JP7530554B2

JP7530554B2 - ３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および／またはアジピン酸を生産するための遺伝子改変微生物および当該化学品の製造方法

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Publication number: JP7530554B2
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Inventors: 匡平磯部; 健司河村; 勝成山田
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Description

本発明は、目的物質の生産に関与するポリペプチドをコードする核酸を導入、または当該ポリペプチドの発現を増強した遺伝子改変微生物および当該微生物を用いた物質製造方法に関する。

３－ヒドロキシアジピン酸（ＩＵＰＡＣ名：３－ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｅｄｉｏｉｃａｃｉｄ）、α－ヒドロムコン酸（ＩＵＰＡＣ名：（Ｅ）－ｈｅｘ－２－ｅｎｅｄｉｏｉｃａｃｉｄ）およびアジピン酸（ＩＵＰＡＣ名：ｈｅｘａｎｅｄｉｏｉｃａｃｉｄ）は炭素数６のジカルボン酸である。これらは多価アルコールと重合することでポリエステルとして、また多価アミンと重合することでポリアミドの原料として用いることができる。また、これらの末端にアンモニアを付加してラクタム化することで、単独でもポリアミドの原料になり得る。

微生物を利用した３－ヒドロキシアジピン酸またはα－ヒドロムコン酸の製造に関連して以下の文献が知られている。

特許文献１には、代謝経路を改変した微生物を用いた１，３－ブタジエンの製造方法が記載されており、当該文献中では、アセチル－ＣｏＡおよびスクシニル－ＣｏＡから１，３－ブタジエンが生合成される代謝経路における代謝中間体として３－ヒドロキシアジピン酸（３－ヒドロキシアジペート）が記載されている。

特許文献２には、代謝経路を改変した微生物を用いたムコン酸の製造方法が記載されており、当該文献中では、アセチル－ＣｏＡおよびスクシニル－ＣｏＡからｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ－ムコン酸が生合成される代謝経路における代謝中間体としてα－ヒドロムコン酸（２，３－デヒドロアジペート）が記載されている。

特許文献３、４には、非天然の微生物を用いたアジピン酸やヘキサメチレンジアミン（ＨＭＤＡ）の製造方法が記載されており、当該文献中で、これらの物質は、アセチル－ＣｏＡおよびスクシニル－ＣｏＡから３－オキソアジピル－ＣｏＡが合成される反応が生合成経路に含まれる点で共通しているが、３－オキソアジピル－ＣｏＡ以降の生合成経路は別々であると記載されている。さらに、特許文献３では、ＨＭＤＡの製造において、増殖と共役したＨＭＤＡの形成を改善するための代謝経路の追加的な遺伝子欠失としてピルビン酸キナーゼが記載されているが、ピルビン酸キナーゼの欠損が、アジピン酸の生産性向上に関係するとの記載はない。

また、特許文献１から４に記載された生合成経路では、いずれも３－オキソアジピル－ＣｏＡを３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡへと還元する酵素反応を経由するとの記載がある。

特許文献５および特許文献６には、セラチア属微生物を用いた３－ヒドロキシアジピン酸と、α－ヒドロムコン酸の製造方法がそれぞれ記載されている。当該文献中には、特に、アセチル－ＣｏＡおよびスクシニル－ＣｏＡより３－オキソアジピル－ＣｏＡを生じる反応を触媒するアシルトランスフェラーゼの活性を強化することにより、３－ヒドロキシアジピン酸とα－ヒドロムコン酸の生産効率を向上させることが可能であることが開示されているが、ピルビン酸キナーゼに関する記載はない。

また、特許文献７には、インシリコ分析に基づく微生物の改良方法が開示されており、大腸菌のピルビン酸キナーゼおよびホスホトランスフェラーゼ系酵素をコードする遺伝子であるｐｙｋＦ、ｐｙｋＡ、ｐｔｓＧを欠失させ、嫌気条件下で培養することにより、コハク酸の生産性が向上することが開示されている。

特表２０１３－５３５２０３号公報米国特許出願公開第２０１１／０１２４９１１Ａ１号明細書特開２０１５－１４６８１０号公報特表２０１１－５１５１１１号公報国際公開第２０１７／２０９１０２号国際公開第２０１７／２０９１０３号特表２００８－５２７９９１号公報

特許文献１または２には、微生物内で３－ヒドロキシアジピン酸またはα－ヒドロムコン酸が生成しうる代謝経路の記載はあるが、代謝を３－ヒドロキシアジピン酸またはα－ヒドロムコン酸で止め、培養液中に分泌させるという記載はない。また、特許文献１から４に記載された３－オキソアジピル－ＣｏＡを３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡへと還元する反応を触媒する酵素をコードする核酸を導入した非天然の微生物を用いて、実際に３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸またはアジピン酸が製造できるかどうかの検証はなされていない。従って特許文献１から４に記載された３－オキソアジピル－ＣｏＡを３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡへと還元する反応を触媒する酵素についても、３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および／またはアジピン酸の製造において優れた活性を示す当該酵素の存在は未だ知られていなかった。

そこで本発明では、３－オキソアジピル－ＣｏＡを基質とした還元反応において優れた活性を示す酵素をコードする核酸を導入、または当該酵素の発現を増強した遺伝子改変微生物を基にさらに代謝経路を改変して、３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および／またはアジピン酸を高い収率で製造するための遺伝子改変微生物および当該改変微生物を用いた物質製造方法を提供することを目的とする。

本発明者らは上記目的を達成するため鋭意検討した結果、３－オキソアジピル－ＣｏＡを基質とした還元反応において優れた活性を示す酵素をコードする核酸を導入、または当該酵素の発現を増強し、さらに、ピルビン酸キナーゼの機能を欠損させた遺伝子改変微生物は、高い収率で３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および／またはアジピン酸を製造可能であることを見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は、以下のものを提供する。
（１）以下（ａ）～（ｃ）のいずれかに記載のポリペプチドをコードする核酸を導入、または当該ポリペプチドの発現を増強し、かつピルビン酸キナーゼの機能を欠損させた遺伝子改変微生物：
（ａ）配列番号１～７のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号１～７のいずれかのアミノ酸配列において、１０個以下のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素活性を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号１～７のいずれかのアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有し、かつ３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素活性を有するポリペプチド。
（２）前記（ｂ）および（ｃ）から選択されるポリペプチドが、配列番号１７３のアミノ酸配列からなる領域を含む、（１）記載の遺伝子改変微生物。
（３）前記配列番号１７３のアミノ酸配列において、Ｎ末端側から１３番目のアミノ酸残基がフェニルアラニンまたはロイシンであり、Ｎ末端側から１５番目のアミの酸残基がロイシンまたはグルタミンであり、Ｎ末端側から１６番目のアミノ酸残基がリシンまたはアスパラギンであり、Ｎ末端側から１７番目のアミノ酸残基がグリシンまたはセリンであり、Ｎ末端側から１９番目のアミノ酸残基がプロリンまたはアルギニンであり、Ｎ末端側から２１番目のアミノ酸残基がロイシン、メチオニンまたはバリンである、（２）記載の遺伝子改変微生物。
（４）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｈａｆｎｉａ属およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属からなる群から選ばれる微生物の遺伝子改変体である、（１）～（３）のいずれかに記載の遺伝子改変微生物。
（５）アセチル－ＣｏＡおよびスクシニル－ＣｏＡから３－オキソアジピルＣｏＡおよび補酵素Ａを生成する能力並びに３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡから３－ヒドロキシアジピン酸を生成する能力を有する、（１）～（４）のいずれかに記載の遺伝子改変微生物。
（６）アセチル－ＣｏＡおよびスクシニル－ＣｏＡから３－オキソアジピルＣｏＡおよび補酵素Ａを生成する能力、３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡから２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡを生成する能力並びに２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡからα－ヒドロムコン酸を生成する能力を有する、（１）～（４）のいずれかに記載の遺伝子改変微生物。
（７）アセチル－ＣｏＡおよびスクシニル－ＣｏＡから３－オキソアジピルＣｏＡおよび補酵素Ａを生成する能力、３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡから２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡを生成する能力、２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡからアジピル－ＣｏＡを生成する能力並びにアジピル－ＣｏＡからアジピン酸を生成する能力を有する、（１）～（４）のいずれかに記載の遺伝子改変微生物。
（８）さらにホスホトランスフェラーゼ系酵素の機能を欠損させた、（１）～（７）のいずれかに記載の遺伝子改変微生物。
（９）（１）～（５）および（８）のいずれかに記載の遺伝子改変微生物を、炭素源を発酵原料として含む培地にて培養することを含む、３－ヒドロキシアジピン酸の製造方法。
（１０）（１）～（４）、（６）および（８）のいずれかに記載の遺伝子改変微生物を、炭素源を発酵原料として含む培地にて培養することを含む、α－ヒドロムコン酸の製造方法。
（１１）（１）～（４）、（７）および（８）のいずれかに記載の遺伝子改変微生物を、炭素源を発酵原料として含む培地にて培養することを含む、アジピン酸の製造方法。

本発明に係る遺伝子改変微生物は、３－オキソアジピル－ＣｏＡから３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡへの還元反応において優れた活性を示す酵素を発現し、さらにピルビン酸キナーゼの機能が欠損していることによって、ピルビン酸キナーゼの機能が欠損していない親株の微生物と比較して、３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および／またはアジピン酸を高い収率で生産することができる。

本発明に係る物質製造方法は、３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを経由して生成する３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および／またはアジピン酸の生産性に優れる遺伝子改変微生物を用いるため、これらの物質の生産性を大幅に向上させることができる。

３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子と、５－アミノレブリン酸シンターゼ遺伝子とが構成する遺伝子クラスターを示す図である。

本発明の微生物は、以下（ａ）～（ｃ）に記載のポリペプチドをコードする核酸を導入、または当該ポリペプチドの発現を増強し、かつピルビン酸キナーゼの機能を欠損させた遺伝子改変微生物である。

（ａ）配列番号１～７のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号１～７のいずれかに記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素活性を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号１～７のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の配列同一性を有し、かつ３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する活性を有するポリペプチド

以下、本明細書中では３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素を「３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼ」と記載する。また、本明細書では３－ヒドロキシアジピン酸を３ＨＡ、α－ヒドロムコン酸をＨＭＡ、アジピン酸をＡＤＡと略すことがある。

本発明で核酸を導入するとは、微生物の菌体外から菌体内へと核酸を導入し、該微生物に該核酸がコードするポリペプチドの生産能を付与することを指す。導入する方法は特に限定されず、微生物内で自律複製可能な発現ベクターに当該核酸を組み込み宿主微生物に導入する方法や、微生物のゲノムに当該核酸を組み込む方法などを用いることができる。

本発明でポリペプチドの発現を増強するとは、微生物が元来有しているポリペプチドの発現を増強することを指す。発現を増強する方法は特に限定されないが、当該ポリペプチドをコードする核酸のコピー数を増加させる方法、当該ポリペプチドのコーディング領域上流のプロモーター領域やリボソーム結合配列を改変する方法などが挙げられる。これらの方法は単独で行ってもよいし、組み合わせてもよい。

また、導入する核酸は１種類でも複数種類でもよい。また核酸の導入とポリペプチドの発現の増強を組み合わせてもよい。

本発明で用いる、配列番号１～７のいずれかに記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼの酵素活性を有するポリペプチドついて、「１もしくは数個」の範囲は、１０個以内が好ましく、さらに好ましくは５個以内、特に好ましくは４個以内、最も好ましくは１個または２個以内である。ここで、アミノ酸が置換される場合、性質が類似したアミノ酸に置換された場合（いわゆる保存的置換）にポリペプチドの活性が維持される可能性が高くなる。すなわち、アミノ酸が置換する場合、類似した性質のアミノ酸に置換しても生理活性が維持される場合が多いので、置換の場合は、類似した性質のアミノ酸に置換したものが好ましい。すなわち、天然のタンパク質を構成する２０種類のアミノ酸は、低極性側鎖を有する中性アミノ酸（Ｇｌｙ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ａｌａ，Ｍｅｔ，Ｐｒｏ）、親水性側鎖を有する中性アミノ酸（Ａｓｎ，Ｇｌｎ，Ｔｈｒ，Ｓｅｒ，Ｔｙｒ，Ｃｙｓ）、酸性アミノ酸（Ａｓｐ，Ｇｌｕ）、塩基性アミノ酸（Ａｒｇ，Ｌｙｓ，Ｈｉｓ）、芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐ）のように類似の性質を有するものにグループ分けでき、これらの間での置換であればポリペプチドの性質が変化しないことが多い。

本発明で用いる、配列番号１～７のいずれかのアミノ酸配列に対して７０％以上の配列同一性を有し、かつ３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼの酵素活性を有するポリペプチドについて、配列同一性の好ましい範囲は、８０％以上が好ましく、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９９％以上である。

本発明で「配列同一性」とは、２つのアミノ酸配列または塩基配列にギャップを導入して、またはギャップを導入しないで整列させた場合の、最適なアライメントにおいて、オーバーラップする全アミノ酸配列（翻訳開始点となるアミノ酸を含む）または塩基配列（開始コドンを含む）に対する同一アミノ酸または塩基の割合（パーセンテージ）を意味し、式（１）によって算出する。式（１）において、比較する短い方の配列長は４００アミノ酸以上であり、４００アミノ酸未満の場合には配列同一性は定義されない。配列同一性は、この分野で汎用されているアルゴリズムであるＢＬＡＳＴ（ＢａｓｉｃＬｏｃａｌＡｌｉｇｎｍｅｎｔＳｅａｒｃｈＴｏｏｌ）を用いて容易に調べることができる。例えばＢＬＡＳＴは、ＮＣＢＩ（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）やＫＥＧＧ（ＫｙｏｔｏＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａｏｆＧｅｎｅｓａｎｄＧｅｎｏｍｅｓ）などのウェブサイトから誰でも利用可能であり、デフォルトのパラメーターを用いて容易に配列同一性を調べることができる。また、配列同一性はＧｅｎｅｔｙｘなどのソフトウェアに搭載されている同様の機能を用いても調べることができる。

配列同一性（％）＝一致数（ギャップ同士はカウントしない）／短い方の配列長（両端のギャップを含まない長さ）×１００・・・式（１）。

式（１）に従い、Ｇｅｎｅｔｙｘの機能（％ＩｄｅｎｔｉｔｙＭａｔｒｉｘ）を用いて配列番号１～７に記載のアミノ酸配列間の配列同一性を算出すると、最も配列同一性の値が低い配列番号２と４との値は７１．５１％となり、配列番号１～７に記載のアミノ酸配列は、お互いに少なくとも７０％以上の配列同一性を有している。Ｇｅｎｅｔｙｘを用いた配列同一性の算出結果を表１に示す。なお、下記表１～表５において、一番左側の数字は配列番号を示す。

配列番号１～７に記載の各アミノ酸配列をＱｕｅｒｙとして、ＮＣＢＩのアミノ酸データベース（Ｎｏｎ－ｒｅｄｕｎｄａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）に登録されている全アミノ酸配列との配列同一性を、ＢＬＡＳＴＰを用いて調べた結果、配列同一性が７０％以上の配列は全てＳｅｒｒａｔｉａ属細菌由来であった。

前記（ａ）の配列番号１～７に記載のポリペプチドは、いずれもＮ末端側からのアミノ酸残基１５～３８番目（以下、便宜的に、Ｎ末端側から何番目のアミノ酸残基かを、「ａ．ａ．」で表すことがある。したがって、例えば、Ｎ末端側からのアミノ酸残基１５～３８番目は、単に「１５～３８ａ．ａ．」と表すことがある）において配列番号１７３に示す２４アミノ酸残基からなる共通配列１を有している。共通配列１において、Ｘａａは任意のアミノ酸残基であるが、１３ａ．ａ．は好ましくはフェニルアラニンまたはロイシンであり、１５ａ．ａ．は好ましくはロイシンまたはグルタミンであり、１６ａ．ａ．は好ましくはリシンまたはアスパラギンであり、１７ａ．ａ．はグリシンまたはセリン、より好ましくはグリシンであり、１９ａ．ａ．は好ましくはプロリンまたはアルギニンであり、２１ａ．ａ．は好ましくはロイシン、メチオニンまたはバリンである。共通配列１は、ＮＡＤ＋結合残基およびその周辺のアミノ酸残基にあたる。ＮＡＤ＋結合残基は、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ．２０１２Ｆｅｂ；９４（２）：４７１－８．で示されているように、共通配列１の２４番目のアミノ酸残基がアスパラギン酸であるが、共通配列１ではアスパラギンである点が特徴である。共通配列１を有することによって、配列番号１～７に記載のポリペプチドは、３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼとしての優れた酵素活性を示すと考える。

前記（ｂ）および（ｃ）に記載のポリペプチドについても、１～２００ａ．ａ．以内に配列番号１７３に示す２４アミノ酸残基からなる共通配列１を有していることが好ましい。より好ましい共通配列の位置は、１～１５０ａ．ａ．以内であり、さらに好ましくは、１～１００ａ．ａ．以内である。その具体例としては、配列番号８～８６のアミノ酸配列が挙げられる。配列番号８～８６のアミノ酸配列は、１５～３８ａ．ａ．において配列番号１７３に示す２４アミノ酸残基からなる共通配列１を有している。なお、配列番号８～８６のアミノ酸配列は、配列番号１～７のいずれかのアミノ酸配列と配列同一性が９０％以上である。Ｇｅｎｅｔｙｘを用いた配列同一性の算出結果を表２－１から表２－３および表３－１から表３－３に示す。

