JP7530554B2 - 3-ヒドロキシアジピン酸、α-ヒドロムコン酸および/またはアジピン酸を生産するための遺伝子改変微生物および当該化学品の製造方法 - Google Patents
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- C12Y101/01157—3-Hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase (1.1.1.157)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Description
(1)以下(a)~(c)のいずれかに記載のポリペプチドをコードする核酸を導入、または当該ポリペプチドの発現を増強し、かつピルビン酸キナーゼの機能を欠損させた遺伝子改変微生物:
(a)配列番号1~7のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b)配列番号1~7のいずれかのアミノ酸配列において、10個以下のアミノ酸が置換、欠失、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ3-オキソアジピル-CoAを還元して3-ヒドロキシアジピル-CoAを生成する反応を触媒する酵素活性を有するポリペプチド、
(c)配列番号1~7のいずれかのアミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有し、かつ3-オキソアジピル-CoAを還元して3-ヒドロキシアジピル-CoAを生成する反応を触媒する酵素活性を有するポリペプチド。
(2)前記(b)および(c)から選択されるポリペプチドが、配列番号173のアミノ酸配列からなる領域を含む、(1)記載の遺伝子改変微生物。
(3)前記配列番号173のアミノ酸配列において、N末端側から13番目のアミノ酸残基がフェニルアラニンまたはロイシンであり、N末端側から15番目のアミの酸残基がロイシンまたはグルタミンであり、N末端側から16番目のアミノ酸残基がリシンまたはアスパラギンであり、N末端側から17番目のアミノ酸残基がグリシンまたはセリンであり、N末端側から19番目のアミノ酸残基がプロリンまたはアルギニンであり、N末端側から21番目のアミノ酸残基がロイシン、メチオニンまたはバリンである、(2)記載の遺伝子改変微生物。
(4)Escherichia属、Serratia属、Hafnia属およびPseudomonas属からなる群から選ばれる微生物の遺伝子改変体である、(1)~(3)のいずれかに記載の遺伝子改変微生物。
(5)アセチル-CoAおよびスクシニル-CoAから3-オキソアジピルCoAおよび補酵素Aを生成する能力並びに3-ヒドロキシアジピル-CoAから3-ヒドロキシアジピン酸を生成する能力を有する、(1)~(4)のいずれかに記載の遺伝子改変微生物。
(6)アセチル-CoAおよびスクシニル-CoAから3-オキソアジピルCoAおよび補酵素Aを生成する能力、3-ヒドロキシアジピル-CoAから2,3-デヒドロアジピル-CoAを生成する能力並びに2,3-デヒドロアジピル-CoAからα-ヒドロムコン酸を生成する能力を有する、(1)~(4)のいずれかに記載の遺伝子改変微生物。
(7)アセチル-CoAおよびスクシニル-CoAから3-オキソアジピルCoAおよび補酵素Aを生成する能力、3-ヒドロキシアジピル-CoAから2,3-デヒドロアジピル-CoAを生成する能力、2,3-デヒドロアジピル-CoAからアジピル-CoAを生成する能力並びにアジピル-CoAからアジピン酸を生成する能力を有する、(1)~(4)のいずれかに記載の遺伝子改変微生物。
(8)さらにホスホトランスフェラーゼ系酵素の機能を欠損させた、(1)~(7)のいずれかに記載の遺伝子改変微生物。
(9)(1)~(5)および(8)のいずれかに記載の遺伝子改変微生物を、炭素源を発酵原料として含む培地にて培養することを含む、3-ヒドロキシアジピン酸の製造方法。
(10)(1)~(4)、(6)および(8)のいずれかに記載の遺伝子改変微生物を、炭素源を発酵原料として含む培地にて培養することを含む、α-ヒドロムコン酸の製造方法。
(11)(1)~(4)、(7)および(8)のいずれかに記載の遺伝子改変微生物を、炭素源を発酵原料として含む培地にて培養することを含む、アジピン酸の製造方法。
(b)配列番号1~7のいずれかに記載のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ3-オキソアジピル-CoAを還元して3-ヒドロキシアジピル-CoAを生成する反応を触媒する酵素活性を有するポリペプチド
(c)配列番号1~7のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して70%以上の配列同一性を有し、かつ3-オキソアジピル-CoAを還元して3-ヒドロキシアジピル-CoAを生成する活性を有するポリペプチド
カラム:Synergi hydro-RP(Phenomenex社製)、長さ100mm、内径3mm、粒径2.5μm
移動相:0.1%ギ酸水溶液/メタノール=70/30
流速:0.3mL/分
カラム温度:40℃
LC検出器:DAD(210nm)
・MS/MS:Triple-Quad LC/MS(Agilent Technologies社製)
イオン化法:ESI ネガティブモード。
100mM Tris-HCl(pH8.2)
10mM MgCl2
0.5mM succinyl-CoA
5mM 3-oxoadipic acid sodium salt
2μM CoA transferase。
100mM Tris-HCl(pH8.2)
10mM MgCl2
150μL/mL 3-oxoadipyl-CoA solution
0.5mM NADH
1mM dithiothreitol
10μM 3-oxoadipyl-CoA reductase。
Escherichia fergusonii、Escherichia coliなどのEscherichia属。
Pseudomonas chlororaphis、Pseudomonas putida、Pseudomonas azotoformans、Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciensなどのPsuedomonas属。
Hafnia alveiなどのHafnia属。
Corynebacteriumacetoacidophilum、Corynebacterium acetoglutamicum、Corynebacterium ammoniagenes、Corynebacterium glutamicumなどのCorynebacterium属。
