui variantes de fitases de Buttiauxella sp. que podem ser usadas em aplicações industriais, incluindo métodos para liquefação de amido, fermentações de álcool e para intensificação de digestão de fosfato em alimentos e rações para animais. Em particular, as variantes de fitase de acordo com a presente descrição são muito úteis para degradação de fitase em etapas de liquefação de amido em processos de produção de etanol combustível. As variantes da presente descrição compreendem uma ou mais variações (incluindo substituições, inserções e deleções) da sequência de aminoácido da fitase de Buttiauxella sp. (SEQ ID NO: 1). Em uma modalidade vantajosa, a sequência de aminoácido de a variante compreende pelo menos uma variação quando comparado com a sequência de aminoácido de SEQ. ID NO: 1 e a pelo menos uma variação é em uma, duas ou três posições selecionadas do grupo consistindo em: 75, 76 e 374, em que cada posição corresponde à posição de a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1.

[00075] Por exemplo, vantajosamente, a variação nas variantes de fitase de acordo com modalidades da presente descrição é selecionada do grupo consistindo em: S75, Q76 e A374 correspondendo à SEQ ID NO: 1.

[00076] Em modalidades vantajosas da presente descrição, a variação em a variante de fitase é uma substituição e a substituição pode ser selecionada do grupo consistindo em: S75P, Q76R e A374P, em que cada posição corresponde à posição de a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1.

[00077] Em outras modalidades vantajosas, as variantes de fitase de acordo com a presente descrição compreendem uma outra variação em uma ou mais posições selecionadas do grupo consistindo em: N37, G77, H160, F164, , T171, S188, G192, K198, A235, , Q256 e/ou P367, em que cada posição corresponde à posição de a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1.

[00078] Em ainda outras modalidades vantajosas, a variação em variantes de fitase de acordo com a presente descrição é uma substituição e a substituição pode ser em uma ou mais posições selecionadas do grupo consistindo em: N37Y, G77S, H160R, F164E, F164S, T171V, T171I, S188P, G192A, K198R, A235V, Q256P, Q256A, Q256E e/ou P367L.

[00079] Em outras modalidades vantajosas, as variantes de fitase de acordo com a presente descrição compreendem ainda uma variação em uma ou mais posições selecionadas do grupo consistindo em: A89, D92, T134, F164, T176, A178, K207, A209, S248, Q256, A26E e/ou N270.

[00080] Ainda, em outras modalidades vantajosas, as variantes de fitase de acordo com a presente descrição compreendem uma outra variação em uma ou mais posições selecionadas do grupo consistindo em: A89T, D92A, T134I, F164S, T176K, A178P, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E e/ou N270K.

[00081] Em ainda outras modalidades vantajosas, as variantes de fitase de acordo com a presente descrição compreendem uma sequência de SEQ ID NO: 2.

[00082] Variantes de fitase vantajosas de acordo com a presente descrição compreendem uma sequência contendo variações selecionadas do grupo consistindo em:

[00083] N37Y, S75P, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K198R, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P

[00084] N37Y, G77S, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K198R, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P

[00085] N37Y, S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171I, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P

[00086] N37Y, A89T, D92A, T134I, F164E, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256P, A261E, N270K, A374P

[00087] S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171I, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P

[00088] N37Y, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171I, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P

[00089] N37Y, Q76R, A89T, D92A, T134I, F164S, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256A, A261E, N270K, A374P

[00090] S75P, A89T, D92A, T134I, F164E, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P

[00091] S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, P367L, A374P

[00092] N37Y, A89T, D92A, T134I, F164E, T171I, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P

[00093] N37Y, Q76R, A89T, D92A, T134I, F164E, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P

[00094] N37Y, Q76R, A89T, D92A, T134I, F164E, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256A, A261E, N270K, A374P

[00095] N37Y, S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, F164E, T171V, T176K, A178P, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256A, A261E, N270K, A374P

[00096] N37Y, S75P, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P

[00097] N37Y, A89T, D92A, T134I, H160R, F164S, T171I, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256E, A261E, N270K, A374P

[00098] A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P

[00099] N37Y, S75P, A89T, D92A, T134I, H160R, F164S, T171V, T176K, A178P, S188P, K207E, A209S, S248L, Q256H, A261E, N270K, A374P

[000100] N37Y, S75P, A89T, D92A, T134I, F164S, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256A, A261E, N270K, A374P

[000101] S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256A, A261E, N270K, A374P

[000102] N37Y, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164S, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P.

[000103] Modalidades da presente descrição também incluem variantes de qualquer uma das fitases apresentadas nas sequências a) a t), as quais têm atividade de fitase e uma sequência de aminoácido tendo uma identidade de sequência percentual e/ou homologia percentual de pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 93%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% e pelo menos 99% quando comparado com cada da variantes de fitase apresentada nas sequências a) a t).

[000104] Aminoácidos são referidos aqui usando a abreviação de três letras ou a abreviação de uma única letra para aminoácidos. A tabela abaixo fornece uma lista dos aminoácidos padrão, junto com suas abreviações.

[000105] Além das variações de aminoácido específicas e ácidos nucleicos que codificam as variações, substituições conservativas das variações são proporcionadas aqui. Tais substituições são aquelas as quais são conservativas, por exemplo, em que um aminoácido variante é substituído por outro aminoácido do mesmo tipo geral. Aminoácidos podem ser classificados em ácidos, básicos, neutros e polares e não polares e/ou aromáticos, dependendo de sua cadeia lateral. Substituições preferidas de uma posição de aminoácido variante incluem aquelas que têm uma ou mais classificações que são as mesmas conforme um aminoácido variante nessa posição. Assim, em geral, os aminoácidos Lys, Arg e His são básicos; aminoácidos de ácido aspártico e ácido glutâmico são ácidos; os aminoácidos Ser, Thr, Cys, Gln e Asn são neutros polares; os aminoácidos Gly, Ala, Val, Ile e Leu são alifáticos não polares e os aminoácidos Phe, Trp e Tyr são aromáticos. Gly e Ala são pequenos aminoácidos e Val, Ile e Leu são aminoácidos alifáticos.

[000106] A menos que de outro modo especificado, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado conforme entendido por aqueles versados na técnica ao qual a presente descrição pertence. Singleton et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 20a ED., John Wiley and Sons, New York (1994) e Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991) fornecem àqueles versados na técnica um dicionário geral de muitos dos termos usados na presente descrição.

[000107] A presente descrição não está limitada pelos métodos e materiais exemplificativos são divulgados aqui e quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui podem ser usados na prática ou testagem de modalidades da presente descrição. Faixas numéricas são inclusivas dos números que definem a faixa. A menos que de outro modo indicado, as sequências de ácido nucleico são escritas da esquerda para a direita na orientação 5' para 3'; sequências de aminoácido são escritas da esquerda para a direita na orientação amino para carbóxi, respectivamente.

[000108] Os cabeçalhos fornecidos aqui não são limitativos dos vários aspectos ou modalidades da presente descrição, os quais podem ser tomados por referência ao relatório como um todo. Consequentemente, os termos definidos imediatamente abaixo são mais completamente definidos através de referência à especificação como um todo.

[000109] Ácido fítico (hexakisfosfato de mio-inositol) é um constituinte importante em safras de cereais, legumes e sementes oleosas. A forma de sal, fitato, é a principal forma de armazenamento de fósforo nessas plantas.

[000110] Fitases catalisam a hidrólise de monoéster de fosfato de ácido fítico, a qual resulta em uma formação gradual de pentakis-, tetrakis-, tris-, bis- e monofosfatos de mio-inositol, bem como na liberação de fosfato inorgânico.

[000111] Os termos "variante de fitase" ou "variante" ou "forma modificada" refere-se a uma enzima fitase com uma sequência de aminoácido derivada da sequência de aminoácido da fitase parental tendo uma ou mais substituições, inserções e/ou deleções de aminoácido as quais, juntas, são referidas como "mutações".

[000112] Os termos "fitase parental" ou "enzima parental" refere-se a uma enzima fitase da qual uma variante de fitase é derivada. A fitase parental pode ser uma fitase do tipo silvestre ou outra variante de fitase. Em particular, na presente invenção, uma "fitase parental" pode ser derivada de uma Buttiauxella sp. Adequadamente, a "fitase parental" é derivada da cepa P1-29 de Buttiauxella, conforme descrito aqui a qual tem, de preferência, a sequência de aminoácido apresentada aqui.

[000113] Conforme usado aqui, o termo "fitase" ou "atividade de fitase" refere-se a uma proteína ou polipeptídeo o qual é capaz de catalisar a hidrólise de fitato em (1) mio-inositol e/ou (2) mono-, di-, tri-, tetra- e/ou penta-fosfatos do mesmo e (3) fosfato inorgânico. Por exemplo, enzimas tendo atividade catalítica, conforme definido em Enzyme Commission número EC 3.1.3.8 ou número EC 3.1.3.26.

[000114] O termo "uma fitase de Buttiauxella sp.", conforme usado aqui, refere-se a uma proteína fitase obtida de uma Buttiauxella sp. Em uma modalidade, a fitase de Buttiauxella sp. compreende a sequência de aminoácido derivada de uma cepa depositada sob o número de acesso NCIMB 41248 (National Collections of Industrial Marine and Food Bacteria, Scotland, Reino Unido). Em uma modalidade vantajosa, uma fitase de Buttiauxella sp. compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2.

[000115] O termo "correspondendo a uma fitase de Buttiauxella sp.", conforme usado aqui, refere-se a uma enzima tendo uma ou mais das mesmas ou características funcionais ou sequências similares a uma fitase de Buttiauxella sp., mas não necessariamente obtida de uma fonte de Buttiauxella sp.

[000116] O termo "Buttiauxella" refere-se a um gênero de bactérias gram negativas, facultativamente anaeróbicas da família Enterobacteriaceae e Buttiauxella spp incluem B. agrestis, B. brennerase, B.ferragutiae, B. gaviniae, B. izardii, B. noackiae e B. warmboldiae. Cepas de espécies Buttiauxella estão disponíveis, por exemplo, da American Type Culture Collection (ATCC) e DSMZ, o German National Resource Centre for Biological Material.

[000117] O termo "fitase do tipo silvestre" ou "tipo silvestre" refere-se a uma enzima com uma sequência de aminoácido encontrada na natureza. Em particular, a fitase do tipo silvestre é aquela mostrada como SEQ ID. No. 1.

[000118] O termo "variante" de uma fitase de Buttiauxella sp." ou "variante de fitase", conforme usado aqui, significa uma enzima fitase com uma sequência de aminoácido que difere, pelo menos quanto a uma substituição, inserção e/ou deleção, quando comparado com a sequência de aminoácido da fitase de SEQ. ID NO: 1. Os termos "variante" e "variação", conforme usado aqui, significam meramente que há uma diferença entre a sequência de aminoácido da variante de fitase e a sequência de aminoácido de SEQ. ID NO: 1 e não significa que as mesmas têm uma sequência de aminoácido ou sequência de nucleotídeo de SEQ. ID NO: 1 ou qualquer outra fitase que serve como um material de iniciação de qualquer forma e/ou foi fisicamente variada, sofreu mutação, modificada ou de outro modo alterada para proporcionar a variante. Dito simplesmente, as variantes de fitase da presente descrição (incluindo suas sequências de aminoácido e nucleotídeo) podem ser preparadas por meio de qualquer método e aqueles versados na técnica estarão prontamente familiarizados com números métodos, alguns dos quais são descritos aqui, para produzir as variantes de fitase.

[000119] O termo "proteína", conforme usado aqui, inclui proteínas, polipeptídeos e peptídeos.

[000120] Os termos "resíduo de aminoácido equivalente a", "aminoácido correspondendo a" e equivalentes gramaticais dos mesmos são usados aqui para referir-se a um resíduo de aminoácido de uma proteína tendo a posição e efeito similares conforme aqueles indicados em uma sequência de aminoácido em particular de uma proteína em particular. Aqueles versados na técnica reconhecerão a equivalência de resíduos especificados em proteínas fitase comparáveis.

[000121] "Identidade percentual de sequência", com relação a duas sequências de aminoácido ou polinucleotídeo, refere-se ao percentual de resíduos que são idênticos nas duas sequências quando as sequências são otimamente alinhadas. Assim, uma identidade de sequência de aminoácido de 80% significa que 80% dos aminoácidos nas duas sequências polipeptídicas otimamente alinhadas são idênticos. A identidade percentual pode ser determinada, por exemplo, comparando diretamente a informação de sequência entre duas moléculas mediante alinhamento das sequências, contando o número exato de equivalências entre as duas sequências alinhadas, dividindo pelo comprimento da sequência mais curta e multiplicando o resultado por 100. Programas de computador prontamente disponíveis podem ser usados para auxiliar na análise, tal como o ALIGN, Dayhoff, M.O. em "Atlas of Protein Sequence and Structure", M.O. Dayhoff et al., Supl. 3: 353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, DC, o qual adapta o algoritmo de homologia local de Smith e Waterman (1981) Advances in Appl. Math. 2: 482-489 para análise peptídica. Programas para determinação da identidade de sequência de nucleotídeo estão disponíveis no Wisconsin Sequence Analysis Package, Versão 8 (disponível da Genetics Computer Group, Madison, WI), por exemplo, os programas BESTFIT, FASTA e GAP, os quais também contam com o algoritmo de Smith e Waterman. Esses programas são prontamente utilizados com os parâmetros de default recomendados pelo fabricante e descritos no Wisconsin Sequence Analysis Package mencionado acima. Um exemplo de um algoritmo que é adequado para determinação da similaridade de sequência é o algoritmo BLAST, o qual é descrito em Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). Software para realização de análises pelo BLAST está publicamente disponível do National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Da mesma, programas de computador para determinação da homologia percentual também estão prontamente disponíveis.

[000122] O termo "propriedade" ou equivalentes gramaticais do mesmo, no contexto de um polipeptídeo, conforme usado aqui, refere- se a qualquer característica ou atributo de um polipeptídeo que pode ser selecionado ou detectado. Essas propriedades incluem, mas não estão limitadas a, estabilidade oxidativa, especificidade de substrato, atividade catalítica, estabilidade térmica, temperatura e/ou perfil de atividade de pH, estabilidade de processamento em ração e capacidade de ser secretado.

[000123] O termo "estabilidade intensificada", no contexto de uma propriedade, tal como estabilidade em maiores temperaturas, menor pH, etc., refere-se a uma maior atividade enzimática retida com o tempo quando comparado com outra fitase identificada, tal como aquela de SEQ ID NO: 1. A menos que outra fitase seja especificamente identificada, o termo "estabilidade intensificada", quando usado aqui, irá se referir a uma maior atividade enzimática retida com o tempo quando comparado com a fitase de SEQ ID NO: 1.

[000124] Os termos "termicamente estável" e "termoestável" refere-se a fitases da presente descrição que retêm uma quantidade especificada de atividade enzimática após exposição a uma temperatura elevada. Variantes de fitase de acordo com presente descrição são consideradas termoestáveis em uma temperatura especificada se a enzima retém mais de 50% de sua atividade após exposição à temperatura especificada durante 10 minutos em um pH de 5,5 em tampão.

[000125] O termo "atividade térmica aprimorada", quando de referência às variantes de fitase da presente descrição, significa que a variante de fitase exibe a mesma ou uma quantidade aumentada de atividade enzimática de fitase em temperatura elevada quando comparado com a atividade enzimática de fitase de outra fitase identificada, tal como aquela de SEQ ID NO: 1. A menos que outra fitase seja especificamente identificada, o termo "atividade térmica aprimorada", quando usado aqui, irá se referir à atividade térmica de uma variante de fitase da presente descrição quando comparado com a atividade térmica da fitase de SEQ ID NO: 1. Discussão adicional a respeito de atividade térmica é fornecida abaixo no Exemplo 6.

[000126] Os termos "polinucleotídeo" e "ácido nucleico", usados permutavelmente aqui, referem-se a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, seja ribonucleotídeos ou deoxiribonucleotídeos. Esses termos incluem, mas não estão limitados a, um DNA fita simples, dupla ou tripla, DNA genômico, cDNA, RNA, híbrido de DNA-RNA ou um polímero compreendendo bases de purina e pirimidina ou outras bases de nucleotídeo naturais, química, bioquimicamente modificadas, não naturais ou derivatizadas.

[000127] Conforme usado aqui, o termo "gene" refere-se a um polinucleotídeo (por exemplo, um segmento de DNA), que codifica um polipeptídeo e inclui regiões precedentes e após as regiões de codificação, bem como sequências intervenientes (íntrons) entre segmentos de codificação individuais (éxons).

