JP2002253244A - 超耐熱性エステラーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 高温下でのペプチド及びエステルの加水分
解、またその逆反応であるペプチド及びエステルの酵素
的合成、及びラセミ体のペプチド及びエステルの光学分
割を可能にするための手段を提供する。 【解決手段】 アエロパイラム属細菌等に由来する、３
０〜１００℃の温度範囲においてぺプチダーゼ活性及び
エステラーゼ活性を有する超耐熱性エステラーゼを提供
する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、超耐熱性エステラ
ーゼ、それをコードするポリヌクレオチド、その製造方
法、及びその使用方法に関する。詳しくは、本発明は、
３０〜１００℃の範囲においてぺプチダーゼ活性及びエ
ステラーゼ活性を共に有する超耐熱性エステラーゼに関
する。

【０００２】

【従来の技術】エステラーゼは、種々のエステルの分
解、合成、交換あるいはラセミ体エステルの光学分割に
用いられる。しかし、従来の酵素は常温菌が生産したも
のが多く、７０℃以上になるとほとんど失活してしまっ
ていた。７０〜１００℃の温度範囲では、室温において
固体状であるほとんどの油脂が液体状になるため、この
範囲において活性を有するエステラーゼが得られれば、
新規な利用法が開発されるものと思われる。しかし、７
０℃以上で生育する好熱菌は一般にエーテル脂質を膜脂
質とする古細菌に属し、エステルに作用するエステラー
ゼ、及びペプチドの分解、合成等に用いられるぺプチダ
ーゼ活性を有する耐熱性酵素は得られていない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】従来の常温菌由来の耐
熱性ペプチダーゼおよびエステラーゼは、１００℃近い
高温下では不安定であるため、反応は比較的低温（４０
〜６０℃）で行う必要があった。しかしながら、従来酵
素的分解が低温でしか行えないことから、上記の室温に
おいて固体状で反応する方法しか利用することができな
かった。そのため、反応速度が遅いという問題点があっ
た。１００℃近い高温下で上記の反応を行うと、基質の
液化、基質濃度の増加、反応効率の向上、混入微生物の
除去等、多くの利点が考えられる。そこで、１００℃近
い高温下で働き、さらに、その条件下で安定な酵素が渇
望されている。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者は、以上のよう
な課題を解決すべく、９０〜１００℃で生育する超好熱
性菌に着目し、種々検討を行った。まず、超好熱菌の膜
脂質はエーテル脂質であるため、エステラーゼ遺伝子を
見い出すことは、困難であることが予想された。そこ
で、脂質分解酵素であるリパーゼがエステラーゼ活性も
もつことが知られているので、リパーゼモチーフ（GXSX
GグリシンXアミノ酸セリンXアミノ酸グリシン）遺伝子
をスクリーニングすることとした。すなわち、超好熱性
菌の遺伝子配列から、本酵素活性を示すと推測されるリ
パーゼモチーフ遺伝子との相同性検索を行い、アエロパ
イラム属菌においてリパーゼモチーフを持つ遺伝子を見
出すことに成功した。

【０００５】さらに、PCR反応で増幅したリパーゼモチ
ーフを持つ遺伝子を大腸菌に導入し、85℃で３０分間加
熱する等の活性な状態で目的の酵素を生産する条件を研
究後、酵素タンパク質を生産し、この酵素が高温（９０
〜９５℃）で安定で、かつ、３０〜１００℃の範囲にお
いて超耐熱性エステラーゼ活性及びぺプチダーゼ活性を
共に有する２機能性の酵素活性を示すことを確認し、本
発明を完成するに至った。さらに、ここで得られた遺伝
子を、他の微生物に組み込み、本酵素を多量に分泌生産
することもできる。

【０００６】すなわち、本発明は、以下の（１）〜（１
０）を提供する。 （１） ３０〜１００℃の温度範囲においてぺプチダー
ゼ活性及びエステラーゼ活性を有する超耐熱性エステラ
ーゼ。 （２） アエロパイラム属由来である、上記（１）記載
の超耐熱性エステラーゼ。 （３） 下記の（i）又は（ii）のポリヌクレオチド。 （i）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリ
ヌクレオチド （ii）配列番号１に示すヌクレオチド配列において１若
しくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加
されたポリヌクレオチドであって、３０〜１００℃の温
度範囲においてぺプチダーゼ活性及びエステラーゼ活性
を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド （４） 下記の（iii）又は（iv）のポリペプチド。 （iii）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペ
プチド （iv）配列番号２に示すアミノ酸配列において１若しく
は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたポ
リペプチドであって、３０〜１００℃の温度範囲におい
てぺプチダーゼ活性及びエステラーゼ活性を有するポリ
ペプチド