本発明の（ａ）～（ｃ）に記載のポリペプチドをコードする核酸は、当該ポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端にさらなるペプチドまたはタンパク質が付加されるような配列を含んでいてもよい。このようなペプチドまたはタンパク質としては、例えば、分泌シグナル配列、輸送タンパク質、結合タンパク質、精製用のタグペプチド、蛍光タンパク質等を含むものが例示できる。こうしたペプチドまたはタンパク質に関しては、当業者が目的に応じて、付加する機能を有するペプチドまたはタンパク質を選択して、本発明のポリペプチドに付加することができる。なお、アミノ酸配列の配列同一性には、このようなペプチドまたはタンパク質は含まれない。

配列番号１～８６に記載のポリペプチドをコードする核酸は、配列番号１～８６に記載のアミノ酸配列に翻訳されうるような塩基配列であれば特に限定されず、各アミノ酸に対応するコドン（標準遺伝暗号）を参考に決定することができる。その際、本発明に使用する宿主微生物にとってよく使用されているコドンで塩基配列を再設計してもよい。

配列番号１～８６に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸の塩基配列の具体例としては、それぞれ、配列番号８７～１７２に記載の塩基配列が挙げられる。

本発明において、ある核酸がコードするポリペプチドが、３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼ活性を有しているかどうかは、以下の形質転換株Ａと形質転換株Ｂを作製し、培養試験の結果、培養液中に３－ヒドロキシアジピン酸またはα－ヒドロムコン酸を確認することができれば、当該核酸が３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードしていると判断する。判断方法を下記スキーム１に示す生合成経路を用いて説明する。

上記スキーム１は、３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸、および／またはアジピン酸を生産するために必要な反応経路の例を示している。ここで、反応Ａは、アセチル－ＣｏＡおよびスクシニル－ＣｏＡから３－オキソアジピル－ＣｏＡおよび補酵素Ａを生成する反応を示す。反応Ｂは、３－オキソアジピル－ＣｏＡから３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応を示す。反応Ｃは、３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡから２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡを生成する反応を示す。反応Ｄは、２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡからアジピル－ＣｏＡを生成する反応を示す。反応Ｅは３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡから３－ヒドロキシアジピン酸を生成する反応を示す。反応Ｆは、２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡからα－ヒドロムコン酸を生成する反応を示す。反応Ｇは、アジピル－ＣｏＡからアジピン酸を生成する反応を示す。

形質転換株Ａは、反応Ａ，反応Ｅおよび反応Ｆを触媒する酵素を有する。形質転換株Ｂは、反応Ａ、反応Ｃ、反応Ｅおよび反応Ｆを触媒する酵素を有する。

まず、形質転換株Ａを作製する。反応Ａ、反応Ｅおよび反応Ｆをそれぞれ触媒する酵素を発現するプラスミドを作製する。なお、反応ＥとＦは同一の酵素で反応を触媒することが可能である。当該プラスミドを、３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸、およびアジピン酸のいずれも生産する能力のない微生物株であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入する。得られた形質転換株に対し、酵素活性の有無を調べる対象となるポリペプチドをコードする核酸を適当なプロモーターの下流に組み込んだ発現プラスミドを導入し、形質転換株Ａを得る。形質転換株Ａを培養し、培養後の培養液に３－ヒドロキシアジピン酸が含まれているかどうかを確認する。３－ヒドロキシアジピン酸が培養液中に確認できた場合、次に形質転換株Ｂを作製する。形質転換株Ｂは、形質転換株Ａに対し、反応Ｃを触媒する酵素を発現するプラスミドを作製して導入することで得る。形質転換株Ｂを培養し、培養後の培養液にα－ヒドロムコン酸が含まれているかどうかを確認する。培養後の培養液にα－ヒドロムコン酸が含まれることを確認することができれば、形質転換株Ａが生産した３－ヒドロキシアジピン酸および形質転換株Ｂが生産したα－ヒドロムコン酸は、３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを経由して生成されたことがわかるため、対象となるポリペプチドが３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼ活性を有していると判断する。

反応Ａを触媒する酵素をコードする遺伝子として、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａＫＴ２４４０株由来のｐｃａＦ（ＮＣＢＩＧｅｎｅＩＤ：１０４１７５５、配列番号１７４）を用いる。

反応ＥおよびＦを触媒する酵素をコードする遺伝子として、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａＫＴ２４４０株由来のｐｃａＩおよびｐｃａＪ（ＮＣＢＩＧｅｎｅＩＤ：１０４６６１３、１０４６６１２、配列番号１７５、１７６）の全長を含む連続した配列を用いる。ｐｃａＩおよびｐｃａＪがコードするポリペプチドは、複合体を形成することによって反応Ｅと反応Ｆを触媒する。

反応Ｃを触媒する酵素をコードする核酸として、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａＫＴ２４４０株遺伝子ｐａａＦ（ＮＣＢＩＧｅｎｅＩＤ：１０４６９３２、配列番号１７７）を用いる。

形質転換株Ａ、形質転換株Ｂの培養方法は、以下のとおりである。なお培養の際には、プラスミドを安定に保持するための抗生物質や、組み込んだ核酸がコードするポリペプチドの発現を誘導する物質を適宜加えることができる。ｐＨ７に調整した培地Ｉ（Ｂａｃｔｏトリプトン（ＤｉｆｃｏＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）１０ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ酵母エキス（ＤｉｆｃｏＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）５ｍＬに、形質転換株ＡまたはＢを一白金耳植菌し、３０℃、１２０ｍｉｎ－１で１８時間振とう培養し、前培養液とする。続いて当該前培養液０．２５ｍＬをｐＨ６．５に調整した培地ＩＩ（コハク酸１０ｇ／Ｌ、グルコース１０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム１ｇ／Ｌ、リン酸カリウム５０ｍＭ、硫酸マグネシウム０．０２５ｇ／Ｌ、硫酸鉄０．０６２５ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン２．７ｍｇ／Ｌ、塩化カルシウム０．３３ｍｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１．２５ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏトリプトン２．５ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ酵母エキス１．２５ｇ／Ｌ）５ｍＬに添加し、３０℃、１２０ｍｉｎ－１で２４時間振とう培養する。得られた培養液中に３－ヒドロキシアジピン酸またはα－ヒドロムコン酸が含まれているかを確認する。

培養液中に３－ヒドロキシアジピン酸またはα－ヒドロムコン酸が含まれることは、培養液を遠心し、上清をＬＣ－ＭＳ／ＭＳで分析することにより確認できる。分析の条件は以下のとおりである。

・ＨＰＬＣ：１２９０Ｉｎｆｉｎｉｔｙ（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）
カラム：Ｓｙｎｅｒｇｉｈｙｄｒｏ－ＲＰ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）、長さ１００ｍｍ、内径３ｍｍ、粒径２．５μｍ
移動相：０．１％ギ酸水溶液／メタノール＝７０／３０
流速：０．３ｍＬ／分
カラム温度：４０℃
ＬＣ検出器：ＤＡＤ（２１０ｎｍ）
・ＭＳ／ＭＳ：Ｔｒｉｐｌｅ－ＱｕａｄＬＣ／ＭＳ（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）
イオン化法：ＥＳＩネガティブモード。

３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼの活性の値は、３－オキソアジピン酸から酵素反応で調製した３－オキソアジピル－ＣｏＡを基質として、精製３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼを用いて生成する３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを測定することで算出できる。具体的な方法は、以下の通りである。

３－オキソアジピン酸は公知の方法（例えば、ＷＯ２０１７／０９９２０９の参考例１に記載された方法）により調製することができる。

３－オキソアジピル－ＣｏＡ溶液の調製：常法に従いＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａＫＴ２４４０株のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行い、ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする核酸（ｐｃａＩおよびｐｃａＪ、ＮＣＢＩ－ＧｅｎｅＩＤ：１０４６６１３および１０４６６１２）の全長を増幅する。なお、このＰＣＲで用いるプライマーの塩基配列は、例えば配列番号１９４および１９５である。当該増幅断片を大腸菌用発現ベクターであるｐＲＳＦ－１ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＫｐｎＩサイトに、ヒスチジンタグ配列と同じフレームとなるよう挿入する。当該プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、常法に従いイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による当該酵素の発現誘導、続いて培養液からのヒスチジンタグを利用した精製を行い、ＣｏＡトランスフェラーゼ溶液を得る。当該溶液を用いて以下組成の３－オキソアジピル－ＣｏＡ調製用酵素反応溶液を調製し、２５℃で３分分反応させた後、ＵＦ膜（ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ－０．５ｍＬ１０Ｋ、ＭｅｒｃｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で処理することで酵素を除去し、得られた透過液を３－オキソアジピル－ＣｏＡ溶液とする。

（酵素反応溶液）
１００ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．２）
１０ｍＭＭｇＣｌ_２
０．５ｍＭｓｕｃｃｉｎｙｌ－ＣｏＡ
５ｍＭ３－ｏｘｏａｄｉｐｉｃａｃｉｄｓｏｄｉｕｍｓａｌｔ
２μＭＣｏＡｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ。

３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼ活性の確認：常法に従い対象とする微生物株のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行い、３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼをコードする核酸全長を増幅する。なお、このＰＣＲで用いるプライマーの塩基配列は、例えば配列番号１９６および１９７である。当該増幅断片を大腸菌用発現ベクターｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＢａｍＨＩサイトに、ヒスチジンタグ配列と同じフレームとなるよう挿入する。当該プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、常法に従いイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による当該酵素の発現誘導、続いて培養液からのヒスチジンタグを利用した精製を行い、３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼ溶液を得る。３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼ活性は、本酵素溶液を用いて以下組成の酵素反応溶液を調製し、２５℃における３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡの生成量を測定することで確認できる。

（酵素反応溶液）
１００ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．２）
１０ｍＭＭｇＣｌ_２
１５０μＬ／ｍＬ３－ｏｘｏａｄｉｐｙｌ－ＣｏＡｓｏｌｕｔｉｏｎ
０．５ｍＭＮＡＤＨ
１ｍＭｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ
１０μＭ３－ｏｘｏａｄｉｐｙｌ－ＣｏＡｒｅｄｕｃｔａｓｅ。

本発明で、（ａ）～（ｃ）に記載のポリペプチドの発現を増強した遺伝子改変微生物は、（ａ）～（ｃ）に記載のポリペプチドをコードする核酸を元来有している微生物を宿主として、当該宿主微生物が有する（ａ）～（ｃ）に記載のポリペプチドの発現を、遺伝子改変により増強した微生物である。

（ａ）～（ｃ）に記載のポリペプチドをコードする核酸を元来有している微生物の具体例は、以下のＳｅｒｒａｔｉａ属微生物が挙げられる。Ｓｅｒｒａｔｉａｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ（配列番号１、１８～２８、３０～３３、３５～６６、６９、７０、７２～７８、７９を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａｎｅｍａｔｏｄｉｐｈｉｌａ（配列番号２、２９、６７を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ（配列番号３、７９～８４、８６を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａｐｒｏｔｅａｍａｃｕｌａｎｓ（配列番号４、８５を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａｕｒｅｉｌｙｔｉｃａ（配列番号５を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａｓｐ．ＢＷ１０６（配列番号６を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ（配列番号７を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａｓｐ．Ｓ１１９（配列番号８を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａｓｐ．ＹＤ２５（配列番号９を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａｓｐ．ＦＳ１４（配列番号１０を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａｓｐ．ＨＭＳＣ１５Ｆ１１（配列番号１１を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａｓｐ．ＪＫＳ０００１９９（配列番号１２を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａｓｐ．ＴＥＬ（配列番号１３を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａｓｐ．ＩＳＴＤ０４（配列番号１４を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａｓｐ．ＳＣＢＩ（配列番号１５を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａｓｐ．Ｓ４（配列番号１６を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａｓｐ．Ｃ－１（配列番号１７を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａｓｐ．ＯＭＬＷ３（配列番号３４を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａｓｐ．ＯＬＥＬ１（配列番号６８を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａｓｐ．ＯＬＥＬ２（配列番号７１を有する微生物）などが挙げられる。

上記した（ａ）、（ｂ）、（ｃ）に記載したポリペプチドは、３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性をも兼備しており、この３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼは、Ｓｅｒｒａｔｉａ属微生物において５－アミノレブリン酸シンターゼ遺伝子と遺伝子クラスターを構成する３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子によりコードされるものである。

ここで、Ｓｅｒｒａｔｉａ属微生物において５－アミノレブリン酸シンターゼ遺伝子と遺伝子クラスターを構成する３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子において、「遺伝子クラスター」とは、関連する機能を有する一連の核酸群が近接して存在する領域を意味する。遺伝子クラスターの具体的な構成要素としては、例えば単一の転写制御因子により転写調節される核酸群、単一の転写プロモーター制御下で転写されるオペロンなどが挙げられる。ある核酸が遺伝子クラスターを構成する核酸であるかどうかは、オンラインでａｎｔｉＳＭＡＳＨなどの遺伝子クラスター検索プログラムを用いて調べることもできる。また、あるポリペプチドが３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼあるいは５－アミノレブリン酸シンターゼに分類されるかどうかは、ＮＣＢＩ（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）やＫＥＧＧ（ＫｙｏｔｏＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａｏｆＧｅｎｅｓａｎｄＧｅｎｏｍｅｓ）などのウェブサイトでＢＬＡＳＴ（ＢａｓｉｃＬｏｃａｌＡｌｉｇｎｍｅｎｔＳｅａｒｃｈＴｏｏｌ）検索を行い、当該ポリペプチドのアミノ酸配列との相同性が高い酵素を調べることでわかる。例えば配列番号４のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩのデータベース上で、ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＡＢＶ４０９３５．１として登録されており、アミノ酸配列から、３－ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質であると推定されることが記載されている。また、配列番号４のアミノ酸配列をコードする遺伝子は、ＮＣＢＩのデータベース上で、ＧｅｎｅＩＤ：ＣＰ０００８２６．１として登録されており、Ｓｅｒｒａｔｉａｐｒｏｔｅａｍａｃｕｌａｎｓ５６８のゲノム上に保存されていること、またＧｅｎｅＩＤ：ＣＰ０００８２６．１の位置２０１５３１３から２０１６８４２に保存されていることが検索できる。さらに、この遺伝子の位置情報から、その前後の遺伝子配列を確認することができ、５－アミノレブリン酸シンターゼ遺伝子（ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＡＢＶ４０９３３．１）と図１に示す遺伝子クラスターを構成することも確認できる。同様に、配列番号１～３、６～２０、２２～３０、３２～３５、３７、３８、４０、４２～４８、５１～５６、５９～６３、６５、６６、６８～７３、７５～８１、８３～８５のアミノ酸配列については、表３－４、表３－５に示すプロテインＩＤとＧｅｎｅＩＤによって、ＮＣＢＩ上でその情報を確認することが可能である。

以下、本明細書中では、Ｓｅｒｒａｔｉａ属微生物において５－アミノレブリン酸シンターゼ遺伝子と遺伝子クラスターを構成する３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子にコードされるポリペプチドをコードする核酸を、「本発明で用いる３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子」と記載し、当該３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子がコードするポリペプチドを、「本発明で用いる３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ」と記載する。

本発明で用いる３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子が含まれる遺伝子クラスターは、少なくとも３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子および５－アミノレブリン酸シンターゼ遺伝子を含んでいれば、他の核酸がクラスターに含まれていてもよい。図１に本発明で用いる３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子が含まれる遺伝子クラスターの具体例を示す。

当該遺伝子クラスターを有するＳｅｒｒａｔｉａ属微生物の具体例は、Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓ．ｎｅｍａｔｏｄｉｐｈｉｌａ、Ｓ．ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ、Ｓ．ｐｒｏｔｅａｍａｃｕｌａｎｓ、Ｓ．ｕｒｅｉｌｙｔｉｃａ、Ｓ．ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａｓｐ．ＢＷ１０６、Ｓｅｒｒａｔｉａｓｐ．Ｓ１１９、Ｓｅｒｒａｔｉａｓｐ．ＹＤ２５、Ｓｅｒｒａｔｉａｓｐ．ＦＳ１４、Ｓｅｒｒａｔｉａｓｐ．ＨＭＳＣ１５Ｆ１１、Ｓｅｒｒａｔｉａｓｐ．ＪＫＳ０００１９９、Ｓｅｒｒａｔｉａｓｐ．ＴＥＬ、Ｓｅｒｒａｔｉａｓｐ．ＩＳＴＤ０４、Ｓｅｒｒａｔｉａｓｐ．ＳＣＢＩ、Ｓｅｒｒａｔｉａｓｐ．Ｓ４、Ｓｅｒｒａｔｉａｓｐ．Ｃ－１、Ｓｅｒｒａｔｉａｓｐ．ＯＭＬＷ３、Ｓｅｒｒａｔｉａｓｐ．ＯＬＥＬ１、Ｓｅｒｒａｔｉａｓｐ．ＯＬＥＬ２、Ｓ．ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓなどが挙げられる。

本発明で用いる、３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼは、優れた３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼ活性を有している。３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼをコードする核酸が、３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼ活性を有しているかどうかは、上記と同様の方法で確認することができる。

本発明で用いる３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子がコードするポリペプチドは、共通配列１を有していることを特徴とする。このようなポリペプチドのアミノ酸配列の具体例としては、配列番号１～８６のアミノ酸配列が挙げられる。

本発明では、前記共通配列１を有していれば、配列番号８～８６のいずれのポリペプチドのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸も好ましく用いることができる。ここで、「１もしくは数個」の範囲は、１０個以内が好ましく、さらに好ましくは５個以内、特に好ましくは４個以内、最も好ましくは１個または２個以内である。ここで、アミノ酸が置換される場合、性質が類似したアミノ酸に置換された場合（すなわち、上記した保存的置換）にポリペプチドの活性が維持される可能性が高くなる。また、配列番号８～８６のいずれのポリペプチドのアミノ酸配列と、配列同一性が７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９９％以上の配列同一性を有し、かつ３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸も好ましく用いることができる。

