CN116157524A

CN116157524A - 新型谷氨酰胺-水解gmp合酶变体和用于使用其生产嘌呤核苷酸的方法

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Publication number: CN116157524A
Application number: CN202180021824.5A
Authority: CN
Inventors: 权娜罗; 李沚泫; 裴贤贞; 金大永; 金恩智; 许兰; 柳慧连; 金斐那; 孙晟光
Original assignee: CJ CheilJedang Corp
Current assignee: CJ CheilJedang Corp
Priority date: 2021-09-23
Filing date: 2021-12-17
Publication date: 2023-05-23
Anticipated expiration: 2041-12-17
Also published as: AU2021420803A1; MX2022010627A; JP2023545878A; CN116157524B; EP4180523A1; EP4180523A4; ZA202208933B; CA3170389A1

Abstract

本申请涉及谷氨酰胺‑水解GMP合酶变体以及用于通过使用其产生嘌呤核苷酸的方法。

Description

新型谷氨酰胺-水解GMP合酶变体和用于使用其生产嘌呤核苷酸的方法

[技术领域]

本公开涉及谷氨酰胺-水解GMP合酶变体和用于使用其生产嘌呤核苷酸的方法。

[背景技术]

嘌呤核苷酸是一种基于核酸的材料，广泛用于食品调味添加剂或食品中，并且作为一种增味的基于核酸的调味料受到关注。

对于嘌呤核苷酸的生产，已经进行了各种研究以开发具有高效生产和发酵工艺技术的微生物。例如，主要使用目标物质-特异性方法，诸如增加编码参与嘌呤核苷酸的生物合成的酶的基因的表达或除去生物合成中不必要的基因(EP 3722430 A1和US 2020-0347346 A1)。

随着对嘌呤核苷酸需求的增加，仍然需要研究有效的嘌呤核苷酸生产。

[公开内容]

[技术问题]

本公开提供谷氨酰胺水解GMP合酶变体。

[技术方案]

本公开的一个方面是提供谷氨酰胺-水解GMP合酶变体。

本公开的另一个方面是提供编码所述变体的多核苷酸。

本公开的又另一个方面是提供一种微生物，其含有所述变体或编码所述变体的多核苷酸。

本公开的又另一个方面是提供用于生产嘌呤核苷酸的方法，所述方法包括培养所述微生物。

[有利效果]

本公开的变体可用于以高效生产嘌呤核苷酸。

[发明详述]

本公开将具体描述如下。本公开中公开的每个描述和实施方案也可以应用于其他描述和实施方案。也就是说，本公开中公开的各种要素的所有组合都落入本公开的范围内。此外，本公开的范围不受以下具体描述的限制。此外，在整个说明书中，引用了许多论文和专利文件，并提供了它们的引文。所引用的论文和专利文件的公开内容通过引用以其整体并入本说明书中，并且更清楚地解释了本公开所落入的技术领域的水平和本公开的细节。

本公开的一个方面提供了谷氨酰胺-水解GMP合酶变体，其中对应于SEQ ID NO:3中位置29的氨基酸被另一种氨基酸取代。

谷氨酰胺-水解GMP合酶变体是指这样的变体，其包括在具有谷氨酰胺-水解GMP合酶活性的多肽或谷氨酰胺-水解GMP合酶中，将对应于SEQ ID NO:3的N-末端起位置29的氨基酸用另一种氨基酸取代。

在本公开中，“谷氨酰胺-水解GMP合酶”是参与将5'-黄苷一磷酸(XMP)转化为5'-鸟苷一磷酸(以下称为GMP)的酶。

本公开的谷氨酰胺-水解GMP合酶可以是谷氨酰胺-水解GMP合酶或具有谷氨酰胺-水解GMP合酶活性的多肽，对其进行修饰以制备本公开中提供的谷氨酰胺-水解GMP合酶变体。

具体地，所述多肽可以是天然存在的多肽或野生型多肽或其成熟多肽，并且可以包括其变体或功能片段，但包括但不限于任何多肽，只要它可以是本公开的谷氨酰胺-水解GMP合酶变体的亲本即可。

在一个实施方案中，本公开的谷氨酰胺-水解GMP合酶可以源自棒杆菌属，且更具体地，源自停滞棒杆菌(Corynebacterium stationis)，但不限于此。

在一个实施方案中，本公开的谷氨酰胺-水解GMP合酶可以是SEQ ID NO:3的多肽。在一个实施方案中，本公开的谷氨酰胺-水解GMP合酶可以是与SEQ ID NO:3的多肽具有至少约60%、70%、75%、80%、85%、90%、93%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的多肽，并且在谷氨酰胺-水解GMP合酶的范围内包括但不限于具有与由SEQ ID NO:3的氨基酸序列组成的多肽的活性相同或相应的活性的任何多肽。具体地，所述谷氨酰胺-水解GMP合酶可以具有、含有SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列或基本上由其组成，但不限于此。