[000128] Conforme usado aqui, os termos "construto de DNA," "transformação de DNA" e "vetor de expressão" são usados permutavelmente para referir-se ao DNA usado para introduzir sequências em uma célula hospedeira ou organismo. O DNA pode ser gerado in vitro através de PCR ou qualquer outra(s) técnica(s) adequada(s) conhecida(s) por aqueles versados na técnica. O construto de DNA, transformação de DNA ou cassete de expressão recombinante pode ser incorporado em um plasmídeo, cromossomo, DNA mitocondrial, DNA de plastídeo, vírus ou fragmento de ácido nucleico. Tipicamente, a porção cassete de expressão recombinante de um vetor de expressão, construto de DNA ou transformação de DNA inclui, dentre outras sequências, uma sequência de ácido nucleico a ser transcrita e um promotor. Em modalidades preferidas, vetores de expressão têm a capacidade de incorporar e expressar fragmentos de DNA heterólogos em uma célula hospedeira.

[000129] Conforme usado aqui, o termo "vetor" refere-se a um construto de polinucleotídeo criado para introduzir ácidos nucleicos em um ou mais tipos de célula. Vetores incluem vetores de clonagem, vetores de expressão, vetores de derivação, plasmídeos, cassetes e semelhantes.

[000130] Conforme usado aqui no contexto de introdução uma sequência de ácido nucleico em uma célula, o termo "introduzido" refere-se a qualquer método adequado para transferência da sequência de ácido nucleico para a célula. Tais métodos para introdução incluem, mas não estão limitados a, fusão de protoplasta, transfecção, transformação, conjugação e transdução e inclui referência à incorporação de uma sequência de ácido nucleico em uma célula eucariota ou procariota, em que a sequência de ácido nucleico pode ser incorporada no genoma da célula (por exemplo, cromossomo, plasmídeo, plastídeo ou DNA mitocondrial), convertido em um replicon autônomo ou transitoriamente expressa (por exemplo, mRNA transfectado).

[000131] O termo "alinhamento ótimo" refere-se ao alinhamento que proporciona o maior escore de identidade de sequência.

[000132] Os termos "proteína" e "polipeptídeo" são usados permutavelmente aqui. Na presente descrição e reivindicações, os códigos de uma letra e três letras convencionais para resíduos de aminoácido são usados. O código de 3 letras para aminoácidos, conforme definido em conformidade com a IUPACIUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN). Deve ser entendido também que um polipeptídeo pode ser codificado por mais de uma sequência de nucleotídeo em virtude de degenerância do código genético.

[000133] Variantes da presente descrição são descritas conforme a seguinte nomenclatura: [resíduo de aminoácido original de SEQ. ID NO: 1/posição de resíduo de aminoácido original em SEQ. ID NO: 1/resíduo de aminoácido substituído]. Por exemplo, em SEQ ID NO: 2, a substituição de treonina (T) pela alanina (A) original na posição 89 de SEQ ID NO: 1 é representada como A89T. Quando a posição adequada para substituição é identificada aqui sem um aminoácido específico sugerido, deve ser entendido que qualquer resíduo de aminoácido pode substituir o resíduo de aminoácido presente na posição. Onde uma fitase variante contém uma deleção em comparação com outras fitases, a deleção é indicada com "*". Por exemplo, uma deleção at posição A89 de SEQ. ID NO: 1 é representado como A89*. Uma deleção de dois ou mais aminoácidos consecutivos é indicada, por exemplo, como (89 - 91)*.

[000134] O termo "sequência sinalizadora" ou "peptídeo sinalizador" refere-se a quaisquer sequências de nucleotídeo e/ou aminoácidos as quais podem participar na secreção das formas maduras ou precursoras da proteína. Essa definição de sequência sinalizadora é aquela funcional, se destinando a incluir todas aquelas sequências de aminoácido codificadas pela porção N-terminal do gene de proteína, a qual participa na realização de secreção da proteína. Elas são, frequentemente, mas não universalmente, ligadas à porção N-terminal de uma proteína ou à porção N-terminal de uma proteína precursora.

[000135] "Cepa hospedeira" ou "célula hospedeira" refere-se a um hospedeiro adequado para um vetor de expressão compreendendo DNA de acordo com a presente descrição.

[000136] Os termos "derivada de" e "obtida de" referem-se a não apenas uma fitase produzida ou produzível por uma cepa do organismo em questão, mas também uma fitase codificada por uma sequência de DNA isolada de tal cepa e produzida em um organismo hospedeiro contendo tal sequência de DNA. Adicionalmente, os termos referem-se a uma fitase a qual é codificada por uma sequência de DNA de original sintética e/ou originária de cDNA e a qual tem as características identificadas da fitase em questão. Consequentemente, uma fitase que é "derivada de" e "obtida de" outra fitase não significa necessariamente que a fita foi fisicamente derivada ou fisicamente obtida da segunda fitase, mas antes, pode também significar que a fitase em questão foi preparada usando conhecimento ou idéias derivadas de conhecimento a respeito da segunda fitase.

[000137] Por "fragmento funcional" entenda-se um fragmento do polipeptídeo que retém as propriedades características desse polipeptídeo. No contexto da presente invenção, um fragmento funcional de uma enzima fitase é um fragmento que retém a capacidade de clivagem de fitase da proteína inteira.

[000138] O termo "isolado", "recuperado" ou "purificado" refere-se a um material que é removido de seu ambiente natural. O termo "substancialmente purificado" significa que o material foi purificado em um grau pelo menos substancial.

[000139] Em um aspecto, de preferência, a sequência de nucleotídeo ou aminoácido está em uma forma isolada. O termo "isolada" significa que a sequência é pelo menos substancialmente isenta de pelo menos um outro componente com o qual a sequência está naturalmente associada na natureza e conforme encontrado na natureza.

[000140] Em um aspecto, de preferência a sequência de nucleotídeo ou aminoácido está em uma forma purificada. O termo "purificada" significa que a sequência está em um estado relativamente puro pelo menos 1%, 5% puro ou 10% puro, mais preferivelmente pelo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% puro. Em uma modalidade preferida, quando de referência a um polipeptídeo, a pureza, conforme definido acima, é determinada em termos de ser purificada de outros polipeptídeos através de eletroforese por SDS-PAGE. Em uma modalidade preferida, quando de referência a um polinucleotídeo, a pureza, conforme definido acima, é determinada em termos de ser purificada de outros polinucleotídeos.

[000141] Conforme usado com referência à presente invenção, os termos "expressão", "expressa", "expresso" e "expressível" são sinônimos dos respectivos termos "transcrição", "transcreve", "transcrito" e "passível de transcrição".

[000142] Conforme usado com referência à presente invenção, os termos "transformação" e "transfecção" referem-se a um método de introdução de sequências de ácido nucleico em hospedeiros, células hospedeiras, tecidos ou órgãos.

[000143] Conforme usado com referência à presente invenção, os termos "produzir", "produção de", "produzido", "produzível", "produção" são sinônimos dos respectivos termos "preparar", "preparo", "preparado", "preparação", "gerado", "geração" e "preparável".

[000144] Uma "ração" e um "alimento", respectivamente, significam qualquer dieta, farinha ou semelhante natural ou artificial ou componentes de tais farinhas destinadas a ser comidas, ingeridas, digeridas, por um animal (ração) e um ser humano (alimento), respectivamente.

[000145] A "aditivo para alimento ou ração" é um composto ou uma composição com múltiplos componentes destinada a ou adequada para ser adicionada a um alimento ou ração. Ele pode, mas não é requerido, compreender um ou mais compostos, tais como vitaminas, minerais ou enzimas para intensificação de ração e veículos e/ou excipientes adequados e, usualmente, é fornecido em uma forma que é adequada para ser adicionada a uma ração para animal.

[000146] O termo "liquefação de amido" refere-se a um processo pelo qual amido é convertido em dextrinas de cadeia mais curta e menos viscosa.

[000147] O termo "substrato" refere-se a uma substância que é ou compreende pelo menos uma entidade que pode ser sofrer ação pela(s) enzima(s) da presente invenção. Exemplos de tais entidades incluem: fitato e produtos intermediários da degradação de fitase, tais como inositol pentafosfatos, tetrafosfatos, trifosfatos difosfatos e monofosfatos. Exemplos de substratos que compreendem a referida entidade incluem grãos, cereais e outros materiais de planta ou materiais baseados em carboidrato para uso, por exemplo, em ingredientes para rações, liquefação, sacarificação, fermentação, processos de sacarificação/fermentação simultâneas e/ou em uma única etapa para a produção, por exemplo, de álcoois de fermentação (por exemplo, etanol ou butanol) ou açúcares para uso em fermentações para a produção de álcoois (por exemplo, etanol ou butanol) ou açúcares para a produção de outros produtos (por exemplo, produtos não alcoólicos).

[000148] O termo "fermentações de álcool" refere-se a processos fermentativos nos quais um micro-organismo (por exemplo, um levedo) converte um substrato em um metabólito o qual é classificado como um álcool (por exemplo, etanol ou butanol).

[000149] Um "promotor" é uma sequência regulatória que está envolvida em ligação à RNA polimerase para iniciar a transcrição de um gene.

[000150] "Sob o controle transcricional" é um termo bem entendido na técnica para indicar que a transcrição de uma sequência de polinucleotídeo, usualmente uma sequência de DNA, depende de estar operavelmente ligada a um elemento o qual contribui para o início ou promoção de transcrição.

[000151] "Sob controle traducional" é um termo bem entendido na técnica que indica um processo regulatório que ocorre após o mRNA ter sido formado.

[000152] Conforme usado aqui, quando de descrição de proteínas e genes que as codificam, o termo para o gene está em itálico (por exemplo, o gene que codifica fitase de Buttiauxella). O termo para a proteína, em geral, não está em itálico e a primeira letra está, em geral, em letra maiúscula.

[000153] O termo "operavelmente ligado" refere-se à justaposição em que os elementos estão em uma configuração que permite que os mesmos estejam funcionalmente relacionados. Por exemplo, um promotor é operavelmente ligado a uma sequência de codificação se ele controla a transcrição da sequência.

[000154] O termo "marcador seletivo" refere-se a um gene capaz de expressão em um hospedeiro que permite fácil seleção daqueles hospedeiros contendo um ácido nucleico ou vetor introduzido. Exemplos de marcadores selecionáveis incluem, mas não estão limitados a, antimicrobianos (por exemplo, higromicina, bleomicina ou cloranfenicol) e/ou genes que conferem uma vantagem metabólica, tal como uma vantagem nutricional, a uma célula hospedeira.

[000155] O termo "heterólogo", com referência a um polinucleotídeo ou proteína, refere-se a um polinucleotídeo ou proteína que não ocorre naturalmente em uma célula hospedeira.

[000156] O termo "endógeno", com referência a um polinucleotídeo ou proteína, refere-se a um polinucleotídeo ou proteína que ocorre naturalmente na célula hospedeira.

[000157] Os termos "recuperado", "isolado e "separado", conforme usado aqui, refere-se a um composto, proteína, célula, ácido nucleico ou aminoácido que é removido de pelo menos um componente com o qual ele está naturalmente associado.

[000158] Conforme usado aqui, os termos "transformada", "estavelmente transformada" e "transgênica" usados em referência a uma célula significa que a célula tem uma sequência de ácido nucleico não nativa (por exemplo, heteróloga) integrada em seu genoma ou como um plasmídeo epissômico que é mantido através de múltiplas gerações.

[000159] Conforme usado aqui, o termo "expressão" refere-se ao processo pelo qual um polipeptídeo é produzido baseado na sequência de ácido nucleico de um gene. O processo inclui transcrição e tradução.

[000160] Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui possam ser usados na prática ou testagem da presente descrição, métodos e materiais exemplificativos e vantajosos são agora descritos. Todas as publicações mencionadas aqui são incorporadas aqui por referência até o ponto necessário para divulgar e descrever os métodos e/ou materiais relacionados à descrição para as quais as publicações são mencionadas.

[000161] Outras definições de termos podem aparecer por toda a especificação. Antes que modalidades exemplificativas sejam descritas em maiores detalhes, deve ser entendido que a presente descrição não está limitada às modalidades particulares descritas, uma vez que as mesmas podem, naturalmente, variar. Deve ser também entendido que a terminologia usada aqui é para fins de descrição de modalidades particulares e não se destina a ser limitativa, uma vez que o escopo da presente descrição será limitado apenas pelas reivindicações em anexo.

[000162] Onde uma faixa de valores é fornecida, deve ser entendido que cada valor interveniente, até o décimo da unidade do menor limite, a menos que o contexto oriente claramente de outro modo, entre os limites máximo e mínimo dessa faixa, é também especificamente divulgado. Cada faixa menor entre qualquer valor estabelecido ou valor interveniente em uma faixa estabelecida e qualquer outro valor estabelecido ou interveniente nessa faixa estabelecida é abrangido pela presente descrição. Os limites máximo e mínimo dessas faixas menores podem ser independentemente incluídos ou excluídos da faixa e cada faixa onde qualquer um, nenhum ou ambos os limites são incluídos nas faixas menores também é abrangido pela presente descrição, sujeito a qualquer limite especificamente excluído na faixa estabelecida. Onde a faixa estabelecida inclui um ou ambos os limites, faixas excluindo qualquer um ou ambos esses limites incluídos também são incluídas na presente descrição.

[000163] Deve ser notado que, conforme usado aqui e nas reivindicações em anexo, as formas no singular "um", "uma", "o" e "a" incluem os referentes no plural, a menos que o contexto oriente claramente de outro modo. Assim, por exemplo, referência a "um gene" inclui uma pluralidade de tais agentes candidatos e referência à "célula" inclui referência a uma ou mais células e equivalentes das mesmas conhecidas por aqueles versados na técnica e assim por diante.

[000164] As publicações discutidas aqui são fornecidas unicamente por sua descrição anterior à data de depósito do presente pedido. Nada aqui deve ser construído como uma admissão de que tais publicações constituem a técnica anterior às reivindicações em anexo aqui.

[000165] Enzima fitase, conforme usado como enzimas parentais ou precursoras, incluem uma fitase de Buttiauxella sp. e aquelas enzimas correspondendo a uma fitase de Buttiauxella sp. Em algumas modalidades, a fitase parental de Buttiauxella sp. compreende a sequência de aminoácido derivada de uma cepa de Buttiauxella sp. depositada sob o número de acesso NCIMB 41248. Em algumas modalidades, a fitase parental de Buttiauxella sp. compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a fitase parental de Buttiauxella sp. é derivada de B. agrestis, B. brennerase, B. ferragutiae, B. gaviniae, B. izardii, B. noackiae e B. warmboldiae. Referência é feita ao documento WO 2006/043178, o qual é especificamente incorporado aqui por referência e o qual descreve fitases obteníveis de ou derivadas de uma Buttiauxella sp. parental e fitases correspondendo à enzima fitase de Buttiauxella sp. Em algumas modalidades, uma fitase variante do tipo silvestre de Buttiauxella sp. tem pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 93%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% e pelo menos 99% de identidade de sequência de aminoácido ao polipeptídeo de SEQ ID NO: 1.

[000166] Modalidades da presente descrição referem-se a fitases variantes (por exemplo, fitases variantes de Buttiauxella sp.). Especificamente, o documento WO 2006/043178 descreve a mutagênese e uma enzima fitase do tipo silvestre tendo a sequência divulgada no mesmo como SEQ ID NO: 3. Uma série de mutações preferidas é ensinada no documento WO 2006/043178. Uma fitase variante conterá pelo menos uma substituição, deleção ou inserção de aminoácido, com substituições de aminoácido sendo frequentemente vantajosas. A substituição, inserção ou deleção de aminoácido pode ocorrer em qualquer resíduo dentro do peptídeo da fitase. Uma variante de fitase da presente descrição é uma variante a qual não têm uma sequência de aminoácido idêntica à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 aqui.

[000167] Em modalidades vantajosas da presente descrição, a variante compreenderá uma substituição em uma fitase de Buttiauxella sp. e mais especificamente correspondendo às referidas posições equivalentes em SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a substituição compreende qualquer um dos 19 aminoácidos restantes correspondendo a A, C, D, E, F, 0, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W ou Y. Contudo, também aminoácidos sintéticos e outros poderiam ser usados.