【０００７】（５） 上記（３）に記載のポリヌクレオ
チドを含有する組換えベクター。 （６） 上記（５）に記載の組換えベクターを含有する
形質転換体。 （７） アエロパイラム属に属する超耐熱性エステラー
ゼ生産菌を培地中で培養し、培養物から超耐熱性エステ
ラーゼを採取することを特徴とする、上記（２）に記載
の超耐熱性エステラーゼの製造方法。 （８） 上記（６）に記載の形質転換体を培地中で培養
し、培養物から超耐熱性エステラーゼを採取することを
特徴とする、上記（１）又は（２）に記載の超耐熱性エ
ステラーゼの製造方法。 （９） ７０℃以上の温度におけるペプチド、エステ
ル、及び／又は脂質の分解、合成、交換あるいはラセミ
体エステルの光学分割のための、上記（１）又は（２）
に記載の超耐熱性エステラーゼの使用方法。 （１０） 上記ペプチド、エステル、及び／又は脂質が
室温において固体状である場合、有機溶媒を添加するこ
とを特徴とする、上記（９）に記載の分解方法。

【０００８】

【発明の実施の形態】以下に、本発明を具体的に説明す
る。本発明においてペプチダーゼ活性とは、ペプチドを
分解する活性のことをいう。また、本発明においてエス
テラーゼ活性とは、エステルを分解する活性のことをい
う。

【０００９】本発明で使用した特に好適な超好熱性菌
は、アエロパイラム属に属する好気性好熱性古細菌 ア
エロパイラム ぺルニクス（登録番号ＪＣＭ９８２０）
である。これら超好熱性細菌の遺伝子配列から本酵素活
性を示すと思われる遺伝子を探した。具体的には、超好
熱菌の膜脂質はエーテル脂質であるためにエステラーゼ
遺伝子を見出すことは困難であることが予想された。一
方、リパーゼは、エステラーゼ活性をももっている場合
があることから、超好熱性菌の遺伝子配列から本酵素活
性を示すと推測されるリパーゼモチーフ（GXSXGグリシ
ンXアミノ酸セリンXアミノ酸グリシン）遺伝子との相同
性検索を行い、上記超好熱菌においてリパーゼモチーフ
を持つ遺伝子を見出した。得られた遺伝子をPCR反応で
増幅し、抽出した後、タンパク質発現プラスミドpET 11
a（Novagen社製）に挿入、そのプラスミドを大腸菌に組
み込み、本酵素の生産を行った。但し、本発明において
使用できるベクターはプラスミドに限定されるものでは
なく、宿主も大腸菌に限定されるものではない。いずれ
も当分野において通常使用されるもの、例えばpAUR101
等のベクター、酵母菌、枯草菌等の宿主細胞を適宜選択
して使用することができる。生産された酵素は、界面活
性剤を入れて抽出し、加熱処理およびカラムクロマトグ
ラムで単離精製する。

【００１０】本発明のタンパク質は、ぺプチダーゼ及び
エステラーゼ活性を有する超耐熱性エステラーゼであ
り、そのタンパク質をコードする遺伝子は例えば配列番
号１のごとくであり、その遺伝子から推定されるアミノ
酸配列は例えば配列番号２のようである。大腸菌によっ
て生産されるタンパク質は、2.5%のトリトンX１００を
加えて抽出し、抽出したタンパク質は、加熱処理により
大腸菌タンパク質を沈澱させ、硫安塩析、陰イオン交換
樹脂（ハイトラップQセファロース）、疎水性クロマト
グラフで精製したタンパク質のゲルろ過より求めた分子
量も58-69kDであったので、１量体で存在していた。精
製したタンパク質は、分子量約63,000のタンパク質で、
各種のジペプチド、アシルアミノペプチド、パラニトロ
フェノールエステル、トリブチリンを分解した。反応pH
は７〜９で活性が高く至適pHは、８附近にあった。至適
温度は５０℃であったが、９０℃でも５０℃の４０％の
活性があった。

【００１１】本発明の超耐熱性エステラーゼは、例えば
アエロパイラム属に属する超耐熱性エステラーゼ生産菌
を培地中で培養し、培養物から超耐熱性エステラーゼを
採取することにより得ることができる。具体的な培養条
件等は下記実施例に記載するが、当業者であればこれら
の記載に基づいて培地等の培養条件の選択を適宜改変す
ることができる。

【００１２】本発明に係る超耐熱性エステラーゼはま
た、（i）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなる
ポリヌクレオチド、又は（ii）配列番号１に示すヌクレ
オチド配列において１若しくは複数個のヌクレオチドが
欠失、置換若しくは付加されたポリヌクレオチドであっ
て、３０〜１００℃の温度範囲においてぺプチダーゼ活
性及びエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードす
るポリヌクレオチドから得ることができる。すなわち、
これらのポリヌクレオチドを含有する組換えベクターを
作製し、適当な宿主に導入して形質転換体を得、この形
質転換体を培地中で培養し、培養物から超耐熱性エステ
ラーゼを採取することにより得ることができる。ここ
で、上記（ii）に示すポリヌクレオチドは、例えば部位
特異的突然変異誘発等の当分野において通常使用される
手段により得ることができ、また自然界から得ることも
できる。タンパク質をコードするポリヌクレオチドにお
いては、コドンの縮重や、コードされるタンパク質にお
けるアミノ酸の保存的置換等により、ヌクレオチド配列
が異なる場合であってもそのコードするタンパク質の機
能が同じか、類似することは周知である。また、種々の
機能的に影響のない数十個程度の欠失体が存在すること
も良く知られており、当業者であれば、本明細書の記載
に基づいて、酵素の機能を著しく損なうことなくこうし
た欠失体、置換体若しくは付加体を得ることができる。
従って、本明細書において「複数個」とは、数十個、好
ましくは数個を意味する。