Bacillus badius、Bacillus megaterium、Bacillus roseusなどのBacillus属。
Streptomyces vinaceus、Streptomyces karnatakensis、Streptomyces olivaceusなどのStreptomyces属。
Cupriavidus metallidurans、Cupriavidus necator、Cupriavidus oxalaticusなどのCupriavidus属。
Acinetobacter baylyi、Acinetobacter radioresistensなどのAcinetobacter属。
Alcaligenes faecalisなどのAlcaligenes属。
Nocardioides albusなどのNocardioides属。
Brevibacterium iodinumなどのBrevibacterium属。
Delftia acidovoransなどのDelftia属。
Shimwellia blattaeなどのShimwellia属。
Aerobacter cloacaeなどのAerobacter属。
Rhizobium radiobacterなどのRhizobium属。
Serratia grimesii、Serratia ficaria、Serratia fonticola、Serratia odorifera、Serratia plymuthica、Serratia entomophilaまたはSerratia nematodiphilaなどのSerratia属。
Escherichia fergusonii、Escherichia coliなどのEscherichia属。
Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas putida、Pseudomonas azotoformans、Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciensなどのPsuedomonas属。
Hafnia alveiなどのHafnia属。
Bacillus badiusなどのBacillus属。
Cupriavidus metallidurans、Cupriavidus numazuensis、Cupriavidus oxalaticusなどのCupriavidus属。
Acinetobacter baylyi、Acinetobacter radioresistensなどのAcinetobacter属。
Alcaligenes faecalisなどのAlcaligenes属。
Delftia acidovoransなどのDelftia属。
Shimwellia blattaeなどのShimwellia属。
Serratia grimesii、Serratia ficaria、Serratia fonticola、Serratia odorifera、Serratia plymuthica、Serratia entomophilaまたはSerratia nematodiphilaなどのSerratia属。
100mM Tris-HCl(pH8.0)
10mM MgCl2
0.1mM succinyl-CoA
0.2mM acetyl-CoA
0.2mM NADH
1mM dithiothreitol
10μg/mL 3-oxoadipyl-CoA reductase
5μg/mL acyltransferase。
100mM Tris-HCl(pH8.0)
10mM MgCl2
0.4mM succinyl-CoA
2mM α-hydromuconic acid sodium salt
20μg/mL CoA transferase。
100mM Tris-HCl(pH8.0)
10mM MgCl2
300μL/mL 2,3-dehydroadipyl-CoA solution
1mM dithiothreitol
20μg/mL enoyl-CoA hydratase。
100mM Tris-HCl(pH8.0)
10mM MgCl2
300μL/mL 2,3-dehydroadipyl-CoA solution0.2mM NADH
1mM dithiothreitol
20μg/mL enoyl-CoA reductase。
100mM Tris-HCl(pH8.0)
10mM MgCl2
0.4mM succinyl-CoA
2mM 3-hydroxyadipic acid sodium salt
20μg/mL CoA transferase。
100mM Tris-HCl(pH8.0)
10mM MgCl2
0.4mM succinyl-CoA
2mM α-hydromuconic acid sodium salt
20μg/mL CoA transferase。
100mM Tris-HCl(pH8.0)
10mM MgCl2
0.4mM succinyl-CoA
2mM adipic acid sodium salt
20μg/mL CoA-transferase。
カラム:Synergi hydro-RP(Phenomenex社製)、長さ100mm、内径3mm、粒径2.5μm
移動相:0.1%ギ酸水溶液/メタノール=70/30
流速:0.3mL/分
カラム温度:40℃
LC検出器:DAD(210nm)
・MS/MS:Triple-Quad LC/MS(Agilent Technoogies社製)
イオン化法:ESI ネガティブモード。
カラム:Shodex Sugar SH1011(昭和電工株式会社製)、長さ300 mm、内径8 mm、粒径6μm
移動相:0.05M 硫酸水溶液
流速:0.6mL/min
カラム温度:65℃
検出器:RI。
3-オキソアジピル-CoAおよび補酵素Aを生成する反応(反応A)を触媒する酵素、および3-ヒドロキシアジピル-CoAから3-ヒドロキシアジピン酸を生成する反応(反応E)かつ2,3-デヒドロアジピル-CoAからα-ヒドロムコン酸を生成する反応(反応F)を触媒する酵素、および配列番号1、2、3、4、5、6、7に記載のポリペプチドを発現するプラスミドの作製