[000168] Variantes podem ser preparadas por meio de mutagênese aleatória, mutagênese por saturação de sítio e mutagênese sítio- específica de nucleotídeos no DNA que codifica a proteína fitase usando cassetes ou mutagênese por PCR ou outras técnicas bem conhecidas na técnica para produzir variantes as quais podem, após o que, ser produzidas em cultura de células. Referência é feita a Morinaga et al. (1984) Biotechnology 2: 646 -649; Nelson e Long, (1989) Analytical Biochem., 180: 147 - 151 e Sarkar e Sommer (1999) Biotechniques 8: 404-407. Fragmentos de proteína fitase variante podem também ser preparados por meio de síntese in vitro usando técnicas estabelecidas.

[000169] Polinucleotídeos podem ser obtidos por meio de procedimentos padrões conhecidos na técnica, por exemplo, a partir de DNA clonado (por exemplo, uma "biblioteca" de DNA), mediante síntese química, através de clonagem de cDNA, por meio de PCR (USP 4.683.202 ou Saiki et al., Science 239: 487 - 491(1988)), através de métodos sinteticamente estabelecidos (Beucage et al., (1981) Tetrahedron Letters 22: 1859 -1869 e Matthes et al., EMBO J. 3: 801 - 895 (1984)) ou através da clonagem de DNA genômico ou fragmentos do mesmo, substancialmente purificados da célula desejada, tal como Buttiauxella sp. (veja, por exemplo, Sambrook et al., 2001, Molecular Clonagem, A Laboratory Manual, 3a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Glover, DM e Hames, BD (Eds.), 1995, DNA Clonagem 1: A Practical Approach and DNA Cloning 2: A Practical Approach, Oxford University Press, Oxford). Sequências de ácido nucleico derivadas de DNA genômico e derivados das mesmas podem conter regiões regulatórias além das regiões de codificação.

[000170] Para expressar os polipeptídeos, métodos padrões de expressão de DNA recombinante podem ser usados (veja, por exemplo, Goeddel; Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)). Por exemplo, DNA que codifica o polipeptídeo desejado pode ser inserido em um vetor de expressão o qual é, então, transfectado em uma célula hospedeira adequada. Deve ser entendido que o design do vetor de expressão, incluindo a seleção de sequências regulatórias, é afetado por fatores tais como a escolha da célula hospedeira, o nível de expressão de proteína desejado e se expressão é constitutiva ou induzível.

[000171] Transfecção do vetor de expressão em uma célula hospedeira pode ser realizada usando técnicas padrões, tais como eletroporação, precipitação de fosfato de cálcio e Transfecção com DEAE-dextrana.

[000172] Células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão do DNA nos vetores aqui são as células de procariotas, de levedo ou eucariotas superiores, tais como células de planta, conforme descrito acima. Além de procariotas, micróbios eucariotas, tais como fungos filamentosos ou levedos, são hospedeiros de clonagem ou expressão adequados para as variantes de fitase de acordo com presente descrição.

[000173] Células hospedeiras podem ser transformadas com os vetores de expressão ou clonagem descritos acima para produção de proteína e cultivadas em meio nutriente convencional modificado conforme apropriado para indução de promotores, seleção de transformantes ou amplificação dos genes que codificam as sequências desejadas. As condições de cultura, tais como temperatura, pH e semelhantes, são aquelas previamente usadas com a célula hospedeira selecionada para expressão e serão evidentes para aqueles versados na técnica.

[000174] O polipeptídeo preparado a partir das células pode ser purificado usando, por exemplo, cromatografia em hidróxiapatita, eletroforese em gel, diálise e cromatografia por afinidade.

[000175] Em algumas modalidades, uma fitase variante de acordo com presente descrição terá propriedades alteradas. Vantajosamente, uma variante de acordo com modalidades da presente descrição terá propriedades aprimoradas quando comparado com a fitase do tipo silvestre de SEQ. ID NO: 1. Em algumas modalidades, as propriedades alteradas, por exemplo, aprimoradas, serão estabilidade térmica, atividade térmica, estabilidade de processamento em ração e/ou atividade específica (veja figura2).

[000176] Em algumas modalidades, as variantes abrangidas pela presente descrição terão estabilidade aumentada térmica quando comparado com fitases de Buttiauxella sp. conhecidas na técnica (por exemplo, fitases de Buttiauxella sp. de acordo com SEQ ID NO: 1). Em algumas modalidades, a variante terá uma diferença de estabilidade térmica (Thermal Difference - TD) de pelo menos 21,9°C, pelo menos 22,4°C, pelo menos 22,6°C, pelo menos 22,9°C, pelo menos 23,2°C, pelo menos 23,4°C, pelo menos 23,5°C, pelo menos 23,5°C, pelo menos 23,7°C, pelo menos 24,1°C, pelo menos 24,2°C, pelo menos 24,4°C, pelo menos 24,9°C, pelo menos 25,0°C, pelo menos 25,9°C, pelo menos 26,5°C e pelo menos 26,8°C comparado com a BP-WT.

[000177] Em algumas modalidades, as variantes abrangidas pela presente descrição exibirão estabilidade aumentada em temperaturas elevadas quando comparado com a fitase do tipo silvestre de SEQ. ID NO: 1. Em algumas modalidades, a variante de fitase será termoestável em cerca de 65°C, em cerca de 70°C, em cerca de 75°C, em cerca de 80°C ou maior. Conforme discutido acima, as fitases de acordo com presente descrição são consideradas termoestáveis se a enzima retém mais de 50% de sua atividade após exposição a uma temperatura especificada durante 10 minutos em um pH de 5,5.

[000178] Em algumas modalidades, as variantes terão uma maior atividade térmica. Em algumas modalidades, a variante abrangida pela presente descrição terão uma diferença de atividade térmica (Thermal Activity Difference - TAD) de pelo menos 17,4°C, pelo menos 17,5°C, pelo menos 17,6°C, pelo menos 17,8°C, pelo menos 17,9°C, pelo menos 18,4°C, pelo menos 18,7°C, pelo menos 18,8°C, pelo menos 18,9°C, pelo menos 19,0°C, pelo menos 19,3°C, pelo menos 19,5°C, pelo menos 20,0°C, pelo menos 20,1°C e pelo menos 20,2°C comparado com a BP-WT.

[000179] Em algumas modalidades, as fitases variantes de acordo com presente descrição terão uma atividade específica de pelo menos 1000 U/mg, pelo menos 1200 U/mg, pelo menos 1400 U/mg, pelo menos 1600 U/mg, pelo menos 1800 U/mg, pelo menos 2000 U/mg, pelo menos 2200 U/mg, pelo menos 2300 U/mg, pelo menos 2400U/mg e pelo menos 2500 U/mg , em que a atividade específica é determinada mediante incubação da fitase a 67°C em uma solução contendo fitase a 10 mM, CaC12 a 1 mM em tampão de acetato de sódio a 200 mM em um pH de 5,5 conforme detalhado no Exemplo 3 da presente descrição.

[000180] Em algumas modalidades, as fitases variantes de acordo com presente descrição terão uma atividade específica de pelo menos 800 U/mg, pelo menos 1000 U/mg, pelo menos 1200 U/mg, pelo menos 1400 U/mg, pelo menos 1600 U/mg, pelo menos 1800 U/mg, pelo menos 2000 U/mg, pelo menos 2200 U/mg, pelo menos 2300 U/mg, pelo menos 2400U/mg, pelo menos 2500 U/mg e pelo menos 2600 U/mg , em que a atividade específica é determinada mediante incubação da fitase a 80°C em uma solução contendo 10mM fitato, 1mM CaC12 em tampão de acetato de sódio a 200 mM em um pH de 5,5 conforme detalhado no Exemplo 3 da presente descrição.

[000181] Em algumas modalidades, as fitases variantes de acordo com presente descrição serão termoestáveis a 80°C, isto é, retêm 50% de atividade após exposição a 80°C durante 10 minutos em um pH de 5,5 e, ao mesmo tempo, têm uma atividade específica de pelo menos 2500 U/mg a 80°C e pelo menos 2300 U/mg a 67°C, em que a atividade específica é determinada mediante incubação da fitase na temperatura especificada em uma solução contendo fitato a 10 mM, CaCl2 a 1 mM em tampão de acetato de sódio a 200 mM em um pH de 5,5 conforme detalhado no Exemplo 3 da presente descrição.

[000182] Em algumas modalidades, as variantes abrangidas pela presente descrição podem ser usadas em um método de produção de um composto de fosfato compreendendo tratamento de um fitato com uma fitase variante abrangida pela presente descrição (por exemplo, variante de SEQ ID NO: 2). O fitato pode ser di-, tri-, tetra e/ou pentafosfatos de mio-inositol. Outros fosfatos orgânicos adequados incluem inositol-tetrafosfatos e inositol-oligofosfatos.

[000183] Em algumas modalidades, as variantes abrangidas pela presente descrição reterão essencialmente o mesmo nível de atividade específica que a BP-WT, mas têm um aumento na estabilidade em maiores temperaturas, maior pH e/ou menor pH quando comparado com a BP-WT.

[000184] Em algumas modalidades, as variantes abrangidas pela presente descrição reterão essencialmente o mesmo nível de atividade específica que a BP-WT, mas têm uma atividade térmica aprimorada.

[000185] Em algumas modalidades, presente descrição proporciona um método de produção de uma enzima tendo atividade de fitase conforme descrito aqui, compreendendo: (a) fornecimento de uma célula hospedeira transformada com um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo que codifica uma variante de fitase conforme descrito aqui, (b) cultura da célula hospedeira transformada sob condições adequadas para que a célula hospedeira produza a variante de fitase; e (c) recuperação da variante de fitase.

[000186] Em algumas modalidades, o vetor de expressão compreenderá um polinucleotídeo o qual codifica uma fitase compreendendo uma sequência de aminoácido tendo uma substituição em resíduos de aminoácido correspondendo às posições mostradas na figura2.

[000187] Em algumas modalidades da presente descrição, a cepa hospedeira é geneticamente manipulada para expressar fitases heterólogas ou variantes tendo atividade de fitase de acordo com presente descrição.

[000188] Células hospedeiras úteis para a produção de uma fitase abrangida pela presente descrição incluem células bacterianas, células fúngicas e células de planta. Células hospedeiras incluem as células e prole das células e protoplastas criados a partir das células, os quais podem ser usados para produzir uma fitase variante de acordo com presente descrição.

[000189] Vetores úteis incluindo construtos de DNA compreendendo um polinucleotídeo que codifica uma fitase da presente descrição e métodos de transformação de células hospedeiras são bem conhecidos na técnica e técnicas e metodologia padrão podem ser usadas.

[000190] De acordo com presente descrição, um construto de DNA compreendendo ácido nucleico que codifica uma fitase variante abrangida pela presente descrição é construído para transferir e/ou expressar a variante em uma célula hospedeira. Em uma modalidade, o construto de DNA é transferido para uma célula hospedeira através de um vetor de expressão o qual compreende sequências regulatórias (por exemplo, promotores, sítios de ligação ribossômica, sequências de início e término de transcrição, sequências de início e término de tradução, intensificadores, sequências ativadoras, sequências de expressão célula-específicas, sequências sinalizadoras e/ou terminadores) operavelmente ligados à sequência de codificação da fitase variante.

[000191] Um vetor de expressão compreendendo um construto de DNA com um polinucleotídeo que codifica a fitase variante pode ser qualquer vetor o qual é capaz de replicação autônoma em um determinado organismo hospedeiro fúngico ou de integração no DNA do hospedeiro. Em algumas modalidades, o vetor de expressão é um plasmídeo ou um bacteriófago. Em algumas modalidades, o vetor de expressão é pré-montado e contém sequências requeridas para transcrição em alto nível e um marcador selecionável. Em algumas modalidades, a região de codificação para o gene de fitase variante ou parte do mesmo é inserida nesse vetor de expressão para fins gerais, de modo que ela esteja sob o controle transcricional do promotor e sequências terminadoras do construto de expressão. Em algumas modalidades, genes ou partes dos mesmos são inseridas a jusante do promotor forte cbh1.

[000192] Resumidamente, com relação à produção de uma fitase em células fúngicas hospedeiras, referência é feita a Sambrook et al., (1989) supra, Ausubel (1987) supra, van den Hondel et al. (1991) em Bennett e Lasure (Eds.) MORE GENE MANIPULATIONS IN FUNGI, Academic Press (1991) páginas 70 -76 e 396-428; Nunberg et al., (1984) Mol. Cell Biol. 4: 2306-2315; Boel et al., (1984) EMBO J. 3: 1581-1585; Finkelstein em BIOTECHNOLOGY OF FILAMENTOUS FUNGI, Finkelstein et al. Eds. Butterworth-Heinemann, Boston, MA (1992), Cap. 6; Kinghorn et al. (1992) APPLIED MOLECULAR GENETICS OF FILAMENTOUS FUNGI, Blackie Academic and Professional, Chapman e Hall, Londres; Kelley et al., (1985) EMBO J. 4: 475 - 479; Penttila et al. (1987) Gene 61: 155-164; e Patente U.S. No. 5.874.276. Uma lista de vetores adequados pode ser encontrada no Fungal Genetics Stock Center Catalogue of Strains (FGSC, www em fgsc.net). Vetores adequados incluem aqueles obtidos, por exemplo, da Invitrogen Life Technologies e Promega. Vetores específicos adequados para uso em células fúngicas hospedeiras incluem vetores tais como pFB6, pBR322, pUC 18, pUC100, pDON™201, pDONR™221, pENTR™, pGEM®3Z e pGEM®4Z.

[000193] Em algumas modalidades, o vetor pode ser qualquer vetor o qual, quando introduzido em uma célula hospedeira fúngica, é integrado no genoma da célula hospedeira e é reproduzido. Alguns exemplos não limitativos de tais vetores são fornecidos no Fungal Genetics Stock Center Catalogue of Strains (FGSC, < www.fgsc.net»). Exemplos adicionais de vetores de expressão e/ou integração adequados são fornecidos em Sambrook et al., (1989) supra, Ausubel (1987) supra, van den Hondel et al. (1991) em Bennett e Lasure (Eds.) MORE GENE MANIPULATIONS IN FUNGI, Academic Press. 396-428 e Patente U.S. No. 5.874.276. Vetores particularmente úteis incluem pTREX, pFB6, pBR322, PUCI8, pUCI00 e pENTR/D. Plasmídeos adequados para uso em células bacterianas incluem pBR322 e pUC19, que permitem replicação em E. coli e pE194, por exemplo, que permite replicação em Bacillus.

[000194] Em algumas modalidades, ácidos nucleicos que codificam a fitase variante abrangida pela presente descrição são operavelmente ligados a um promotor adequado, o qual mostra atividade transcricional na célula hospedeira. Em geral, a expressão de uma fitase variante é realizada sob qualquer promotor adequado conhecido ou posteriormente descoberto na técnica. Em algumas modalidades, a fitase variante é expressa sob um promotor nativo ao hospedeiro. Em algumas modalidades, a variante de fitase é expressa sob um promotor heterólogo que é ativo na célula hospedeira. Por exemplo, se uma célula de Trichoderma é usada como uma célula hospedeira, então, vantajosamente, o promotor é ativo em uma célula hospedeira de Trichoderma.

[000195] Em algumas modalidades, o promotor é um promotor constitutivo ou induzível. Um "promotor constitutivo" é um promotor que é ativo sob a maioria das condições ambientais e de desenvolvimento. Um promotor "induzível" ou "repressível" é um promotor que é ativo sob regulação ambiental ou de desenvolvimento. Em algumas modalidades, promotores são induzíveis ou repressíveis em virtude de alterações em fatores ambientais incluindo, mas não limitado a, disponibilidade de carbono, nitrogênio ou outro nutriente, temperatura, pH, osmolaridade, a ausência de metal(is) pesado(s), a concentração de inibidor(es), estresse ou uma combinação dos precedentes, conforme é conhecido na técnica. Em algumas modalidades, os promotores induzíveis ou repressíveis são induzíveis ou repressíveis por fatores metabólicos, tais como o nível de determinadas fontes de carbono, o nível de determinadas fontes de energia, o nível de determinados catabólitos ou uma combinação dos precedentes, conforme é conhecido na técnica. Em uma modalidade, o promotor é um que é nativo à célula hospedeira. Por exemplo, quando T. reesei é o hospedeiro, o promotor é um promotor nativo de T. Reesei, tal como o promotor cbh1, o qual é depositado no GenBank sob o Número de Acesso D86235.