本公开中待突变的谷氨酰胺-水解GMP合酶可以是棒杆菌属物种来源的谷氨酰胺-水解GMP合酶，并且具体地可以包括但不限于含有SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列的多肽/蛋白或具有与所述合酶相同活性的任何多肽/蛋白。例如，所述多肽/蛋白可以含有SEQID NO:3的氨基酸序列或与其具有至少80％同源性或同一性的氨基酸序列，但不限于此。具体地，所述多肽/蛋白可以含有与SEQ ID NO:3具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同源性或同一性的氨基酸序列。在其部分序列中具有缺失、修饰、取代或添加的多肽/蛋白明显被包括在本公开中待突变的多肽/蛋白的范围内，只要其为具有这种同源性或同一性且表现出谷氨酰胺-水解GMP合酶活性的多肽/蛋白。

本公开的谷氨酰胺-水解GMP合酶的序列可以在已知数据库NCBI GenBank中得到。例如，本公开的谷氨酰胺-水解GMP合酶可以是由guaA基因编码的多肽。例如，本公开的谷氨酰胺-水解GMP合酶可以源自停滞棒杆菌、干酪棒杆菌(Corynebacterium casei)或产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)，并且其实例可以是由NCBI参考序列WP_194285183.1、WP_006823296.1或WP_040355890.1表达的酶，但不限于此。

如本文所用，术语“同源性”或“同一性”是指两个给定氨基酸序列或核苷酸序列之间的相似程度，并且可以表示为百分比。术语同源性和同一性经常可以互换使用。

可以通过标准比对算法确定保守多核苷酸或多肽的序列同源性或同一性，并且可以一起使用由待使用的程序建立的默认空位罚分。基本上，同源或相同的序列通常可以在中等或高度严格的条件下作为整体或部分与彼此杂交。显然，杂交还包括与含有常用密码子或考虑到多核苷酸中的密码子简并性的密码子的多核苷酸的杂交。

任何两个多核苷酸或多肽序列之间的同源性、相似性或同一性可以使用已知的计算机算法，诸如“FASTA”程序，通过使用Pearson等人, (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444中的默认参数来确定。或者，可以使用在欧洲分子生物学开放软件套件(EMBOSS)包(包括Rice等人, 2000, Trends Genet. 16:276–277) (版本5.0.0或更高版本)(GCG程序包(Devereux, J. 等人, Nucleic Acids Research 12:387 (1984))的Needleman程序中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443–453)、BLASTP、BLASTN、FASTA (Atschul, S. F. 等人, J MOLEC BIOL 215:403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, 编, Academic Press,San Diego,1994, 和CARILLO等人 (1988) SIAM J Applied Math 48:1073)确定同源性、相似性或同一性。例如，同源性、相似性或同一性可以使用来自国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)数据库的BLAST或ClustalW来确定。

多核苷酸或多肽之间的同源性、相似性或同一性可以通过使用如例如由Needleman等人(1970), J Mol Biol. 48:443介绍的GAP计算机程序(如由Smith和Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482所公开)比较序列信息来确定。简而言之，GAP程序将同源性、相似性或同一性定义为通过将相似对齐的符号(即核苷酸或氨基酸)的数量除以两个序列中较短者中的符号的总数而获得的值。GAP程序的默认参数可以包括：(1)二进制比较矩阵(对于同一性，含有值1，且对于非同一性，含有值0)和Gribskov等人 (1986)Nucl. Acids Res. 14: 6745的加权比较矩阵，如Schwartz和Dayhoff, 编, Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp.353–358 (1979)所公开(或EDNAFULL (NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵)；(2)对于每个空位，罚分为3.0，并且对于每个空位中的每个符号，额外处以0.10的罚分(或10的空位开放罚分和0.5的空位扩展罚分)；和(3)对于末端空位，没有罚分。

如本文所用，术语“变体”是指与通过至少一个氨基酸的保守取代和/或修饰而突变之前的氨基酸序列相比具有不同序列但维持功能或特性的多肽。这种变体通常可以通过修饰多肽的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸并评估修饰多肽的特性来鉴定。也就是说，与突变前的多肽的能力相比，变体的能力可以增加、不变或降低。一些变体可以包括其中至少一部分、诸如N-末端前导序列或跨膜结构域被除去的变体。其他变体可以包括其中除去成熟蛋白的N-末端和/或C-末端的一部分的变体。术语“变体”也可以与“修饰”、“修饰的蛋白”、“修饰的多肽”、“突变体”、“突变蛋白”、“相异体(divergent)”等互换使用，并且在被突变的含义上所使用的任何术语都可以使用，但不限于此。