【００１３】本発明はまた、（iii）配列番号２に示す
アミノ酸配列からなるポリペプチド、又は（iv）配列番
号２に示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のア
ミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたポリペプチドで
あって、３０〜１００℃の温度範囲においてぺプチダー
ゼ活性及びエステラーゼ活性を有するポリペプチドを提
供する。ここで、上記（iv）に示すポリペプチドは、例
えば部位特異的突然変異誘発等の当分野において通常使
用される手段により得ることができ、また自然界から得
ることもできる。上記したように、タンパク質において
は、アミノ酸の保存的置換を始めとする欠失、置換若し
くは付加により、機能が類似するタンパク質が得られる
ことは周知である。また、例えばＮ末端またはＣ末端等
で、種々の機能的に影響のない数十個程度の欠失体が存
在することも良く知られており、当業者であれば、本明
細書の記載に基づいて、酵素の機能領域を特定し、その
機能を著しく損なうことなくこうした欠失体、置換体若
しくは付加体を得ることができる。従って、本明細書に
おいて「複数個」とは、数十個、好ましくは数個を意味
する。

【００１４】本発明の超耐熱性エステラーゼは、例えば
７０℃以上の温度におけるペプチド、エステル、及び／
又は脂質の分解、合成、交換あるいはラセミ体エステル
の光学分割のために使用することができる。上記ペプチ
ド、エステル、及び／又は脂質は、特に限定されるもの
ではないが、室温において固体状であるものが本発明に
おいて、例えばphe-Ala、Ala-Phe、Trp-Ala等のペプチ
ドを基質として挙げることができる。固体状の基質を高
濃度で反応する場合、ヘキサン、イソオクタン等の疎水
性の有機溶媒を添加することにより反応速度を更に上げ
ることができる。

【００１５】

【実施例】実施例１ アエロパイラム ぺルニクスゲノ
ムDNAからの酵素遺伝子のクローニング DNAデータベース（製品評価センターホームページhttp:
//www.mild.nite.go.jp/）からアエロパイラム・ペルニ
クス（APE1547）の情報を得、酵素遺伝子と推定される
配列を選択した。具体的には、リパーゼモチーフ（GXSX
GグリシンXアミノ酸セリンXアミノ酸グリシン）遺伝子
を探した。すなわち、超好熱性菌の遺伝子配列から本酵
素活性を示すと推測されるリパーゼモチーフ遺伝子との
相同性検索を行ってリパーゼモチーフ遺伝子を見出し
た。

【００１６】得られた遺伝子配列情報から、アパープラ
イマー（5'CTTACGACTATCTCAGCGCATTATAATGCCTGT3'（配
列番号３））及びロアプライマー（5'TTGGAGCCTCCCGGCG
GTGGATCCCTATCTCCT3'（配列番号４））を設計した。ア
エロパイラム ぺルニクス（ＪＣＭ９８２０）から常法
によって抽出精製したゲノムを鋳型とし、上記アパープ
ライマー及びロアプライマーを用いてPCR増幅反応を実
施した。

【００１７】Ventポリメラーゼ１μl、Ventポリメラー
ゼバッファー１０μl、dNTP mix（２５ｍＭ）1.5μl、
鋳型DNA溶液４μl、アパープライマー（１００μＭ）１
μl、ロアプライマー（１００μＭ）１μl、蒸留水81.5
μlを混合し、PCR反応を行った。反応条件は、変性を９
４℃で1分、アニーリングを４８℃で２分、伸長を７０
℃で３分とし、３５サイクルで行った。

【００１８】PCR産物の確認は、PCR産物２μl、色素混
合液２μl、TEバッファー５μl、及びＨバッファー１μ
lの計１０μlを混合し、0.7％アガロースゲル上で電気
泳動させ、UVイルミネーターによる可視化（３０分間）
によって行った。目的とするバンドをマーカーとの比較
によって決定した。

【００１９】増幅したPCR産物をQIAquick Gel Extracti
on Kit（Quiagen）を用いて精製した。目的のバンドを
含有するゲルを透明なチューブに入れ、重量を測定後、
３容量のBuffer QGを添加し、２〜３分毎に攪拌しなが
ら５０℃で１０分間インキュベートした。全てのゲルが
溶解した後、溶媒の色を確認した。溶媒が黄色を示した
場合は、１ゲル容量のイソプロパノールを添加して混合
した。QIAquickスピンカラムを２ｍｌのチューブに入
れ、これに0.5ｍｌのQGバッファーを添加して、4000rpm
で１分間遠心分離した。次いで0.75ｍｌのPEバッファー
を加えて再度4000rpmで１分間遠心分離し、フロースル
ーを捨て、カラムを更に13000rpmで１分間遠心分離し
た。その後QIAquickカラムを1.5ｍｌのチューブに入れ
て５０ｍｌの蒸留水を添加し、DNAを溶出させた。電気
泳動で結果を確認した。