一方で、本発明で用いる３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼには該当しないが、３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼの活性を有しているポリペプチドとして、例えば、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａＫＴ２４４０株由来のＰａａＨ（配列番号１７８）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｓｔｒ．Ｋ－１２ｓｕｂｓｔｒ．ＭＧ１６５５株由来のＰａａＨ（配列番号１７９）、ＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｂａｙｌｙｉＡＤＰ１株由来のＤｃａＨ（配列番号１８０）、ＳｅｒｒａｔｉａｐｌｙｍｕｔｈｉｃａＮＢＲＣ１０２５９９株由来のＰａａＨ（配列番号１８１）などが挙げられるが、これらのポリペプチドには、表４および表５に示すように共通配列１が含まれていないことがわかる。なお、これらのポリペプチドは、（ｂ）配列番号１～７のいずれかのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素活性を有するポリペプチド、または（ｃ）配列番号１～７のいずれかのアミノ酸配列に対して７０％以上の配列同一性を有し、かつ３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素活性を有するポリペプチドには該当しない。

本発明でピルビン酸キナーゼやホスホトランスフェラーゼ系酵素の機能を欠損させるとは、これら酵素活性を欠損させることである。機能を欠損させる方法は特に限定されないが、例えば、当該酵素をコードする遺伝子を、遺伝子変異剤、紫外線照射などによる遺伝子変異処理、部位特異的変異法等による塩基配列の一部や全部の欠損処理、塩基配列へのフレームシフト変異の導入、塩基配列へのストップコドンの挿入等により、欠損させることにより行うことができる。また、遺伝子組換え技術を用いて、塩基配列の全部または一部を除去したり、他の塩基配列と置換したりすることでも遺伝子の欠損を行うことができる。これらの中で好ましくは塩基配列の一部もしくは全体を欠損させる方法が好ましい。

ピルビン酸キナーゼはＥＣ２．７．１．４０に分類され、ホスホエノールピルビン酸（本明細書中ではＰＥＰと記載する場合がある。）を脱リン酸化し、ピルビン酸およびＡＴＰに変換する反応を触媒する酵素である。具体的には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｓｔｒ．Ｋ－１２ｓｕｂｓｔｒ．ＭＧ１６５５株由来のｐｙｋＦ（ＮＣＢＩ－ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＮＰ＿４１６１９１、配列番号１８２）、ｐｙｋＡ（ＮＣＢＩ－ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＮＰ＿４１６３６８、配列番号１８３）、およびＳｅｒｒａｔｉａｇｒｉｍｅｓｉｉＮＢＲＣ１３５３７株由来のｐｙｋＦ（配列番号１８４）、ｐｙｋＡ（配列番号１８５）などが挙げられる。

下記スキーム２の代謝経路に示されるように、本発明で用いる微生物がピルビン酸キナーゼをコードする遺伝子を２個以上有する場合は、全てのピルビン酸キナーゼの機能を欠損させることが好ましい。本発明で用いる微生物が有する遺伝子がコードするポリペプチドがピルビン酸キナーゼであるかどうかは、ＮＣＢＩ（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）やＫＥＧＧ（ＫｙｏｔｏＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａｏｆＧｅｎｅｓａｎｄＧｅｎｏｍｅｓ）などのウェブサイトでＢＬＡＳＴ（ＢａｓｉｃＬｏｃａｌＡｌｉｇｎｍｅｎｔＳｅａｒｃｈＴｏｏｌ）検索を行えばよい。または

本発明の遺伝子改変微生物は、さらにホスホトランスフェラーゼ系酵素の機能が欠損させることが好ましい。ホスホトランスフェラーゼ系酵素とは、ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ（ＰＥＰ）－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓｙｓｔｅｍ（ＰＴＳ）を指す（本明細書中では、ＰＴＳ酵素と記載することがある。）ＰＴＳは、下記スキーム２の代謝経路に示されるように、ヘキソース、ヘキシトール、二糖などの炭水化物を細胞内に取り込むための主要な仕組みである。ＰＴＳにおいて、炭水化物は細胞内に取り込まれると同時にリン酸エステルへと変換され、一方リン酸供与体であるＰＥＰはピルビン酸へと変換するため、ＰＴＳ酵素遺伝子を欠損した微生物変異体では、ＰＥＰからピルビン酸への変換反応が阻害される。

ＰＴＳ酵素は、炭水化物の種類によらず機能するｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅｓｕｇａｒｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｅｎｚｙｍｅＩおよびｐｈｏｓｐｈｏｃａｒｒｉｅｒｐｒｏｔｅｉｎＨＰｒの２種類の共通酵素と、特定の炭水化物に特異的なｍｅｍｂｒａｎｅ－ｂｏｕｎｄｓｕｇａｒｓｐｅｃｉｆｉｃｐｅｒｍｅａｓｅｓ（ｅｎｚｙｍｅＩＩ）で構成される。ｅｎｚｙｍｅＩＩはさらにｓｕｇａｒ－ｓｐｅｃｉｆｉｃＩＩＡ、ＩＩＢ、およびＩＩＣｃｏｍｐｏｎｅｎｔで構成される。ｅｎｚｙｍｅＩＩの酵素は生物種によって個別あるいは複数ドメインタンパクとしてつながった状態で存在する。微生物では、ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅｓｕｇａｒｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｅｎｚｙｍｅＩはｐｔｓＩ遺伝子、ｐｈｏｓｐｈｏｃａｒｒｉｅｒｐｒｏｔｅｉｎＨＰｒはｐｔｓＨ遺伝子、グルコース特異的ＩＩＡはｃｒｒ遺伝子、同じくグルコース特異的ＩＩＢおよびＩＩＣはｐｔｓＧ遺伝子にそれぞれコードされている。ｐｔｓＧ遺伝子がコードする酵素は、ＥＣ２．７．１．１９９に分類され、ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｎｐｉ－ｐｈｏｓｐｈｏｈｉｓｔｉｄｉｎｅ－Ｄ－ｇｌｕｃｏｓｅｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅと呼ばれる。

本発明では、上記のＰＴＳ酵素遺伝子のうち、１種類を欠損させてもよいし、複数を欠損させてもよい。上記のＰＴＳ酵素遺伝子のいずれを欠損させてもよいが、好ましくはグルコースの取り込みに関与する酵素遺伝子を欠損させることが好ましく、特にｐｔｓＧ遺伝子を欠損させることが好ましい。ｐｔｓＧ遺伝子の具体例には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｓｔｒ．Ｋ－１２ｓｕｂｓｔｒ．ＭＧ１６５５株由来のｐｔｓＧ（ＮＣＢＩ－ＧｅｎｅＩＤ：９４５６５１）およびＳｅｒｒａｔｉａｇｒｉｍｅｓｉｉＮＢＲＣ１３５３７株由来のｐｔｓＧ（配列番号２３８）などが挙げられる。

本発明で用いる微生物が有する遺伝子がコードするポリペプチドがｐｒｏｔｅｉｎ－Ｎｐｉ－ｐｈｏｓｐｈｏｈｉｓｔｉｄｉｎｅ－Ｄ－ｇｌｕｃｏｓｅｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅであるかどうかは、ＮＣＢＩやＫＥＧＧなどのウェブサイトでＢＬＡＳＴ検索を行えばよい。

後述のとおり、大腸菌は３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸を製造する能力を有する微生物であり、特表２００８－５２７９９１号公報では、大腸菌のピルビン酸キナーゼをコードするｐｙｋＦおよびｐｙｋＡ並びにホスホトランスフェラーゼ系酵素をコードするｐｔｓＧ遺伝子を欠損させた遺伝子改変株を作製したこと、また当該遺伝子改変株を嫌気的条件で培養すると、コハク酸の収率が増加し、酢酸およびエタノールの収率が減少することが記載されている。ここで酢酸およびエタノールは、上記スキーム２の代謝経路に示すように、アセチル－ＣｏＡから代謝される化合物である。つまり、特表２００８－５２７９９１号公報では、大腸菌のｐｔｓＧ、ｐｋＦ、ｐｙｋＡ遺伝子を欠損させることにより、アセチル－ＣｏＡの供給量が低下し、酢酸およびエタノールの収率が低下したと推定される。

本発明の方法で製造する３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および／またはアジピン酸は、前述のとおり、アセチル－ＣｏＡおよびスクシニル－ＣｏＡから反応Ａによって生産される３－オキソアジピル－ＣｏＡから複数の反応を介して代謝される化合物である。よって、特表２００８－５２７９９１号公報の記載から、ピルビン酸キナーゼとホスホトランスフェラーゼ系酵素の遺伝子を欠損させると、アセチル－ＣｏＡの供給量の低下により３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および／またはアジピン酸の収率も低下することが予想される。しかし、本発明では、上記の予想に反して、３－オキソアジピル－ＣｏＡから３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡへの還元反応において優れた活性を示す酵素を発現した遺伝子改変微生物において、ピルビン酸キナーゼおよびホスホトランスフェラーゼ系酵素の遺伝子を欠損させることで、３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および／またはアジピン酸の収率が向上し、かつ酢酸およびエタノールの収率も向上する。

本発明で遺伝子改変微生物を得るための宿主として用いることができる微生物は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｈａｆｎｉａ属、Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｄｅｌｆｔｉａ属、Ｓｈｉｍｗｅｌｌｉａ属、Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属およびＣａｎｄｉｄａ属に属する微生物が挙げられる。これらの中でも、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｈａｆｎｉａ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に属する微生物が好ましい。

本発明の遺伝子改変微生物を用いて３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および／またはアジピン酸を製造する方法を説明する。

３－ヒドロキシアジピン酸を製造する能力を有する微生物としては、アセチル－ＣｏＡおよびスクシニル－ＣｏＡから３－オキソアジピル－ＣｏＡおよび補酵素Ａを生成（反応Ａ）する能力、および３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡから３－ヒドロキシアジピン酸を生成（反応Ｅ）する能力を有する微生物を利用する。これらの生成能力を有する微生物を宿主微生物とすることで、３－ヒドロキシアジピン酸を高生産することができる本発明の遺伝子改変微生物を取得することができる。

前記反応ＡおよびＥを触媒する能力を元来有すると推定される微生物としては、以下の種属に属する微生物が挙げられる。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｆｅｒｇｕｓｏｎｉｉ、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉなどのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属。
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓｓｕｂｓｐ．ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓなどのＰｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ属。
ＨａｆｎｉａａｌｖｅｉなどのＨａｆｎｉａ属。
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍなどのＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属。
Ｂａｃｉｌｌｕｓｂａｄｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、ＢａｃｉｌｌｕｓｒｏｓｅｕｓなどのＢａｃｉｌｌｕｓ属。
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｖｉｎａｃｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｋａｒｎａｔａｋｅｎｓｉｓ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｏｌｉｖａｃｅｕｓなどのＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属。
Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓｎｅｃａｔｏｒ、ＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓｏｘａｌａｔｉｃｕｓなどのＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属。
Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｂａｙｌｙｉ、ＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｒａｄｉｏｒｅｓｉｓｔｅｎｓなどのＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属。
ＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｆａｅｃａｌｉｓなどのＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属。
ＮｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓａｌｂｕｓなどのＮｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ属。
ＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｏｄｉｎｕｍなどのＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属。
ＤｅｌｆｔｉａａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓなどのＤｅｌｆｔｉａ属。
ＳｈｉｍｗｅｌｌｉａｂｌａｔｔａｅなどのＳｈｉｍｗｅｌｌｉａ属。
ＡｅｒｏｂａｃｔｅｒｃｌｏａｃａｅなどのＡｅｒｏｂａｃｔｅｒ属。
ＲｈｉｚｏｂｉｕｍｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒなどのＲｈｉｚｏｂｉｕｍ属。
Ｓｅｒｒａｔｉａｇｒｉｍｅｓｉｉ、Ｓｅｒｒａｔｉａｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａｏｄｏｒｉｆｅｒａ、Ｓｅｒｒａｔｉａｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ、ＳｅｒｒａｔｉａｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａまたはＳｅｒｒａｔｉａｎｅｍａｔｏｄｉｐｈｉｌａなどのＳｅｒｒａｔｉａ属。

前記反応Ａおよび／またはＥを触媒する能力を元来有していない微生物であっても、これら反応Ａ、Ｅを触媒する酵素をコードする核酸を適当に組み合わせて微生物に導入し、これらの生成能を付与することで、前記宿主微生物として利用することができる。

α－ヒドロムコン酸を製造する能力を有する微生物としては、アセチル－ＣｏＡおよびスクシニル－ＣｏＡから３－オキソアジピルＣｏＡおよび補酵素Ａを生成（反応Ａ）する能力、３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを脱水して２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡを生成（反応Ｃ）する能力、および２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡからα－ヒドロムコン酸を生成（反応Ｆ）する能力を有する微生物を利用する。これらの生成能力を有する微生物を宿主微生物とすることで、α－ヒドロムコン酸を高生産することができる本発明の遺伝子改変微生物を取得することができる。

前記反応Ａ、ＣおよびＦを触媒する能力を元来有すると推定される微生物としては、以下の種属に属する微生物が挙げられる。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｆｅｒｇｕｓｏｎｉｉ、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉなどのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属。
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓｓｕｂｓｐ．ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓなどのＰｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ属。
ＨａｆｎｉａａｌｖｅｉなどのＨａｆｎｉａ属。
ＢａｃｉｌｌｕｓｂａｄｉｕｓなどのＢａｃｉｌｌｕｓ属。
Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓｎｕｍａｚｕｅｎｓｉｓ、ＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓｏｘａｌａｔｉｃｕｓなどのＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属。
Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｂａｙｌｙｉ、ＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｒａｄｉｏｒｅｓｉｓｔｅｎｓなどのＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属。
ＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｆａｅｃａｌｉｓなどのＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属。
ＤｅｌｆｔｉａａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓなどのＤｅｌｆｔｉａ属。
ＳｈｉｍｗｅｌｌｉａｂｌａｔｔａｅなどのＳｈｉｍｗｅｌｌｉａ属。
Ｓｅｒｒａｔｉａｇｒｉｍｅｓｉｉ、Ｓｅｒｒａｔｉａｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａｏｄｏｒｉｆｅｒａ、Ｓｅｒｒａｔｉａｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ、ＳｅｒｒａｔｉａｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａまたはＳｅｒｒａｔｉａｎｅｍａｔｏｄｉｐｈｉｌａなどのＳｅｒｒａｔｉａ属。

前記反応Ａ、Ｃおよび／またはＦを触媒する能力を元来有していない微生物であっても、これら反応Ａ、Ｃ、Ｆを触媒する酵素をコードする核酸を適当に組み合わせて微生物に導入し、これらの生成能を付与することで、前記宿主微生物として利用することができる。

アジピン酸を製造する能力を有する微生物としては、スクシニル－ＣｏＡから３－オキソアジピル－ＣｏＡおよび補酵素Ａを生成（反応Ａ）する能力、３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを脱水して２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡを生成（反応Ｃ）する能力、２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡを還元してアジピル－ＣｏＡを生成（反応Ｄ）する能力、およびアジピル－ＣｏＡからアジピン酸を生成（反応Ｇ）する能力を有する微生物を利用する。これらの生成能力を有する微生物を宿主微生物とすれば、アジピン産を高生産することができる遺伝子改変微生物を取得することができる。

前記反応Ａ、Ｃ、ＤおよびＧを触媒する能力を元来有すると推定される微生物としては、ＴｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａｆｕｓｃａなどのＴｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ属が挙げられる。

前記反応Ａ、Ｃ、ＤおよびＧを触媒する能力を元来有していない微生物であっても、これら反応Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｇを触媒する酵素をコードする核酸を適当に組み合わせて微生物に導入し、これらの生成能を付与することで、前記宿主微生物として利用することができる。

以下に反応Ａ、Ｃ～Ｇを触媒する酵素の具体例を示す。

３－オキソアジピル－ＣｏＡを生成する反応Ａを触媒する酵素は、例えば、アシルトランスフェラーゼ（β－ケトチオラーゼ）などを用いることができる。アシルトランスフェラーゼとしてはＥＣ番号による分類上の限定は特にないが、ＥＣ２．３．１．－に分類されるアシルトランスフェラーゼが好ましく、具体的には３－オキソアジピル－ＣｏＡチオラーゼとしてＥＣ２．３．１．１７４に分類される酵素、アセチル－ＣｏＡＣ－アセチルトランスフェラーゼとしてＥＣ２．３．１．９に分類される酵素、アセチル－ＣｏＡＣ－アシルトランスフェラーゼとしてＥＣ２．３．１．１６に分類される酵素が挙げられる。これらの中でもＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＭＧ１６５５株由来のＰａａＪ（ＮＣＢＩ－ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＮＰ＿４１５９１５）、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａＫＴ２４４０株由来のＰｃａＦ（ＮＣＢＩ－ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＮＰ＿７４３５３６）などを好ましく用いることができる。

上記のアシルトランスフェラーゼが、スクシニル－ＣｏＡおよびアセチル－ＣｏＡを基質として、３－オキソアジピル－ＣｏＡを生成できるかどうかは、精製アシルトランスフェラーゼによる３－オキソアジピル－ＣｏＡ生成反応と、３－オキソアジピル－ＣｏＡを基質とした精製３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼによる還元反応を組み合わせ、３－オキソアジピル－ＣｏＡの還元に伴うＮＡＤＨの減少量を測定することで確認できる。具体的な測定方法は、例えば以下の通りである。

アシルトランスフェラーゼ活性の確認：常法に従い対象とする微生物株のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行い、アシルトランスフェラーゼをコードする核酸全長を増幅する。当該増幅断片を大腸菌用発現ベクターｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＳａｃＩサイトに、ヒスチジンタグ配列と同じフレームとなるよう挿入する。当該プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、常法に従いイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による当該酵素の発現誘導、続いて培養液からのヒスチジンタグを利用した精製を行い、アシルトランスフェラーゼ溶液を得る。アシルトランスフェラーゼ活性は、当該酵素溶液を用いて以下組成の酵素反応溶液を調製し、３０℃におけるＮＡＤＨの酸化に伴う３４０ｎｍ吸収の減少を測定することで確認できる。