[000196] Exemplos não limitativos adequados de promotores incluem cbh1, cbh2, egl1, egl2, egl3, egl4, egl5, xyn1 e xyn2, o promotor do gene de fosfatase ácida passível de repressão (phoA) de P. chrysogenus (veja, por exemplo, Graessle et al., (1997) Appl. Environ. Microbiol., 63: 753-756), o promotor passível de repressão PCK1 de glicose (veja por exemplo, Leuker et al., (1997), Gene, 192: 235-240), o promotor MET3 maltose-induzível, glicose-repressível (veja Liu et al., (2006), Eukary. Cell, 5: 638-649), o promotor pKi e o promotor cpc1. Outros exemplos de promotores úteis incluem promotores de genes de glicoamilase de A. awamori e A. niger (veja, por exemplo, Nunberg et al., (1984) Mol. Cell Biol. 154: 2306-2315 e Boel et al., (1984) EMBO J. 3: 1581-1585). Também, os promotores do gene xln1 de T. reesei podem ser úteis (veja. por exemplo, documento EPA 137280A1).

[000197] Em algumas modalidades, o vetor de expressão também inclui uma sequência de término de transcrição a jusante do gene estrutural para conferir término eficiente. Em algumas modalidades, a sequência de término e a sequência promotora são derivadas da mesma fonte. Em outras modalidades, a sequência de término é homóloga a uma célula hospedeira. Uma sequência terminadora particularmente adequada é cbh1 derivada de uma cepa de Trichoderma e particularmente T. reesei. Outros terminadores fúngicos incluem o terminador do gene de glicoamilase de A. niger ou A. awamori (veja, por exemplo, Nunberg et al. (1984) supra e Boel et al., (1984) supra).

[000198] Métodos usados para ligar o construto de DNA compreendendo um polinucleotídeo que codifica a variante de fitase, um promotor, um terminador e outras sequências e inserção dos mesmos em um vetor adequado são bem conhecidos na técnica. A ligação é, em geral, realizada através de ligação em sítios de restrição convenientes. Se tais sítios não existem, os ligantes de oligonucleotídeo sintético são usados de acordo com a prática convencional (veja, por exemplo, Sambrook (1989) supra e Bennett e Lasure, MORE GENE MANIPULATIONS IN FUNGI, Academic Press, San Diego (1991) páginas 70-76). Adicionalmente, vetores podem ser construídos usando técnicas de recombinação conhecidas (por exemplo, Invitrogen Life Technologies, Gateway Technology). Transformação, expressão e cultura de células hospedeiras.

[000199] Introdução de um construto de DNA ou vetor em uma célula hospedeira inclui técnicas tais como transformação; eletroporação; microinjeção nuclear; transdução; transfecção (por exemplo, lipofecção mediada e transfecção mediada por DEAE-Dextrina); incubação com fosfato de cálcio; precipitação de DNA; bombardeamento em alta velocidade com microprojéteis revestidos de DNA; e fusão de protoplasto.

[000200] Transformação métodos para Aspergillus e Trichoderma são descritos, por exemplo, em Yelton et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470 - 1474; Berka et al., (1991) em Applications of Enzyme Biotechnology, Eds. Kelly e Baldwin, Plenum Press (NY); Cao et al., (2000) Sci. 9: 991 - 1001; Campbell et al., (1989) Curr. Genet. 16: 53- 56; Pentilla et al., (1987) Gene 61: 155 - 164); de Groot et al., (1998) Nat. Biotechnol. 16: 839 - 842; USP 6.022.725; USP 6.268.328 e EP 238 023. A expressão de proteína heteróloga em Trichoderma é descrita nos documentos USP 6.022.725; USP 6.268.328; Harkki et al. (1991); Enzyme Microb. Technol. 13: 227-233; Harkki et al., (1989) Bio Technol. 7: 596-603; EP 244.234; EP 215.594; e Nevalainen et al., "The Molecular Biology of Trichoderma and its Application to the Expression of Both Homologous and Heterologous genes", em MOLECULAR INDUSTRIAL MYCOLOGY, Eds. Leong e Berka, Marcel Dekker Inc., NY (1992) páginas 129 - 148). Referência é também feita ao documento W096100787 e Bajar et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8202 - 28212 para transformação de cepas de Fusarium.

[000201] Métodos para produzir um construto de DNA útil em transformação de plantas e métodos para transformação de plantas são também conhecidos. Alguns desses métodos incluem transferência de gene mediada por Agrobacterium tumefaciens; bombardeamento de microprojétil, transformação de protoplastas mediada por PEG, eletroporação e semelhantes. Referência é feita, por exemplo, aos documentos USP 5.780.708; USP 6.803.499; USP 6.777.589; Fromm et al. (1990) Biotechnol. 8: 833-839; Potrykus et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199: 169 - 177; Brisson et al., (1984) Nature 310: 511-514; Takamatsu et al., (1987) EMBO J 6: 307-311; Coruzzi et al., (1984) EMBO J 3: 1671-1680; Broglie et al. (1984) Science 224: 838-843; Winter J e Sinibaldi RM (1991) Results Probl Cell Differ 17: 85-105; Hobbs S ou Murry LE (1992) em McGraw Hill Yearbook of Science and Technology, McGraw Hill, New York, N.Y., páginas 191-196; e Weissbach e Weissbach (1988) Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, New York, N.Y., páginas 421-463. As células transformadas podem ser cultivadas usando técnicas padrões sob condições adequadas em frasco de agitação, fermentações em pequena escala ou larga escala (incluindo fermentações contínuas, em batelada e alimentada em batelada) em fermentadores de laboratório ou industriais, com meio adequado contendo sais fisiológicos e nutrientes (veja, por exemplo, Pourquie, J. et al., BIOCHEMISTRY AND GENETICS OF CELLULOSE DEGRADATION, eds. Aubert, J. P. et al., Academic Press, páginas 71-86, 1988 e Ilmen, M. et al., (1997) Appl. Environ. Microbiol. 63: 1298-1306). Meios comuns comercialmente preparados (por exemplo, caldo de Extrato de Malte de Levedo (Yeast Malt Extract - YM), caldo de Luria Bertani (LB) e caldo de Dextrose de Sabouraud (SD) encontram uso na presente descrição. Condições de cultura preferidas para células fúngicas filamentosas são conhecidas na técnica e podem ser encontradas na literatura cientifica e/ou de fornecedores dos fungos, tais como American Type Culture Collection e Fungal Genetics Stock Center.

[000202] Em algumas modalidades, transformantes geneticamente estáveis são construídos com sistemas de vetor, pelo que o ácido nucleico que codifica uma variante de fitase é estavelmente integrado no cromossomo de uma cepa hospedeira. Transformantes são, então, purificados por meio de técnicas conhecidas.

[000203] De forma a avaliar a expressão de variantes de fitase tendo atividade de fitase por uma linhagem de célula que foi transformada com um polinucleotídeo heterólogo que codifica uma variante de fitase tendo atividade de fitase abrangida pela presente descrição, ensaios podem ser realizados a nível de proteína, a nível de RNA ou mediante o uso de bioensaios funcionais particulares à atividade e/ou produção de fitase. Em geral, os ensaios empregados incluem Northern blotting, dot blotting (análise de DNA ou RNA), RT-PCR (reação em cadeia de polimerase com transcriptase reversa) ou hibridização in situ, usando uma sonda apropriadamente rotulada (baseada na sequência de codificação de ácido nucleico) e Southern blotting e autorradiografia convencionais.

[000204] Além disso, a produção e/ou expressão de uma variante de fitase tendo atividade de fitase pode ser medida em uma amostra diretamente, por exemplo, através de ensaios que medem diretamente a atividade de fitase (FTU) pela liberação de fosfato inorgânico. O fosfato inorgânico forma um complexo amarelo com reagente de molibdato-vanadato ácido e o complexo amarelo foi medido em um comprimento de onda de 415 nm em um espectrofotômetro e o fosfato inorgânico foi quantificado com uma curva padrão de fosfato. Uma unidade de fitase (FTU) é a quantidade de enzima que libera 1 micromole de fosfato inorgânico (Pi) a partir de fitato por minuto.

[000205] Além disso, expressão gênica pode ser avaliada por meio de métodos imunológicos, tais como coloração imunohistoquímica de células, seções teciduais ou imunoensaio de meio de cultura tecidual, por exemplo, através de Western blot ou ELISA. Tais imunoensaios podem ser usados para avaliar quantitativa e qualitativamente a expressão de uma fitase. Os detalhes de tais métodos são conhecidos por aqueles versados na técnica e muitos reagentes para a prática de tais métodos estão comercialmente disponíveis.

[000206] Ensaios de atividade de fitase são bem conhecidos na técnica e um exemplo é o ensaio clássico para liberação de fosfato inorgânico desenvolvido por Fiske e SubbaRow, Journal of Biological Chemistry 66: 375-392 (1925). Uma variação desse método é encontrada em Mitchell et al., Microbiol. 143: 245-252 (1997). Um método alternativo é descrito em FOOD CHEMICALS CODEX, 4a Edição, Committee on Food Chemicals Codex, Institute of Medicine, National Academy Press, Washington, DC, 1996 nas páginas 809-810. Cada uma dessas referências é incorporada aqui. Em uma série desses ensaios, colorimetria é, então, realizada usando um espectrofotômetro e comparado com controles de concentração conhecida de fosfato inorgânico (Pi) e/ou controles produzidos através de reações com enzimas tendo atividade de fitase conhecida. Uma unidade de atividade é determinada como a quantidade de amostra de enzima requerida para liberar 1 μmol de Pi por minuto a partir de fitato sob condições de reação definidas. Referência é também feita aos documentos USP 6.221.644 e USP 6.139.902.

[000207] Em algumas modalidades da presente descrição, as variantes de fitase tendo atividade de fitase expressas por um hospedeiro Trichoderma ou Aspergillus serão mais de 1 grama de proteína por litro (g/l), mais de 2 g/l, mais de 5 g/l, mais de 10 g/l, mais de 20 g/l, mais de 25 g/l, mais de 30 g/l, mais de 50 g/l e também mais de 100 g/l de meio de cultura.

[000208] Os polipeptídeos produzidos quando de expressão das sequências de ácido nucleico da presente descrição podem ser recuperados ou isolados da fermentação de cultura de células e substancialmente purificado em uma variedade de formas de acordo com técnicas bem estabelecidas na técnica. Aqueles versados na técnica são capazes de selecionar as técnicas de purificação e isolamento mais apropriadas. A fitase da presente descrição pode ser recuperada do meio de cultura ou de lisatos da célula hospedeira. Se ligada à membrana, ela pode ser liberada da membrana usando uma solução detergente adequada (por exemplo, Triton-X 100) ou através de clivagem enzimática. Células empregadas em expressão de fitase podem ser rompidas através de diversos meios físicos ou químicos, tais como ciclos de congelamento-descongelamento, ultrassom, ruptura mecânica ou agentes de lise celular. Pode ser desejado purificar a fitase de proteínas celulares ou polipeptídeos recombinantes. Os seguintes procedimentos são exemplificativos de procedimentos de purificação adequados: através de fracionamento sobre uma coluna de troca de íons; precipitação de etanol; HPLC de fase reversa; cromatografia sobre sílica ou uma resina de troca de cátions, tal como DEAE; cromatofocalização; SDS-PAGE; precipitação com sulfato de amônio; filtração em gel usando, por exemplo, Sephadex G-75; colunas de proteína A Sepharose para remover contaminantes; e colunas de quelação de metal para ligar formar epítopo-rotuladas da fitase. Vários métodos de purificação de proteína podem ser empregados e tais métodos são conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, em Deutscher, METHODS IN ENZYMOLOGY, 182 (1990); Scopes, PROTEIN PURIFICATION: PRINCIPLES AND PRACTICE, Springer- Verlag, New York (1982). A(s) etapa(s) de purificação selecionada(s) dependerá(ão), por exemplo, da natureza do processo de produção usado e da forma particular de fitase produzida.

[000209] Em geral, uma fitase ou variante de fitase (incluindo a fitase de acordo com SEQ ID NO: 1 ) produzida em culturas de célula é secretada no meio e pode ser purificada ou isolada, por exemplo, mediante remoção de componentes indesejados do meio de cultura de célula. Em alguns casos, a variante de fitase pode ser produzida em uma forma celular requerendo recuperação de um lisato de célula. Em tais casos, a enzima é purificada das células nas quais ela foi produzida usando técnicas rotineiramente empregadas por aqueles versados na técnica. Exemplos incluem, mas não estão limitados a, cromatografia por afinidade (veja, por exemplo, Tilbeurgh et al., (1984) FEBS Lett. 16: 215); métodos de cromatografia de troca de íons (veja por exemplo, Goyal et al., (1991) Biores. Technol. 36: 37; Fliess et al., (1983) Eur. J Appl. Microbiol. Biotechnol. 17: 314; Bhikhabhai et al. (1984) J Appl. Biochem. 6: 336; e Ellouz et al., (1987) Chromatography 396: 307), incluindo troca de íons usando materiais com alto poder de resolução (veja por exemplo, Medve et al., (1998) J Chromatography A 808: 153); cromatografia de interação hidrofóbica (veja por exemplo, Tomaz e Queiroz, (1999) J Chromatography A 865: 123); divisão em duas fases (veja por exemplo, Brumbauer et al., (1999) Bioseparation 7: 287); precipitação de etanol; HPLC de fase reversa; cromatografia sobre sílica ou uma resina de troca de cátions, tal como DEAE; cromatofocalização; SDS-PAGE; precipitação com sulfato de amônio; e/ou filtração em gel usando, por exemplo, Sephadex G-75.

[000210] Em algumas modalidades da presente descrição, células fúngicas expressando variantes de fitase heterólogas são crescidas sob condições de fermentação contínua ou em batelada. Uma fermentação em batelada clássica é um sistema fechado, em que a composição do meio é configurada no início da fermentação e não está sujeita a alterações artificiais durante a fermentação. Assim, no início da fermentação, o meio é inoculado com o(s) organismo(s) desejado. Nesse método, a fermentação é deixada ocorrer sem a adição de quaisquer componentes ao sistema. Tipicamente, uma fermentação em batelada qualifica um "lote" com relação à adição da fonte de carbono e tentativas são feitas, frequentemente, para controlar fatores tais como pH e concentração de oxigênio. O metabólito e composições de biomassa do sistema em batelada mudam constantemente até o momento em que a fermentação é cessada. Dentro de culturas em batelada, as células progridem através de uma fase log estática para uma fase log de alto crescimento e, finalmente, para uma face estacionária onde a taxa de crescimento é diminuída ou impedida. Se não tratadas, as células na fase estacionária eventualmente morrem. Em geral, células na fase log são responsáveis pelo volume de produção de produto final.

[000211] Uma variação do sistema padrão em batelada é o sistema de "fermentação com alimentação em batelada", o qual também encontra uso com a presente descrição. Nessa variação de um sistema em batelada típico, o substrato é adicionado em incrementos à medida que a fermentação progride. Sistemas de alimentação em batelada são úteis quando repressão de catabólito está apta para inibir o metabolismo das células e onde se deseja ter quantidades limitadas de substrato no meio. Medição da concentração de substrato real em sistemas de alimentação em batelada é difícil e, portanto, estimada com base em alterações de fatores mensuráveis, tais como pH, oxigênio dissolvido e a pressão parcial de gases residuais, tal como CO2. Fermentações em batelada e por alimentação em batelada são comuns e bem conhecidas na técnica.

[000212] Fermentação contínua é um sistema aberto onde um meio de fermentação definido é adicionado continuamente a um biorreator e uma quantidade igual de meio condicionado é removida simultaneamente para processamento. Fermentação contínua geralmente mantém as culturas em uma alta densidade constante, onde as células estão primariamente em crescimento de fase log.

[000213] Fermentação contínua permite a modulação de um fator ou qualquer número de fatores que afetam o crescimento celular e/ou concentração de produto final. Por exemplo, em uma modalidade, um nutriente limitativo, tal como a fonte de carbono ou a fonte de nitrogênio, é mantido em uma taxa fixa e todos os outros parâmetros se deixam ser moderados. Em outros sistemas, uma série de fatores que afetam o crescimento pode ser alterada continuamente, enquanto que a concentração celular, medida pela turbidez do meio, é mantida constante. Sistemas contínuos devem manter condições de crescimento em estado uniforme. Assim, perda de células em virtude do meio ser extraído deve ser equilibrada contra a taxa de crescimento celular na fermentação. Métodos de modulação de nutrientes e fatores de crescimento para processos de fermentação contínua, bem como técnicas para maximização da taxa de formação de produto são bem conhecidos na técnica de microbiologia industrial.