大腸菌内で自律複製可能なベクターpBBR1MCS-2(ME Kovach, (1995), Gene 166: 175-176)をXhoIで切断し、pBBR1MCS-2/XhoIを得た。当該ベクターに構成的な発現プロモーターを組み込むために、Escherichia coli K-12 MG1655のゲノムDNAを鋳型としてgapA(NCBI Gene ID: NC_000913.3)の上流域200b(配列番号186)をPCR増幅するためのプライマーを設計し(配列番号187、188)、常法に従ってPCR反応を行った。得られた断片およびpBBR1MCS-2/XhoI を、In-Fusion HD Cloning Kit(タカラバイオ株式会社製)を用いて連結し、大腸菌株DH5αに導入した。得られた組換え大腸菌株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認したプラスミドをpBBR1MCS-2::Pgapとした。続いてpBBR1MCS-2::PgapをScaIで切断し、pBBR1MCS-2::Pgap/ScaI を得た。反応Aを触媒する酵素をコードする遺伝子を増幅するために、Pseudomonas putida KT2440株のゲノムDNAを鋳型としてアシルトランスフェラーゼ遺伝子pcaF(NCBI Gene ID: 1041755、配列番号189)の全長をPCR増幅するためのプライマーを設計し(配列番号190、191)、常法に従ってPCR反応を行った。得られた断片およびpBBR1MCS-2::Pgap/ScaIを、In-Fusion HD Cloning Kitを用いて連結し、大腸菌株DH5αに導入した。得られた組換え株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認したプラスミドをpBBR1MCS-2::ATとした。続いてpBBR1MCS-2::ATをHpaIで切断し、pBBR1MCS-2::AT/HpaIを得た。反応Dおよび反応Eを触媒する酵素をコードする遺伝子を増幅するために、Pseudomonas putida KT2440株のゲノムDNAを鋳型としてCoAトランスフェラーゼ遺伝子pcaIおよびpcaJ(NCBI Gene ID: 1046613、1046612、配列番号192、193)の全長を含む連続した配列をPCR増幅するためのプライマーを設計し(配列番号194、195)、常法に従ってPCR反応を行った。得られた断片およびpBBR1MCS-2::AT/HpaIを、In-Fusion HD Cloning Kitを用いて連結し、大腸菌株DH5αに導入した。得られた組換え株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認したプラスミドをpBBR1MCS-2::ATCTとした。
3-ヒドロキシアジピル-CoAから2,3-デヒドロアジピル-CoAを生成する反応(反応C)を触媒する酵素を発現するためのプラスミドの作製
大腸菌内で自律複製可能な発現ベクターpMW119(ニッポンジーン社製)をSacIで切断し、pMW119/SacIを得た。当該ベクターに構成的な発現プロモーターを組み込むために、Escherichia coli K-12 MG1655のゲノムDNAを鋳型としてgapA(NCBI Gene ID: NC_000913.3)の上流域200b(配列番号186)をPCR増幅するためのプライマーを設計し(配列番号210、211)、常法に従ってPCR反応を行った。得られた断片およびpMW119/SacIを、In-Fusion HD Cloning Kit(タカラバイオ株式会社製)を用いて連結し、大腸菌株DH5αに導入した。得られた組換え大腸菌株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認したプラスミドをpMW119::Pgapとした。続いてpMW119::PgapをSphIで切断し、pMW119::Pgap/SphIを得た。反応Cを触媒する酵素をコードする遺伝子を増幅するために、Pseudomonas putida KT2440株のゲノムDNAを鋳型としてエノイル-CoAヒドラターゼ遺伝子paaF(NCBI Gene ID: 1046932、配列番号176)の全長をPCR増幅するためのプライマーを設計し(配列番号212、213)、常法に従ってPCR反応を行った。得られた断片およびpMW119::Pgap/SphIを、In-Fusion HD Cloning Kit(タカラバイオ株式会社製)を用いて連結し、大腸菌株DH5αに導入した。得られた組換え株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認した。得られたプラスミドを「pMW119::EH」とした。
アセチル-CoAおよびスクシニル-CoAから3-オキソアジピル-CoAおよび補酵素Aを生成する反応(反応A)を触媒する酵素、およびアジピル-CoAからアジピン酸を生成する反応(反応G)を触媒する酵素、および配列番号1、2、3、4、5、6、7、に記載のポリペプチドを発現するプラスミドの作製
反応Gを触媒する酵素をコードする遺伝子を増幅するために、Acinetobacter baylyi ADP1株のゲノムDNAを鋳型としてCoAトランスフェラーゼ遺伝子dcaIおよびdcaJ(NCBI Gene ID:CR543861.1、配列番号214、215)の全長を含む連続した配列をPCR増幅するためのプライマーを設計し(配列番号216、217)、常法に従ってPCR反応を行った。得られた断片および参考例1で作製したpBBR1MCS-2::ATCTOR1、pBBR1MCS-2::ATCTOR2、pBBR1MCS-2::ATCTOR3、pBBR1MCS-2::ATCTOR4、pBBR1MCS-2::ATCTOR5、pBBR1MCS-2::ATCTOR6、pBBR1MCS-2::ATCTOR7をそれぞれHpaIで切断して得られる断片を、In-Fusion HD Cloning Kitを用いて連結し、大腸菌株DH5αに導入した。得られた組換え株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認したプラスミドをそれぞれpBBR1MCS-2::ATCT2OR1、pBBR1MCS-2::ATCT2OR2、pBBR1MCS-2::ATCT2OR3、pBBR1MCS-2::ATCT2OR4、pBBR1MCS-2::ATCT2OR5、pBBR1MCS-2::ATCT2OR6、pBBR1MCS-2::ATCT2OR7とした。
3-ヒドロキシアジピル-CoAから2,3-デヒドロアジピル-CoAを生成する反応(反応C)および2,3-デヒドロアジピル-CoAからアジピル-CoAを生成する反応(反応D)を触媒する酵素を発現するためのプラスミドの作製
pMW119::EHをHindIIIで切断し、pMW119::EH/HindIIIを得た。反応Dを触媒する酵素をコードする遺伝子を増幅するために、Acinetobacter baylyi ADP1株由来のdcaA(NCBI-ProteinID:AAL09094.1、配列番号218)の全長をPCR増幅するためのプライマーを設計し(配列番号219、220)、常法に従ってPCR反応を行った。得られた断片およびpMW119::EH/HindIIIを、In-Fusion HD Cloning Kit(タカラバイオ株式会社製)を用いて連結し、大腸菌株DH5αに導入した。得られた組換え株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認したプラスミドをpMW119::EHERとした。