（酵素反応溶液）
１００ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
１０ｍＭＭｇＣｌ_２
０．１ｍＭｓｕｃｃｉｎｙｌ－ＣｏＡ
０．２ｍＭａｃｅｔｙｌ－ＣｏＡ
０．２ｍＭＮＡＤＨ
１ｍＭｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ
１０μｇ／ｍＬ３－ｏｘｏａｄｉｐｙｌ－ＣｏＡｒｅｄｕｃｔａｓｅ
５μｇ／ｍＬａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ。

本発明で用いる宿主微生物において元来発現する酵素がアシルトランスフェラーゼ活性を有しているかどうかは、精製アシルトランスフェラーゼの代わりに細胞破砕液（ｃｅｌｌｆｒｅｅｅｘｔｒａｃｔ：ＣＦＥ）を用いて上述の測定を行うことで確認できる。大腸菌を対象とした具体的な測定方法は、例えば以下の通りである。

ＣＦＥの調製：ｐＨ７に調整した培地（培地組成：トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）５ｍＬに活性測定の対象となる大腸菌ＭＧ１６５５株を一白金耳植菌し、３０℃で１８時間振とう培養する。得られた培養液をｐＨ７に調整した培地（培地組成：トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、フェルラ酸２．５ｍＭ、ｐ－クマル酸２．５ｍＭ、安息香酸２．５ｍＭ、ｃｉｓ，ｃｉｓ－ムコン酸２．５ｍＭ、プロトカテク酸２．５ｍＭ、カテコール２．５ｍＭ、３ＯＡ２．５ｍＭ、３－ヒドロキシアジピン酸２．５ｍＭ、α－ヒドロムコン酸２．５ｍＭ、アジピン酸２．５ｍＭ、フェニルエチルアミン２．５ｍＭ）５ｍＬに添加し、３０℃で３時間振とう培養する。

得られた培養液に１０ｍＬの０．９％塩化ナトリウムを加え、菌体を遠心分離して上清を取り除く操作を３回行い、菌体を洗浄する。洗浄後の菌体をＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１００ｍＭ、ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ１ｍＭからなるＴｒｉｓ－ＨＣｌバッファー１ｍＬに懸濁し、得られた懸濁液にガラスビーズ（φ０．１ｍｍ）を加え、超音波破砕機を用い４℃で菌体を破砕する。菌体破砕液を遠心して得られる上清のうち０．５ｍＬをＵＦ膜（ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ－０．５ｍＬ１０Ｋ、ＭｅｒｃｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に通し、透過液を除去したのちＴｒｉｓ－ＨＣｌバッファー０．４ｍＬを添加することを３回繰り返すことで低分子量の夾雑物を除去した後、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファーで再懸濁して液量を０．１ｍＬとしたものをＣＦＥとする。精製酵素の代わりに当該ＣＦＥを全量０．１ｍＬの酵素反応溶液に対して０．０５ｍＬ添加し、酵素活性の確認を行う。

２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡを生成する反応Ｃを触媒する酵素は、例えば、エノイル－ＣｏＡヒドラターゼなどを用いることができる。エノイル－ＣｏＡヒドラターゼとしては、ＥＣ番号による分類上の限定は特にないが、ＥＣ番号４．２．１．－に分類されるエノイル－ＣｏＡヒドラターゼが好ましく、具体的にはエノイル－ＣｏＡヒドラターゼまたは２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡヒドラターゼとしてＥＣ４．２．１．１７に分類される酵素が挙げられる。これらの中でもＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＭＧ１６５５株由来のＰａａＦ（ＮＣＢＩ－ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＮＰ＿４１５９１１）、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａＫＴ２４４０株由来のＰａａＦ（ＮＣＢＩ－ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＮＰ＿７４５４２７）などを好ましく用いることができる。

エノイル－ＣｏＡヒドラターゼが触媒する反応は一般的に可逆反応であることから、エノイル－ＣｏＡヒドラターゼが、３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを基質として２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡが生成する反応を触媒する活性を有することは、α－ヒドロムコン酸から酵素反応で調製した２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡを基質として、精製エノイル－ＣｏＡヒドラターゼを用いて生成する３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを検出することで確認することができる。具体的な測定方法は、例えば以下の通りである。

ここで用いるα－ヒドロムコン酸は、公知の方法（例えば、ＷＯ２０１６／１９９８５８Ａ１の参考例１に記載された方法）により調製することができる。

２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡ溶液の調製：常法に従いＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａＫＴ２４４０株のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行い、ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする核酸（ｐｃａＩおよびｐｃａＪ、ＮＣＢＩ－ＧｅｎｅＩＤ：１０４６６１３および１０４６６１２）の全長を増幅する。当該増幅断片を大腸菌用発現ベクターであるｐＲＳＦ－１ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＫｐｎＩサイトに、ヒスチジンタグ配列と同じフレームとなるよう挿入する。当該プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、常法に従いイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による当該酵素の発現誘導、続いて培養液からのヒスチジンタグを利用した精製を行い、ＣｏＡトランスフェラーゼ溶液を得る。当該溶液を用いて以下組成の２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡ調製用酵素反応溶液を調製し、３０℃で１０分反応させた後、ＵＦ膜（ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ－０．５ｍＬ１０Ｋ、ＭｅｒｃｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で処理することで酵素を除去し、得られた透過液を２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡ溶液とする。

（酵素反応溶液）
１００ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
１０ｍＭＭｇＣｌ_２
０．４ｍＭｓｕｃｃｉｎｙｌ－ＣｏＡ
２ｍＭ α－ｈｙｄｒｏｍｕｃｏｎｉｃａｃｉｄｓｏｄｉｕｍｓａｌｔ
２０μｇ／ｍＬＣｏＡｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ。

エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ活性の確認：常法に従い対象とする微生物株のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行い、エノイル－ＣｏＡヒドラターゼをコードする核酸全長を増幅する。当該増幅断片を大腸菌用発現ベクターｐＥＴ－１６ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＮｄｅＩサイトに、ヒスチジンタグ配列と同じフレームとなるよう挿入する。当該プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、常法に従いイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による当該酵素の発現誘導、続いて培養液からのヒスチジンタグを利用した精製を行い、エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ溶液を得る。エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ活性は、当該溶液を用いて以下組成の酵素反応溶液を調製し、３０℃で１０分反応させた後、ＵＦ膜（ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ－０．５ｍＬ１０Ｋ、ＭｅｒｃｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で処理することで酵素を除去し、得られた透過液中の３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを高速液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析計（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）（Ａｇｉｌｅｎｔ社）で検出することで確認できる。

（酵素反応溶液）
１００ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
１０ｍＭＭｇＣｌ_２
３００μＬ／ｍＬ２，３－ｄｅｈｙｄｒｏａｄｉｐｙｌ－ＣｏＡｓｏｌｕｔｉｏｎ
１ｍＭｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ
２０μｇ／ｍＬｅｎｏｙｌ－ＣｏＡｈｙｄｒａｔａｓｅ。

本発明で用いる宿主微生物において元来発現する酵素がエノイル－ＣｏＡヒドラターゼ活性を有しているかどうかは、精製エノイル－ＣｏＡヒドラターゼの代わりにＣＦＥを全量０．１ｍＬの酵素反応溶液に対して０．０５ｍＬ添加して上述の測定を行うことで確認できる。大腸菌を対象としたＣＦＥの調製方法の具体例はアシルトランスフェラーゼ活性の確認方法に記載した通りである。

アジピル－ＣｏＡを生成する反応Ｄを触媒する酵素は、例えば、エノイル－ＣｏＡレダクターゼなどを用いることができる。エノイル－ＣｏＡレダクターゼとしては、ＥＣ番号による分類上の限定は特にないが、ＥＣ番号１．３．－．－に分類されるエノイル－ＣｏＡレダクターゼが好ましく、具体的にはｔｒａｎｓ－２－エノイル－ＣｏＡレダクターゼとしてＥＣ１．３．１．４４に分類される酵素、アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼとしてＥＣ１．３．８．７に分類される酵素が挙げられる。これらの具体例は、例えば特表２０１１－５１５１１１、ＪＡｐｐｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１５Ｏｃｔ；１１９（４）：１０５７－６３．などに開示されているが、中でもＥｕｇｌｅｎａｇｒａｃｉｌｉｓＺ株由来のＴＥＲ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ５ＥＵ９０）、ＴｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａｆｕｓｃａＹＸ株由来のＴｆｕ＿１６４７（ＮＣＢＩ－ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＡＡＺ５５６８２）、ＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｂａｙｌｙｉＡＤＰ１株由来のＤｃａＡ（ＮＣＢＩ－ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＡＡＬ０９０９４．１）などを好ましく用いることができる。

エノイル－ＣｏＡレダクターゼが、２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡを基質とした場合、アジピル－ＣｏＡが生成する活性を有することは、α－ヒドロムコン酸から酵素反応で調製した２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡを基質として、精製エノイル－ＣｏＡレダクターゼを用いて２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡの還元に伴うＮＡＤＨの減少量を測定することで確認できる。

α－ヒドロムコン酸の調製と、２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡ溶液の調製は、上記と同様に行うことができる。

エノイル－ＣｏＡレダクターゼ活性の確認：常法に従い対象とする微生物株のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行い、エノイル－ＣｏＡレダクターゼをコードする核酸全長を増幅する。当該増幅断片を大腸菌用発現ベクターｐＥＴ－１６ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＮｄｅＩサイトに、ヒスチジンタグ配列と同じフレームとなるよう挿入する。当該プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、常法に従いイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による当該酵素の発現誘導、続いて培養液からのヒスチジンタグを利用した精製を行い、エノイル－ＣｏＡレダクターゼ溶液を得る。エノイル－ＣｏＡレダクターゼ活性は、本酵素溶液を用いて以下組成の酵素反応溶液を調製し、３０℃におけるＮＡＤＨの酸化に伴う３４０ｎｍ吸収の減少を測定することで確認できる。

（酵素反応溶液）
１００ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
１０ｍＭＭｇＣｌ_２
３００μＬ／ｍＬ２，３－ｄｅｈｙｄｒｏａｄｉｐｙｌ－ＣｏＡｓｏｌｕｔｉｏｎ０．２ｍＭＮＡＤＨ
１ｍＭｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ
２０μｇ／ｍＬｅｎｏｙｌ－ＣｏＡｒｅｄｕｃｔａｓｅ。

本発明で用いる宿主微生物において元来発現する酵素がエノイル－ＣｏＡレダクターゼ活性を有しているかどうかは、精製エノイル－ＣｏＡレダクターゼの代わりにＣＦＥを全量０．１ｍＬの酵素反応溶液に対して０．０５ｍＬ添加して上述の測定を行うことで確認できる。大腸菌を対象としたＣＦＥの調製方法の具体例はアシルトランスフェラーゼ活性の確認方法に記載した通りである。

３－ヒドロキシアジピン酸を生成する反応Ｅ、α－ヒドロムコン酸を生成する反応Ｆ、アジピン酸を生成する反応Ｇを触媒する酵素は、例えば、ＣｏＡトランスフェラーゼあるいはアシル－ＣｏＡヒドロラーゼなどを用いることができるが、ＣｏＡトランスフェラーゼが好ましい。

ＣｏＡトランスフェラーゼとしては、ＥＣ番号による分類上の限定は特にないが、ＥＣ番号２．８．３．－に分類されるＣｏＡトランスフェラーゼが好ましく、具体的にはＣｏＡトランスフェラーゼまたはアシル－ＣｏＡトランスフェラーゼとしてＥＣ２．８．３．６に分類される酵素などが挙げられる。

本発明において、「ＣｏＡトランスフェラーゼ」とは、アシル－ＣｏＡおよびコハク酸を基質としてカルボン酸およびスクシニル－ＣｏＡを生成する反応の触媒活性（ＣｏＡトランスフェラーゼ活性）を有する酵素を意味する。

３－ヒドロキシアジピン酸を生成する反応Ｅ、α－ヒドロムコン酸を生成する反応Ｆを触媒する酵素には、中でもＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａＫＴ２４４０株由来のＰｃａＩおよびＰｃａＪ（ＮＣＢＩ－ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＮＰ＿７４６０８１およびＮＰ＿７４６０８２）等を好ましく用いることができる。

また、アジピン酸を生成する反応Ｇを触媒する酵素には、ＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｂａｙｌｙｉＡＤＰ１株由来のＤｃａＩおよびＤｃａＪ（ＮＣＢＩ－ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＣＡＧ６８５３８およびＣＡＧ６８５３９）などを好ましく用いることができる。

３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡ、２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡまたはアジピル－ＣｏＡを基質とするＣｏＡトランスフェラーゼ活性は、本酵素反応が可逆反応であることから、３－ヒドロキシアジピン酸およびスクシニル－ＣｏＡ、α－ヒドロムコン酸およびスクシニル－ＣｏＡ、またはアジピン酸およびスクシニル－ＣｏＡを基質として、精製ＣｏＡトランスフェラーゼを用いて生成する３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡ、２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡまたはアジピル－ＣｏＡを検出することで確認することができる。具体的な測定方法は、例えば以下の通りである。

３－ヒドロキシアジピン酸の調製：３－ヒドロキシアジピン酸はＷＯ２０１６／１９９８５６Ａ１の参考例１に記載された方法により調製する。

３－ヒドロキシアジピン酸を基質としたＣｏＡトランスフェラーゼ活性の確認：常法に従い対象とする微生物株のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行い、ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする核酸全長を増幅する。当該増幅断片を大腸菌用発現ベクターであるｐＲＳＦ－１ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＫｐｎＩサイトに、ヒスチジンタグ配列と同じフレームとなるよう挿入する。当該プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、常法に従いイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による当該酵素の発現誘導、続いて培養液からのヒスチジンタグを利用した精製を行い、ＣｏＡトランスフェラーゼ溶液を得る。当該溶液を用いて以下組成の酵素反応溶液を調製し、３０℃で１０分反応させた後、ＵＦ膜（ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ－０．５ｍＬ１０Ｋ、ＭｅｒｃｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で処理することで酵素を除去し、透過液中の３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを高速液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析計（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）（Ａｇｉｌｅｎｔ社）で検出することで確認できる。

（酵素反応溶液）
１００ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
１０ｍＭＭｇＣｌ_２
０．４ｍＭｓｕｃｃｉｎｙｌ－ＣｏＡ
２ｍＭ３－ｈｙｄｒｏｘｙａｄｉｐｉｃａｃｉｄｓｏｄｉｕｍｓａｌｔ
２０μｇ／ｍＬＣｏＡｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ。

α－ヒドロムコン酸の調製：α－ヒドロムコン酸はＷＯ２０１６／１９９８５８Ａ１の参考例１に記載された方法により調製する。

α－ヒドロムコン酸を基質としたＣｏＡトランスフェラーゼ活性の確認：常法に従い対象とする微生物株のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行い、ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする核酸全長を増幅する。当該増幅断片を大腸菌用発現ベクターであるｐＲＳＦ－１ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＫｐｎＩサイトに、ヒスチジンタグ配列と同じフレームとなるよう挿入する。当該プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、常法に従いイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による当該酵素の発現誘導、続いて培養液からのヒスチジンタグを利用した精製を行い、ＣｏＡトランスフェラーゼ溶液を得る。当該溶液を用いて以下組成の酵素反応溶液を調製し、３０℃で１０分反応させた後、ＵＦ膜（ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ－０．５ｍＬ１０Ｋ、ＭｅｒｃｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で処理することで酵素を除去し、透過液中の２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡを高速液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析計（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）（Ａｇｉｌｅｎｔ社）で検出することで確認できる。

アジピン酸を基質としたＣｏＡトランスフェラーゼ活性の確認：常法に従い対象とする微生物株のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行い、ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする核酸全長を増幅する。当該増幅断片を大腸菌用発現ベクターであるｐＲＳＦ－１ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＫｐｎＩサイトに、ヒスチジンタグ配列と同じフレームとなるよう挿入する。当該プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、常法に従いイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による当該酵素の発現誘導、続いて培養液からのヒスチジンタグを利用した精製を行い、ＣｏＡトランスフェラーゼ溶液を得る。当該溶液を用いて以下組成の酵素反応溶液を調製し、３０℃で１０分反応させた後、ＵＦ膜（ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ－０．５ｍＬ１０Ｋ、ＭｅｒｃｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で処理することで酵素を除去し、透過液中のアジピル－ＣｏＡを高速液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析計（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）（Ａｇｉｌｅｎｔ社）で検出することで確認できる。

（酵素反応溶液）
１００ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
１０ｍＭＭｇＣｌ_２
０．４ｍＭｓｕｃｃｉｎｙｌ－ＣｏＡ
２ｍＭａｄｉｐｉｃａｃｉｄｓｏｄｉｕｍｓａｌｔ
２０μｇ／ｍＬＣｏＡ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ。

本発明で用いる宿主微生物において元来発現する酵素がＣｏＡトランスフェラーゼ活性を有しているかどうかは、精製ＣｏＡトランスフェラーゼの代わりにＣＦＥを全量０．１ｍＬの酵素反応溶液に対して０．０５ｍＬ添加して上述の測定を行うことで確認できる。大腸菌を対象としたＣＦＥの調製方法の具体例はアシルトランスフェラーゼ活性の確認方法に記載した通りである。