【００２０】実施例２ 酵素遺伝子による大腸菌の形質
転換 上記実施例１ で増幅した遺伝子を制限酵素（NdeI及び
BamHI）で消化し、同じ制限酵素で切断したベクターpET
11a中に挿入した。まず、増幅したPCR産物５μl、BamHI
１μl、NdeI１μl、バッファーＫ１μl、蒸留水２μlを
混合し、３７℃で１時間インキュベートし、次いでNdeI
0.5μlを添加し、３７℃で３０分間インキュベートし
た。分解反応を電気泳動で確認した。

【００２１】次にQIAquick Gel Extraction Kitを用
い、純粋なセグメントを得、サンプルをTEバッファー３
０μl中に懸濁した。標的DNA５μl、Pub11a１μl、liga
tion solution I mix６０μlを混合し、１６℃で一晩静
置した。得られたプラスミドを用い、大腸菌XL2コンピ
テント細胞を形質転換した。

【００２２】−８０℃に保存していたコンピテント細胞
を氷上に置き、液状になったところで１００μlを氷冷
したファルコンチューブにとり、1.7μlのメルカプトエ
タノールを添加した。軽く攪拌した後、時々攪拌しなが
ら１０分間氷上に置いた。次にligation mixを添加し、
氷上に３０分間置いた。４２℃で３０秒間の加熱後にす
ばやく氷上に戻し、そのまま２分間置いた。次いで９０
０μlのSOC培地を添加し、振とうしながら３７℃で１時
間培養した。培養した細胞を、アンピシリン（５００
×）２０μlを添加したプレート上にまき、各プレート
２５０μlをクリーンベンチで風乾し、３７℃で一晩培
養した。

【００２３】実施例３ 形質転換体の作製 形質転換体の細胞を、アンピシリン（１００μｇ／ｍ
ｌ）を含有する２YT培地（１％酵母抽出物、1.6％トリ
プトン、0.5％NaCl含有）で３７℃で増殖させた。Plasm
id Mini Purification Kit（Quiagen）を用いて形質転
換細胞からプラスミドを得た。

【００２４】具体的には、形質転換体を培養した培地を
2000rpmで１５分間遠心分離した。上清を捨て、細菌ペ
レットを0.3ｍｌのP1バッファーに再懸濁し、0.3ｍｌの
P2バッファーを添加して混合し、室温で５分間インキュ
ベートした。次いでP3バッファーを添加して速やかに混
合し、氷上で５分間インキュベートした後、１３００rp
mで１０分間遠心分離した。上清をとり、１ｍｌQBTバッ
ファーによって平衡化し、重力による流出によって空に
したQIAGEN-tip 20にのせ、重力によって樹脂内に侵入
させた後、QCバッファーで洗浄し、次いで0.8QFバッフ
ァーでDNAを溶出させた。室温のイソプロパノール0.7容
量でDNAを沈降させ、13000rpmで３０分間の遠心分離を
行い、注意深く上清をとった。DNAを１ｍｌの７０％エ
タノールで洗浄し、５分間風乾した後、３０μlのTEバ
ッファーに溶解させた。

【００２５】次に、制限酵素によってプラスミドを切り
出した。目的の遺伝子を含有するプラスミド１μl、Bam
HI１μl、NdeI１μl、Ｋバッファー１μl、蒸留水６μl
を混合し、３７℃で１時間インキュベートし、dye mix
３μlを添加し、確認のために電気泳動を行った。この
結果、形質転換体に目的の遺伝子が含まれていることが
確認された。

【００２６】実施例４ 酵素の精製１ BL21形質転換体のプレートから数個のコロニーをとり、
１０ｍｌのYT培地中にまき、アンピシリン（５００×）
２０μlを添加して攪拌しながら３７℃で一晩予備培養
した。培養物１ｍｌをYT培地１００ｍｌにアンピシリン
（５００×）２０μlと共に入れ、攪拌しながら３７℃
でＡ600が0.6から1.0になるまで培養した。次いでIPTG
１００ｍＭを培地１ｍｌ当たり１０μlの濃度で添加
し、攪拌しながら約９時間培養を継続した。4500rpmで
２０分間の遠心分離を行い、上清を除去して細胞を回収
した。これを−２０℃で３０分間保存した後に室温で融
解した。この細胞を、１０ｍＭ Tris-HClバッファー
（ｐＨ8.0）３００μlに懸濁し、１ｍｇのDNaseIを添加
して３７℃で３０分間加熱した。超音波処理を20分間行
った後にTritonX-100を添加（最終濃度2.5％）し、８５
℃で３０分間加熱した。