此外，所述变体可以包括对多肽的特性和二级结构具有最小影响的氨基酸的缺失或添加。例如，翻译时或翻译后指导蛋白的转移的蛋白的N-末端的信号(或前导)序列可以与变体的N-末端缀合。此外，所述变体还可以与另一个序列或接头缀合，使得鉴定、纯化或合成所述变体。

本公开中提供的谷氨酰胺-水解GMP合酶变体可以是含有其中SEQ ID NO:3中对应于位置29的氨基酸被另一种氨基酸取代的氨基酸序列的多肽。具体地，其他氨基酸可以选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸和组氨酸。

“另一种氨基酸”不受限制，只要该氨基酸与取代前的氨基酸不同即可。本公开中的表述“用特定氨基酸取代”显然是用与取代前的氨基酸不同的氨基酸取代，即使“用另一种氨基酸取代”没有具体说明。

在一个实施方案中，本公开的变体可以是其中作为参考蛋白的SEQ ID NO:3的氨基酸序列中的对应于位置29的氨基酸是除了精氨酸之外的氨基酸的变体。具体地，所述变体的SEQ ID NO:3中对应于位置29的氨基酸可以选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸和组氨酸。

在一个实施方案中，本公开的谷氨酰胺-水解GMP合酶变体可以含有这样的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列中对应于位置29的氨基酸是除了精氨酸之外的氨基酸并且其与SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.7%或99.8%同源性或同一性。

例如，本公开的谷氨酰胺-水解GMP合酶变体可以由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成或可以含有与其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.7%或99.8%同一性的氨基酸序列，但不限于此。

显然，甚至具有在其部分中具有缺失、修饰、取代、保守取代或添加的氨基酸序列的变体也可以包括在本公开的范围内，只要该氨基酸序列具有这种同源性或同一性且表现出对应于本公开的变体的活性。

例如，在所述氨基酸序列的N-末端、C-末端和/或内部可能存在不改变本公开的变体的功能的序列添加或缺失、天然存在的突变、沉默突变或保守取代。

“保守取代”是指一种氨基酸被具有与其相似的结构和/或化学特性的另一种氨基酸取代。这种氨基酸取代通常可以基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性而发生。通常，保守取代可能对蛋白或多肽的活性影响很小或没有影响。

如本文所用，术语“对应于”是指在多肽中列举的位置处的氨基酸残基，或与多肽中列举的残基相似、相同或同源的氨基酸残基。鉴定对应位置处的氨基酸可以是确定涉及特定序列的序列的特定氨基酸。如本文所用，术语“对应区域”通常是指相关蛋白或参考蛋白中的相似或相应位点。

例如，将任何氨基酸序列与SEQ ID NO:3比对，并且基于此，所述氨基酸序列的每个氨基酸残基可以参照对应于SEQ ID NO:3的氨基酸残基的氨基酸残基编号位置进行编号。例如，如本公开中所述的序列比对算法可以鉴定相比于查询序列(也称为“参考序列”)的氨基酸的位置或修饰(诸如取代、插入或缺失)发生的位置。

对于这种比对，可以例如使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970, J. Mol. Biol. 48:443–453)或EMBOSS包的Needle程序(EMBOSS: The EuropeanMolecular Biology Open Software Suite, Rice等人, 2000, Trends Genet. 16:276–277)，但不限于此，可以适当地使用本领域已知的序列比对程序、成对序列比较算法等。

本公开的另一个方面提供了编码本公开的变体的多核苷酸。

如本文所用，术语“多核苷酸”是指作为核苷酸聚合物具有超过一定长度的DNA或RNA链，所述核苷酸聚合物是通过共价键连接的核苷酸单体的长链。

例如，编码本公开的谷氨酰胺-水解GMP合酶的多核苷酸可以具有或含有编码SEQID NO:4的核苷酸序列的序列。例如，编码谷氨酰胺-水解GMP合酶的多核苷酸可以由或基本上由SEQ ID NO:4的序列组成。

考虑到密码子简并性或本公开的变体待在其中表达的生物体优选的密码子，本公开的多核苷酸可以在一定范围内在其编码区中进行各种修饰，在所述范围内，本公开的变体的氨基酸序列不改变。

具体地，编码本公开的谷氨酰胺-水解GMP合酶变体的多核苷酸可以具有或含有与SEQ ID NO:4的序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%和小于100%同源性或同一性的核苷酸序列，或者可以由或基本上由与SEQ ID NO:4的序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%和小于100%同源性或同一性的核苷酸序列组成，但不限于此。在具有这种同源性或同一性的序列中，编码SEQ ID NO:3中对应于位置29的氨基酸的密码子可以是编码除了精氨酸之外的氨基酸的密码子之一。