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損したセラチア属微生物変異体の作製
セラチア属微生物のピルビン酸キナーゼをコードする遺伝子であるpykFおよびpykAを欠損させ、ピルビン酸キナーゼの機能が欠損したセラチア属微生物変異体を作製した。
pKD4を鋳型として、プライマーとして配列番号221および222のオリゴDNAを用いてPCRを行い、pykF欠損のための配列長1.6kbのPCR断片を得た。FRT recombinase発現プラスミドであるpKD46を、Serratia grimesii NBRC13537株に導入し、アンピシリン耐性株を取得した。得られた株をアンピシリン500μg/mLを含む5mLのLB培地に植菌し、30℃で1日振とう培養した。培養液0.5mLをアンピシリン500μg/mLおよびアラビノース50mMを含む50mLのLB培地に植菌し、30℃で2時間、回旋培養した。培養液を20分間氷冷したのち、菌体を10%(w/w)グリセロールで3回洗浄した。洗浄後のペレットを100μLの10%(w/w)グリセロールで懸濁し、5μLのPCR断片と混合したのちエレクトロポレーションキュベット内で10分間氷冷した。Gene pulser(Bio-rad社製)を用いてエレクトロポレーションを実施した(3kV、200Ω、25μF)後、即座に1mLのSOC培地を添加し、30℃で2時間振とう培養した。全量をカナマイシン25μg/mLを含むLB寒天培地に塗布し、30℃で1日インキュベートした。得られたカナマイシン耐性株を用いてコロニーダイレクトPCRを行い、バンド長より目的遺伝子の欠損およびカナマイシン耐性遺伝子の挿入を確認した。プライマーは配列番号223および225のオリゴDNAを使用した。
pKD4を鋳型として、プライマーとして配列番号226および227のオリゴDNAを用いてPCRを行い、配列長1.6kbのpykA欠損用PCR断片を得た。
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損し、かつ反応A、B、EおよびFを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入したセラチア属微生物変異体の作製
実施例1で作製したSgΔPPに対して、参考例1で作製したプラスミドをそれぞれ導入し、セラチア属微生物変異体を作製した。また、コントロールとして、SgΔPPに、空ベクターであるpBBR1MCS-2を導入したセラチア属微生物変異体を作製した。
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損しておらず、かつ反応A、B、EおよびFを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入したセラチア属微生物変異体の作製
実施例2と同様の方法にて、Serratia grimesii NBRC13537にpBBR1MCS-2(コントロール)、pBBR1MCS-2::ATCTOR1、pBBR1MCS-2::ATCTOR2、pBBR1MCS-2::ATCTOR3、pBBR1MCS-2::ATCTOR4、pBBR1MCS-2::ATCTOR5、pBBR1MCS-2::ATCTOR6、またはpBBR1MCS-2::ATCTOR7を導入した。得られた株をそれぞれSg/pBBR(ネガティブコントロール)、Sg/3HA1、Sg/3HA2、Sg/3HA3、Sg/3HA4、Sg/3HA5、Sg/3HA6、Sg/3HA7とした。
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損したセラチア属微生物変異体を用いた3-ヒドロキシアジピン酸およびα-ヒドロムコン酸の生産試験
実施例2で作製したセラチア属微生物変異体を用いて、3-ヒドロキシアジピン酸およびα-ヒドロムコン酸の生産試験を行った。
当該培養液より菌体を遠心分離した上清をMillex-GV(0.22μm、PVDF、Merck社製)を用いて膜処理し、透過液を以下の方法で分析することで培養上清中に蓄積した3-ヒドロキシアジピン酸、α-ヒドロムコン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。さらに、その結果を元に上記の式(2)を用いて算出した3-ヒドロキシアジピン酸およびα-ヒドロムコン酸の収率を表7に示す。ただし、LC-MS/MSによる定量分析において0.1mg/L以下であった場合は検出限界以下とし、表中には以下N.D.と表す。
・HPLC:1290Infinity(Agilent Technologies社製)
カラム:Synergi hydro-RP(Phenomenex社製)、長さ100mm、内径3mm、粒径2.5μm
移動相:0.1%ギ酸水溶液/メタノール=70/30
流速:0.3mL/分
カラム温度:40℃
LC検出器:1260DAD VL+(210nm)
・MS/MS:Triple-Quad LC/MS(Agilent Technologies社製)
イオン化法:ESI ネガティブモード。
・HPLC:LC-10A(島津製作所製)
カラム: Shim-pack SPR-H(島津ジーエルシー社製)、長さ250mm、内径7.8mm、粒径8μm
Shim-pack SCR-101H(島津ジーエルシー社製)長さ250mm、内径7.8mm、粒径10μm
移動相: 5mM p-トルエンスルホン酸
反応液:5mM p-トルエンスルホン酸、0.1mM EDTA、20mM Bis-Tris
流速:0.8mL/min
カラム温度:45℃
検出器:CDD-10Avp(島津製作所製)
・HPLC:Shimazu Prominence(島津製作所製)
カラム:Shodex Sugar SH1011(昭和電工株式会社製)、長さ300 mm、内径8 mm、粒径6μm
移動相:0.05M 硫酸水溶液
流速:0.6mL/min
カラム温度:65℃
検出器:RID-10A(島津製作所製)。
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損していないセラチア属微生物変異体を用いた3-ヒドロキシアジピン酸およびα-ヒドロムコン酸の生産試験