本発明で（ａ）～（ｃ）に記載のポリペプチド、または３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼは、従来技術で用いられている３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼよりも優れた活性を有することを特徴とする。ここで、「優れた活性」とは、同一の宿主微生物、発現条件下で当該ポリペプチドまたは従来の３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼを発現した遺伝子改変微生物を、炭素源を発酵原料として含む培地で培養した場合、従来の３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼを発現した遺伝子改変微生物に比べて高い収率で３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸、またはアジピン酸を生産することを意味する。ここで、３－ヒドロキシアジピン酸収率は式（２）に従って算出する。α－ヒドロムコン酸収率またはアジピン酸収率は、式（２）の３－ヒドロキシアジピン酸をそれぞれα－ヒドロムコン酸またはアジピン酸に置き換えることで算出する。

収率（％）＝３－ヒドロキシアジピン酸生成量（ｍｏｌ）／炭素源の消費量（ｍｏｌ）×１００・・・式（２）。

本発明で（ａ）～（ｃ）に記載のポリペプチド、または３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼが、従来技術で用いられている３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼよりも優れた活性を有することを確認する具体的な方法は以下の通りである。大腸菌内で自立複製可能なベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２（ＭＥＫｏｖａｃｈ，（１９９５），Ｇｅｎｅ１６６：１７５－１７６）をＸｈｏＩで切断し、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２／ＸｈｏＩを得る。当該ベクターに構成的な発現プロモーターを組み込むために、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＫ－１２ＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡを鋳型としてｇａｐＡ（ＮＣＢＩＧｅｎｅＩＤ：ＮＣ＿０００９１３．３）の上流域２００ｂ（配列番号１８６）を常法に従ってＰＣＲ増幅し（用いるプライマーは、例えば配列番号１８７および１８８である）、得られた断片およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２／ＸｈｏＩを、Ｉｎ－ＦｕｓｉｏｎＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を用いて連結し、プラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：Ｐｇａｐを得る。ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＰｇａｐをＳｃａＩで切断し、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：Ｐｇａｐ／ＳｃａＩを得る。アシルトランスフェラーゼをコードする核酸全長を常法に従ってＰＣＲ増幅し（用いるプライマーは、例えば配列番号１９０および１９１である）、得られた断片およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：Ｐｇａｐ／ＳｃａＩを、Ｉｎ－ＦｕｓｉｏｎＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔを用いて連結しプラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴを得る。ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴをＨｐａＩで切断し、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴ／ＨｐａＩを得る。ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする核酸全長を常法に従ってＰＣＲ増幅し（用いるプライマーは、例えば配列番号１９４および１９５である）、得られた断片およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴ／ＨｐａＩを、“Ｉｎ－ＦｕｓｉｏｎＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ”を用いて連結しプラスミドをｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴを得る。

一方、大腸菌内で自律複製可能な発現ベクターｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）をＢａｍＨＩで切断し、ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１／ＢａｍＨＩを得る。配列番号１～８６のポリペプチドあるいは従来技術で用いられている３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼをコードする核酸を常法に従ってＰＣＲ増幅し（用いるプライマーは、例えば配列番号１９６および１９７である）、得られた断片およびｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１／ＢａｍＨＩを、Ｉｎ－ＦｕｓｉｏｎＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を用いて連結し、配列番号１～８６のポリペプチドあるいは従来技術で用いられている３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼを発現するプラスミドを得る。

得られたプラスミドおよびｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴを、大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）にエレクトロポレーション（ＮＭＣａｌｖｉｎ，ＰＣＨａｎａｗａｌｔ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１７０（１９８８），ｐｐ．２７９６－２８０１）で導入する。導入後の当該株をｐＨ７に調整した培地Ｉ（Ｂａｃｔｏトリプトン（ＤｉｆｃｏＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）１０ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ酵母エキス（ＤｉｆｃｏＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、カナマイシン２５μｇ／ｍＬおよびクロラムフェニコール１５μｇ／ｍＬ）５ｍＬに一白金耳植菌し、３０℃、１２０ｍｉｎ－１で１８時間振とう培養する。当該培養液０．２５ｍＬをｐＨ６．５に調整した培地ＩＩ（コハク酸１０ｇ／Ｌ、グルコース１０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム１ｇ／Ｌ、リン酸カリウム５０ｍＭ、硫酸マグネシウム０．０２５ｇ／Ｌ、硫酸鉄０．０６２５ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン２．７ｍｇ／Ｌ、塩化カルシウム０．３３ｍｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１．２５ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏトリプトン２．５ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ酵母エキス１．２５ｇ／Ｌ、カナマイシン２５μｇ／ｍＬ、クロラムフェニコール１５μｇ／ｍＬおよびＩＰＴＧ０．０１ｍＭ）５ｍＬに添加し、３０℃、１２０ｍｉｎ－１で２４時間振とう培養する。当該培養液より菌体を遠心分離した上清をＭｉｌｌｅｘ－ＧＶ（０．２２μｍ、ＰＶＤＦ、Ｍｅｒｃｋ社製）を用いて膜処理し、透過液を分析することで培養上清中の３－ヒドロキシアジピン酸および炭素源の濃度を定量する。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる３－ヒドロキシアジピン酸の定量分析は以下の条件で行う。

・ＨＰＬＣ：１２９０Ｉｎｆｉｎｉｔｙ（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）
カラム：Ｓｙｎｅｒｇｉｈｙｄｒｏ－ＲＰ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）、長さ１００ｍｍ、内径３ｍｍ、粒径２．５μｍ
移動相：０．１％ギ酸水溶液／メタノール＝７０／３０
流速：０．３ｍＬ／分
カラム温度：４０℃
ＬＣ検出器：ＤＡＤ（２１０ｎｍ）
・ＭＳ／ＭＳ：Ｔｒｉｐｌｅ－ＱｕａｄＬＣ／ＭＳ（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｏｇｉｅｓ社製）
イオン化法：ＥＳＩネガティブモード。

ＨＰＬＣによる糖、コハク酸などの炭素源の定量分析は以下の条件で行う。

・ＨＰＬＣ：ＳｈｉｍａｚｕＰｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（島津製作所製）
カラム：ＳｈｏｄｅｘＳｕｇａｒＳＨ１０１１（昭和電工株式会社製）、長さ３００ｍｍ、内径８ｍｍ、粒径６μｍ
移動相：０．０５Ｍ硫酸水溶液
流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：６５℃
検出器：ＲＩ。

本発明においてアシルトランスフェラーゼ、ＣｏＡトランスフェラーゼ、エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ、エノイル－ＣｏＡレダクターゼのいずれかをコードする核酸を宿主微生物に導入する場合、当該核酸はデータベース上に存在する当該酵素のアミノ酸配列を元に人工的に合成してもよいし、天然から分離してもよい。人工的に合成する場合、導入する宿主微生物に合わせて各アミノ酸に対応するコドンの使用頻度を変更してもよい。

本発明で、アシルトランスフェラーゼ、ＣｏＡトランスフェラーゼ、エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ、エノイル－ＣｏＡレダクターゼのいずれかをコードする核酸を宿主微生物に導入する方法は特に限定されず、宿主微生物内で自律複製可能な発現ベクターに当該核酸を組み込み宿主微生物に導入する方法や、宿主微生物のゲノムに当該核酸を組み込む方法などを用いることができる。

当該酵素をコードする核酸を天然から分離する場合、遺伝子源となる生物は特に限定されないが、例えば、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｂａｙｌｙｉ、ＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｒａｄｉｏｒｅｓｉｓｔｅｎｓなどのＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、ＡｅｒｏｂａｃｔｅｒｃｌｏａｃａｅなどのＡｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、ＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｆａｅｃａｌｉｓなどのＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓｂａｄｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、ＢａｃｉｌｌｕｓｒｏｓｅｕｓなどのＢａｃｉｌｌｕｓ属、ＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｏｄｉｎｕｍなどのＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍなどのＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓｎｅｃａｔｏｒ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓｎｕｍａｚｕｅｎｓｉｓ、ＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓｏｘａｌａｔｉｃｕｓなどのＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属、ＤｅｌｆｔｉａａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓなどのＤｅｌｆｔｉａ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｆｅｒｇｕｓｏｎｉｉなどのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、ＨａｆｎｉａａｌｖｅｉなどのＨａｆｎｉａ属、ＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍなどのＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、ＮｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓａｌｂｕｓなどのＮｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ属、ＰｌａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍｏｋｅａｎｏｋｏｉｔｅｓなどのＰｌａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｒａｇｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａ、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｒｅｐｔｉｌｉｖｏｒａなどのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、ＲｈｉｚｏｂｉｕｍｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒなどのＲｈｉｚｏｂｉｕｍ属、ＲｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓなどのＲｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属、ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどのＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓｅｒｒａｔｉａｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａｇｒｉｍｅｓｉｉ、Ｓｅｒｒａｔｉａｎｅｍａｔｏｄｉｐｈｉｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａｏｄｏｒｉｆｅｒａ、ＳｅｒｒａｔｉａｐｌｙｍｕｔｈｉｃａなどのＳｅｒｒａｔｉａ属、ＳｈｉｍｗｅｌｌｉａｂｌａｔｔａｅなどのＳｈｉｍｗｅｌｌｉａ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｋａｒｎａｔａｋｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｏｌｉｖａｃｅｕｓ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｖｉｎａｃｅｕｓなどのＳｔｅｒｐｔｏｍｙｃｅｓ属、ＹａｒｒｏｗｉａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａなどのＹａｒｒｏｗｉａ属、ＹｅｒｓｉｎｉａｒｕｃｋｅｒｉなどのＹｅｒｓｉｎｉａ属、ＥｕｇｌｅｎａｇｒａｃｉｌｉｓなどのＥｕｇｌｅｎａ属、ＴｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａｆｕｓｃａなどのＴｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ属が挙げられ、好ましくはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｅｕｇｌｅｎａ属、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ属である。

本発明で発現させるポリペプチドをコードする核酸を発現ベクターまたは宿主微生物ゲノムに組み込む場合、当該発現ベクターまたはゲノム組み込み用核酸はプロモーター、リボソーム結合配列、発現させるポリペプチドをコードする核酸、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーター活性を制御する遺伝子が含まれていてもよい。

本発明で用いるプロモーターは、宿主微生物内で酵素を発現させられるものであれば特に限定されないが、例えばｇａｐプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが挙げられる。

本発明で発現ベクターを用いて核酸の導入や、ポリペプチドの発現の増強を行う場合は、当該微生物中で自律複製可能であれば特に限定されないが、例えばｐＢＢＲ１ＭＣＳベクター、ｐＢＲ３２２ベクター、ｐＭＷベクター、ｐＥＴベクター、ｐＲＳＦベクター、ｐＣＤＦベクター、ｐＡＣＹＣベクター、および上述のベクターの派生型などが挙げられる。

本発明でゲノム組み込み用核酸を用いて核酸の導入や、ポリペプチドの発現の増強を行う場合は、部位特異的相同組換えを用いて導入する。部位相同組換えの方法は特に限定されないが、例えばλ ＲｅｄレコンビナーゼおよびＦＬＰレコンビナーゼを用いる方法（ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．２０００Ｊｕｎ６；９７（１２）：６６４０－６６４５．）、λ ＲｅｄレコンビナーゼおよびｓａｃＢ遺伝子を用いる方法（ＢｉｏｓｃｉＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＢｉｏｃｈｅｍ．２００７Ｄｅｃ；７１（１２）：２９０５－１１．）が挙げられる。

発現ベクターまたはゲノム組み込み用核酸の導入方法は、微生物に核酸を導入する方法であれば特に限定されないが、例えばカルシウムイオン法（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９（１９７０））、エレクトロポレーション法（ＮＭＣａｌｖｉｎ，ＰＣＨａｎａｗａｌｔ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１７０（１９８８），ｐｐ．２７９６－２８０１）などが挙げられる。

本発明では、３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼをコードする核酸を導入、もしくは当該ポリペプチドの発現を増強した遺伝子改変微生物を、通常の微生物が利用し得る炭素源を発酵原料として含有する培地、好ましくは液体培地中において培養する。当該遺伝子改変微生物が利用し得る炭素源の他には、窒素源、無機塩および必要に応じてアミノ酸やビタミンなどの有機微量栄養素を程よく含有した培地を用いる。上記栄養源を含有していれば天然培地、合成培地のいずれでも利用できる。

発酵原料とは、当該遺伝子改変微生物が代謝し得る原料である。「代謝」とは、微生物が細胞外から取り入れた、あるいは細胞内で別の化学物質より生じたある化学物質が、酵素反応により別の化学物質へと変換されることを指す。炭素源としては、糖類を好ましく用いることができる。糖類の具体例としては、グルコース、シュクロース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、キシロース、アラビノース等の単糖類、これら単糖類が結合した二糖類、多糖類、およびこれらを含有する澱粉糖化液、糖蜜、セルロース含有バイオマス糖化液などが挙げられる。

また、上記に挙げた糖以外にも、ＣｏＡトランスフェラーゼの基質であるコハク酸を添加することで３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および／またはアジピン酸を効率よく生産することができる。

上記に挙げた炭素源は、一種類のみ用いてもよいし、組み合わせて用いてもよい。炭素源の添加において、培地中の炭素源の濃度は、特に限定されず、炭素源の種類などに応じて適宜設定することができ、好ましくは、糖類は５ｇ／Ｌ～３００ｇ／Ｌ、コハク酸は０．１ｇ／Ｌ～１００ｇ／Ｌである。

当該遺伝子改変微生物の培養に用いる窒素源としては、例えば、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩類、尿素、硝酸塩類、その他補助的に使用される有機窒素源、例えば、油粕類、大豆加水分解液、カゼイン分解物、その他のアミノ酸、ビタミン類、コーンスティープリカー、酵母または酵母エキス、肉エキス、ペプトン等のペプチド類、各種発酵菌体およびその加水分解物などが使用できる。培地中の窒素源の濃度は、特に限定されないが、好ましくは、０．１ｇ／Ｌ～５０ｇ／Ｌである。

当該遺伝子改変微生物の培養に用いる無機塩類としては、例えば、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩およびマンガン塩等を適宜添加使用することができる。

３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および／またはアジピン酸を生産するための遺伝子改変微生物の培養条件は、前記成分組成の培地、培養温度、撹拌速度、ｐＨ、通気量、植菌量などを、当該遺伝子改変微生物の種類および外部条件などに応じて、適宜調節あるいは選択して設定する。

培養におけるｐＨの範囲は当該遺伝子改変微生物が生育することができれば特に制限はないが、好ましくはｐＨ５～８、より好ましくはｐＨ５．５～６．８である。

培養における通気条件の範囲は３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および／またはアジピン酸を生産することができれば特に制限はないが、当該微生物変異体を良好に生育させるために、少なくとも培養開始時において培養容器内の気相および／または液相に酸素が残存していることが好ましい。

液体培養において発泡がある場合には、鉱油、シリコーン油および界面活性剤などの消泡剤を適宜培地に配合することができる。

前記微生物の培養物中に、３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および／またはアジピン酸が回収可能な量まで生産された後、生産された当該生産物を回収することができる。生産された当該生産物の回収、例えば単離は、蓄積量が適度に高まった時点で培養を停止し、その培養物から、発酵生産物を採取する一般的な方法に準じて行うことができる。具体的には、遠心分離、ろ過などにより菌体を分離したのち、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、活性炭処理、結晶化、膜分離、蒸留などにより、当該生産物を培養物から単離することができる。より具体的には、当該生産物の塩に酸成分を添加して析出物を回収する方法、培養物を逆浸透膜やエバポレーターなどを用いた濃縮操作により水を除去して当該生産物の濃度を高めた後、冷却結晶化や断熱結晶化により当該生産物および／または当該生産物の塩の結晶を析出させ、遠心分離やろ過などにより当該生産物および／または当該生産物の塩の結晶を得る方法、培養物にアルコールを添加して当該生産物をエステルとした後、蒸留操作により当該生産物のエステルを回収後、加水分解により当該生産物を得る方法等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。また、これらの回収方法は生成物の物性などにより適当に選択して最適化することができる。

以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。

参考例１
３－オキソアジピル－ＣｏＡおよび補酵素Ａを生成する反応（反応Ａ）を触媒する酵素、および３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡから３－ヒドロキシアジピン酸を生成する反応（反応Ｅ）かつ２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡからα－ヒドロムコン酸を生成する反応（反応Ｆ）を触媒する酵素、および配列番号１、２、３、４、５、６、７に記載のポリペプチドを発現するプラスミドの作製
大腸菌内で自律複製可能なベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２（ＭＥＫｏｖａｃｈ，（１９９５），Ｇｅｎｅ１６６：１７５－１７６）をＸｈｏＩで切断し、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２／ＸｈｏＩを得た。当該ベクターに構成的な発現プロモーターを組み込むために、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＫ－１２ＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡを鋳型としてｇａｐＡ（ＮＣＢＩＧｅｎｅＩＤ：ＮＣ＿０００９１３．３）の上流域２００ｂ（配列番号１８６）をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計し（配列番号１８７、１８８）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られた断片およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２／ＸｈｏＩを、Ｉｎ－ＦｕｓｉｏｎＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を用いて連結し、大腸菌株ＤＨ５αに導入した。得られた組換え大腸菌株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認したプラスミドをｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：Ｐｇａｐとした。続いてｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＰｇａｐをＳｃａＩで切断し、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：Ｐｇａｐ／ＳｃａＩを得た。反応Ａを触媒する酵素をコードする遺伝子を増幅するために、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａＫＴ２４４０株のゲノムＤＮＡを鋳型としてアシルトランスフェラーゼ遺伝子ｐｃａＦ（ＮＣＢＩＧｅｎｅＩＤ：１０４１７５５、配列番号１８９）の全長をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計し（配列番号１９０、１９１）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られた断片およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：Ｐｇａｐ／ＳｃａＩを、Ｉｎ－ＦｕｓｉｏｎＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔを用いて連結し、大腸菌株ＤＨ５αに導入した。得られた組換え株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認したプラスミドをｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴとした。続いてｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴをＨｐａＩで切断し、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴ／ＨｐａＩを得た。反応Ｄおよび反応Ｅを触媒する酵素をコードする遺伝子を増幅するために、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａＫＴ２４４０株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子ｐｃａＩおよびｐｃａＪ（ＮＣＢＩＧｅｎｅＩＤ：１０４６６１３、１０４６６１２、配列番号１９２、１９３）の全長を含む連続した配列をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計し（配列番号１９４、１９５）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られた断片およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴ／ＨｐａＩを、Ｉｎ－ＦｕｓｉｏｎＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔを用いて連結し、大腸菌株ＤＨ５αに導入した。得られた組換え株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認したプラスミドをｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴとした。

ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴをＳｃａＩで切断し、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ／ＳｃａＩを得た。配列番号１のポリペプチドをコードする核酸を増幅するために、ＳｅｒｒａｔｉａｍａｒｃｅｓｃｅｎｓＡＴＣＣ１３８８０株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号８７に記載の核酸を増幅するためのプライマーを設計し（配列番号１９６、１９７）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。配列番号２のポリペプチドをコードする核酸を増幅させるために、ＳｅｒｒａｔｉａｎｅｍａｔｏｄｉｐｈｉｌａＤＳＭ２１４２０株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号８８に記載の核酸を増幅するためのプライマーを設計し（配列番号１９８、１９９）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。配列番号３のポリペプチドをコードする核酸を増幅させるために、ＳｅｒｒａｔｉａｐｌｙｍｕｔｈｉｃａＮＢＲＣ１０２５９９株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号８９に記載の核酸を増幅するためのプライマーを設計し（配列番号２００、２０１）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。配列番号４のポリペプチドをコードする核酸を増幅させるために、Ｓｅｒｒａｔｉａｐｒｏｔｅａｍａｃｕｌａｎｓ５６８株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号９０に記載の核酸を増幅するためのプライマーを設計し（配列番号２０２、２０３）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。配列番号５のポリペプチドをコードする核酸を増幅させるために、ＳｅｒｒａｔｉａｕｒｅｉｌｙｔｉｃａＬｒ５／４株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号９１に記載の核酸を増幅するためのプライマーを設計し（配列番号２０４、２０５）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。配列番号６のポリペプチドをコードする核酸を増幅させるために、Ｓｅｒｒａｔｉａｓｐ．ＢＷ１０６株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号９２に記載の核酸を増幅するためのプライマーを設計し（配列番号２０６、２０７）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。配列番号７のポリペプチドをコードする核酸を増幅させるために、ＳｅｒｒａｔｉａｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓＦＫ０１株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号９３に記載の核酸を増幅するためのプライマーを設計し（配列番号２０８、２０９）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られたそれぞれの断片およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ／ＳｃａＩを、Ｉｎ－ＦｕｓｉｏｎＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を用いて連結し、大腸菌株ＤＨ５αに導入した。得られた組換え株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認した。

配列番号１に記載のポリペプチドを発現するためのプラスミドを「ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ１」、配列番号２に記載のポリペプチドを発現するためのプラスミドを「ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ２」、配列番号３に記載のポリペプチドを発現するためのプラスミドを「ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ３」、配列番号４に記載のポリペプチドを発現するためのプラスミドを「ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ４」、配列番号５に記載のポリペプチドを発現するためのプラスミドを「ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ５」、配列番号６に記載のポリペプチドを発現するためのプラスミドを「ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ６」、配列番号７に記載のポリペプチドを発現するためのプラスミドを「ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ７」とし、これらのプラスミドについて表６に示す。

参考例２
３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡから２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡを生成する反応（反応Ｃ）を触媒する酵素を発現するためのプラスミドの作製
大腸菌内で自律複製可能な発現ベクターｐＭＷ１１９（ニッポンジーン社製）をＳａｃＩで切断し、ｐＭＷ１１９／ＳａｃＩを得た。当該ベクターに構成的な発現プロモーターを組み込むために、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＫ－１２ＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡを鋳型としてｇａｐＡ（ＮＣＢＩＧｅｎｅＩＤ：ＮＣ＿０００９１３．３）の上流域２００ｂ（配列番号１８６）をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計し（配列番号２１０、２１１）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られた断片およびｐＭＷ１１９／ＳａｃＩを、Ｉｎ－ＦｕｓｉｏｎＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を用いて連結し、大腸菌株ＤＨ５αに導入した。得られた組換え大腸菌株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認したプラスミドをｐＭＷ１１９：：Ｐｇａｐとした。続いてｐＭＷ１１９：：ＰｇａｐをＳｐｈＩで切断し、ｐＭＷ１１９：：Ｐｇａｐ／ＳｐｈＩを得た。反応Ｃを触媒する酵素をコードする遺伝子を増幅するために、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａＫＴ２４４０株のゲノムＤＮＡを鋳型としてエノイル－ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子ｐａａＦ（ＮＣＢＩＧｅｎｅＩＤ：１０４６９３２、配列番号１７６）の全長をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計し（配列番号２１２、２１３）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られた断片およびｐＭＷ１１９：：Ｐｇａｐ／ＳｐｈＩを、Ｉｎ－ＦｕｓｉｏｎＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を用いて連結し、大腸菌株ＤＨ５αに導入した。得られた組換え株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認した。得られたプラスミドを「ｐＭＷ１１９：：ＥＨ」とした。

参考例３
アセチル－ＣｏＡおよびスクシニル－ＣｏＡから３－オキソアジピル－ＣｏＡおよび補酵素Ａを生成する反応（反応Ａ）を触媒する酵素、およびアジピル－ＣｏＡからアジピン酸を生成する反応（反応Ｇ）を触媒する酵素、および配列番号１、２、３、４、５、６、７、に記載のポリペプチドを発現するプラスミドの作製
反応Ｇを触媒する酵素をコードする遺伝子を増幅するために、ＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｂａｙｌｙｉＡＤＰ１株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子ｄｃａＩおよびｄｃａＪ（ＮＣＢＩＧｅｎｅＩＤ：ＣＲ５４３８６１．１、配列番号２１４、２１５）の全長を含む連続した配列をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計し（配列番号２１６、２１７）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られた断片および参考例１で作製したｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ１、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ２、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ３、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ４、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ５、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ６、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ７をそれぞれＨｐａＩで切断して得られる断片を、Ｉｎ－ＦｕｓｉｏｎＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔを用いて連結し、大腸菌株ＤＨ５αに導入した。得られた組換え株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認したプラスミドをそれぞれｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ１、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ２、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ３、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ４、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ５、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ６、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ７とした。

参考例４
３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡから２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡを生成する反応（反応Ｃ）および２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡからアジピル－ＣｏＡを生成する反応（反応Ｄ）を触媒する酵素を発現するためのプラスミドの作製
ｐＭＷ１１９：：ＥＨをＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ｐＭＷ１１９：：ＥＨ／ＨｉｎｄＩＩＩを得た。反応Ｄを触媒する酵素をコードする遺伝子を増幅するために、ＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｂａｙｌｙｉＡＤＰ１株由来のｄｃａＡ（ＮＣＢＩ－ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＡＡＬ０９０９４．１、配列番号２１８）の全長をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計し（配列番号２１９、２２０）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られた断片およびｐＭＷ１１９：：ＥＨ／ＨｉｎｄＩＩＩを、Ｉｎ－ＦｕｓｉｏｎＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を用いて連結し、大腸菌株ＤＨ５αに導入した。得られた組換え株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認したプラスミドをｐＭＷ１１９：：ＥＨＥＲとした。

実施例１
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損したセラチア属微生物変異体の作製
セラチア属微生物のピルビン酸キナーゼをコードする遺伝子であるｐｙｋＦおよびｐｙｋＡを欠損させ、ピルビン酸キナーゼの機能が欠損したセラチア属微生物変異体を作製した。

ｐｙｋＦおよびｐｙｋＡの欠損方法は、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．２０００Ｊｕｎ６；９７（１２）：６６４０-６６４５．に記載の方法に従った。

ｐｙｋＦを欠損したセラチア属微生物変異体の作製
ｐＫＤ４を鋳型として、プライマーとして配列番号２２１および２２２のオリゴＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、ｐｙｋＦ欠損のための配列長１．６ｋｂのＰＣＲ断片を得た。ＦＲＴｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ発現プラスミドであるｐＫＤ４６を、ＳｅｒｒａｔｉａｇｒｉｍｅｓｉｉＮＢＲＣ１３５３７株に導入し、アンピシリン耐性株を取得した。得られた株をアンピシリン５００μｇ／ｍＬを含む５ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３０℃で１日振とう培養した。培養液０．５ｍＬをアンピシリン５００μｇ／ｍＬおよびアラビノース５０ｍＭを含む５０ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３０℃で２時間、回旋培養した。培養液を２０分間氷冷したのち、菌体を１０％（ｗ／ｗ）グリセロールで３回洗浄した。洗浄後のペレットを１００μＬの１０％（ｗ／ｗ）グリセロールで懸濁し、５μＬのＰＣＲ断片と混合したのちエレクトロポレーションキュベット内で１０分間氷冷した。Ｇｅｎｅｐｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏ－ｒａｄ社製）を用いてエレクトロポレーションを実施した（３ｋＶ、２００Ω、２５μＦ）後、即座に１ｍＬのＳＯＣ培地を添加し、３０℃で２時間振とう培養した。全量をカナマイシン２５μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３０℃で１日インキュベートした。得られたカナマイシン耐性株を用いてコロニーダイレクトＰＣＲを行い、バンド長より目的遺伝子の欠損およびカナマイシン耐性遺伝子の挿入を確認した。プライマーは配列番号２２３および２２５のオリゴＤＮＡを使用した。

続いて当該カナマイシン耐性株を５ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３７℃にて２回継代培養することでｐＫＤ４６を脱落させ、アンピシリン感受性株を得た。アンピシリン感受性株にｐＣＰ２０を導入し、再びアンピシリン耐性株を取得した。得られた株を４０℃で培養した後にコロニーダイレクトＰＣＲを行い、バンド長よりカナマイシン耐性遺伝子の脱落を確認した。プライマーは配列番号２２４および２２５のオリゴＤＮＡを使用した。カナマイシン感受性株を５ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３７℃にて２回継代培養することでｐＣＰ２０を脱落させた。得られた株をＳｅｒｒａｔｉａｇｒｉｍｅｓｉｉＮＢＲＣ１３５３７ΔｐｙｋＦとした。

ｐｙｋＡを欠損したセラチア属微生物変異体の作製
ｐＫＤ４を鋳型として、プライマーとして配列番号２２６および２２７のオリゴＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、配列長１．６ｋｂのｐｙｋＡ欠損用ＰＣＲ断片を得た。

ｐｙｋＦ欠損株の作製と同様の方法にて、ＳｅｒｒａｔｉａｇｒｉｍｅｓｉｉＮＢＲＣ１３５３７ΔｐｙｋＦ株のｐｙｋＡを欠損させた。当該株にｐＫＤ４６を導入したのち、ｐｙｋＡ欠損用ＰＣＲ断片を導入した。得られたカナマイシン耐性株を用いてコロニーダイレクトＰＣＲを行い、バンド長より目的遺伝子の欠損およびカナマイシン耐性遺伝子の挿入を確認した。プライマーは配列番号２２３および２２９のオリゴＤＮＡを使用した。

続いてｐＫＤ４６を脱落させ、アンピシリン感受性株を得た。アンピシリン感受性株にｐＣＰ２０を導入し、再びアンピシリン耐性株を取得した。得られた株を用いてコロニーダイレクトＰＣＲを行い、バンド長よりカナマイシン耐性遺伝子の脱落を確認した。プライマーは配列番号２２８および２２９のオリゴＤＮＡを使用した。カナマイシン感受性株よりｐＣＰ２０を脱落させた。得られた株をＳｇΔＰＰとした。

実施例２
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損し、かつ反応Ａ、Ｂ、ＥおよびＦを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入したセラチア属微生物変異体の作製
実施例１で作製したＳｇΔＰＰに対して、参考例１で作製したプラスミドをそれぞれ導入し、セラチア属微生物変異体を作製した。また、コントロールとして、ＳｇΔＰＰに、空ベクターであるｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２を導入したセラチア属微生物変異体を作製した。

ＳｇΔＰＰを５ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３０℃で１日振とう培養した。培養液０．５ｍＬを５ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３０℃で２時間、振とう培養した。培養液を２０分間氷冷したのち、菌体を１０％（ｗ／ｗ）グリセロールで３回洗浄した。洗浄後のペレットを１００μＬの１０％（ｗ／ｗ）グリセロールで懸濁し、１μＬのｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２（コントロール）、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ１、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ２、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ３、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ４、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ５、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ６、またはｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ７と混合したのちエレクトロポレーションキュベット内で１０分間氷冷した。Ｇｅｎｅｐｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏ－ｒａｄ社製）を用いてエレクトロポレーションを実施した（３ｋＶ、２００Ω、２５μＦ）後、即座に１ｍＬのＳＯＣ培地を添加し、３０℃で１時間振とう培養した。５０μＬをカナマイシン２５μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３０℃で１日インキュベートした。得られた株をそれぞれＳｇΔＰＰ／ｐＢＢＲ（ネガティブコントロール）、ＳｇΔＰＰ／３ＨＡ１、ＳｇΔＰＰ／３ＨＡ２、ＳｇΔＰＰ／３ＨＡ３、ＳｇΔＰＰ／３ＨＡ４、ＳｇΔＰＰ／３ＨＡ５、ＳｇΔＰＰ／３ＨＡ６、ＳｇΔＰＰ／３ＨＡ７とした。

参考例５
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損しておらず、かつ反応Ａ、Ｂ、ＥおよびＦを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入したセラチア属微生物変異体の作製
実施例２と同様の方法にて、ＳｅｒｒａｔｉａｇｒｉｍｅｓｉｉＮＢＲＣ１３５３７にｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２（コントロール）、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ１、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ２、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ３、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ４、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ５、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ６、またはｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ７を導入した。得られた株をそれぞれＳｇ／ｐＢＢＲ（ネガティブコントロール）、Ｓｇ／３ＨＡ１、Ｓｇ／３ＨＡ２、Ｓｇ／３ＨＡ３、Ｓｇ／３ＨＡ４、Ｓｇ／３ＨＡ５、Ｓｇ／３ＨＡ６、Ｓｇ／３ＨＡ７とした。

実施例３
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損したセラチア属微生物変異体を用いた３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の生産試験
実施例２で作製したセラチア属微生物変異体を用いて、３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の生産試験を行った。

ｐＨ７に調整した培地Ｉ（Ｂａｃｔｏトリプトン（ＤｉｆｃｏＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）１０ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ酵母エキス（ＤｉｆｃｏＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、カナマイシン２５μｇ／ｍＬ）５ｍＬ（φ１８ｍｍガラス試験管、アルミ栓）に、実施例２で作製した変異体を一白金耳植菌し、３０℃、１２０ｍｉｎ－１で２４時間振とう培養した。当該培養液０．２５ｍＬをｐＨ６．５に調整した培地ＩＩ（グルコース５０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム１ｇ／Ｌ、リン酸カリウム５０ｍＭ、硫酸マグネシウム０．０２５ｇ／Ｌ、硫酸鉄０．０６２５ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン２．７ｍｇ／Ｌ、塩化カルシウム０．３３ｍｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１．２５ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏトリプトン２．５ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ酵母エキス１．２５ｇ／Ｌ、カナマイシン２５μｇ／ｍＬ）５ｍＬ（φ１８ｍｍガラス試験管、アルミ栓）に添加し、３０℃、１２０ｍｉｎ－１で２４時間振とう培養した。

基質および生成物の定量分析
当該培養液より菌体を遠心分離した上清をＭｉｌｌｅｘ－ＧＶ（０．２２μｍ、ＰＶＤＦ、Ｍｅｒｃｋ社製）を用いて膜処理し、透過液を以下の方法で分析することで培養上清中に蓄積した３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。さらに、その結果を元に上記の式（２）を用いて算出した３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の収率を表７に示す。ただし、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる定量分析において０．１ｍｇ／Ｌ以下であった場合は検出限界以下とし、表中には以下Ｎ．Ｄ．と表す。

ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の定量分析
・ＨＰＬＣ：１２９０Ｉｎｆｉｎｉｔｙ（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）
カラム：Ｓｙｎｅｒｇｉｈｙｄｒｏ－ＲＰ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）、長さ１００ｍｍ、内径３ｍｍ、粒径２．５μｍ
移動相：０．１％ギ酸水溶液／メタノール＝７０／３０
流速：０．３ｍＬ／分
カラム温度：４０℃
ＬＣ検出器：１２６０ＤＡＤＶＬ＋（２１０ｎｍ）
・ＭＳ／ＭＳ：Ｔｒｉｐｌｅ－ＱｕａｄＬＣ／ＭＳ（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）
イオン化法：ＥＳＩネガティブモード。

ＨＰＬＣによる有機酸の定量分析
・ＨＰＬＣ：ＬＣ－１０Ａ（島津製作所製）
カラム：Ｓｈｉｍ－ｐａｃｋＳＰＲ－Ｈ（島津ジーエルシー社製）、長さ２５０ｍｍ、内径７．８ｍｍ、粒径８μｍ
Ｓｈｉｍ－ｐａｃｋＳＣＲ－１０１Ｈ（島津ジーエルシー社製）長さ２５０ｍｍ、内径７．８ｍｍ、粒径１０μｍ
移動相：５ｍＭｐ－トルエンスルホン酸
反応液：５ｍＭｐ－トルエンスルホン酸、０．１ｍＭＥＤＴＡ、２０ｍＭＢｉｓ－Ｔｒｉｓ
流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：４５℃
検出器：ＣＤＤ－１０Ａｖｐ（島津製作所製）