此外，本公开的多核苷酸可以包括但不限于在严格条件下可以与能够从已知基因序列(例如与本公开的多核苷酸序列的部分或全部互补的序列)制备的探针杂交的序列。术语“严格条件”是指能够在多核苷酸之间使得能够特异性杂交的条件。这些条件详细描述于文献中(参见J. Sambrook等人, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第2版,Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; 和F.M. Ausubel等人, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons,Inc., New York, 9.50–9.51, 11.7–11.8)。例如，此类条件可以包括这样的条件，在所述条件下具有高同源性或同一性的多核苷酸、诸如在其之间具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同源性或同一性的多核苷酸与彼此杂交，但具有较低同源性或同一性的多核苷酸与彼此不杂交；或用于典型Southern杂交的洗涤条件，其中洗涤在对应于以下的盐浓度和温度下进行一次、特别是两次或三次：60℃、1×SSC、0.1% SDS；具体地60℃，0.1×SSC，0.1% SDS；且更具体地，68℃，0.1×SSC，0.1% SDS。

杂交需要两个核酸具有互补序列，尽管碱基之间的错配是可能的，这取决于杂交严格性。术语“互补”用于描述可以与彼此杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，对于DNA，腺嘌呤与胸腺嘧啶互补，且胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本公开的多核苷酸还可以包括与整个序列以及与基本上相似的核酸序列互补的分离的核酸片段。

具体地，与本公开的多核苷酸具有同源性或同一性的多核苷酸可以使用包括在T_m为55℃的杂交步骤的杂交条件和利用上述条件来检测。此外，T_m值可以是60℃、63℃或65℃，但不限于此，并且本领域技术人员可以根据目的适当控制。

用于杂交多核苷酸的适当严格性取决于多核苷酸的长度和互补程度，并且其变量是本领域众所周知的(例如，Sambrook等人，同上)。

本公开的又另一个方面提供了载体，其包括编码本公开的变体的多核苷酸。所述载体可以是用于在宿主细胞中表达多核苷酸的表达载体，但不限于此。

本公开的“载体”可以包括含有可操作地连接至合适的表达控制区(或表达控制序列)(以便在适当的宿主中表达靶多肽)的编码靶多肽的多核苷酸的核苷酸序列的DNA构建体。所述表达控制区可以包括能够起始转录的启动子、用于控制这种转录的任何操纵子序列、用于编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列、以及用于控制转录和翻译终止的序列。所述载体在转化至适当的宿主细胞后，可以独立于宿主的基因组进行复制或发挥功能，或者可以整合至基因组本身中。

本公开中使用的载体没有特别限制，并且可以使用本领域已知的任何载体。通常使用的载体的实例可以包括天然或重组质粒、粘粒、病毒和噬菌体。例如，pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A和Charon21A可用作噬菌体载体或粘粒载体，并且基于pBR、基于pUC、基于pBluescriptII、基于pGEM、基于pTZ、基于pCL和基于pET的载体可以用作质粒载体。具体地，可以使用pDZ、pDC、pDCM2、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118和pCC1BAC载体。

例如，编码靶多肽的多核苷酸可以通过用于将染色体插入细胞中的载体插入染色体中。可以使用本领域已知的任何方法将多核苷酸插入染色体，例如同源重组，但不限于此。所述载体可以进一步包括用于研究染色体插入或不插入的选择标记。所述选择标记用于选择用载体转化的细胞，即鉴定靶核酸分子的插入，并且可以使用赋予可选择表型、诸如抗药性、营养缺陷型、细胞毒性药物抗性或表面蛋白表达的标记。在用选择剂处理的情况下，只有表达选择标记的细胞才可以存活或表达其他表型性状，使得可以选择转化的细胞。

如本文所用，术语“转化”意指将含有编码靶多肽的多核苷酸的载体引入宿主细胞或微生物中以允许由多核苷酸编码的多肽在宿主细胞中表达。转化的多核苷酸的实例可以包括任何多肽，只要它可以在宿主细胞中表达，不管它是插入并位于宿主细胞的染色体中还是位于染色体之外。此外，多核苷酸的实例包括编码靶蛋白的DNA和/或RNA。多核苷酸可以以任何形式引入，只要多核苷酸可以在宿主细胞中引入和表达即可。例如，可以以表达盒的形式引入多核苷酸，所述表达盒是含有自我表达所需的所有因子的基因构建体。表达盒通常可以包括与多核苷酸可操作地连接的启动子、转录终止信号、核糖体结合位点和翻译末端信号。所述表达盒可以是能够自我复制的表达载体。此外，所述多核苷酸可以以原样形式引入宿主细胞中，以与宿主细胞中表达所需的序列可操作地连接，但不限于此。