実施例3と同様の方法にて、参考例5で作製したセラチア属微生物変異体を培養した。培養上清中に蓄積した3-ヒドロキシアジピン酸、α-ヒドロムコン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。さらに、その結果を元に上記式(2)を用いて算出した3-ヒドロキシアジピン酸およびα-ヒドロムコン酸の収率を表7に示す。
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損した大腸菌変異体の作製
大腸菌のピルビン酸キナーゼをコードする遺伝子であるpykFおよびpykAを欠損させ、ピルビン酸キナーゼの機能が欠損した大腸菌の変異体を作製した。pykFおよびpykAの欠損方法は、Proc Natl Acad Sci USA.2000 Jun 6;97(12):6640-6645.に記載の方法に従った。
pKD4を鋳型として、プライマーとして配列番号230および231のオリゴDNAを用いてPCRを行い、pykF欠損のための配列長1.6kbのPCR断片を得た。
pKD4を鋳型として、プライマーとして配列番号234および235のオリゴDNAを用いてPCRを行い、配列長1.6kbのpykA欠損用PCR断片を得た。
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損し、かつ反応A、B、EおよびFを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入した大腸菌変異体の作製
実施例4で作製したEcΔPPに対して、参考例1で作製したプラスミドをそれぞれ導入し、大腸菌の変異体を作製した。
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損しておらず、かつ反応A、B、EおよびFを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入した大腸菌変異体の作製
実施例5と同様の方法にて、Escherichia coli MG1655にpBBR1MCS-2(コントロール)、pBBR1MCS-2::ATCTOR1、pBBR1MCS-2::ATCTOR2、pBBR1MCS-2::ATCTOR3、pBBR1MCS-2::ATCTOR4、pBBR1MCS-2::ATCTOR5、pBBR1MCS-2::ATCTOR6、またはpBBR1MCS-2::ATCTOR7を導入した。得られた株をそれぞれEc/pBBR(ネガティブコントロール)、Ec/3HA1、Ec/3HA2、Ec/3HA3、Ec/3HA4、Ec/3HA5、Ec/3HA6、Ec/3HA7とした。
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損した大腸菌の変異体を用いた3-ヒドロキシアジピン酸およびα-ヒドロムコン酸の生産試験
実施例3と同様の方法にて、実施例5で作製した変異体を培養した。培養上清中に蓄積した3-ヒドロキシアジピン酸、α-ヒドロムコン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。その値を元に上記式(2)を用いて算出した3-ヒドロキシアジピン酸およびα-ヒドロムコン酸の収率を表8に示す。
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損していない大腸菌の変異体を用いた3-ヒドロキシアジピン酸およびα-ヒドロムコン酸の生産試験
実施例6と同様の方法にて、参考例6で作製した変異体を培養した。培養上清中に蓄積した3-ヒドロキシアジピン酸、α-ヒドロムコン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。その値を元に上記式(2)を用いて算出した3-ヒドロキシアジピン酸およびα-ヒドロムコン酸の収率を表8に示す。
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損し、かつ反応A、B、C、EおよびFを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入したセラチア属微生物変異体の作製
実施例2で作製したセラチア属微生物変異体それぞれに対して、参考例2で作製したプラスミドpMW119::EHを導入し、セラチア属微生物変異体を作製した。また、コントロールとして、実施例2で作成したSgΔPP/pBBRに、空ベクターであるpMW119を導入したセラチア属微生物変異体を作製した。
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損しておらず、かつ反応A、B、C、EおよびFを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入したセラチア属微生物変異体の作製
実施例7と同様の方法にて、Sg/pBBR、Sg/3HA1、Sg/3HA2、Sg/3HA3、Sg/3HA4、Sg/3HA5、Sg/3HA6、Sg/3HA7にpMW119(コントロール)、またはpMW119::EHを導入した。得られた株をそれぞれSg/pBBRpMW(ネガティブコントロール)、Sg/HMA1、Sg/HMA2、Sg/HMA3、Sg/HMA4、Sg/HMA5、Sg/HMA6、Sg/HMA7とした。
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損したセラチア属微生物の変異体を用いたα-ヒドロムコン酸の生産試験
培地にアンピシリンを500μg/mLとなるように添加した以外は実施例3と同様の方法にて、実施例7で作製した変異体を培養した。培養上清中に蓄積したα-ヒドロムコン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。その値を元に上記式(2)を用いて算出したα-ヒドロムコン酸の収率を表9に示す。
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損していないセラチア属微生物の変異体を用いたα-ヒドロムコン酸の生産試験
実施例8と同様の方法にて、参考例7で作製した変異体を培養した。培養上清中に蓄積したα-ヒドロムコン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。その値を元に上記式(2)を用いて算出したα-ヒドロムコン酸の収率を表9に示す。
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損し、かつ反応A、B、C、EおよびFを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入した大腸菌変異体の作製