[000214] Em uma modalidade da presente descrição, uma composição enzimática é proporcionada compreendendo pelo menos uma fitase de acordo com presente descrição. Composições de acordo com presente descrição podem ser preparadas de acordo com métodos conhecidos na técnica e podem estar na forma de uma composição líquida ou seca.

[000215] Composições líquidas não precisam conter qualquer coisa além da enzima fitase a qual, tipicamente, pode estar em uma forma substancialmente purificada ou pelo menos parcialmente purificada, embora uma forma substancialmente purificada seja frequentemente vantajosa. Um estabilizante, tal como glicerol, sorbitol ou monopropileno glicol pode, frequentemente, ser adicionado. A composição líquida pode também compreender um ou mais aditivos, tais como sais, açúcares, conservantes, agentes para ajuste de pH (isto é, agentes de tamponamento), proteínas ou fitato (um substrato para fitase). Composições líquidas típicas são pastas aquosas ou baseadas em óleo.

[000216] Composições secas podem ser composições secas por pulverização, caso no qual a composição não precisa conter qualquer coisa além da enzima em uma forma seca. Usualmente, contudo, composições secas são os assim denominados granulados, os quais podem ser prontamente misturados, por exemplo, com os componentes do alimento ou ração ou, mais preferivelmente, formam um componente de uma pré-mistura. O tamanho de partícula dos granulados enzimáticos é, de preferência, compatível com aquele dos outros componentes da mistura.

[000217] Em algumas modalidades, uma composição enzimática incluindo uma fitase variante abrangida pela presente descrição será opcionalmente usada em combinação com qualquer uma ou uma combinação das seguintes enzimas - glucoamilases, alfa amilases, proteases, pululanases, isoamilases, celulases, hemicelulases, xilanases, glicotransferases de ciclodextrina, lipases, fitases, lacases, oxidases, esterases, cutinases, pectinases, oxidases de glicose, beta glucosidases, fosfatases, beta-amilase, hidrolases, transferases outras fitases e combinações das mesmas.

[000218] Em algumas modalidades, a composição de fitase é um alimento ou composição de ração para animal. Um alimento ou composição de ração para animal pode compreender uma fitase em uma concentração de 10 a 15.000 U/kg de ração ou alimento (por exemplo, 100 a 5.000 U/kg, 200 - 2.000 U/kg e também 500 - 1000 U /kg). A composição de fitase pode ser usada como um aditivo o qual é ativo no trato digestivo de animais de criação e domésticos, tais como alpaca, bisão, camelo, gado, galinha, ave, chinchila, alce, burro, pato, peixe, rã, cabra, ganso, codorna, cavalo, lhama, marta, mula, ostra, pombo, veado, ovelha, crustáceos, suíno, peru, iaque, búfalo, gato, chimpanzé, cão, furão, gerbil, peixes dourados, porquinho-da-índia, hamster, macaco, periquito, répteis e roedores e animais de criação aquáticos, incluindo peixe e crustáceos, tal como camarão. Quando comparado com a fitase do tipo silvestre de SEQ. ID NO: 1, as variantes de fitase da presente descrição podem conferir resistência aprimorada às proteases encontradas em tais animais ou podem, de outro modo, conferir atividade prolongada nos tratos digestivos de tais animais. A presente descrição considera um método para a produção de um alimento ou ração para animal, caracterizado pelo fato de que fitase de acordo com presente descrição é misturada com o referido alimento ou ração para animal para qualquer um de tais animais. As composições líquidas podem ser adicionadas a um alimento ou ração após uma peletização opcional dos mesmos. Em algumas modalidades, a ração para animal compreenderá um ou mais dos seguintes componentes: a) cereais, tais como pequenos grãos (por exemplo, trigo, cevada, centeio, aveias e combinações dos mesmos) e/ou grãos grandes, tais como milho verde ou sorgo; b) subprodutos de cereais, tais como farelo de glúten de milho, Solúveis de Grão Seco de Destilaria (DDGS), farelo de trigo, fubá de trigo, semolina de trigo, farelo de arroz, cascas de arroz, cascas de aveia, semente de palma e polpa cítrica; c) proteína obtida de fontes tais como soja, girassol, amendoim, lúpulo, ervilhas feijão, algodão, canola, farinha de peixe, proteína plasmática seca, carne e farinha de osso, proteína de batata, soro, copra, gergelim; d) óleos e gorduras obtidas de fontes vegetais e animais; e) minerais e vitaminas; f) suplementos, tais como enzimas, betaína, flavorizantes, óleos essenciais, promotores de crescimento, antibiótico, coccidiostáticos, probióticos e prebióticos.

[000219] Também proporcionado é um método para a redução dos níveis de fósforo em estrume animal, caracterizado pelo fato de que um animal é alimentado com uma ração para animal compreendendo uma variante de fitase de acordo com presente descrição em uma quantidade eficaz na conversão de fitato contido na referida ração para animal.

[000220] Ainda, as composições de fitase abrangidas pela presente descrição podem ser usadas em métodos de hidrólise de amido. A composição de fitase pode ser adicionada durante a etapa de liquefação de amido, a etapa de sacarificação e/ou durante a etapa de fermentação. Alfa-amilases são usadas para decompor ligações 1-4 em amido durante processos industriais de hidrólise de amido usando material vegetal reduzido, tais como grãos triturados, como um estoque de alimentação (por exemplo, em processos de fermentação, levedura e cozimento). Amilases são requeridas para decompor o amido e obtenção de atividade adequada dessas enzimas é, algumas vezes, problemática. Sabe-se há algum tempo que a fitase tem um efeito inibitório sobre as amilases. Portanto, composições enzimáticas compreendendo uma fitase de acordo com presente descrição podem ser usadas em um processo de hidrólise de amido a fim de reduzir o efeito inibitório do fitato sobre a alfa amilase (EP 0 813607B1).

[000221] Fitases, fitato e derivados diversos de fitato de fosfato encontram muitos usos em produtos para cuidados pessoais, produtos médicos e produtos nutricionais, bem como várias aplicações industriais, particularmente nos campos de limpeza, têxtil, litográfico e químico. Vantajosamente, por exemplo, as variantes de fitase de acordo com modalidades da presente descrição podem ser usadas em fermentação de álcool, por exemplo, para a produção de biocombustível.

USO DE FITASES

[000222] Conforme estabelecido acima, a presente invenção refere- se também à produção de fitases conforme descrito aqui.

[000223] Em particular, a presente invenção refere-se também ao uso das sequências de aminoácido, conforme divulgado aqui, na produção de compostos de fosfato orgânico e inorgânico.

[000224] Assim, a presente invenção refere-se ainda ao uso das sequências de nucleotídeo que codificam fitases na geração de vetores ou sistemas de expressão para a expressão das fitases.

[000225] Além disso, a presente invenção refere-se ao uso de tais vetores ou sistemas de expressão na geração de células hospedeiras as quais expressam fitases.

[000226] A invenção refere-se ainda ao uso de células hospedeiras modificadas na geração de precursores de compostos orgânicos e inorgânicos de fosfato ou na geração de compostos de fosfato orgânico específicos.

[000227] Compostos orgânicos e inorgânicos de fosfato incluem pentakis-, tetrakis-, tris-, bis- e monofosfatos de mio-inositol.

[000228] Adequadamente, a invenção, portanto, proporciona um método de produção de um composto de fosfato orgânico compreendendo tratamento de um fitato com uma fitase de acordo com a presente invenção. Adequadamente, o fosfato orgânico é fitato ou todos os possíveis estereoisômeros de di-, tri-, tetra- e pentafosfatos de mio-inositol. Outros fosfatos orgânicos adequados incluem inositol- tetrafosfatos e inositol-oligofosfatos. Em uma modalidade preferida, o método é um processo biotecnológico in vivo.

[000229] Tais métodos para produção de um composto de fosfato orgânico podem, adequadamente, compreender as etapas de:

[000230] fornecimento de uma célula hospedeira que compreende transgenes passíveis de expressão compreendendo a fitase da invenção;

[000231] cultura do organismo transgênica sob condições adequadas para expressão do transgene; e

[000232] recuperação do composto de fosfato orgânico da cultura.

[000233] Os compostos podem ser usados para uma série de aplicações, incluindo em ensaios para a caracterização de fitases. Alguns fosfatos de inositol estão envolvidos, como moléculas sinalizadoras, em regulação intracelular e podem ser usados como produtos químicos de pesquisa.

[000234] Em outro aspecto, é proporcionado um método para a produção de um alimento ou ração para animal. Ração para animal é, tipicamente, produzida em moinhos de ração nos quais as matérias- primas são primeiro trituradas em um tamanho de partícula adequado e, então, misturadas com aditivos apropriados. A ração pode, então, ser produzida como um purê ou pelotas; o último envolve, tipicamente, um método pelo qual a temperatura é elevada para um nível-alvo e, então, a ração é passada através de uma matriz para produzir pelotas de um tamanho em particular. Subsequentemente, aditivos líquidos, tais como gordura e enzima, podem ser adicionados. As pelotas são deixadas esfriar antes de transporte. Produção de ração para animal pode também envolver uma etapa adicional que inclui extrusão ou expansão antes de peletização - em particular através de técnicas adequadas que podem incluir pelo menos o uso de vapor.

[000235] Consequentemente, a invenção ainda proporciona o uso de uma sequência de aminoácido que codifica uma fitase ou uma célula hospedeira que expressa uma fitase para produzir uma fitase para uso na fabricação de um produto alimentício ou ração. Em um aspecto, é proporcionado o uso de uma sequência de aminoácido, conforme descrito aqui, na fabricação de um produto alimentício ou ração. Em outro aspecto, é proporcionado o uso de uma célula hospedeira, de acordo com a invenção, na fabricação de um produto alimentício ou ração. Em outro aspecto, é proporcionado o uso de um vetor ou sistema de expressão, de acordo com a invenção, na fabricação de um produto alimentício ou ração.

[000236] A presente invenção também abrange o uso das enzimas como um componente de combinações de ração com outros componentes a serem fornecidos a animais.

COMBINAÇÃO COM OUTROS COMPONENTES

[000237] As enzimas da presente invenção podem ser usadas em combinação com outros componentes ou veículos. Exemplos de outros componentes já foram fornecidos aqui. Esses e outros componentes adicionais são agora discutidos.

[000238] Veículos adequados para enzimas para ração incluem trigo (grosseiramente triturado). Além disso, há uma série de técnicas de encapsulação, incluindo aquelas baseadas em revestimento com cera/gordura, adição de gomas vegetais, etc.

[000239] Exemplos de outros componentes incluem um ou mais de: espessantes, agentes de gelificação, emulsificantes, aglutinantes, modificadores de cristal, adoçantes (incluindo adoçantes artificiais), modificadores de reologia, estabilizantes, anti-oxidantes, corantes, enzimas, veículos, carreadores, excipientes diluentes, agentes de lubrificação, agentes de flavorização, matéria colorante, agentes de suspensão, desintegrantes, aglutinantes de granulação, etc. Esses outros componentes podem ser naturais. Esses outros componentes podem ser preparados usando técnicas químicas e/ou enzimáticas.

[000240] Conforme usado aqui, o termo "espessante" ou "agente de gelificação", conforme usado aqui, refere-se a um produto que impede separação diminuindo ou impedindo o movimento de partículas, seja gotículas de líquidos imiscíveis, ar ou sólidos insolúveis.

[000241] O termo "estabilizante", conforme usado aqui, é definido como um ingrediente ou combinação de ingredientes que impede um produto (por exemplo, um produto alimento) de mudar com o tempo.

[000242] O termo "emulsificante", conforme usado aqui, refere-se a um ingrediente (por exemplo, um ingrediente para produto alimentício) que impede a separação de emulsões.

[000243] Conforme usado aqui, o termo "aglutinante" refere-se a um ingrediente (por exemplo, um ingrediente alimentício) que mantém o produto unido através de uma reação física ou química.

[000244] O termo "modificador de cristal", conforme usado aqui, refere-se a um ingrediente (por exemplo, um ingrediente alimentício) que afeta a cristalização de gordura ou água.

[000245] "Carreadores" ou "veículos" significa materiais adequados para administração de compostos e incluem qualquer material conhecido na técnica tal como, por exemplo, qualquer líquido, gel, solvente, diluente líquido, solubilizante ou semelhante, o qual é não tóxico e o qual não interage com quaisquer componentes da composição de uma maneira prejudicial.

[000246] Exemplos de carreadores nutricionalmente aceitáveis incluem, por exemplo, grão, água, soluções salinas, álcool, silicone, ceras, geléia de petróleo, óleos vegetais e semelhantes.

[000247] Exemplos de excipientes incluem uma ou mais de: celulose microcristalina e outras celuloses, lactose, citrato de sódio, carbonato de cálcio, fosfato de cálcio dibásico, glicina, amido, açúcar de leite e polietileno glicóis de alto peso molecular.

[000248] Exemplos de desintegrantes incluem um ou mais de: amido (de preferência amido de milho, batata ou tapioca), amido glicolato de sódio, croscarmelose de sódio e determinados silicatos complexos.

[000249] Exemplos de aglutinantes de granulação incluem um ou mais de: polivinilpirrolidona, hidroxipropil metil celulose (HPMC), hidroxipropil celulose (HPC), sacarose, maltose, gelatina e acácia.

[000250] Exemplos de agentes de lubrificação incluem um ou mais de: estearato de magnésio, ácido esteárico, beenato de glicerila e talco.

[000251] Exemplos de diluentes incluem um ou mais de: água, etanol, propileno glicol e glicerina e combinações dos mesmos.

[000252] Os outros componentes podem ser usados simultaneamente (por exemplo, quando eles estão em mistura ou mesmo quando eles são distribuídos através de vias diferentes) ou sequencialmente (por exemplo, eles podem ser distribuídos através de vias diferentes).

[000253] Conforme usado aqui, o termo "componente adequado para consumo por um ser humano ou animal" significa um composto o qual é ou pode ser adicionado a uma composição da presente invenção como um suplemento o qual pode ser de benefício nutricional, um substituto de fibra ou tem um efeito geralmente benefício para o consumidor.

[000254] À guisa de exemplo, os componentes podem ser prebióticos, tais como alginato, xantana, pectina, goma de semente de alfarroba (Locust Bean Gum - LBG), inulina, goma guar, galacto-oligossacarídeo (GOS), fruto-oligossacarídeo (FOS), lacto-sacarose, oligossacarídeos de soja, palatinose, isomalto-oligossacarídeos, gluco-oligossacarídeos e xilo-oligossacarídeos.

SUBSTÂNCIA ALIMENTÍCIA OU DE RAÇÃO

[000255] Os compostos podem ser usados como - ou no preparo de - uma substância alimentícia ou de ração. Aqui, o termo "alimentício" é usado em um sentido amplo - e abrange alimento e produtos alimentícios para seres humanos, bem como alimentos para animais (isto é, uma ração). O termo "ração" é usado com referência a produtos que são alimentados a animais na criação dos mesmos. Em um aspecto preferido, o alimento ou ração é para consumo por animais monogástricos, tais como porco, ave e peixe.

[000256] O alimento ou ração pode estar na forma de uma solução ou como um sólido - dependendo do uso e/ou do modo de aplicação e/ou do modo de administração.

INGREDIENTES E SUPLEMENTOS ALIMENTÍCIOS E PARA RAÇÃO

[000257] Os compostos podem ser usados como um ingrediente alimentício ou para ração.

[000258] Conforme usado aqui, o termo "ingrediente alimentício ou para ração" inclui uma formulação a qual é ou pode ser adicionada a alimentos ou gêneros alimentícios e inclui formulações as quais podem ser usadas em baixos níveis em uma ampla variedade de produtos.

[000259] O ingrediente alimentício pode estar na forma de uma solução ou como um sólido - dependendo do uso e/ou do modo de aplicação e/ou modo de administração.

[000260] Os compostos podem ser - ou podem ser adicionados a - suplementos alimentícios.

COMPOSIÇÕES ALIMENTÍCIAS E DE RAÇÃO

[000261] Composições de ração para animais monogástricos incluem, tipicamente, composições compreendendo produtos de planta os quais contêm fitato. Tais composições incluem rações baseadas em farinha de milho, farelo de soja, farelo de colza, farelo de semente de algodão, milho verde, trigo, cevada e sorgo.

[000262] As fitases descritas aqui podem ser - ou podem ser adicionadas a - substâncias e composições alimentícias ou de ração.