如上，术语“可操作地连接”是指用于起始和介导编码本公开的变体的多核苷酸转录的启动子序列和多核苷酸序列之间的功能连接。

本公开的又另一个方面提供了微生物，其包括本公开的变体或编码所述变体的多核苷酸。

本公开的微生物可以包括本公开的变体、编码所述变体的多核苷酸或包含所述多核苷酸的载体。

如本文所用，术语“微生物(或菌株)”涵盖所有野生型微生物或天然或人工遗传修饰的微生物，是指其中特定机制由于外源基因的插入或内源基因的活性的增强或失活而减弱或增强的微生物，并且可以是包括用于产生靶多肽、蛋白或产物的遗传修饰的微生物。

本公开的微生物可以是：包含本公开的变体、编码本公开的变体的多核苷酸和包含编码本公开的变体的多核苷酸的载体中的至少一种的微生物；经修饰以表达本公开的变体或编码本公开的变体的多核苷酸的微生物；表达本公开的变体或编码本公开的变体的多核苷酸的微生物(例如重组菌株)；或具有本公开的变体的活性的微生物(例如，重组菌株)，但不限于此。

本公开的微生物可以具有嘌呤核苷酸-产生能力。

本公开的微生物可以是天然具有谷氨酰胺-水解GMP合酶或嘌呤核苷酸-产生能力的微生物，或通过将本公开的变体或编码其的多核苷酸(或包含所述多核苷酸的载体)引入没有谷氨酰胺-水解GMP合酶或嘌呤核苷酸-产生能力的亲本菌株和/或通过赋予亲本菌株嘌呤核苷酸-产生能力而获得的微生物，但不限于此。例如，本公开的微生物可以是具有通过引入本公开的谷氨酰胺-水解GMP合酶变体而赋予的嘌呤核苷酸-产生能力的微生物。例如，本公开的微生物可以是具有通过引入本公开的谷氨酰胺-水解GMP合酶变体而增强的嘌呤核苷酸-产生能力的微生物。然而，本公开的微生物不限于此。

例如，本公开的菌株是由包含本公开的多核苷酸或编码本公开的变体的多核苷酸的载体转化的细胞或微生物，且因此表达本公开的变体，并且为了本公开的目的，本公开的菌株涵盖通过包含本公开的变体可以产生嘌呤核苷酸的所有微生物。例如，本公开的菌株可以是经由通过将编码本公开的变体的多核苷酸引入天然野生型微生物或产生嘌呤核苷酸的微生物中来表达谷氨酰胺-水解GMP合酶变体而具有增强的嘌呤核苷酸-产生能力的重组菌株。与天然野生型微生物或谷氨酰胺-水解GMP合酶未修饰微生物(即表达野生型谷氨酰胺-水解GMP合酶(SEQ ID NO:3)的微生物或不表达修饰蛋白的微生物)相比，重组菌株具有增强的嘌呤核苷酸-产生能力，但不限于此。

如本文所用，术语“未修饰的微生物”可以是指原样的野生型菌株或天然菌株，或在由于天然或人工因素引起的基因突变的转化前的菌株，不排除包含可能天然存在于微生物中的突变的菌株。例如，未修饰微生物可以是指其中未引入本文所述的谷氨酰胺-水解GMP合酶变体的或在其引入之前的菌株。“未修饰的微生物”可以与“修饰前的菌株”、“修饰前的微生物”、“未变化的菌株”、“未修饰的菌株”、“未变化的微生物”或“参考微生物”互换使用。

在一个实施方案中，本公开的微生物可以是棒杆菌属的微生物。例如，本公开的微生物可以是停滞棒杆菌(Corynebacterium stationis)、粗糙棒杆菌(Corynebacterium crudilactis)、沙漠棒杆菌(Corynebacterium deserti)、高效棒杆菌(Corynebacterium efficiens)、愈伤棒杆菌(Corynebacterium callunae)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、奇异棒杆菌(Corynebacterium singulare)、耐盐棒杆菌(Corynebacterium halotolerans)、纹带棒杆菌(Corynebacterium striatum)、产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、污染棒杆菌(Corynebacterium pollutisoli)、亚胺棒杆菌(Corynebacterium imitans)、睾丸棒杆菌(Corynebacterium testudinoris)或微黄棒杆菌(Corynebacterium flavescens)。具体地，本公开的微生物可以是停滞棒杆菌，但不限于此。

本文中的术语“嘌呤核苷酸”是指含有基于嘌呤的结构的核苷酸。嘌呤核苷酸可以是XMP、IMP、GMP或AMP，且特别是IMP、XMP或GMP。更具体地，嘌呤核苷酸可以是XMP或GMP，但不限于此。