実施例5で作製した大腸菌変異体それぞれに対して、参考例2で作製したプラスミドpMW119::EHを導入し、大腸菌変異体を作製した。また、コントロールとして、実施例5で作成したEcΔPP/pBBRに、空ベクターであるpMW119を導入した大腸菌変異体を作製した。
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損しておらず、かつ反応A、B、C、EおよびFを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入した大腸菌変異体の作製
実施例9と同様の方法にて、Ec/pBBR、Ec/3HA1、Ec/3HA2、Ec/3HA3、Ec/3HA4、Ec/3HA5、Ec/3HA6、Ec/3HA7にpMW119(コントロール)、またはpMW119::EHを導入した。得られた株をそれぞれEc/pBBRpMW(ネガティブコントロール)、Ec/HMA1、Ec/HMA2、Ec/HMA3、Ec/HMA4、Ec/HMA5、Ec/HMA6、Ec/HMA7とした。
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損した大腸菌の変異体を用いたα-ヒドロムコン酸の生産試験
培地にアンピシリンを100μg/mLとなるように添加した以外は実施例6と同様の方法にて、実施例9で作製した変異体を培養した。培養上清中に蓄積したα-ヒドロムコン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。その値を元に上記式(2)を用いて算出したα-ヒドロムコン酸の収率を表10に示す。
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損していない大腸菌の変異体を用いたα-ヒドロムコン酸の生産試験
実施例10と同様の方法にて、参考例8で作製した変異体を培養した。培養上清中に蓄積したα-ヒドロムコン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。その値を元に上記式(2)を用いて算出したα-ヒドロムコン酸の収率を表10に示す。
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損し、かつ反応A、B、C、D、およびGを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入したセラチア属微生物変異体の作製
実施例2と同様の方法にて、SgΔPPに対して参考例3で作成したpBBR1MCS-2::ATCT2OR1、pBBR1MCS-2::ATCT2OR2、pBBR1MCS-2::ATCT2OR3、pBBR1MCS-2::ATCT2OR4、pBBR1MCS-2::ATCT2OR5、pBBR1MCS-2::ATCT2OR6、またはpBBR1MCS-2::ATCT2OR7を導入した。得られた変異体それぞれに対して、実施例7と同様の方法にて、参考例4で作製したプラスミドpMW119::EHERを導入し、セラチア属微生物変異体を作製した。得られた株をそれぞれSgΔPP/ADA1、SgΔPP/ADA2、SgΔPP/ADA3、SgΔPP/ADA4、SgΔPP/ADA5、SgΔPP/ADA6、SgΔPP/ADA7とした。
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損しておらず、かつ反応A、B、C、D、およびGを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入したセラチア属微生物変異体の作製
実施例11と同様の方法にて、Serratia grimesii NBRC13537に対して参考例3で作成したpBBR1MCS-2::ATCT2OR1、pBBR1MCS-2::ATCT2OR2、pBBR1MCS-2::ATCT2OR3、pBBR1MCS-2::ATCT2OR4、pBBR1MCS-2::ATCT2OR5、pBBR1MCS-2::ATCT2OR6、またはpBBR1MCS-2::ATCT2OR7を導入した。得られた変異体それぞれに対して、実施例7と同様の方法にて、参考例4で作製したプラスミドpMW119::EHERを導入し、セラチア属微生物変異体を作製した。得られた株をそれぞれSg/ADA1、Sg/ADA2、Sg/ADA3、Sg/ADA4、Sg/ADA5、Sg/ADA6、Sg/ADA7とした。
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損したセラチア属微生物の変異体を用いたアジピン酸の生産試験
実施例8と同様の方法にて、実施例11で作製した変異体およびSgΔPP/pBBRpMW(ネガティブコントロール)を培養した。培養上清中に蓄積したアジピン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。なおアジピン酸の定量はLC-MS/MSを用いて3-ヒドロキシアジピン酸およびα-ヒドロムコン酸と同様の条件にて行った。その値を元に上記式(2)を用いて算出したアジピン酸の収率を表11に示す。
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損していないセラチア属微生物の変異体を用いたアジピン酸の生産試験
実施例8と同様の方法にて、参考例9で作製した変異体およびSg/pBBRpMWを培養した。培養上清中に蓄積したアジピン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。その値を元に上記式(2)を用いて算出したアジピン酸の収率を表11に示す。
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損し、かつ反応A、B、C、D、およびGを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入した大腸菌変異体の作製
実施例5と同様の方法にて、EcΔPPに対して参考例3で作成したpBBR1MCS-2::ATCT2OR1、pBBR1MCS-2::ATCT2OR2、pBBR1MCS-2::ATCT2OR3、pBBR1MCS-2::ATCT2OR4、pBBR1MCS-2::ATCT2OR5、pBBR1MCS-2::ATCT2OR6、またはpBBR1MCS-2::ATCT2OR7を導入した。得られた変異体それぞれに対して、実施例9と同様の方法にて、参考例4で作製したプラスミドpMW119::EHERを導入し、大腸菌変異体を作製した。得られた株をそれぞれEcΔPP/ADA1、EcΔPP/ADA2、EcΔPP/ADA3、EcΔPP/ADA4、EcΔPP/ADA5、EcΔPP/ADA6、EcΔPP/ADA7とした。