ＨＰＬＣによる糖およびアルコールの定量分析
・ＨＰＬＣ：ＳｈｉｍａｚｕＰｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（島津製作所製）
カラム：ＳｈｏｄｅｘＳｕｇａｒＳＨ１０１１（昭和電工株式会社製）、長さ３００ｍｍ、内径８ｍｍ、粒径６μｍ
移動相：０．０５Ｍ硫酸水溶液
流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：６５℃
検出器：ＲＩＤ－１０Ａ（島津製作所製）。

比較例１
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損していないセラチア属微生物変異体を用いた３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の生産試験
実施例３と同様の方法にて、参考例５で作製したセラチア属微生物変異体を培養した。培養上清中に蓄積した３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。さらに、その結果を元に上記式（２）を用いて算出した３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の収率を表７に示す。

本比較例１の結果と実施例３の結果を比較すると、セラチア属微生物のピルビン酸キナーゼの機能を欠損させることにより、３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の収率が向上することがわかった。

実施例４
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損した大腸菌変異体の作製
大腸菌のピルビン酸キナーゼをコードする遺伝子であるｐｙｋＦおよびｐｙｋＡを欠損させ、ピルビン酸キナーゼの機能が欠損した大腸菌の変異体を作製した。ｐｙｋＦおよびｐｙｋＡの欠損方法は、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．２０００Ｊｕｎ６；９７（１２）：６６４０－６６４５．に記載の方法に従った。

ｐｙｋＦを欠損した大腸菌の変異体の作製
ｐＫＤ４を鋳型として、プライマーとして配列番号２３０および２３１のオリゴＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、ｐｙｋＦ欠損のための配列長１．６ｋｂのＰＣＲ断片を得た。

ＦＲＴｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ発現プラスミドであるｐＫＤ４６を、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＭＧ１６５５株に導入し、アンピシリン耐性株を取得した。得られた株をアンピシリン１００μｇ／ｍＬを含む５ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３０℃で１日振とう培養した。培養液０．５ｍＬをアンピシリン１００μｇ／ｍＬおよびアラビノース５０ｍＭを含む５０ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３０℃で２時間、回旋培養した。培養液を２０分間氷冷したのち、菌体を１０％（ｗ／ｗ）グリセロールで３回洗浄した。洗浄後のペレットを１００μＬの１０％（ｗ／ｗ）グリセロールで懸濁し、５μＬのＰＣＲ断片と混合したのちエレクトロポレーションキュベット内で１０分間氷冷した。Ｇｅｎｅｐｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏ－ｒａｄ社製）を用いてエレクトロポレーションを実施した（３ｋＶ、２００Ω、２５μＦ）後、即座に１ｍＬのＳＯＣ培地を添加し、３０℃で２時間振とう培養した。全量をカナマイシン２５μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３０℃で１日インキュベートした。得られたカナマイシン耐性株を用いてコロニーダイレクトＰＣＲを行い、バンド長より目的遺伝子の欠損およびカナマイシン耐性遺伝子の挿入を確認した。プライマーは配列番号２２３および２３３のオリゴＤＮＡを使用した。

続いて当該カナマイシン耐性株を５ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３７℃にて２回継代培養することでｐＫＤ４６を脱落させ、アンピシリン感受性株を得た。アンピシリン感受性株にｐＣＰ２０を導入し、再びアンピシリン耐性株を取得した。得られた株を４０℃で培養した後にコロニーダイレクトＰＣＲを行い、バンド長よりカナマイシン耐性遺伝子の脱落を確認した。プライマーは配列番号２３２および２３３のオリゴＤＮＡを使用した。カナマイシン感受性株を５ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３７℃にて２回継代培養することでｐＣＰ２０を脱落させた。得られた株をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＭＧ１６５５ΔｐｙｋＦとした。

ｐｙｋＡを欠損した大腸菌の変異体の作製
ｐＫＤ４を鋳型として、プライマーとして配列番号２３４および２３５のオリゴＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、配列長１．６ｋｂのｐｙｋＡ欠損用ＰＣＲ断片を得た。

ｐｙｋＦ欠損株の作製と同様の方法にて、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＭＧ１６５５ΔｐｙｋＦ株のｐｙｋＡを欠損させた。当該株にｐＫＤ４６を導入したのち、ｐｙｋＡ欠損用ＰＣＲ断片を導入した。得られたカナマイシン耐性株を用いてコロニーダイレクトＰＣＲを行い、バンド長より目的遺伝子の欠損およびカナマイシン耐性遺伝子の挿入を確認した。プライマーは配列番号２２３および２２４のオリゴＤＮＡを使用した。

続いてｐＫＤ４６を脱落させ、アンピシリン感受性株を得た。アンピシリン感受性株にｐＣＰ２０を導入し、再びアンピシリン耐性株を取得した。得られた株を用いてコロニーダイレクトＰＣＲを行い、バンド長よりカナマイシン耐性遺伝子の脱落を確認した。プライマーは配列番号２３６および２３７のオリゴＤＮＡを使用した。カナマイシン感受性株よりｐＣＰ２０を脱落させた。得られた株をＥｃΔＰＰとした。

実施例５
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損し、かつ反応Ａ、Ｂ、ＥおよびＦを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入した大腸菌変異体の作製
実施例４で作製したＥｃΔＰＰに対して、参考例１で作製したプラスミドをそれぞれ導入し、大腸菌の変異体を作製した。

ＥｃΔＰＰを５ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３０℃で１日振とう培養した。培養液０．５ｍＬを５ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３０℃で２時間、振とう培養した。培養液を２０分間氷冷したのち、菌体を１０％（ｗ／ｗ）グリセロールで３回洗浄した。洗浄後のペレットを１００μＬの１０％（ｗ／ｗ）グリセロールで懸濁し、１μＬのｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２（ネガティブコントロール）、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ１、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ２、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ３、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ４、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ５、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ６、またはｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ７と混合したのちエレクトロポレーションキュベット内で１０分間氷冷した。Ｇｅｎｅｐｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏ－ｒａｄ社製）を用いてエレクトロポレーションを実施した（３ｋＶ、２００Ω、２５μＦ）後、即座に１ｍＬのＳＯＣ培地を添加し、３０℃で１時間振とう培養した。５０μＬをカナマイシン２５μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３０℃で１日インキュベートした。得られた株をそれぞれＥｃΔＰＰ／ｐＢＢＲ（ネガティブコントロール）、ＥｃΔＰＰ／３ＨＡ１、ＥｃΔＰＰ／３ＨＡ２、ＥｃΔＰＰ／３ＨＡ３、ＥｃΔＰＰ／３ＨＡ４、ＥｃΔＰＰ／３ＨＡ５、ＥｃΔＰＰ／３ＨＡ６、ＥｃΔＰＰ／３ＨＡ７とした。

参考例６
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損しておらず、かつ反応Ａ、Ｂ、ＥおよびＦを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入した大腸菌変異体の作製
実施例５と同様の方法にて、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＭＧ１６５５にｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２（コントロール）、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ１、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ２、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ３、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ４、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ５、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ６、またはｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ７を導入した。得られた株をそれぞれＥｃ／ｐＢＢＲ（ネガティブコントロール）、Ｅｃ／３ＨＡ１、Ｅｃ／３ＨＡ２、Ｅｃ／３ＨＡ３、Ｅｃ／３ＨＡ４、Ｅｃ／３ＨＡ５、Ｅｃ／３ＨＡ６、Ｅｃ／３ＨＡ７とした。

実施例６
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損した大腸菌の変異体を用いた３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の生産試験
実施例３と同様の方法にて、実施例５で作製した変異体を培養した。培養上清中に蓄積した３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。その値を元に上記式（２）を用いて算出した３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の収率を表８に示す。

比較例２
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損していない大腸菌の変異体を用いた３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の生産試験
実施例６と同様の方法にて、参考例６で作製した変異体を培養した。培養上清中に蓄積した３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。その値を元に上記式（２）を用いて算出した３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の収率を表８に示す。

本比較例２の結果と実施例６の結果を比較すると、大腸菌のピルビン酸キナーゼの機能を欠損させることにより、３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の収率が向上することがわかった。

実施例７
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損し、かつ反応Ａ、Ｂ、Ｃ、ＥおよびＦを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入したセラチア属微生物変異体の作製
実施例２で作製したセラチア属微生物変異体それぞれに対して、参考例２で作製したプラスミドｐＭＷ１１９：：ＥＨを導入し、セラチア属微生物変異体を作製した。また、コントロールとして、実施例２で作成したＳｇΔＰＰ／ｐＢＢＲに、空ベクターであるｐＭＷ１１９を導入したセラチア属微生物変異体を作製した。

ＳｇΔＰＰ／ｐＢＢＲ、ＳｇΔＰＰ／３ＨＡ１、ＳｇΔＰＰ／３ＨＡ２、ＳｇΔＰＰ／３ＨＡ３、ＳｇΔＰＰ／３ＨＡ４、ＳｇΔＰＰ／３ＨＡ５、ＳｇΔＰＰ／３ＨＡ６、ＳｇΔＰＰ／３ＨＡ７を、カナマイシン２５μｇ／ｍＬを含む５ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３０℃で１日振とう培養した。培養液０．５ｍＬをカナマイシン２５μｇ／ｍＬを含む５ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３０℃で２時間、振とう培養した。培養液を２０分間氷冷したのち、菌体を１０％（ｗ／ｗ）グリセロールで３回洗浄した。洗浄後のペレットを１００μＬの１０％（ｗ／ｗ）グリセロールで懸濁し、１μＬのｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２（コントロール）、またはｐＭＷ１１９：：ＥＨと混合したのちエレクトロポレーションキュベット内で１０分間氷冷した。Ｇｅｎｅｐｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏ－ｒａｄ社製）を用いてエレクトロポレーションを実施した（３ｋＶ、２００Ω、２５μＦ）後、即座に１ｍＬのＳＯＣ培地を添加し、３０℃で１時間振とう培養した。５０μＬをアンピシリン５００μｇ／ｍＬおよびカナマイシン２５μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３０℃で１日インキュベートした。得られた株をそれぞれＳｇΔＰＰ／ｐＢＢＲｐＭＷ（ネガティブコントロール）、ＳｇΔＰＰ／ＨＭＡ１、ＳｇΔＰＰ／ＨＭＡ２、ＳｇΔＰＰ／ＨＭＡ３、ＳｇΔＰＰ／ＨＭＡ４、ＳｇΔＰＰ／ＨＭＡ５、ＳｇΔＰＰ／ＨＭＡ６、ＳｇΔＰＰ／ＨＭＡ７とした。

参考例７
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損しておらず、かつ反応Ａ、Ｂ、Ｃ、ＥおよびＦを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入したセラチア属微生物変異体の作製
実施例７と同様の方法にて、Ｓｇ／ｐＢＢＲ、Ｓｇ／３ＨＡ１、Ｓｇ／３ＨＡ２、Ｓｇ／３ＨＡ３、Ｓｇ／３ＨＡ４、Ｓｇ／３ＨＡ５、Ｓｇ／３ＨＡ６、Ｓｇ／３ＨＡ７にｐＭＷ１１９（コントロール）、またはｐＭＷ１１９：：ＥＨを導入した。得られた株をそれぞれＳｇ／ｐＢＢＲｐＭＷ（ネガティブコントロール）、Ｓｇ／ＨＭＡ１、Ｓｇ／ＨＭＡ２、Ｓｇ／ＨＭＡ３、Ｓｇ／ＨＭＡ４、Ｓｇ／ＨＭＡ５、Ｓｇ／ＨＭＡ６、Ｓｇ／ＨＭＡ７とした。

実施例８
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損したセラチア属微生物の変異体を用いたα－ヒドロムコン酸の生産試験
培地にアンピシリンを５００μｇ／ｍＬとなるように添加した以外は実施例３と同様の方法にて、実施例７で作製した変異体を培養した。培養上清中に蓄積したα－ヒドロムコン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。その値を元に上記式（２）を用いて算出したα－ヒドロムコン酸の収率を表９に示す。

比較例３
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損していないセラチア属微生物の変異体を用いたα－ヒドロムコン酸の生産試験
実施例８と同様の方法にて、参考例７で作製した変異体を培養した。培養上清中に蓄積したα－ヒドロムコン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。その値を元に上記式（２）を用いて算出したα－ヒドロムコン酸の収率を表９に示す。

本比較例３の結果と実施例８の結果を比較すると、セラチア属微生物のピルビン酸キナーゼの機能を欠損させることにより、α－ヒドロムコン酸の収率が向上することがわかった。

実施例９
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損し、かつ反応Ａ、Ｂ、Ｃ、ＥおよびＦを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入した大腸菌変異体の作製
実施例５で作製した大腸菌変異体それぞれに対して、参考例２で作製したプラスミドｐＭＷ１１９：：ＥＨを導入し、大腸菌変異体を作製した。また、コントロールとして、実施例５で作成したＥｃΔＰＰ／ｐＢＢＲに、空ベクターであるｐＭＷ１１９を導入した大腸菌変異体を作製した。

ＥｃΔＰＰ／ｐＢＢＲ、ＥｃΔＰＰ／３ＨＡ１、ＥｃΔＰＰ／３ＨＡ２、ＥｃΔＰＰ／３ＨＡ３、ＥｃΔＰＰ／３ＨＡ４、ＥｃΔＰＰ／３ＨＡ５、ＥｃΔＰＰ／３ＨＡ６、ＥｃΔＰＰ／３ＨＡ７を、カナマイシン２５μｇ／ｍＬを含む５ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３０℃で１日振とう培養した。培養液０．５ｍＬをカナマイシン２５μｇ／ｍＬを含む５ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３０℃で２時間、振とう培養した。培養液を２０分間氷冷したのち、菌体を１０％（ｗ／ｗ）グリセロールで３回洗浄した。洗浄後のペレットを１００μＬの１０％（ｗ／ｗ）グリセロールで懸濁し、１μＬのｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２（コントロール）、またはｐＭＷ１１９：：ＥＨと混合したのちエレクトロポレーションキュベット内で１０分間氷冷した。Ｇｅｎｅｐｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏ－ｒａｄ社製）を用いてエレクトロポレーションを実施した（３ｋＶ、２００Ω、２５μＦ）後、即座に１ｍＬのＳＯＣ培地を添加し、３０℃で１時間振とう培養した。５０μＬをアンピシリン１００μｇ／ｍＬおよびカナマイシン２５μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３０℃で１日インキュベートした。得られた株をそれぞれＥｃΔＰＰ／ｐＢＢＲｐＭＷ（ネガティブコントロール）、ＥｃΔＰＰ／ＨＭＡ１、ＥｃΔＰＰ／ＨＭＡ２、ＥｃΔＰＰ／ＨＭＡ３、ＥｃΔＰＰ／ＨＭＡ４、ＥｃΔＰＰ／ＨＭＡ５、ＥｃΔＰＰ／ＨＭＡ６、ＥｃΔＰＰ／ＨＭＡ７とした。

参考例８
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損しておらず、かつ反応Ａ、Ｂ、Ｃ、ＥおよびＦを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入した大腸菌変異体の作製
実施例９と同様の方法にて、Ｅｃ／ｐＢＢＲ、Ｅｃ／３ＨＡ１、Ｅｃ／３ＨＡ２、Ｅｃ／３ＨＡ３、Ｅｃ／３ＨＡ４、Ｅｃ／３ＨＡ５、Ｅｃ／３ＨＡ６、Ｅｃ／３ＨＡ７にｐＭＷ１１９（コントロール）、またはｐＭＷ１１９：：ＥＨを導入した。得られた株をそれぞれＥｃ／ｐＢＢＲｐＭＷ（ネガティブコントロール）、Ｅｃ／ＨＭＡ１、Ｅｃ／ＨＭＡ２、Ｅｃ／ＨＭＡ３、Ｅｃ／ＨＭＡ４、Ｅｃ／ＨＭＡ５、Ｅｃ／ＨＭＡ６、Ｅｃ／ＨＭＡ７とした。

実施例１０
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損した大腸菌の変異体を用いたα－ヒドロムコン酸の生産試験
培地にアンピシリンを１００μｇ／ｍＬとなるように添加した以外は実施例６と同様の方法にて、実施例９で作製した変異体を培養した。培養上清中に蓄積したα－ヒドロムコン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。その値を元に上記式（２）を用いて算出したα－ヒドロムコン酸の収率を表１０に示す。

比較例４
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損していない大腸菌の変異体を用いたα－ヒドロムコン酸の生産試験
実施例１０と同様の方法にて、参考例８で作製した変異体を培養した。培養上清中に蓄積したα－ヒドロムコン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。その値を元に上記式（２）を用いて算出したα－ヒドロムコン酸の収率を表１０に示す。

本比較例４の結果と実施例１０の結果を比較すると、大腸菌のピルビン酸キナーゼの機能を欠損させることにより、α－ヒドロムコン酸の収率が向上することがわかった。

実施例１１
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損し、かつ反応Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＧを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入したセラチア属微生物変異体の作製
実施例２と同様の方法にて、ＳｇΔＰＰに対して参考例３で作成したｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ１、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ２、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ３、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ４、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ５、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ６、またはｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ７を導入した。得られた変異体それぞれに対して、実施例７と同様の方法にて、参考例４で作製したプラスミドｐＭＷ１１９：：ＥＨＥＲを導入し、セラチア属微生物変異体を作製した。得られた株をそれぞれＳｇΔＰＰ／ＡＤＡ１、ＳｇΔＰＰ／ＡＤＡ２、ＳｇΔＰＰ／ＡＤＡ３、ＳｇΔＰＰ／ＡＤＡ４、ＳｇΔＰＰ／ＡＤＡ５、ＳｇΔＰＰ／ＡＤＡ６、ＳｇΔＰＰ／ＡＤＡ７とした。