本公开的“肌苷5'-一磷酸或5'-肌苷酸(IMP)”和“鸟苷5'-一磷酸或5'-鸟苷酸(GMP)”(其为核酸生物合成代谢系统的中间体)，在体内具有生理上重要的作用，并且广泛用于食品、药品等中。具体地，已知IMP本身赋予牛肉风味，并且已知源自XMP的GMP赋予蘑菇风味。已知这两种材料增强谷氨酸钠(MSG)的风味，并且因此作为一种增味的基于核酸的调味料已经受到很多关注。

在一个实施方案中，GMP可以通过从XMP转化而产生，但不限于此。例如，GMP的产量可以通过将越来越多产生的XMP转化为GMP而增加，且因此GMP也包括在本公开的范围内。

本公开的“XMP”也称为黄苷-5'-一磷酸或5'-黄嘌呤酸，并且可以由IMP通过IMP脱氢酶的作用形成或通过GMP合酶的作用转化为GMP。

如本文所用，术语“产生嘌呤核苷酸的微生物”涵盖所有野生型微生物或天然或人工遗传修饰的微生物，并且是指其中特定机制由于外源基因的插入或内源基因的活性的增强或失活而减弱或增强的微生物，其中所述微生物可以具有基因突变或增强的用于产生靶嘌呤核苷酸的活性。

通过含有本公开的谷氨酰胺-水解GMP合酶变体，本公开的产生嘌呤核苷酸的微生物可以保留增强的产生靶嘌呤核苷酸的能力。

在一个实施方案中，本公开中的产生嘌呤核苷酸的微生物或具有嘌呤核苷酸-产生能力的微生物可以是其中一些参与嘌呤核苷酸生物合成的基因被增强或减少、或一些参与嘌呤核苷酸降解途径的基因被增强或减少的微生物。

如本文所用，术语多肽活性的“减少”具有涵盖与内在活性相比所有活性降低或活性缺失的概念。减少可以与失活、缺乏、下调、下降、降低、衰减等互换使用。

所述减少还可以包括：由于编码多肽的多核苷酸发生突变等，多肽自身的活性与原始微生物具有的多肽的活性相比降低或消失的情况；由于编码多肽的多核苷酸的基因的表达受到抑制或翻译成编码多核苷酸的多肽的抑制或翻译为多肽的抑制，细胞中整体多肽的活性和/或浓度(表达水平)与天然菌株相比更低的情况；不进行多核苷酸表达的情况；和/或尽管多核苷酸表达，但多肽没有活性的情况。“内在活性”是指当菌株或微生物通过由天然或人为因素引起的基因突变转化时，修饰前的亲本菌株或野生型或未修饰的微生物原始具有的特定多肽的活性。该术语可以与“修饰前的活性”互换使用。多肽的活性与其内在活性相比的“失活、缺乏、下降、下调、降低或减弱”意指该多肽的活性与转化前的亲本菌株或未修饰的微生物最初具有的特定多肽的活性相比更低。

多肽活性的减少可以通过本领域已知的任何方法进行，但不限于此，并且可以通过应用本领域众所周知的各种方法来实现(例如，Nakashima N. 等人, Bacterialcellular engineering by genome editing and gene silencing. Int J Mol Sci.2014;15(2):2773–2793, 和Sambrook等人. Molecular Cloning 2012, 等)。

具体地，本公开的多肽的减少可以通过以下实现：

1)缺失编码多肽的基因的一部分或全部；

2)修饰表达控制区(或表达控制序列)以降低编码多肽的基因的表达；

3)修饰构成多肽的氨基酸序列以消除或减少多肽的活性(例如，氨基酸序列中至少一个氨基酸的缺失/取代/添加)；

4)修饰编码多核苷酸的基因序列以消除或减少多肽的活性(例如，缺失/取代/添加多肽基因的核苷酸序列中的至少一个核苷酸以编码经修饰以消除或减少多肽的活性的多肽)；

5)修饰编码起始密码子的核苷酸序列或编码多肽的基因转录物的5'-UTR区；

6)引入与编码多肽的基因转录物互补结合的反义寡核苷酸(例如，反义RNA)；

7)向编码多肽的基因的Shine-Dalgarno序列的上游添加与Shine-Dalgarno序列互补的序列，以形成使核糖体的附接不可能的二级结构；

8)向编码多肽的基因序列的开放阅读框(ORF)的3'末端添加待逆转录的启动子(逆转录工程改造，RTE)；或

9)选自项目1)至8)的两种或更多种的组合，但不特别限于此。

例如，这些描述如下。

编码项目1)中多肽的基因的部分或全部的缺失可以是染色体中编码内源靶蛋白的全部多核苷酸的消除，用一些核苷酸的缺失替换多核苷酸，或用标记基因替换。

项目2)中的表达控制区(或表达控制序列)的修饰可以是通过缺失、插入、非保守或保守取代或其组合对表达控制区(或表达控制序列)进行突变，或用活性减少更多的序列替换。表达控制区包括启动子、操纵子序列、编码核糖体结合位点的序列和用于控制转录和翻译终止的序列，但不限于此。