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損しておらず、かつ反応A、B、C、D、およびGを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入した大腸菌変異体の作製
実施例13と同様の方法にて、Escherichia coli MG1655に対して参考例3で作成したpBBR1MCS-2::ATCT2OR1、pBBR1MCS-2::ATCT2OR2、pBBR1MCS-2::ATCT2OR3、pBBR1MCS-2::ATCT2OR4、pBBR1MCS-2::ATCT2OR5、pBBR1MCS-2::ATCT2OR6、またはpBBR1MCS-2::ATCT2OR7を導入した。得られた変異体それぞれに対して、実施例9と同様の方法にて、参考例4で作製したプラスミドpMW119::EHERを導入し、大腸菌変異体を作製した。得られた株をそれぞれEc/ADA1、Ec/ADA2、Ec/ADA3、Ec/ADA4、Ec/ADA5、Ec/ADA6、Ec/ADA7とした。
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損した大腸菌の変異体を用いたアジピン酸の生産試験
実施例10と同様の方法にて、実施例13で作製した変異体およびEcΔPP/pBBRpMWを培養した。培養上清中に蓄積したアジピン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。なおアジピン酸の定量はLC-MS/MSを用いて3-ヒドロキシアジピン酸およびα-ヒドロムコン酸と同様の条件にて行った。その値を元に上記式(2)を用いて算出したアジピン酸の収率を表12に示す。
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損していない大腸菌の変異体を用いたアジピン酸の生産試験
実施例10と同様の方法にて、参考例10で作製した変異体およびEc/pBBRpMWを培養した。培養上清中に蓄積したアジピン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。その値を元に上記式(2)を用いて算出したアジピン酸の収率を表12に示す。
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損したセラチア属微生物の変異体を用いた3-ヒドロキシアジピン酸およびα-ヒドロムコン酸の生産試験2
実施例2で作製したセラチア属微生物変異体を用いて、嫌気条件下での3-ヒドロキシアジピン酸およびα-ヒドロムコン酸の生産試験を行った。
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損していないセラチア属微生物の変異体を用いた3-ヒドロキシアジピン酸およびα-ヒドロムコン酸の生産試験2
実施例15と同様の方法にて、参考例5で作製した変異体を培養した。培養上清中に蓄積した3-ヒドロキシアジピン酸およびα-ヒドロムコン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。その値を元に上記式(2)を用いて算出した3-ヒドロキシアジピン酸およびα-ヒドロムコン酸の収率を表13に示す。
実施例16
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損した大腸菌の変異体を用いた3-ヒドロキシアジピン酸およびα-ヒドロムコン酸の生産試験2
実施例5で作製した大腸菌変異体を用いて、嫌気条件下での3-ヒドロキシアジピン酸およびα-ヒドロムコン酸の生産試験を行った。
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損していない大腸菌の変異体を用いた3-ヒドロキシアジピン酸およびα-ヒドロムコン酸の生産試験2
実施例16と同様の方法にて、参考例6で作製した変異体を培養した。培養上清中に蓄積した3-ヒドロキシアジピン酸およびα-ヒドロムコン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。その値を元に上記式(2)を用いて算出した3-ヒドロキシアジピン酸およびα-ヒドロムコン酸の収率を表14に示す。
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損したセラチア属微生物の変異体を用いたアジピン酸の生産試験2
実施例11で作製したセラチア属微生物変異体を用いて、嫌気条件下でのアジピン酸の生産試験を行った。
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損していないセラチア属微生物の変異体を用いたアジピン酸の生産試験2
実施例17と同様の方法にて、参考例9で作製した変異体を培養した。培養上清中に蓄積したアジピン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。その値を元に上記式(2)を用いて算出したアジピン酸の収率を表15に示す。
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損した大腸菌の変異体を用いたアジピン酸の生産試験2
実施例13で作製した大腸菌変異体を用いて、嫌気条件下でのアジピン酸の生産試験を行った。
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損していない大腸菌の変異体を用いたアジピン酸の生産試験2
実施例18と同様の方法にて、参考例10で作製した変異体を培養した。培養上清中に蓄積したアジピン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。その値を元に上記式(2)を用いて算出したアジピン酸の収率を表16に示す。
ピルビン酸キナーゼ遺伝子およびホスホトランスフェラーゼ系酵素遺伝子が欠損したセラチア属微生物の遺伝子変異体の作製
実施例1で作製したSgΔPP株の有するホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子であるptsGを欠損させ、ピルビン酸キナーゼおよびホスホトランスフェラーゼ系酵素の機能が欠損したセラチア属微生物変異体を作製した。
ピルビン酸キナーゼ遺伝子およびホスホトランスフェラーゼ系酵素遺伝子が欠損し、かつ反応A、B、EおよびFを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入したセラチア属微生物の遺伝子変異体の作製
実施例19で作製したSgΔPPG株に対して、実施例2と同様の方法にて参考例1で作製したプラスミドpBBR1MCS-2::ATCTOR1を導入し、得られたセラチア属微生物変異体をSgΔPPG/3HA1とした。