【００２７】次いで15000rpmで１５分間遠心分離し、上
清を回収した（粗酵素）。この上清４μlをとり、SDSバ
ッファー４μlを添加した混合物から１μlをとって５分
間沸騰させた。Phast System装置（アマシャム ファル
マシア バイオテク社）及びPhastGel 10-15（アマシャ
ム ファルマシア バイオテク社）を用いてSDS-PAGEを
行った。

【００２８】実施例５ 粗酵素液における酵素活性の確
認 実施例４で得られた粗酵素液を用い、酵素活性の確認を
行った。基質としてAla-Ala-Ala（４０ｍＭ）５０μl、
粗酵素液５０μl、Tris-HClバッファー（ｐＨ8.0）９０
０μlを混合し、８５℃で１時間加熱した後、混合液か
ら１２０μlをとり、９００μlのニンヒドリン溶液を添
加し、再度８５℃で５分間加熱した。分解産物の検出の
ためにＡ₅₀₅を検出した結果、酵素活性が確認された。

【００２９】実施例６ 酵素の精製２ 実施例３で得られた形質転換細胞を81YT培地で培養し、
実施例４と同じ条件下で酵素を抽出した。粗酵素の溶液
に(NH₄)₂SO₄を添加してタンパク質を塩析し、7000rpmで
２０分間遠心分離して上清を回収し、蒸留水を添加して
タンパク質を溶解し、これを１０ｍＭのTris-HClバッフ
ァーを用い、４℃で一晩した。翌日バッファーを１回交
換し、４℃で８時間静置した。

【００３０】サンプルを7000rpmで２0分間遠心分離して
沈殿を除いた後、HiTrap Q Sepharoseの５ｍｌのカラム
にのせた。カラムに以下のバッファーを２ｍｌ／分の流
速で４０分間流した。バッファーＡ：５０ｍＭ Tris-HC
l、バッファーＢ：１Ｍ NaClを含有する５０ｍＭ Tris-
HCl。得られた６ｍｌずつの各フラクションをSDS-PAGE
にかけると共に酵素活性を確認し、活性の認められたフ
ラクションを合わせて次の工程に進んだ。

【００３１】選択したフラクションをPhenyl Sepharose
16/10カラムにのせ、以下のバッファーを1.5ｍｌ／分
の流速で流した。バッファーＡ：1.8Ｍ (NH₄)₂SO₄を含
有する１００ｍＭ Na₂HPO₄、バッファーＢ：５０ｍＭ N
a₂HPO₄。得られた６ｍｌずつの各フラクションをSDS-PA
GEにかけると共に酵素活性を確認し、活性の認められた
フラクションを合わせて次の工程に進んだ。選択したフ
ラクションをHiload superdex 26/60カラムにのせ、1.5
ｍｌ／分の流速でバッファー（1Mの食塩を含む100mM Tr
is-HCl (pH8)）を流した。得られた６ｍｌずつの各フラ
クションをSDS-PAGEにかけると共に酵素活性を確認し
た。酵素活性を有したフラクションを用いてHPLC（Macr
o-Prep se1000/40）にかけ、分子量を測定した。上記手
順によって精製された酵素は６９ｋDと５８ｋDの間にあ
り、分子量約63,000のタンパク質であることが確認され
た。

【００３２】実施例７ ペプチドの分解 実施例４で作製した酵素液５０μl、pH8.0のTris-HClバ
ッファー９００μl、４０mMの下記表１に記載の各種の
ジペプチド若しくはトリペプチド溶液５０μlを混合
し、８５℃で１時間反応させた。その後、反応混合液か
ら１２０μlをとり、ニンヒドリン液９００μlを加えて
８５℃で５分間加熱し、分解産物の検出のために、505n
mの吸光度を測定した。

【００３３】

【表１】

【００３４】表１の結果から明らかなように、いずれの
ペプチドにおいても分解反応が観察されたが、アルギニ
ン−フェニルアラニン（Ala-Phe）のジペプチドが最も
良く反応した。Glu-Ala及びAsp-Alaも良く反応したが、
これらは反応中の自己分解が見られ、酵素的分解のみの
結果は得られなかった。

【００３５】実施例８ エステルの分解 実施例４で作製した酵素液５０μl、pH７のリン酸バッ
ファーに懸濁した１mMの各種のエステル９５０μlを混
合し、８５℃で１時間反応させた。分解産物であるp-ニ
トロフェノールの検出のために、403nmの吸光度を測定
した。

【００３６】

【表２】

【００３７】表２の結果から明らかなように、いずれの
エステルにおいても分解反応が観察されたが、ｐ−ニト
ロフェニルカプリン酸エステル、及びｐ−ニトロフェニ
ルラウリン酸エステルが最も良い基質であった。リパー
ゼ活性検出のためには、ｐ−ニトロフェニルカプリン酸
エステルが最も良い基質となり得ることが示された。