参考例９
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損しておらず、かつ反応Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＧを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入したセラチア属微生物変異体の作製
実施例１１と同様の方法にて、ＳｅｒｒａｔｉａｇｒｉｍｅｓｉｉＮＢＲＣ１３５３７に対して参考例３で作成したｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ１、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ２、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ３、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ４、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ５、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ６、またはｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ７を導入した。得られた変異体それぞれに対して、実施例７と同様の方法にて、参考例４で作製したプラスミドｐＭＷ１１９：：ＥＨＥＲを導入し、セラチア属微生物変異体を作製した。得られた株をそれぞれＳｇ／ＡＤＡ１、Ｓｇ／ＡＤＡ２、Ｓｇ／ＡＤＡ３、Ｓｇ／ＡＤＡ４、Ｓｇ／ＡＤＡ５、Ｓｇ／ＡＤＡ６、Ｓｇ／ＡＤＡ７とした。

実施例１２
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損したセラチア属微生物の変異体を用いたアジピン酸の生産試験
実施例８と同様の方法にて、実施例１１で作製した変異体およびＳｇΔＰＰ／ｐＢＢＲｐＭＷ（ネガティブコントロール）を培養した。培養上清中に蓄積したアジピン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。なおアジピン酸の定量はＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いて３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸と同様の条件にて行った。その値を元に上記式（２）を用いて算出したアジピン酸の収率を表１１に示す。

比較例５
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損していないセラチア属微生物の変異体を用いたアジピン酸の生産試験
実施例８と同様の方法にて、参考例９で作製した変異体およびＳｇ／ｐＢＢＲｐＭＷを培養した。培養上清中に蓄積したアジピン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。その値を元に上記式（２）を用いて算出したアジピン酸の収率を表１１に示す。

本比較例５の結果と実施例１２の結果を比較すると、セラチア属微生物のピルビン酸キナーゼの機能を欠損させることにより、アジピン酸の収率が向上することがわかった。

実施例１３
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損し、かつ反応Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＧを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入した大腸菌変異体の作製
実施例５と同様の方法にて、ＥｃΔＰＰに対して参考例３で作成したｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ１、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ２、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ３、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ４、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ５、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ６、またはｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ７を導入した。得られた変異体それぞれに対して、実施例９と同様の方法にて、参考例４で作製したプラスミドｐＭＷ１１９：：ＥＨＥＲを導入し、大腸菌変異体を作製した。得られた株をそれぞれＥｃΔＰＰ／ＡＤＡ１、ＥｃΔＰＰ／ＡＤＡ２、ＥｃΔＰＰ／ＡＤＡ３、ＥｃΔＰＰ／ＡＤＡ４、ＥｃΔＰＰ／ＡＤＡ５、ＥｃΔＰＰ／ＡＤＡ６、ＥｃΔＰＰ／ＡＤＡ７とした。

参考例１０
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損しておらず、かつ反応Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＧを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入した大腸菌変異体の作製
実施例１３と同様の方法にて、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＭＧ１６５５に対して参考例３で作成したｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ１、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ２、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ３、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ４、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ５、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ６、またはｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ７を導入した。得られた変異体それぞれに対して、実施例９と同様の方法にて、参考例４で作製したプラスミドｐＭＷ１１９：：ＥＨＥＲを導入し、大腸菌変異体を作製した。得られた株をそれぞれＥｃ／ＡＤＡ１、Ｅｃ／ＡＤＡ２、Ｅｃ／ＡＤＡ３、Ｅｃ／ＡＤＡ４、Ｅｃ／ＡＤＡ５、Ｅｃ／ＡＤＡ６、Ｅｃ／ＡＤＡ７とした。

実施例１４
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損した大腸菌の変異体を用いたアジピン酸の生産試験
実施例１０と同様の方法にて、実施例１３で作製した変異体およびＥｃΔＰＰ／ｐＢＢＲｐＭＷを培養した。培養上清中に蓄積したアジピン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。なおアジピン酸の定量はＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いて３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸と同様の条件にて行った。その値を元に上記式（２）を用いて算出したアジピン酸の収率を表１２に示す。

比較例６
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損していない大腸菌の変異体を用いたアジピン酸の生産試験
実施例１０と同様の方法にて、参考例１０で作製した変異体およびＥｃ／ｐＢＢＲｐＭＷを培養した。培養上清中に蓄積したアジピン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。その値を元に上記式（２）を用いて算出したアジピン酸の収率を表１２に示す。

本比較例６の結果と実施例１４の結果を比較すると、大腸菌のピルビン酸キナーゼの機能を欠損させることにより、アジピン酸の収率が向上することがわかった。

実施例１５
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損したセラチア属微生物の変異体を用いた３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の生産試験２
実施例２で作製したセラチア属微生物変異体を用いて、嫌気条件下での３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の生産試験を行った。

培地ＩＩを用いた培養を静置にて行った以外は実施例３と同様の方法にて、実施例２で作製したセラチア属微生物変異体を培養した。培養上清中に蓄積した３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。その値を元に上記式（２）を用いて算出した３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の収率を表１３に示す。

比較例７
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損していないセラチア属微生物の変異体を用いた３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の生産試験２
実施例１５と同様の方法にて、参考例５で作製した変異体を培養した。培養上清中に蓄積した３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。その値を元に上記式（２）を用いて算出した３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の収率を表１３に示す。

本比較例７の結果と実施例１５の結果を比較すると、セラチア属微生物のピルビン酸キナーゼの機能を欠損させることにより、嫌気条件下でも３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の収率が向上することがわかった。

実施例１６
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損した大腸菌の変異体を用いた３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の生産試験２
実施例５で作製した大腸菌変異体を用いて、嫌気条件下での３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の生産試験を行った。

培地ＩＩを用いた培養を静置にて行った以外は実施例６と同様の方法にて、実施例５で作製した大腸菌変異体を培養した。培養上清中に蓄積した３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。その値を元に上記式（２）を用いて算出した３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の収率を表１４に示す。

比較例８
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損していない大腸菌の変異体を用いた３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の生産試験２
実施例１６と同様の方法にて、参考例６で作製した変異体を培養した。培養上清中に蓄積した３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。その値を元に上記式（２）を用いて算出した３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の収率を表１４に示す。

本比較例８の結果と実施例１６の結果を比較すると、大腸菌のピルビン酸キナーゼの機能を欠損させることにより、嫌気条件下でも３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の収率が向上することがわかった。

実施例１７
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損したセラチア属微生物の変異体を用いたアジピン酸の生産試験２
実施例１１で作製したセラチア属微生物変異体を用いて、嫌気条件下でのアジピン酸の生産試験を行った。

培地ＩＩを用いた培養を静置にて行った以外は実施例１２と同様の方法にて、実施例１１で作製したセラチア属微生物変異体を培養した。培養上清中に蓄積したアジピン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。その値を元に上記式（２）を用いて算出したアジピン酸の収率を表１５に示す。

比較例９
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損していないセラチア属微生物の変異体を用いたアジピン酸の生産試験２
実施例１７と同様の方法にて、参考例９で作製した変異体を培養した。培養上清中に蓄積したアジピン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。その値を元に上記式（２）を用いて算出したアジピン酸の収率を表１５に示す。

本比較例９の結果と実施例１７の結果を比較すると、セラチア属微生物のピルビン酸キナーゼの機能を欠損させることにより、嫌気条件下でもアジピン酸の収率が向上することがわかった。

実施例１８
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損した大腸菌の変異体を用いたアジピン酸の生産試験２
実施例１３で作製した大腸菌変異体を用いて、嫌気条件下でのアジピン酸の生産試験を行った。

培地ＩＩを用いた培養を静置にて行った以外は実施例１４と同様の方法にて、実施例１３で作製した大腸菌変異体を培養した。培養上清中に蓄積したアジピン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。その値を元に上記式（２）を用いて算出したアジピン酸の収率を表１６に示す。

比較例１０
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損していない大腸菌の変異体を用いたアジピン酸の生産試験２
実施例１８と同様の方法にて、参考例１０で作製した変異体を培養した。培養上清中に蓄積したアジピン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。その値を元に上記式（２）を用いて算出したアジピン酸の収率を表１６に示す。

本比較例１０の結果と実施例１８の結果を比較すると、大腸菌のピルビン酸キナーゼの機能を欠損させることにより、嫌気条件下でもアジピン酸の収率が向上することがわかった。

実施例１９
ピルビン酸キナーゼ遺伝子およびホスホトランスフェラーゼ系酵素遺伝子が欠損したセラチア属微生物の遺伝子変異体の作製
実施例１で作製したＳｇΔＰＰ株の有するホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子であるｐｔｓＧを欠損させ、ピルビン酸キナーゼおよびホスホトランスフェラーゼ系酵素の機能が欠損したセラチア属微生物変異体を作製した。

ｐＫＤ４を鋳型として、プライマーとして配列番号２３９および２４０のオリゴＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、ｐｔｓＧ欠損のための配列長１．６ｋｂのＰＣＲ断片を得た。当該株にｐＫＤ４６を導入したのち、ｐｔｓＧ欠損用ＰＣＲ断片を導入した。得られたカナマイシン耐性株を用いてコロニーダイレクトＰＣＲを行い、バンド長より目的遺伝子の欠損およびカナマイシン耐性遺伝子の挿入を確認した。プライマーは配列番号２２３および２４２のオリゴＤＮＡを使用した。

続いてｐＫＤ４６を脱落させ、アンピシリン感受性株を得た。アンピシリン感受性株にｐＣＰ２０を導入し、再びアンピシリン耐性株を取得した。得られた株を用いてコロニーダイレクトＰＣＲを行い、バンド長よりカナマイシン耐性遺伝子の脱落を確認した。プライマーは配列番号２４１および２４２のオリゴＤＮＡを使用した。カナマイシン感受性株よりｐＣＰ２０を脱落させた。得られた株を以降ＳｇΔＰＰＧと記載する。

実施例２０
ピルビン酸キナーゼ遺伝子およびホスホトランスフェラーゼ系酵素遺伝子が欠損し、かつ反応Ａ、Ｂ、ＥおよびＦを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入したセラチア属微生物の遺伝子変異体の作製
実施例１９で作製したＳｇΔＰＰＧ株に対して、実施例２と同様の方法にて参考例１で作製したプラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ１を導入し、得られたセラチア属微生物変異体をＳｇΔＰＰＧ／３ＨＡ１とした。

実施例２１
ピルビン酸キナーゼおよびホスホトランスフェラーゼ系酵素の機能が欠損し、かつ反応Ａ、Ｂ、ＥおよびＦを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入したセラチア属微生物変異体を用いた３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の生産試験
実施例２０で作製したセラチア属微生物変異体を用いて、実施例１５と同様の方法にて３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の生産試験を行った。

比較例１１
ピルビン酸キナーゼおよびホスホトランスフェラーゼ系酵素の機能が欠損せず、かつ反応Ａ、Ｂ、ＥおよびＦを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入したセラチア属微生物変異体を用いた３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の生産試験
参考例５で作製したＳｇ／３ＨＡ１株を用いて、比較例７と同様の方法にて３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の生産試験を行った。

実施例２１の結果と実施例１５の結果を比較すると、ピルビン酸キナーゼおよびホスホトランスフェラーゼ系酵素の遺伝子が欠損し、かつ３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素活性を強化したセラチア属微生物変異体では、３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の収率がさらに向上することがわかった。また、実施例２１と比較例１１の結果を比較すると、ピルビン酸キナーゼおよびホスホトランスフェラーゼ系酵素の遺伝子が欠損した変異体では、アセチル－ＣｏＡが変換されて生成する酢酸およびエタノールの収率も向上することもわかった。

実施例２２
ピルビン酸キナーゼ遺伝子およびホスホトランスフェラーゼ系酵素遺伝子が欠損した大腸菌の変異体の作製
実施例４で作製したＥｃΔＰＰ株の有するホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子であるｐｔｓＧを欠損させ、ピルビン酸キナーゼおよびホスホトランスフェラーゼ系酵素の機能が欠損した大腸菌の変異体を作製した。

ｐＫＤ４を鋳型として、プライマーとして配列番号２４３および２４４のオリゴＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、ｐｔｓＧ欠損のための配列長１．６ｋｂのＰＣＲ断片を得た。当該株にｐＫＤ４６を導入したのち、ｐｔｓＧ欠損用ＰＣＲ断片を導入した。得られたカナマイシン耐性株を用いてコロニーダイレクトＰＣＲを行い、バンド長より目的遺伝子の欠損およびカナマイシン耐性遺伝子の挿入を確認した。プライマーは配列番号２２３および２４６のオリゴＤＮＡを使用した。

続いてｐＫＤ４６を脱落させ、アンピシリン感受性株を得た。アンピシリン感受性株にｐＣＰ２０を導入し、再びアンピシリン耐性株を取得した。得られた株を用いてコロニーダイレクトＰＣＲを行い、バンド長よりカナマイシン耐性遺伝子の脱落を確認した。プライマーは配列番号２４５および２４６のオリゴＤＮＡを使用した。カナマイシン感受性株よりｐＣＰ２０を脱落させた。得られた株を得られた株を以降ＥｃΔＰＰＧと記載する。

実施例２３
ピルビン酸キナーゼ遺伝子およびホスホトランスフェラーゼ系酵素遺伝子が欠損し、かつ反応Ａ、Ｂ、ＥおよびＦを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入した大腸菌の変異体の作製
実施例２２で作製したＥｃΔＰＰＧ株に対して、実施例５と同様の方法にて参考例１で作製したｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ１を導入し、得られた大腸菌変異体をＥｃΔＰＰＧ／３ＨＡ１とした。

実施例２４
ピルビン酸キナーゼおよびホスホトランスフェラーゼ系酵素の機能が欠損し、かつ反応Ａ、Ｂ、ＥおよびＦを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入した大腸菌変異体を用いた３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の生産試験
実施例２３で作製した大腸菌変異体を用いて、実施例１６と同様の方法にて３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の生産試験を行った。

比較例１２
ピルビン酸キナーゼおよびホスホトランスフェラーゼ系酵素の機能が欠損せず、かつ反応Ａ、Ｂ、ＥおよびＦを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入した大腸菌変異体を用いた３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の生産試験
参考例６で作製したＥｃ／３ＨＡ１を用いて、比較例８と同様の方法にて３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の生産試験を行った。

実施例２４の結果と実施例１６の結果を比較すると、ピルビン酸キナーゼおよびホスホトランスフェラーゼ系酵素の遺伝子が欠損し、かつ３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素活性を強化した大腸菌変異体では、３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の収率がさらに向上することがわかった。また、実施例２４と比較例１２の結果を比較すると、ピルビン酸キナーゼおよびホスホトランスフェラーゼ系酵素の遺伝子が欠損した変異体では、アセチル－ＣｏＡが変換されて生成する酢酸およびエタノールの収率も向上することもわかった。

Claims

以下（ａ）～（ｃ）のいずれかに記載のポリペプチドをコードする核酸を導入、または当該ポリペプチドの発現を増強し、かつピルビン酸キナーゼの機能を欠損させた遺伝子改変微生物：
（ａ）配列番号１～７のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号１～７のいずれかのアミノ酸配列において、１０個以下のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素活性を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号１～７のいずれかのアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有し、かつ３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素活性を有するポリペプチド。
前記（ｂ）および（ｃ）から選択されるポリペプチドが、配列番号１７３のアミノ酸配列からなる領域を含む、請求項１記載の遺伝子改変微生物。
前記配列番号１７３のアミノ酸配列において、Ｎ末端側から１３番目のアミノ酸残基がフェニルアラニンまたはロイシンであり、Ｎ末端側から１５番目のアミの酸残基がロイシンまたはグルタミンであり、Ｎ末端側から１６番目のアミノ酸残基がリシンまたはアスパラギンであり、Ｎ末端側から１７番目のアミノ酸残基がグリシンまたはセリンであり、Ｎ末端側から１９番目のアミノ酸残基がプロリンまたはアルギニンであり、Ｎ末端側から２１番目のアミノ酸残基がロイシン、メチオニンまたはバリンである、請求項２記載の遺伝子改変微生物。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｈａｆｎｉａ属およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属からなる群から選ばれる微生物の遺伝子改変体である、請求項１～３のいずれか１項に記載の遺伝子改変微生物。
アセチル－ＣｏＡおよびスクシニル－ＣｏＡから３－オキソアジピルＣｏＡおよび補酵素Ａを生成する能力並びに３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡから３－ヒドロキシアジピン酸を生成する能力を有する、請求項１～４のいずれか１項に記載の遺伝子改変微生物。
アセチル－ＣｏＡおよびスクシニル－ＣｏＡから３－オキソアジピルＣｏＡおよび補酵素Ａを生成する能力、３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡから２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡを生成する能力並びに２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡからα－ヒドロムコン酸を生成する能力を有する、請求項１～４のいずれか１項に記載の遺伝子改変微生物。
アセチル－ＣｏＡおよびスクシニル－ＣｏＡから３－オキソアジピルＣｏＡおよび補酵素Ａを生成する能力、３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡから２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡを生成する能力、２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡからアジピル－ＣｏＡを生成する能力並びにアジピル－ＣｏＡからアジピン酸を生成する能力を有する、請求項１～４のいずれか１項に記載の遺伝子改変微生物。
さらにホスホトランスフェラーゼ系酵素の機能を欠損させた、請求項１～７のいずれか１項に記載の遺伝子改変微生物。
請求項１～５および８のいずれか１項に記載の遺伝子改変微生物を、炭素源を発酵原料として含む培地にて培養することを含む、３－ヒドロキシアジピン酸の製造方法。
請求項１～４、６および８のいずれか１項に記載の遺伝子改変微生物を、炭素源を発酵原料として含む培地にて培養することを含む、α－ヒドロムコン酸の製造方法。
請求項１～４、７および８のいずれか１項に記載の遺伝子改変微生物を、炭素源を発酵原料として含む培地にて培養することを含む、アジピン酸の製造方法。