[000263] A presente invenção também proporciona um método de preparo de um ingrediente ou suplemento alimentício ou para ração, o método compreendendo mistura de fitases produzidas por meio do processo da presente invenção ou da composição de acordo com a presente invenção com outro ingrediente alimentício. O método para preparo de um ingrediente alimentício é também outro aspecto da presente invenção. Métodos para preparo de ração para animal são apresentados acima. A enzima pode ser adicionada também na forma de uma formulação sólida ou como um aditivo para ração, tal como uma pré-mistura. Uma forma sólida é, tipicamente, adicionada antes ou durante a etapa de mistura; e uma forma líquida é, tipicamente, adicionada após a etapa de peletização.

FORMAS

[000264] O produto e/ou os compostos da presente invenção podem ser usados em qualquer forma adequada - seja quando sozinhos ou quando presentes em uma composição. Da mesma forma, as fitases produzidas de acordo com a presente invenção (isto é, ingredientes - tais como ingredientes alimentícios, ingredientes alimentícios funcionais ou ingredientes farmacêuticos) podem ser usadas em qualquer forma adequada.

[000265] Exemplos adequados de formas incluem um ou mais de: comprimidos, pílulas, cápsulas, óvulos, soluções ou suspensões, os quais podem conter agentes de flavorização ou coloração, para aplicações de liberação imediata, retardada, modificada, sustentada, pulsada ou controlada.

[000266] À guisa de exemplo, se o produto e/ou a composição são usados na forma de tablete - tal como para uso como um ingrediente funcional - os tabletes podem também conter um ou mais de: excipientes, desintegrantes, aglutinantes de granulação ou agentes de lubrificação.

[000267] Exemplos de veículos nutricionalmente aceitáveis para uso no preparo das formas incluem, por exemplo, água, soluções salinas, álcool, silicone, cera, geléia de petróleo e semelhantes.

[000268] Excipientes preferidos para as formas incluem lactose, amido, uma celulose, açúcar de leite ou polietileno glicóis de alto peso molecular.

[000269] Para suspensões aquosas e/ou elixires, os compostos de clivagem de fitase podem ser combinados com vários agentes adoçantes ou flavorizantes, matéria de coloração ou corantes, com agentes de emulsificação e/ou suspensão e com diluentes, tais como água, etanol, propileno glicol e glicerina e combinações dos mesmos.

[000270] As formas podem também incluir cápsulas de gelatina; cápsulas de fibra, tabletes de fibra, etc.

[000271] Os exemplos a seguir são fornecidos para fins ilustrativos apenas e não se destinam a limitar o escopo da presente descrição de qualquer forma.

Métodos e Exemplos Nomenclatura para enzima, conforme usado nos Exemplos

[000272] Fitase BP-17 (algumas vezes referida como BP 17) - a qual é a fitase descrita no Pedido PCT WO 2008/097619 e pode ser obtida da Danisco S/A. A sequência de aminoácido é descrita aqui como SEQ ID NO:5.

[000273] BP-110 (algumas vezes referida como BP 17 var. 110 ou algumas vezes ela é referida como BP17-110 ou BP17 110) - a qual é a fitase de acordo com a presente invenção e pode ser obtida da Danisco S/A. A sequência de aminoácido é descrita aqui como SEQ ID NO:6.

[000274] BP-111 (algumas vezes referida como BP 17 var. 111 ou algumas vezes ela é referida como BP17-111 ou BP17 111) - a qual é a fitase de acordo com a presente invenção e pode ser obtida da Danisco S/A. A sequência de aminoácido é descrita aqui como SEQ ID NO:7.

[000275] BP-112 (algumas vezes referida como BP 17 var. 112 ou algumas vezes ela é referida como BP17-112 ou BP17 112) - a qual é a fitase de acordo com a presente invenção e pode ser obtida da Danisco S/A. A sequência de aminoácido é descrita aqui como SEQ ID NO:2.

[000276] As sequências de aminoácido para BP-17 (SEQ ID NO: 5), BP-110 (SEQ ID NO:6), BP-111 (SEQ ID NO:7) e BP-112 (SEQ ID NO:2) são apresentadas na figura 5. A sequência de aminoácido de BP- 112 é também mostrada na figura 2. A sequência de ácido nucleico de BP-112 é mostrada na figura 4 como SEQ ID NO:4.

[000277] Phyzyme XP - a qual é uma fitase da Danisco S/A

[000278] Natuphos - a qual é uma fitase da BASF.

[000279] Ronozyme P - a qual é uma fitase da Novozymes.

[000280] PARTE A

Exemplo 1. Purificação de enzimas fitase

[000281] Purificação de enzimas fitase foi realizada usando uma 6His- tag N-terminalmente fundida às enzimas fitase. B. subtilis, transformado com um plasmídeo que codifica a enzima fitase 6His-direcionado, foi cultivada em frascos de agitação a 37°C e 160 rpm usando meio LB padrão com a adição de 20 mg/l de Neomicina. Nesse estágio, o meio de cultura acumulou uma quantidade significativa de atividade de fitase. Cerca de 2 l do caldo de cultura foram ajustados para um pH de 8,0, filtrados e aplicados a uma coluna acondicionada com 10 ml de resina de Sepharose Ni-NTA (Qiagen). A coluna foi lavada com tampão de Tris-HCl a 50 mM, NaCl a 300 mM, pH de 8,0 até que a OD280 caísse abaixo de 0,05. Subsequentemente, a fitase ligada foi eluída com o mesmo tampão contendo hidrocloreto de imidazola a 250 mM. O eluato foi submetido à diálise contra tampão de acetato de sódio a 50 mM, pH de 5,0 e armazenado a 4°C. A solução enzimática foi, então, aplicada a uma coluna Resource S equilibrada com tampão de acetato de sódio a 20 mM, pH de 5,0 e a eluição foi realizada usando um gradiente de sal de NaCl a 0,1 M sobre 10 volumes de coluna. Opcionalmente, o eluato foi submetido à diálise contra tampão de acetato de sódio a 20 mM, pH de 5,0 antes de armazenamento a 4°C.

Exemplo 2. Ensaio de atividade de fitase

[000282] Ensaios de fitase foram realizados em lâminas de microtitulação. A reação tinha um volume total de 100 microlitros contendo tampão, conforme descrito abaixo, fitato a 10 mM, cloreto de cálcio a 1 mM e Pluronic F68 a 0,05 % (peso/v). A reação foi deixada processar durante 30 minutos em uma determinada temperatura, por exemplo, entre 37°C e 90°C.

[000283] A liberação de fosfato a partir de fitato, como uma medida da atividade de fitase, foi avaliada mediante incubação de alíquotas das amostras (tipicamente 5 μl) em um volume total de 50 μl de ensaio de detecção de fosfato durante 1h a 37°C. O ensaio continha os seguintes compostos nas concentrações finais fornecidas: Tris/HCl a 1 M, pH de 7,0, Triton X-100 a 0,01% (v/v), ADHP a 0,025 mM (MoBiTec, Gottingen, Alemanha), 0,2 U/ml de maltosefosforilase, maltose a 0,25 mM, 1,25 U/ml de oxidase de glicose, 0,25 U/ml de peroxidase de rábano, EDTA a 1 mM, 0,35 mg/ml de BSA. A reação foi cessada mediante a adição de 30 μl de catalase a 2700 U/ml em H2O. Subsequentemente, a fluorescência a 595 nm foi medida, usando 535 nm como comprimento de onda de excitação. A quantidade de fosfato foi determinada usando uma curva de calibração com soluções de fosfato de concentrações conhecidas. Uma unidade enzimática é definida como a liberação de um micromole de fosfato por minuto.

[000284] Para ensaio da atividade de fitase em diferentes valores de pH, os seguintes tampões foram usados: glicina/HCl a 200 mM de um pH de 2,0 a um pH de 3,5 e acetato de sódio/ácido acético a 100 mM entre um pH de 4,0 e um pH de 5,5.

Exemplo 3. Atividade específica

[000285] A atividade específica de enzimas BP-WT e fitases variantes foi estimada usando as enzimas purificadas de acordo com o Exemplo 1.

[000286] A atividade de fitase foi determinada em lâminas de microtitulação usando um ensaio enzimático acoplado: preparados de enzima foram diluídos em tampão de diluição (acetato de sódio a 50 mM, Pluronic F-68 a 0,05%, 1 mg/ml de BSA). Uma alíquota da solução enzimática, tipicamente 5 μl a 10 μl, foi incubada no ensaio de fitato com um volume total de 80 μl. O ensaio contém os seguintes tampões, substratos e sais nas concentrações finais fornecidas: acetato de sódio a 200 mM, pH de 5,5, fitato a 10 mM, CaCl2 a 1 mM, Pluronic F-68 a 0,05% (peso/v)). Os ensaios foram incubados durante 30 min a 37°C no caso da fitase BP-WT e durante 30 min a 67°C ou 80°C no caso das enzimas fitase variantes.

[000287] A liberação de fosfato a partir de fitato, como uma medida da atividade de fitase, foi avaliada mediante incubação de alíquotas das amostras (tipicamente 5 μl) em um volume total de 50 μl de ensaio de detecção de fosfato durante 1h a 37°C. O ensaio continha os seguintes compostos nas concentrações finais fornecidas: Tris/HCl a 1 M, pH de 7,0, Triton X-100 a 0,01% (v/v), ADHP a 0,025 mM (MoBiTec, Gottingen, Alemanha), 0,2 U/ml de maltosefosforilase, maltose a 0,25 mM, 1,25 U/ml de oxidase de glicose, 0,25 U/ml de peroxidase de rábano, EDTA a 1 mM, 0,35 mg/ml de BSA. A reação foi cessada mediante a adição de 30 μl de catalase a 2700 U/ml em H2O. Subsequentemente, a fluorescência a 595 nm foi medida, usando 535 nm como comprimento de onda de excitação. A quantidade de fosfato foi determinada usando uma curva de calibração com soluções de fosfato de concentrações conhecidas. Uma unidade enzimática é definida como a liberação de um micromole de fosfato por minuto.

[000288] A concentração de fitase foi calculada a partir da absorbância dos preparados a 280 nm e do respectivo coeficiente de extinção para cada uma das variantes de fitase. Os coeficientes de extinção foram calculados com base na composição de aminoácido das proteínas de acordo com um método fornecido por Gill e von Hippel, Analytical Biochemistry 182: 319-326 (1989).

[000289] Tabela 1: Atividade específica de variantes de fitase de acordo com BP-WT, Seq ID No. 1. A atividade específica das enzimas fitase variantes foi determinada a 67°C e 80°C, conforme descrito acima. A enzima BP-WT tem uma atividade específica de 1021 U/mg a 37°C sob as condições descritas acima.

Exemplo 4. Geração e caracterização de variantes de fitase

[000290] Variantes de fitase foram geradas usando diferentes métodos para a mutagênese do DNA que codifica as proteínas fitase, tais como cassetes ou mutagênese por PCR ou outros métodos de mutagênese bem conhecidos na técnica. Esses métodos compreendem aqueles listados acima, tais como os métodos divulgados em Morinaga et al., Biotechnology 2: 646-649 (1984); em Nelson e Long, Analytical Biochemistry 180: 147-151(1989); ou o protocolo de Mutagênese por Limiar de Erro descrito no documento WO 92/18645. Para PCR mutagênica, outro método adequado é divulgado por Cadwell e Joyce, PCR Methods Appl. 3: 136-140(1994).

[000291] Variantes de fitase foram heterologamente expressas em um ou mais dos seguintes hospedeiros de expressão: Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis, Escherichia coli.

Exemplo 5. Estabilidade térmica

[000292] A estabilidade térmica de variantes de fitase foi caracterizada por sua temperatura de inativação. A temperatura de inativação foi determinada pela atividade residual das enzimas fitase após incubação durante 10 min em diferentes temperaturas, pH de 5,5 e subsequente incubação a 37°C durante 60 min. As atividades residuais foram determinadas medindo as atividades de fitase durante 60 min em um pH de 3,5 e 37°C. A temperatura de inativação é definida como a temperatura na qual a atividade residual é de 50% comparado com a atividade residual após incubação durante o mesmo período sob as mesmas condições em temperatura ambiente. Onde extrapolações e interpolações apropriadas a partir de dados de atividade foram feitos de forma a determinar a temperatura correspondendo à 50% de atividade residual. Diferenças de estabilidade térmica (TD), em [°C], foram calculadas subtraindo as temperaturas de inativação das duas enzimas uma da outra.

[000293] Tabela 2: Estabilidade térmica de variantes de fitase de acordo com BT-WT, Seq ID No. 1. Aprimoramentos na estabilidade térmica são apresentados como diferenças de estabilidade térmica TD entre a enzima fitase variante e do tipo silvestre (BP-WT), isto é, TD = (temperatura de inativação da fitase variante) - (temperatura de inativação de BP-WT).

Exemplo 6. Atividade térmica

[000294] A atividade térmica de variantes de fitase foi caracterizada por seu perfil de temperatura-atividade. Como uma medida do perfil de temperatura-atividade, o valor T50 foi definido, no qual a renovação enzimática total do substrato é de 50% comparado com a renovação enzimática da reação operando essencialmente sob as mesmas condições, mas na temperatura ótima da variante de fitase. Os perfis de temperatura-atividade foram determinados mediante incubação das enzimas fitase em um pH de 5,5 e várias temperaturas sob condições ainda descritas no Exemplo 2. Os valores T50 foram determinados mediante interpolações e extrapolações apropriadas a partir dos dados experimentais. As diferenças de atividade térmica (TAD), em [°C], foram calculadas subtraindo os valores T50 das duas enzimas um do outro.

[000295] Tabela 3: Diferenças de atividade térmica (TAD) de variantes de fitase de acordo com BT-WT, Seq ID No: 1. Aprimoramentos na atividade térmica são fornecidos como diferenças T50 entre a enzima fitase variante e do tipo silvestre (BP-WT), isto é, TAD = T50(fitase variante) - T50(BP-WT).

Exemplo 7 - Visão geral de propriedades de variantes de fitase

[000296] A Tabela 4 resume as propriedades atividade específica, estabilidade térmica e atividade térmica de variantes de fitase que foram apresentadas anteriormente nos Exemplos 3, 5 e 6.

[000297] Tabela 4: Atividade específica, estabilidade térmica e atividade térmica de diferentes variantes de fitase de acordo com BT- WT, Seq ID No: 1. Valores para atividades específicas, estabilidade térmica (TD) e atividade térmica (TAD) foram derivados conforme descrito no Exemplo 3, Exemplo 5 e Exemplo 6, respectivamente.

PARTE B Exemplo 8 - Introdução

[000298] A presente invenção é vantajosa, uma vez que ela proporciona novas fitases que têm propriedades que tornam as mesmas particularmente úteis e eficientes como enzimas para ração. Em particular, a invenção refere-se a novos polipeptídeos de fitase isolados e/ou purificados conforme descrito aqui ou um fragmento funcional ou variantes ou formas modificadas das mesmas ou forma modificada das mesmas. A invenção também proporciona a sequência de ácido nucleico que codifica a referida fitase.

[000299] Para ser eficiente como uma enzima aditiva a um alimento ou ração para animal, a fitase tem de combinar uma série de diferentes propriedades. De forma a ser capaz de degradar o ácido fítico no ambiente ácido do estômago de um animal, ela tem ser ativa em baixo pH, de preferência sobre uma ampla faixa de valores de pH. Além disso, ela tem de ter alta atividade específica e, de preferência, alta termoestabilidade para permitir que a proteína suporte altas temperaturas comumente usadas no preparo de gêneros alimentícios, tais como pelotas de ração.

[000300] Também é importante que a enzima tenha ampla especificidade de substrato, permitindo que a mesma hidrólise não apenas o fitato, mas também produtos intermediários da degradação de fitase, tais como pentafosfatos, tetrafosfatos e trifosfatos de inositol. Estudos sobre degradação de fitase em porcos mostraram que esses oligofosfatos de inositol permanecem, de outro modo, grandemente insolúveis nos intestinos grosso e delgado e, assim, inacessíveis às fosfatases alcalinas produzidas pela microflora intestinal do animal. Variações nos perfis de especificidade de substrato de diferentes enzimas foram identificadas. Por exemplo, inositol-trifosfatos gerados pela fitase de B. subtilis são essencialmente resistentes à hidrólise adicional por essa enzima.