【００３８】実施例９ PNAの分解 実施例４で作製した酵素液５０μl、pH8.0のTris-HClバ
ッファー９００μl、４０mMの各種のペプチド溶液５０
μlを混合し、８５℃で１時間反応させ、分解産物であ
るp-ニトロアニリドの検出のために、406nmの吸光度を
測定した。

【００３９】

【表３】

【００４０】表３の結果から明らかなように、いずれの
PNAにおいても分解反応が観察されたが、N-アセチル−
フェニルアラニン−パラニトロアニリド及びN-アセチル
−ロイシン−パラニトロアニリドが最も良い基質であっ
た。

【００４１】実施例１０ トリグリセリドの分解 トリブチリン１００μl、実施例４で作製した酵素液６
００μlを８５℃で１６時間反応させた。反応液をクロ
マトグラフにかけると脂肪酸及びグリセリドのピークが
検出された。そのため、本酵素にはリパーゼ活性もある
ことが解った。

【００４２】実施例１１ 至適温度の検討 酵素活性の至適温度の検討は、基質としてｐ−ニトロフ
ェニルカプリン酸エステルを用いた。該基質溶液（１ｍ
Ｍ、ｐＨ7.0）９５０μl及び実施例４で作製した酵素液
５０μlを混合した計１ｍｌのサンプル７個を用意し、
３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃、及
び９０℃でそれぞれ５分間加熱した後、分解産物である
p-ニトロフェノールの検出のために、403nmの吸光度を
検出した。結果を図１に示す。図１の結果から明らかな
ように、本発明の酵素は４０〜６０℃の範囲で高い分解
活性を示し、５０℃近辺に至適温度を有しているが、調
べた３０〜９０℃の範囲のいずれにおいても分解活性を
有していた。

【００４３】実施例１２ 至適ｐＨの検討 酵素活性における至適ｐＨの検討は、実施例１１と同様
に基質としてｐ−ニトロフェニルカプリン酸エステルを
用いた。該基質溶液（１ｍＭ、ｐＨ7.0）９５０μl及び
実施例４で作製した酵素液５０μlを混合した計１ｍｌ
のサンプル１２個を用意し、図２に示すｐＨにそれぞれ
調製し、５０℃でそれぞれ５分間加熱した後、分解産物
であるp-ニトロフェノールの検出のために、403nmの吸
光度を検出した。結果を図２に示す。図２の結果から明
らかなように、本発明の酵素はｐＨ約６〜９の範囲にお
いて高い分解活性を示し、8.0近辺に至適ｐＨを有して
いた。

【００４４】

【発明の効果】本発明により、反応至適pHは８附近、至
適温度は５０℃であるが、９０℃でも高活性である耐熱
性ペプチダーゼ及びエステラーゼが提供される。さら
に、酵素分子が安定であるという事から耐有機溶媒性の
向上も期待できる。本発明の酵素により、高温下での、
ペプチド及びエステルの加水分解また、その逆反応であ
るペプチド及びエステルの合成も可能になる。また、ラ
セミ体のペプチド及びエステルの光学分割も可能にな
り、従来不可能であった高温下におけるこれらの酵素的
反応が可能となる。