项目3)和4)中的氨基酸序列或多核苷酸序列的修饰可以是在多肽的氨基酸序列或编码多肽的多核苷酸序列中通过缺失、插入、非保守或保守取代或其组合对序列进行修饰，或用经修饰为活性减少更多的氨基酸序列或多核苷酸序列或经改进为无活性的氨基酸序列或多核苷酸序列替换，以减少多肽的活性。例如，可以通过将突变引入多核苷酸序列以形成终止密码子来抑制或减弱基因的表达。

项目5)中的编码起始密码子的核苷酸序列或编码多肽的基因转录物的5'-UTR区的修饰可以是例如用编码另一个具有较低多肽表达率的起始密码子(而不是内源起始密码子)的核苷酸序列取代，但不限于此。

项目6)中的与编码多肽的基因转录物互补结合的反义寡核苷酸(例如反义RNA)的引入可以参考例如文献(Weintraub, H. 等人, Antisense-RNA as a molecular toolfor genetic analysis, Reviews -Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986]。

项目7)中的向编码多肽的基因的Shine-Dalgarno序列的上游添加与Shine-Dalgarno序列互补的序列以形成使核糖体的附接不可能的二级结构可能使mRNA翻译不可能或降低其比率。

项目8)中的向编码多肽的基因序列的开放阅读框(ORF)的3'末端添加待逆转录的启动子(逆转录工程改造，RTE)可能产生与编码多肽的基因转录物互补的反义核苷酸，由此减少多肽的活性。

如本文所用，术语多肽活性的“增强”是指与多肽的内在活性相比，多肽的活性增加。增强可以与活化、上调、过表达、增加等互换使用。在本文中，活化、增强、上调、过表达和增加可以包括表现出原本不具有的活性或与内在活性或修饰前的活性相比表现出增强的活性的全部。“内在活性”是指当通过天然或人为因素引起的基因突变转化菌株或微生物时，在其转化前的亲本菌株或未修饰的微生物最初具有的特定多肽的活性。该术语可以与“修饰前的活性”互换使用。多肽活性与多肽的内在活性相比“增强”、“上调”、“过表达”或“增加”意指转化前的亲本菌株或未修饰的微生物最初具有的特定多肽的活性和/或浓度(表达水平)的提高。

可以通过引入外源多肽或内源多肽的活性增强和/或浓度(表达水平)来实现增强。多肽活性的增强可以通过相应多肽的活性程度或表达水平或从相应多肽产生的产物的量的增加来鉴定。

多肽活性的增强可以通过应用本领域众所周知的各种方法来实现，并且不受限制，只要该方法与转化前微生物相比可以增强靶多肽的活性即可。具体地，可以使用本领域技术人员众所周知的基因工程改造和/或蛋白工程改造(其为分子生物学的常规方法)，但不限于此(例如，Sitnicka等人Functional Analysis of Genes. Advances in Cell Biology. 2010, Vol. 2. 1–16, Sambrook等人 Molecular Cloning 2012等)。

具体地，本公开的多肽的增强可以通过以下实现：

1)增加编码多肽的多核苷酸的细胞内拷贝数；

2)用具有更高活性的序列替换编码多肽的染色体上的基因表达控制区；

3)修饰编码起始密码子的核苷酸序列或编码多肽的基因转录物的5'-UTR区；

4)修饰多肽的氨基酸序列以增强多肽的活性；

5)修饰编码多肽的多核苷酸序列以增强多肽的活性(例如，修饰多肽基因的多核苷酸序列以编码经修饰以增强多肽活性的多肽)；

6)引入表现出多肽活性的外源多肽或编码其的外源多肽；

7)对编码多肽的多核苷酸进行密码子优化；

8)对通过分析多肽的三级结构选择的暴露位点进行修饰或化学修饰；或

9)选自项目1)至8)的两种或更多种的组合，但不特别限于此。

更具体地，多肽的增强描述如下。

项目1)中的增加编码多肽的多核苷酸的细胞内拷贝数可以通过将编码相应多肽的多核苷酸与之可操作地连接并且可以独立于宿主复制和发挥功能的载体引入宿主细胞来实现。或者，项目1)中的增加可以通过将一个或多个拷贝的编码相应多肽的多核苷酸引入宿主细胞的染色体中来实现。向染色体中的引入可以通过将能够将多核苷酸插入宿主细胞中的染色体中的载体引入宿主细胞中来进行。多核苷酸如上所述。