[000301] Adequadamente, essas variantes mostram características aprimoradas com relação a qualquer um dos seguintes: estabilidade à temperatura, faixa de pH, estabilidade à pepsina, atividade específica, especificidade de substrato e especificidade de substrato mais ampla. Métodos adequados para determinação dessas características são divulgados aqui.

[000302] Em particular, os aprimoramentos nas características de fitase são dirigidos à estabilidade enzimática sob condições de processamento de alimento e ração, à estabilidade enzimática durante trânsito no estômago e à atividade e estabilidade enzimáticas no estômato e/ou trato intestinal de um ser humano ou animal, tornando as variantes aprimoradas particularmente adequadas para uso como suplementos para ração. Assim, tais aprimoramentos compreendem, dentre outros parâmetros, o aumento na estabilidade em temperaturas elevadas, de preferência em temperaturas acima de 65°C, o aumento na estabilidade contra digestão proteolítica, de preferência protease do trato digestivo, tal como pepsina, o aumento na atividade catalítica em baixo pH, de preferência atividade catalítica abaixo de um pH de 5,5 e a eficiência geral de liberação de grupos fosfato a partir de fitato e, de preferência, de fosfatos de inositol.

[000303] Aprimoramentos nas características da fitase de acordo com a presente invenção são dirigidos ao uso em processamento de alimento e ração, bem como ao uso como um aditivo de produtos alimentícios e ração. Em particular, os aprimoramentos são dirigidos à estabilidade sob condições de processamento de alimento e ração, à estabilidade durante trânsito no estômago e à atividade e estabilidade no estômago e/ou trato intestinal de um ser humano ou animal. Tais aprimoramentos compreendem dentre outros parâmetros, o aumento na estabilidade em temperaturas elevadas, de preferência em temperaturas acima de 65°C, o aumento na estabilidade contra digestão proteolítica, de preferência protease do trato digestivo, o aumento na atividade catalítica em baixo pH, de preferência atividade catalítica abaixo de um pH de 5,5 e a eficiência geral de liberação de grupos fosfato a partir de fitato.

[000304] O aumento na estabilidade em temperaturas elevadas é quantificado pela temperatura de inativação da enzima. A temperatura de inativação é definida como a temperatura na qual a atividade residual de uma enzima fitase após incubação durante um determinado período e subsequente resfriamento para a temperatura ambiente é de 50% da atividade residual da mesma enzima fitase incubada durante o mesmo período de tempo sob as mesmas condições em temperatura ambiente. Diferenças de termoestabilidade são as diferenças, em °C, entre as temperaturas de inativação das duas enzimas.

Exemplo 9. Estabilidade à pepsina

[000305] Resistência à pepsina em um pH de 2 de fitases de Buttiauxella, as variantes BP-17, BP-110, BP-111 e BP-112, comparado com Phyzyme XP, Natuphos e Ronozyme P

MATERIAIS E MÉTODOS Tampões:

[000306] Tampão de incubação de pepsina: glicina-HCl a 0,1 M, pH de 2,0, 3 mg/ml de BSA, 2,9 mg de cloreto de sódio anidro/mL, 0,73 mg de cloreto de cálcio/mL. Para soluções com pepsina, o tampão de incubação é preparado para conter 500, 1000, 3000, 6000 ou 10000 U/ml de pepsina (Sigma P-7000, 10000 U/mg corresponde a 27 mg/ml), respectivamente. Uma unidade de pepsina é definida como a quantidade de enzima que produzirá uma ΔOD280 de 0,001 por min em um pH de 2,0 a 37°C, medida como produtos solúveis em TCA usando hemoglobina como substrato (Food Chemical Codex).

[000307] Tampão de ensaio de fitase: tampão de acetato a 250 mM, pH de 5,5

[000308] Tampão de ensaio de fitase com BSA: tampão de acetato a 250 mM, pH de 5,5, com 3 mg/ml de BSA Resistência contra concentração crescente de pepsina:

[000309] As configurações para todas as enzimas foram as mesmas: Seis amostras com enzima foram preparadas (em duplicata): quatro amostras com quantidade crescente de pepsina em tampão (pH de 2), uma amostra sem pepsina, mas em tampão de incubação (pH de 2) e uma amostra de controle positivo com enzima em tampão de ensaio com BSA (pH de 5,5).

[000310] Para cada amostra, 900 μl de tampão de incubação sem ou com quantidades crescentes de pepsina ou 900 μl de tampão de ensaio foram misturados com 100 μl de solução enzimática, seguido por incubação a 40°C. Após 120 min de incubação, 100 μl foram extraídos e misturados com 900 μl de tampão de ensaio. As amostras foram imediatamente analisadas com relação à fitase em um pH de 5,5 contra uma curva padrão de fosfato, conforme descrito pela ISO Draft International Standard ISO/DIS 30024. Resultados Resistência à Pepsina

[000311] As variantes de Buttiauxella mostraram todas excelente estabilidade com relação à pepsina em um pH de 2. Em contraste, a atividade de Natuphos foi reduzida dramaticamente já em uma concentração de pepsina de 500 U/ml, com atividade adicionalmente reduzida encontrada em um platô de recuperação de cerca de 45% em uma concentração de pepsina de 3000 U/ml. A recuperação de Ronozyme P foi ainda pior, com uma redução na recuperação de menos de 20% em uma concentração de pepsina de apenas 500 U/mg (Fig 6A & Tabela 4).

[000312] A figura 6 mostra a resistência das fitases originárias de Buttiauxella, as variantes BP-17, BP-110, BP-111 e BP-112 e da Phyzyme XP, Natuphos e Ronozyme P contra concentrações crescentes de pepsina. Os dados são com relação à incubação em um pH de 2 sem pepsina. A: todos os pontos de dados, B: mesmos dados, mas mostrando apenas uma recuperação de mais de 70%. Tabela 5. Mesmos dados conforme apresentado na figura 6

[000313] Existem ligeiras diferenças entre as variantes de Buttiauxella, onde a variante BP-17 var.110 mostra melhor estabilidade, tendo 95% de atividade restante após duas horas de incubação na maior concentração de pepsina, 10000 U/mL (figura 6B). Em comparação, BP-17 mostrou uma recuperação em torno de 85% após duas horas de incubação.

[000314] As fitases de Buttiauxella também mostrara excelente estabilidade ao ácido. Comparação com a atividade medida em um pH de 5,5 após duas horas de incubação em um pH de 2 ou pH de 5,5 mostrou que todas as quatro fitases de Buttiauxella não perdem atividade durante a incubação de 2 horas em um pH de 2, enquanto que Phyzyme XP, Natuphos e a nova Ronozyme P mostraram redução leve a significativa na atividade (Tabela 6).

[000315] Tabela 6. A atividade medida em um pH de 5,5 após incubação em um tampão em um pH de 2 ou pH de 5,5 durante duas horas. Os números são com relação à atividade das amostras incubadas em um pH de 5,5.

Sumário de Dados

[000316] As variantes de fitase de Buttiauxella de acordo com a presente invenção mostram uma recuperação de mais de 75% após 2 horas de incubação em um pH de 2, 37°C, 10000 U/ml de pepsina comparado com a atividade da amostra incubada sob a mesma condição, mas sem pepsina presente.

Exemplo 10. Recuperação de atividade enzimática Avaliação de recuperação de atividade enzimática MATERIAIS E MÉTODOS

[000317] Aqui, avaliou-se a recuperação de atividade enzimática após peletização da enzima formulada em trigo. A enzima é pulverizada sobre trigo granulado e seca antes da mistura com a ração, seguido pelo processo de peletização.

[000318] Enzimas líquidas foram formuladas sobre trigo integral triturado e secas para um teor de matéria seca de aproximadamente 90%. A inativação de enzimas durante estresse térmico no processo de peletização foi testada usando uma unidade de peletização no Technological Institute em Kolding (esquematicamente apresentada na figura 7). A amostra de teste é adicionada a 10 kg de pré-mistura e misturada durante 10 min. Então, 10 kg de pré-mistura foram adicionados a 150 kg de ração (grande misturador horizontal) e misturados durante 15 min. antes de condicionamento/vaporização. A ração é tratada 30 seg. a 90°C/95°C antes de peletização. A temperatura é medida na saída do misturador em cascata. Imediatamente após deixar a prensa de peletização, as pelotas são esfriadas para a temperatura ambiente.

[000319] A atividade de fitase foi medida de acordo com a metodologia mencionada no Exemplo 10.

[000320] A atividade de fitase é de 5 unidades por gm na ração amassada antes de peletização.

RESULTADOS

[000321] Os resultados são apresentados nas figuras 8 a 10.

[000322] Na figura 8, os resultados de experimentos de peletização de três Fitases B variantes de acordo com a presente invenção são divulgados. As enzimas foram formuladas sobre trigo integral triturado e secas para um teor de água de aproximadamente 10%. Aqui, a recuperação de atividade de fitase após peletização para a var 111 de BP 17 é de 90% a 90°C comparado com uma recuperação de 19% a 90°C para a BP 17.

[000323] Como referência, a Phyzyme XP, uma fitase de E. coli, foi formulada sobre trigo integral triturado. Os resultados são mostrados na figura 9. Aqui, a recuperação de atividade de fitase após ser peletizada a 90°C a partir de três lotes de Phyzyme XP formulada sobre trigo integral triturado é de 47%.

[000324] Ronozyme também foi testada. O produto é vendido em uma versão revestida para proteger a enzima do calor no processo de peletização. Nesse experimento, a fitase foi extraída do produto revestido e formulada sobre trigo integral triturado para estudar a termoestabilidade da molécula de fitase sem proteção. Os resultados são mostrados na figura 10.

Sumário de Dados

[000325] As variantes de fitase de Buttiauxella da presente invenção formuladas sobre trigo mostram uma recuperação de mais 70% após serem peletizadas a 90°C.

Exemplo 11. Degradação de ácido fítico Resultados de um estudo de degradação de ácido fítico pela fitase Soluções

[000326] Três diferentes tampões foram usados nas incubações. Elas eram como segue:

[000327] Acetato a 250 mM, pH de 5,5;

[000328] Acetato a 250 mM, pH de 3,5; e

[000329] Glicina HCl a 250 mM, pH de 2,5.

[000330] Todas as fitases usadas nas incubações foram diluídas em tampão de ensaio para um nível de enzima de 1 U/ml.

[000331] A solução substrato de fitato usada na incubação é Fitato a 1% (1 g/100 ml de tampão).

[000332] O substrato é preparado no mesmo tampão conforme usado para a diluição de fitases a fim de manter o nível de pH constante na reação.

[000333] A reação é terminada por HCl a 1M.

Incubação

[000334] Os volumes de incubação são: 1,5 ou 3,0 ml de Fitato + 0,25 ml de enzima + 3,25 ou 1,75 ml de tampão a 37°C, um volume total de 5,0 ml.

[000335] Sub-amostras de 0,5 ml são tomadas em diferentes pontos de tempo (0,30, 60 e 90 min).

[000336] Um tubo de Eppendorf é preparado com a 0,2 ml de HCl a 1M para cada sub-amostra antes da sub-amostragem. Misturando a sub-amostra da incubação com HCl, a reação enzimática é terminada. Cada subamostra de 0,7 ml é armazenada a 4°C até análise por HPLC. Método de HPLC

[000337] Análise de isômeros de fitato e inositol é através de cromatografia de íons de alto desempenho (High Performance Ion Chromatography - HPIC). Esse método foi descrito por Skoglund e Carlsson et al. (J. Agric. Food Chem., 45(1997), 451-436, J. Agric. Food Chem., 46 (1998), 1877-1882; e J. Agric. Food Chem., 49 (2001), 11695-1701. A coluna usada foi um permutador forte de ânions (4 x 250 mm) da Dionex com uma pré-coluna de 4 x 50 mm. Solvente A, água MilliQ, Solvente B, HCl a 1N preparado em água. O gradiente é de 2,5% a 49% de B em 30 min, seguido por 3 min de isocrático a 50% e 2 min de isocrático a 2,5% em um fluxo de 0,8 ml/min. Cada operação dura 35 min. É possível reduzir a operação para um total de 25 min, uma vez que a fitase não produz muitos isômeros de IP teoricamente possíveis. O eluente foi derivatizado em paralelo com uma solução aquosa contendo Fe(NO3)3 . 9HO2 a 0,1% e ácido perclórico a 2% (HClO4) em um fluxo de 0,4 ml/min. Isômeros de fitato e IP foram detectados a 290 nm como um pico positivo. Isso é em virtude da formação do complexo de fitato-Fe3+-ClO4-. Uma solução de ácido perclórico a 60% foi adquirida da Sigma. Resultados

[000338] Os resultados são apresentados nas figuras 11-14. Sumário de Dados

[000339] Todas as enzimas da presente invenção mostram características favoráveis.

[000340] As fitases da presente invenção decompõem o fitato em todos os níveis de pH testados.

[000341] As enzimas da presente invenção são muito ativas em um pH de 5,5.

[000342] BP 110 e BP 111 mostram atividade similar em um pH de 2,5 e 3,5.

[000343] BP 110 e BP 111 decompõem todo o fitato adicionado às incubações após 90 min em um pH de 2,5 e pH de 3,5

[000344] BP112 decompõem 75% do fitato adicionado às incubações após 90 min em um pH de 2,5 e pH de 3,5

[000345] As enzimas da presente invenção mostram melhores características do que a Ronozyme e Natuphos em um pH de 2,5 (veja pelo menos figura 14) (a concentração de enzima é maior do que observado nas FIGs. 11-13, de modo que BP17 de Buttiauxella é a referência).

Exemplo 12. Hidrólise de ácido fítico em um liquefeito Determinação de ácido fítico:

[000346] Teor de ácido fítico: Ácido fítico foi extraído de uma amostra ajustando o pH da pasta a 5% (se ela é uma amostra seca) para um pH 10 e, então, determinando através de um método de HPLC usando uma coluna de troca de íons. O ácido fítico foi avaliado a partir da coluna usando um sistema de gradiente de NaOH. O teor de ácido fítico no líquido foi, então, calculado comparando com um padrão de ácido fítico. Resultados

[000347] O efeito da temperatura sobre a hidrólise de ácido fítico do liquefeito de milho integral triturado a partir de um processo convencional de liquefação por trituração a seco (fonte: Illinois River Energy, Monroe, Illinois) por diferentes fitases variantes de BP termoestáveis, isto é, BP110, BP111 e BP112, foi estudado. O pH de um liquefeito de milho ds ("Dry Solid" - "sólido seco") de milho integral triturado a 32 % foi ajustado para um pH de 5,0 e colocado em um banho de água mantido a 85oC e 89oC. Após equilíbrio de temperatura, a fitase de BP foi adicionada a 4,0 FTU/gds.milho. As amostras foram, então, tiradas a 20 minutos e a reação enzimática foi terminada mediante a adição de hidróxido de sódio a 10 mM (diluído 1 a 10 vezes). As amostras diluídas foram, então, filtradas e analisadas por meio de HPLC com relação a seu perfil de derivados de fitato (IP1 a IP6). Os cromatogramas por HPLC nas figuras 15 e 16 mostram claramente que as fitases de todas as três variantes catalisaram a hidrólise de ácido fítico em uma temperatura maior do que 85°C. O teor de ácido fítico (ácido fítico (IP6) e intermediários IP1 a IP5) no liquefeito de grão de milho integral está em torno de 1,7% ds.milho e os dados na figura 15 mostraram que mais de 95% do ácido fítico foram hidrolisados pela fitase termoestável sob as presentes condições de liquefação. Significativamente, o perfil de HPLC das amostras incubadas a 89°C mostrou que a variante de fitase BP-111 exibia maior termoestabilidade comparado com a fitase de duas outras variantes (veja figura 16; BP- 110 e BP-112).

ASPECTOS SUMARIZADOS

[000348] Aspectos resumidos da presente invenção serão agora descritos por meio de parágrafos numerados.

[000349] Uma variante de fitase tendo atividade de fitase e uma sequência de aminoácido que varia da sequência de aminoácido da fitase de Buttiauxella sp. do tipo silvestre (SEQ ID NO: 1), em que a sequência de aminoácido da variante de fitase compreende pelo menos uma variação quando comparado com SEQ ID NO: 1 e em que a pelo menos uma variação ocorre em uma posição selecionada do grupo consistindo das posições 75, 76 e 374 de SEQ ID NO: 1 e em que cada uma das referidas pelo menos uma variação pode ser a mesma ou diferente e pode compreender uma substituição, deleção ou inserção.