【００４５】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Director-General of National Institute of Advanced Industrial Scie nce and Technology, Ministry of Economy, Trade and Industry <120> Hyperthermophilic Esterase <130> B01-013 <160> 4 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 1749 <212> DNA <213> Aeropyrum pernix <400> 1 gtgcgcatta taatgcctgt tgagttctcg aggattgtta gggatgttga gcgtctaatc 60 gctgttgaga agtatagtct ccaaggcgtc gtggatggtg ataagcttct cgtagtgggg 120 tttagtgagg ggtctgtgaa cgcctacctc tacgacggtg gcgagactgt caagctcaac 180 agggagccta taaacagcgt tctagacccc cactatggcg tcggaagggt tatactggtt 240 agagacgtct cgaagggggc tgagcagcat gccctcttca aggttaacac ctccaggcca 300 ggcgaggagc agcggctcga ggctgtaaag cctatgagga ttctcagcgg cgtcgacaca 360 ggggaggcgg tcgtattcac cggtgccacc gaggataggg tggccctcta cgccctagac 420 ggcggtggcc tcagggagct tgcgaggctc cccggcttcg ggttcgtatc ggacatcagg 480 ggagacctca tagcggggct cggcttcttc ggcggcggca gagtatcgct tttcacttca 540 aacctctcct ccggggggct tagggtcttc gacagcgggg agggcagctt ctcctccgcc 600 tctatatcac ctggaatgaa agttacggct ggtcttgaaa cagctaggga ggccaggctt 660 gtcacggtag acccgaggga tgggtcggtt gaggacctcg agctgccctc gaaagacttc 720 agcagctaca ggcccaccgc catcacctgg ctaggctact tgcccgacgg caggctggcc 780 gtggttgcca ggagggaggg gcggagcgcc gtcttcatag acggggagag ggttgaggcc 840 ccccagggta accatgggag ggtggttcta tggaggggca agctggtcac cagccacacg 900 agcctctcaa cgccgccgag gatagtgtct ctacccagtg gggagcccct gcttgagggt 960 gggctgcctg aggacctcag gcgctccata gccgggtcaa ggctggtttg ggtcgagagc 1020 ttcgacggct ccagggtccc gacttatgtg ctggagagcg ggagggcccc gactccaggc 1080 cccacggttg tgctggtaca cggcgggccc ttcgcggagg acagcgactc ctgggacact 1140 ttcgccgcca gcctcgcggc ggctggcttc cacgtggtca tgcctaacta ccgggggagc 1200 acaggctatg gcgaggagtg gaggctcaag atcataggcg acccctgcgg cggtgagctc 1260 gaggatgtat cggcggcagc caggtgggcc agggagagcg gcctcgccag cgagctttac 1320 atcatgggct acagctacgg cggctacatg accctatgcg ccctaacaat gaagccaggc 1380 ctcttcaagg ccggtgtcgc gggagccagt gtagtggact gggaggagat gtacgagctc 1440 agcgacgccg ccttccggaa cttcatagag cagctgacgg gaggtagcag ggagataatg 1500 aggagcagga gccccataaa ccatgtcgac aggataaagg agcccctagc cctcatacac 1560 cctcagaacg acagcagaac accgctgaaa cccctactga ggctcatggg agagctgctg 1620 gcgcggggga agacgttcga agcccacatt atacccgacg ccggccacgc tataaacaca 1680 atggaggacg cagtaaagat actcctgccc gccgtcttct tcctagccac ccagagggag 1740 aggagatag 1749 <210> 2 <211> 582 <212> PRT <213> Aeropyrum pernix <400> 2 Met Arg Ile Ile Met Pro Val Glu Phe Ser Arg Ile Val Arg Asp Val 1 5 10 15 Glu Arg Leu Ile Ala Val Glu Lys Tyr Ser Leu Gln Gly Val Val Asp 20 25 30 Gly Asp Lys Leu Leu Val Val Gly Phe Ser Glu Gly Ser Val Asn Ala 35 40 45 Tyr Leu Tyr Asp Gly Gly Glu Thr Val Lys Leu Asn Arg Glu Pro Ile 50 55 60 Asn Ser Val Leu Asp Pro His Tyr Gly Val Gly Arg Val Ile Leu Val 65 70 75 80 Arg Asp Val Ser Lys Gly Ala Glu Gln His Ala Leu Phe Lys Val Asn 85 90 95 Thr Ser Arg Pro Gly Glu Glu Gln Arg Leu Glu Ala Val Lys Pro Met 100 105 110 Arg Ile Leu Ser Gly Val Asp Thr Gly Glu Ala Val Val Phe Thr Gly 115 120 125 Ala Thr Glu Asp Arg Val Ala Leu Tyr Ala Leu Asp Gly Gly Gly Leu 130 135 140 Arg Glu Leu Ala Arg Leu Pro Gly Phe Gly Phe Val Ser Asp Ile Arg 145 150 155 160 Gly Asp Leu Ile Ala Gly Leu Gly Phe Phe Gly Gly Gly Arg Val Ser 165 170 175 Leu Phe Thr Ser Asn Leu Ser Ser Gly Gly Leu Arg Val Phe Asp Ser 180 185 190 Gly Glu Gly Ser Phe Ser Ser Ala Ser Ile Ser Pro Gly Met Lys Val 195 200 205 Thr Ala Gly Leu Glu Thr Ala Arg Glu Ala Arg Leu Val Thr Val Asp 210 215 220 Pro Arg Asp Gly Ser Val Glu Asp Leu Glu Leu Pro Ser Lys Asp Phe 225 230 235 240 Ser Ser Tyr Arg Pro Thr Ala Ile Thr Trp Leu Gly Tyr Leu Pro Asp 245 250 255 Gly Arg Leu Ala Val Val Ala Arg Arg Glu Gly Arg Ser Ala Val Phe 260 265 270 Ile Asp Gly Glu Arg Val Glu Ala Pro Gln Gly Asn His Gly Arg Val 275 280 285 Val Leu Trp Arg Gly Lys Leu Val Thr Ser His Thr Ser Leu Ser Thr 290 295 300 Pro Pro Arg Ile Val Ser Leu Pro Ser Gly Glu Pro Leu Leu Glu Gly 305 310 315 320 Gly Leu Pro Glu Asp Leu Arg Arg Ser Ile Ala Gly Ser Arg Leu Val 325 330 335 Trp Val Glu Ser Phe Asp Gly Ser Arg Val Pro Thr Tyr Val Leu Glu 340 345 350 Ser Gly Arg Ala Pro Thr Pro Gly Pro Thr Val Val Leu Val His Gly 355 360 365 Gly Pro Phe Ala Glu Asp Ser Asp Ser Trp Asp Thr Phe Ala Ala Ser 370 375 380 Leu Ala Ala Ala Gly Phe His Val Val Met Pro Asn Tyr Arg Gly Ser 385 390 395 400 Thr Gly Tyr Gly Glu Glu Trp Arg Leu Lys Ile Ile Gly Asp Pro Cys 405 410 415 Gly Gly Glu Leu Glu Asp Val Ser Ala Ala Ala Arg Trp Ala Arg Glu 420 425 430 Ser Gly Leu Ala Ser Glu Leu Tyr Ile Met Gly Tyr Ser Tyr Gly Gly 435 440 445 Tyr Met Thr Leu Cys Ala Leu Thr Met Lys Pro Gly Leu Phe Lys Ala 450 455 460 Gly Val Ala Gly Ala Ser Val Val Asp Trp Glu Glu Met Tyr Glu Leu 465 470 475 480 Ser Asp Ala Ala Phe Arg Asn Phe Ile Glu Gln Leu Thr Gly Gly Ser 485 490 495 Arg Glu Ile Met Arg Ser Arg Ser Pro Ile Asn His Val Asp Arg Ile 500 505 510 Lys Glu Pro Leu Ala Leu Ile His Pro Gln Asn Asp Ser Arg Thr Pro 515 520 525 Leu Lys Pro Leu Leu Arg Leu Met Gly Glu Leu Leu Ala Arg Gly Lys 530 535 540 Thr Phe Glu Ala His Ile Ile Pro Asp Ala Gly His Ala Ile Asn Thr 545 550 555 560 Met Glu Asp Ala Val Lys Ile Leu Leu Pro Ala Val Phe Phe Leu Ala 565 570 575 Thr Gln Arg Glu Arg Arg 580 <210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer for PCR <400> 3 cttacgacta tctcagcgca ttataatgcc tgt 33 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer for PCR <400> 4 ttggagcctc ccggcggtgg atccctatct cct 33