ピルビン酸キナーゼおよびホスホトランスフェラーゼ系酵素の機能が欠損し、かつ反応A、B、EおよびFを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入したセラチア属微生物変異体を用いた3-ヒドロキシアジピン酸およびα-ヒドロムコン酸の生産試験
実施例20で作製したセラチア属微生物変異体を用いて、実施例15と同様の方法にて3-ヒドロキシアジピン酸およびα-ヒドロムコン酸の生産試験を行った。
ピルビン酸キナーゼおよびホスホトランスフェラーゼ系酵素の機能が欠損せず、かつ反応A、B、EおよびFを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入したセラチア属微生物変異体を用いた3-ヒドロキシアジピン酸およびα-ヒドロムコン酸の生産試験
参考例5で作製したSg/3HA1株を用いて、比較例7と同様の方法にて3-ヒドロキシアジピン酸およびα-ヒドロムコン酸の生産試験を行った。
ピルビン酸キナーゼ遺伝子およびホスホトランスフェラーゼ系酵素遺伝子が欠損した大腸菌の変異体の作製
実施例4で作製したEcΔPP株の有するホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子であるptsGを欠損させ、ピルビン酸キナーゼおよびホスホトランスフェラーゼ系酵素の機能が欠損した大腸菌の変異体を作製した。
ピルビン酸キナーゼ遺伝子およびホスホトランスフェラーゼ系酵素遺伝子が欠損し、かつ反応A、B、EおよびFを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入した大腸菌の変異体の作製
実施例22で作製したEcΔPPG株に対して、実施例5と同様の方法にて参考例1で作製したpBBR1MCS-2::ATCTOR1を導入し、得られた大腸菌変異体をEcΔPPG/3HA1とした。
ピルビン酸キナーゼおよびホスホトランスフェラーゼ系酵素の機能が欠損し、かつ反応A、B、EおよびFを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入した大腸菌変異体を用いた3-ヒドロキシアジピン酸およびα-ヒドロムコン酸の生産試験
実施例23で作製した大腸菌変異体を用いて、実施例16と同様の方法にて3-ヒドロキシアジピン酸およびα-ヒドロムコン酸の生産試験を行った。
ピルビン酸キナーゼおよびホスホトランスフェラーゼ系酵素の機能が欠損せず、かつ反応A、B、EおよびFを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入した大腸菌変異体を用いた3-ヒドロキシアジピン酸およびα-ヒドロムコン酸の生産試験
参考例6で作製したEc/3HA1を用いて、比較例8と同様の方法にて3-ヒドロキシアジピン酸およびα-ヒドロムコン酸の生産試験を行った。
Claims (11)
- 以下(a)~(c)のいずれかに記載のポリペプチドをコードする核酸を導入、または当該ポリペプチドの発現を増強し、かつピルビン酸キナーゼの機能を欠損させた遺伝子改変微生物:
(a)配列番号1~7のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b)配列番号1~7のいずれかのアミノ酸配列において、10個以下のアミノ酸が置換、欠失、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ3-オキソアジピル-CoAを還元して3-ヒドロキシアジピル-CoAを生成する反応を触媒する酵素活性を有するポリペプチド、
(c)配列番号1~7のいずれかのアミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有し、かつ3-オキソアジピル-CoAを還元して3-ヒドロキシアジピル-CoAを生成する反応を触媒する酵素活性を有するポリペプチド。 - 前記(b)および(c)から選択されるポリペプチドが、配列番号173のアミノ酸配列からなる領域を含む、請求項1記載の遺伝子改変微生物。
- 前記配列番号173のアミノ酸配列において、N末端側から13番目のアミノ酸残基がフェニルアラニンまたはロイシンであり、N末端側から15番目のアミの酸残基がロイシンまたはグルタミンであり、N末端側から16番目のアミノ酸残基がリシンまたはアスパラギンであり、N末端側から17番目のアミノ酸残基がグリシンまたはセリンであり、N末端側から19番目のアミノ酸残基がプロリンまたはアルギニンであり、N末端側から21番目のアミノ酸残基がロイシン、メチオニンまたはバリンである、請求項2記載の遺伝子改変微生物。
- Escherichia属、Serratia属、Hafnia属およびPseudomonas属からなる群から選ばれる微生物の遺伝子改変体である、請求項1~3のいずれか1項に記載の遺伝子改変微生物。
- アセチル-CoAおよびスクシニル-CoAから3-オキソアジピルCoAおよび補酵素Aを生成する能力並びに3-ヒドロキシアジピル-CoAから3-ヒドロキシアジピン酸を生成する能力を有する、請求項1~4のいずれか1項に記載の遺伝子改変微生物。
- アセチル-CoAおよびスクシニル-CoAから3-オキソアジピルCoAおよび補酵素Aを生成する能力、3-ヒドロキシアジピル-CoAから2,3-デヒドロアジピル-CoAを生成する能力並びに2,3-デヒドロアジピル-CoAからα-ヒドロムコン酸を生成する能力を有する、請求項1~4のいずれか1項に記載の遺伝子改変微生物。
- アセチル-CoAおよびスクシニル-CoAから3-オキソアジピルCoAおよび補酵素Aを生成する能力、3-ヒドロキシアジピル-CoAから2,3-デヒドロアジピル-CoAを生成する能力、2,3-デヒドロアジピル-CoAからアジピル-CoAを生成する能力並びにアジピル-CoAからアジピン酸を生成する能力を有する、請求項1~4のいずれか1項に記載の遺伝子改変微生物。
- さらにホスホトランスフェラーゼ系酵素の機能を欠損させた、請求項1~7のいずれか1項に記載の遺伝子改変微生物。
- 請求項1~5および8のいずれか1項に記載の遺伝子改変微生物を、炭素源を発酵原料として含む培地にて培養することを含む、3-ヒドロキシアジピン酸の製造方法。
- 請求項1~4、6および8のいずれか1項に記載の遺伝子改変微生物を、炭素源を発酵原料として含む培地にて培養することを含む、α-ヒドロムコン酸の製造方法。
- 請求項1~4、7および8のいずれか1項に記載の遺伝子改変微生物を、炭素源を発酵原料として含む培地にて培養することを含む、アジピン酸の製造方法。
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