[000350] Uma fitase de acordo com o parágrafo 1, em que a pelo menos uma variação compreende uma variação de uma, duas ou todas as três das posições selecionadas do grupo consistindo em: S75, Q76 e A374.

[000351] Uma fitase de acordo com o parágrafo 2, em que a pelo menos uma variação compreende uma variação selecionada do grupo consistindo em: S75P, Q76R e A374P.

[000352] Uma fitase de acordo com os parágrafos 1 a 3, em que a pelo menos uma variação também compreende uma variação em uma ou mais posições selecionadas do grupo consistindo em: N37, G77, H160, F164, T171, S188, G192, K198, A235, Q256 e/ou P367.

[000353] Uma fitase de acordo com o parágrafo 4, em que a pelo menos uma variação compreende uma variação selecionada do grupo consistindo em: N37Y, G77S, H160R, F164E, F164S, T171V, T171I, S188P, G192A, K198R, A235V, Q256P, Q256A, Q256E e/ou P367L.

[000354] Uma fitase de acordo com os parágrafos 1 a 5, em que a pelo menos uma variação também compreende uma variação em uma ou mais posições selecionadas do grupo consistindo em: A89, D92, T134, F164, T176, A178, K207, A209, S248, Q256, A261 e/ou N270.

[000355] Uma fitase de acordo com o parágrafo 6, em que a pelo menos uma variação compreende uma variação em uma ou mais posições selecionadas do grupo consistindo em: A89T, D92A, T134I, F164S, T176K, A178P, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E e/ou N270K.

[000356] Uma fitase de acordo com o parágrafo 7, em que a referida fitase compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2.

[000357] Uma fitase de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-8, em que a referida fitase compreende uma sequência compreendendo variações selecionadas do grupo consistindo em:

[000358] N37Y, S75P, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K198R, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P

[000359] N37Y, G77S, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K198R, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P

[000360] N37Y, S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171I, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P

[000361] N37Y, A89T, D92A, T134I, F164E, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256P, A261E, N270K, A374P

[000362] S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171I, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P

[000363] N37Y, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171I, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P

[000364] N37Y, Q76R, A89T, D92A, T134I, F164S, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256A, A261E, N270K, A374P

[000365] S75P, A89T, D92A, T134I, F164E, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P

[000366] S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, P367L, A374P

[000367] N37Y, A89T, D92A, T134I, F164E, T171I, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P

[000368] N37Y, Q76R, A89T, D92A, T134I, F164E, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P

[000369] N37Y, Q76R, A89T, D92A, T134I, F164E, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256A, A261E, N270K, A374P

[000370] N37Y, S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, F164E, T171V, T176K, A178P, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256A, A261E, N270K, A374P

[000371] N37Y, S75P, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P

[000372] N37Y, A89T, D92A, T134I, H160R, F164S, T171I, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256E, A261E, N270K, A374P

[000373] A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P

[000374] N37Y, S75P, A89T, D92A, T134I, H160R, F164S, T171V, T176K, A178P, S188P, K207E, A209S, S248L, Q256H, A261E, N270K, A374P

[000375] N37Y, S75P, A89T, D92A, T134I, F164S, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256A, A261E, N270K, A374P

[000376] S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256A, A261E, N270K, A374P; e

[000377] N37Y, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164S, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P.

[000378] Uma fitase a qual tem pelo menos uma identidade percentual de sequência e/ou homologia percentual mínima à fitase de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-9, em que a identidade e/ou homologia percentual mínima é selecionada do grupo consistindo em pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 93%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% e pelo menos 99%.

[000379] Uma fitase de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 10 tendo pelo menos uma propriedade aprimorada quando comparado com a fitase de SEQ ID NO: 1, em que a propriedade aprimorada é selecionada do grupo consistindo em atividade específica aumentada; sensibilidade diminuída a uma ou mais proteases; atividade térmica aumentada; estabilidade aumentada térmica, estabilidade aumentada em um pH ácido, estabilidade intensificada em um pH básico, estabilidade aumentada de processamento em ração.

[000380] Uma fitase de acordo com o parágrafo 10, em que pelo menos uma propriedade aprimorada é sensibilidade diminuída a uma ou mais proteases encontradas em um animal selecionado do grupo consistindo em seres humanos, alpaca, bisão, camelo, gado, galinha, ave, chinchila, alce, burro, pato, peixe, rã, cabra, ganso, codorna, cavalo, lhama, marta, mula, ostra, pombo, veado, ovelha, crustáceos, suíno, peru, iaque, búfalo, gato, chimpanzé, cão, furão, gerbil, peixes dourados, porquinho-da-índia, hâmster, macaco, periquito, répteis e roedores.

[000381] Uma fitase de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-11, a qual tem atividade prolongada quando comparado com a fitase de SEQ. ID NO: 1 no trato digestivo de um animal selecionado do grupo consistindo em seres humanos, alpaca, bisão, camelo, gado, galinha, ave, chinchila, alce, burro, pato, peixe, rã, cabra, ganso, codorna, cavalo, lhama, marta, mula, ostra, pombo, veado, ovelha, crustáceos, suíno, peru, iaque, búfalo, gato, chimpanzé, cão, furão, gerbil, peixes dourados, porquinho-da-índia, hâmster, macaco, periquito, répteis e roedores.

[000382] Ácido nucleico que codifica uma fitase de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 13.

[000383] Um vetor compreendendo o ácido nucleico de acordo com o parágrafo 14.

[000384] Uma célula hospedeira compreendendo o ácido nucleico de acordo com o parágrafo 14.

[000385] Uma composição enzimática compreendendo pelo menos uma fitase de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 13.

[000386] Uma composição enzimática compreendendo pelo menos uma fitase de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 13, em que a referida composição é útil em liquefação de amido.

[000387] Um método para a produção de uma variante de fitase de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 13 em uma célula hospedeira, compreendendo:

[000388] transformação de uma célula hospedeira com um construto de DNA compreendendo o ácido nucleico que codifica a fitase de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 13 e

[000389] cultura da célula hospedeira transformada em um meio de cultura adequado.

[000390] O método de acordo com o parágrafo 19, em que a célula hospedeira é selecionada do grupo consistindo em uma célula fúngica, uma célula bacteriana ou uma célula de planta.

[000391] Uma variante de fitase tendo atividade de fitase e uma sequência de aminoácido que varia da sequência de aminoácido da fitase de Buttiauxella sp. do tipo silvestre (SEQ ID NO: 1), em que a sequência de aminoácido da variante de fitase compreende pelo menos uma variação quando comparado com SEQ ID NO: 1 e em que a variante tem uma variação em pelo menos uma ou mais das seguintes posições: 70, 193, 197, 221 e 407. De preferência, a variante tem uma variação em pelo menos duas ou mais das seguintes posições: 70, 193, 197, 221 e 407. De preferência, a variante tem uma variação em pelo menos três ou mais das seguintes posições: 70, 193, 197, 221 e 407. De preferência, a variante tem uma variação em pelo menos quatro ou mais das seguintes posições: 70, 193, 197, 221 e 407. De preferência, a variante tem uma variação pelo menos nas seguintes posições: 70, 193, 197, 221 e 407.

[000392] Uma fitase de acordo com o parágrafo 21, em que a variante tem pelo menos as seguintes variações: N70Y, H193R, F197E, S221P e A407P.

[000393] Um método para a produção de um alimento ou ração para animal compreendendo uma etapa de mistura de um polipeptídeo de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 13 ou 21 a 22 ou uma composição enzimática de acordo com o parágrafo 17 ou o parágrafo 18 ou preparada por meio do método de acordo com o parágrafo 19 ou 20 com outro ingrediente para alimento ou ração a fim de formar o referido alimento ou ração para animal.

[000394] Um método para a produção de um alimento ou ração para animal compreendendo uma etapa de pulverização de um polipeptídeo de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 13 ou 21 a 22 ou uma composição enzimática de acordo com o parágrafo 17 ou parágrafo 18 ou preparada por meio do método de acordo com o parágrafo 19 ou 20 na forma líquida sobre o referido alimento ou ração para animal.

[000395] Um método para a produção de um alimento ou ração para animal compreendendo uma etapa de mistura de um polipeptídeo de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 13 ou 21 a 22 ou uma composição enzimática de acordo com o parágrafo 17 ou parágrafo 18 ou preparada por meio do método de acordo com o parágrafo 19 ou 20 como um produto seco com o referido alimento ou ração para animal.

[000396] Um método para a produção de uma ração para animal compreendendo uma etapa de mistura de um polipeptídeo de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 13 ou 21 a 22 ou uma composição enzimática de acordo com o parágrafo 17 ou parágrafo 18 ou preparada por meio do método de acordo com o parágrafo 19 ou 20 com outro ingrediente para alimento ou ração a fim de formar a referida ração para animal.

[000397] Um método para a produção de uma ração para animal compreendendo uma etapa de pulverização de um polipeptídeo de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 13 ou 21 a 22 ou uma composição enzimática de acordo com o parágrafo 17 ou parágrafo 18 ou preparada por meio do método de acordo com o parágrafo 19 ou 20 na forma líquida sobre a referida ração para animal.

[000398] Um método para a produção de uma ração para animal compreendendo uma etapa de mistura de um polipeptídeo de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 13 ou 21 a 22 ou uma composição enzimática de acordo com o parágrafo 17 ou parágrafo 18 ou preparada por meio do método de acordo com o parágrafo 19 ou 20 como um produto seco com a referida ração para animal.

[000399] Um alimento ou composição de ração para animal compreendendo i) uma fitase de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 13 ou 21 a 22 ou uma composição enzimática de acordo com o parágrafo 17 ou parágrafo 18 ou preparada por meio do método de acordo com o parágrafo 19 ou 20 e/ou ii) um alimento ou ração para animal produzida por meio do método de acordo com qualquer um dos parágrafos 23 a 28.

[000400] Uma composição de ração para animal compreendendo i) uma fitase de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 13 ou 21 a 22 ou uma composição enzimática de acordo com o parágrafo 17 ou parágrafo 18 ou preparada por meio do método de acordo com o parágrafo 19 ou 20 e/ou ii) uma ração para animal produzida por meio do método de acordo com qualquer um dos parágrafos 23 a 28.

[000401] Uso de uma fitase polipeptídeo de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 13 ou 21 a 22 ou uma composição enzimática de acordo com o parágrafo 17 ou parágrafo 18 ou preparada por meio do método de acordo com o parágrafo 19 ou 20 em alimento ou ração para animal.

[000402] Uso de uma fitase polipeptídeo de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 13 ou 21 a 22 ou uma composição enzimática de acordo com o parágrafo 17 ou parágrafo 18 ou preparada por meio do método de acordo com o parágrafo 19 ou 20 em uma ração para animal.

[000403] Um método de redução dos níveis de fósforo em estrume animal, caracterizado pelo fato de que um animal é alimentado com uma fitase polipeptídeo de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 13 ou 21 a 22 ou uma composição enzimática de acordo com o parágrafo 17 ou parágrafo 18 ou preparada por meio do método de acordo com o parágrafo 19 ou 20 ou uma ração de acordo com o parágrafo 29 ou 30 e em que a referida fitase está em uma quantidade eficaz na conversão da fitase contida na referida ração para animal.

[000404] Uso de uma fitase polipeptídeo de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 13 ou 21 a 22 ou uma composição enzimática de acordo com o parágrafo 17 ou parágrafo 18 ou preparada por meio do método de acordo com o parágrafo 19 ou 20 ou uma ração de acordo com o parágrafo 29 ou 30, na fabricação de uma ração para animal a fim de reduzir os níveis de fósforo no estrume do animal alimentado com o referido polipeptídeo de fitase.

[000405] Todas as publicações mencionadas no relatório acima e referências citadas nas referidas publicações são aqui incorporadas por referência. Diversas modificações e variações dos métodos descritos e sistemas da presente invenção serão evidentes para aqueles versados na técnica sem se desviar do escopo e espírito da presente invenção. Embora a invenção tenha sido descrita com relação a modalidades específicas preferidas, deverá ser entendido que a invenção, conforme reivindicado, não estará indevidamente limitada a tais modalidades específicas. Na verdade, pretende-se que diversas modificações dos modos descritos para realização da invenção, as quais são óbvias para aqueles versados em biologia molecular ou campos relacionados, estejam dentro do escopo das reivindicações a seguir.

Claims

1) Variante de fitase, caracterizada pelo fato de que possui atividade de fitase e uma sequência de aminoácido correspondendo à sequência de aminoácido da fitase de Buttiauxella sp. do tipo silvestre de SEQ ID NO: 1 com uma variação na posição 75 de SEQ ID NO: 1, em que a referida variante de fitase possui estabilidade térmica aumentada em comparação com fitase de Buttiauxella sp. do tipo silvestre de SEQ ID NO: 1, opcionalmente compreendendo um conjunto de variações adicionais selecionada do grupo consistindo em: i) N37Y, S75P, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K198R, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P; ii) N37Y, S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171I, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P; iii) i) S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171I, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P; Iv) ) S75P, A89T, D92A, T134I, F164E, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P; v) S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, P367L, A374P; vi) N37Y, S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, F164E, T171V, T176K, A178P, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256A, A261E, N270K, A374P; vii) N37Y, S75P, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P; vii) N37Y, S75P, A89T, D92A, T134I, H160R, F164S, T171V, T176K, A178P, S188P, K207E, A209S, S248L, Q256H, A261E, N270K, A374P; ix) ) N37Y, S75P, A89T, D92A, T134I, F164S, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256A, A261E, N270K, A374P; e x) S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256A, A261E, N270K, A374P.

2. Composição enzimática, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos uma fitase como definida na reivindicação 1 incluindo adicionalmente uma ou mais de uma glucoamilase, uma alfa- amilase, uma protease, uma pululanase, uma isoamilase, uma celulase, uma hemicelulase, uma xilanase, uma glicotransferase de ciclodextrina, uma lipase, uma lacase, uma oxidase, uma esterase, uma cutinase, outra fitase ou quaisquer combinações das mesmas.

3. Uso de uma fitase como definida na reivindicação 1 ou da composição enzimática como definida na reivindicação 2, caracterizado pelo fato de ser em liquefação de amido, sacarificação, fermentação ou sacarificação-fermentação simultâneas; por exemplo para a produção de álcool de fermentação tal como etanol ou butanol.

4. Uso de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o substrato é submetido à liquefação de amido, sacarificação, fermentação ou sacarificação-fermentação simultâneas; em que o substrato compreende um grão ou cereal tal como trigo, cevada, centeio, aveias, milho verde, sorgo, farelo de glúten de milho, Solúveis de Grão Seco de Destilaria (DDGS), farelo de trigo, fubá de trigo, semolina de trigo, arroz, cascas de aveia, semente de palma, polpa cítrica ou combinações dos mesmos.

5. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser como um aditivo a um alimento ou ração, por exemplo, em um alimento ou ração contendo Solúveis de Grão Seco de Destilaria (DDGS).

6. Método para a produção de um alimento ou ração para animal caracterizado pelo fato de que compreende: (a) uma etapa de misturação de pelo menos uma fitase como definida na reivindicação 1 ou uma composição enzimática como definida na reivindicação 2, com um outro ingrediente para alimento ou ração a fim de formar o referido alimento ou ração para animal; ou (b) uma etapa de pulverização de pelo menos uma fitase como definida na reivindicação 1 ou uma composição enzimática como definida na reivindicação 2, na forma líquida sobre o referido alimento ou ração para animal.

7. Alimento ou composição de ração para animal caracterizado pelo fato de compreender i) pelo menos uma fitase como definida na reivindicação 1 ou uma composição enzimática como definida na reivindicação 2, e/ou ii) um alimento ou ração para animal produzida por meio do método como definido na reivindicação 6.

8. Método de redução dos níveis de fósforo em estrume animal, caracterizado pelo fato de que um animal é alimentado com pelo menos uma fitase como definida na reivindicação 1 ou uma composição enzimática como definida na reivindicação 2 ou uma ração preparada por meio do método como definido na reivindicação 6, ou uma composição como definida na reivindicação 7, e em que a referida fitase está em uma quantidade eficaz para conversão da fitato contido na referida ração para animal.

9. Uso de pelo menos uma fitase como definida na reivindicação 1 ou uma composição enzimática de como definida na reivindicação 2 ou uma ração preparada por meio do método como definido na reivindicação 6 ou uma composição como definida na reivindicação 7, caracterizado pelo fato de ser na produção de uma ração para animal a fim de reduzir os níveis de fósforo no estrume do animal alimentado com o referido polipeptídeo de fitase.