【００４６】

【配列表フリーテキスト】配列番号３：PCR用プライマ
ー 配列番号４：PCR用プライマー

【図面の簡単な説明】

【図１】反応における温度条件と本発明の酵素の分解活
性との関係を示す。

【図２】反応におけるｐＨ条件と本発明の酵素の分解活
性との関係を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/20 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 9/52 5/00 Ａ (72)発明者 石田 紘靖 茨城県つくば市東１丁目１番３ 経済産業 省産業技術総合研究所 生命工学工業技術 研究所内 (72)発明者 安藤 進 茨城県つくば市東１丁目１番３ 経済産業 省産業技術総合研究所 生命工学工業技術 研究所内 (72)発明者 高 仁鈞 中華人民共和国江蘇省東台市富安鎮富西居 委会六組 Ｆターム(参考） 4B024 BA11 BA14 CA04 DA06 EA04 GA11 HA01 4B050 CC03 DD02 LL05 4B065 AA01X AA26X AC02 BA02 BA22 CA46 CA50

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ３０〜１００℃の温度範囲においてぺプ
   チダーゼ活性及びエステラーゼ活性を有する超耐熱性エ
   ステラーゼ。
2. 【請求項２】 アエロパイラム属由来である、請求項１
   記載の超耐熱性エステラーゼ。
3. 【請求項３】 下記の（１）又は（２）のポリヌクレオ
   チド。 （１）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリ
   ヌクレオチド （２）配列番号１に示すヌクレオチド配列において１若
   しくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加
   されたポリヌクレオチドであって、３０〜１００℃の温
   度範囲においてぺプチダーゼ活性及びエステラーゼ活性
   を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
4. 【請求項４】 下記の（３）又は（４）のポリペプチ
   ド。 （３）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプ
   チド （４）配列番号２に示すアミノ酸配列において１若しく
   は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたポ
   リペプチドであって、３０〜１００℃の温度範囲におい
   てぺプチダーゼ活性及びエステラーゼ活性を有するポリ
   ペプチド
5. 【請求項５】 請求項３に記載のポリヌクレオチドを含
   有する組換えベクター。
6. 【請求項６】 請求項５に記載の組換えベクターを含有
   する形質転換体。
7. 【請求項７】 アエロパイラム属に属する超耐熱性エス
   テラーゼ生産菌を培地中で培養し、培養物から超耐熱性
   エステラーゼを採取することを特徴とする、請求項２に
   記載の超耐熱性エステラーゼの製造方法。
8. 【請求項８】 請求項６に記載の形質転換体を培地中で
   培養し、培養物から超耐熱性エステラーゼを採取するこ
   とを特徴とする、請求項１又は２に記載の超耐熱性エス
   テラーゼの製造方法。
9. 【請求項９】 ７０℃以上の温度におけるペプチド、エ
   ステル、及び／又は脂質の分解、合成、交換あるいはラ
   セミ体エステルの光学分割のための、請求項１又は２に
   記載の超耐熱性エステラーゼの使用方法。
10. 【請求項１０】 上記ペプチド、エステル、及び／又は
    脂質が室温において固体状である場合、有機溶媒を添加
    することを特徴とする、請求項９に記載の使用方法。