项目2)中的用具有强活性的序列替换编码多肽的染色体上的基因表达控制区可以是例如通过缺失、插入、非保守或保守取代或其组合对序列进行修饰或用具有更强活性的序列替换，以进一步增强表达控制区的活性。表达控制区可以包括但不特别限于启动子、操纵子序列、编码核糖体结合位点的序列、控制转录和翻译终止的序列等。例如，其可以是用更强的启动子替换原始启动子，但不限于此。

已知更强的启动子的实例可以是CJ1至CJ7启动子(US 7662943 B2)、lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、λ噬菌体PR启动子、PL启动子、tet启动子、gapA启动子、SPL7启动子、SPL13 (sm3)启动子(US 10584338 B2)、O2启动子(US 10273491 B2)、tkt启动子、yccA启动子等，但不限于此。

项目3)中的修饰编码起始密码子的核苷酸序列或编码多肽的基因转录物的5'-UTR区可以是例如用编码另一个具有更高多肽表达率的起始密码子(而不是内源起始密码子)的核苷酸序列取代，但不限于此。

项目4)和5)中的修饰氨基酸序列或多核苷酸序列可以是在多肽的氨基酸序列或编码多肽的多核苷酸序列中通过缺失、插入、非保守或保守取代或其组合对序列进行修饰，或用经修饰为具有更强活性的氨基酸序列或多核苷酸序列或经修饰为具有增加的活性的氨基酸序列或多核苷酸序列替换，以增强多肽的活性。具体地，所述替换可以通过经由同源重组将多核苷酸插入染色体中进行，但不限于此。本文使用的载体可以进一步包括用于检查染色体插入的选择标记。选择标记如上所述。

项目6)中的引入表现出多肽活性的外源多肽可以是将编码表现出与多肽相同/相似活性的多肽的外源多核苷酸引入宿主细胞。外源多核苷酸不限于其来源或序列，只要外源多核苷酸表现出与多核苷酸相同/相似的活性即可。所述引入可以通过由本领域技术人员适当选择的任何已知转化方法且通过在宿主细胞中表达引入的多核苷酸来进行，产生所述多肽且可以增强其活性。

项目7)中的对编码多肽的多核苷酸进行密码子优化可以是对内源多核苷酸进行密码子优化以增加其在宿主细胞中的转录或翻译，或对外源多核苷酸进行密码子优化以允许其在宿主细胞中的优化转录或翻译。

项目8)中的对通过分析多肽的三级结构选择的暴露位点进行修饰或化学修饰可以是例如通过如下对待修饰或化学修饰的暴露位点进行修饰或化学修饰：比较待分析的多肽的序列信息与存储现有蛋白的序列信息的数据库，根据序列的相似性确定模板蛋白候选物，和基于此鉴定结构。

这种多肽活性的增强可意指相应多肽的活性、浓度或表达水平相对于野生型或修饰前的微生物菌株中表达的多肽的活性或浓度增加，或者由相应多肽产生的产物的量增加，但不限于此。

本公开的微生物中的部分或全部多核苷酸的修饰可以通过如下诱导：(a)基因组编辑，其采用使用用于在微生物中插入染色体的载体的同源重组或工程改造的核酸酶(例如，CRISPR-Cas9)，和/或(b)用光(诸如紫外线和辐射)和/或化学品处理，但不限于此。修饰部分或全部基因的方法可以包括通过DNA重组技术的方法。例如，可以将含有与靶基因同源的核苷酸序列的核苷酸序列或载体引入微生物中以引起同源重组，导致基因的部分或全部缺失。待引入的核苷酸序列或载体可以包括显性选择标记，但不限于此。

本公开的又另一个方面提供了用于产生嘌呤核苷酸的方法，所述方法包括培养包含本公开的变体或编码其的多核苷酸的微生物。

本发明的嘌呤核苷酸生产方法可以包括在培养基中培养包含本公开的变体、编码其的多核苷酸或包含所述多核苷酸的载体的微生物。

如本文所用，术语“培养”是指在适当调整的环境条件下使本公开的微生物生长。本公开的培养程序可以根据本领域已知的适当培养基或培养条件进行。本领域技术人员可以根据选择的菌株容易地调整这种培养。具体地，培养可以是分批型、连续型和/或分批补料型，但不限于此。

如本文所用，“培养基”是指含有培养微生物所需的营养物质作为主要组分的混合物，其中培养基供应营养物质、生长因子等，包括存活和生长所必需的水。具体地，对于用于培养本公开的微生物的培养基和其他培养条件，可以使用任何用于通常的微生物培养的培养基而没有特别限制。然而，本公开的微生物可以在有氧条件下在含有适当碳源、氮源、磷源、无机化合物、氨基酸和/或维生素的常规培养基中培养，同时调整温度、pH等。

具体地，棒杆菌属菌株的培养基可以在文献中找到(美国细菌学学会的“Manualof Methods for General Bacteriology” (Washington D.C., USA, 1981))。

在本公开中，碳源可以包括碳水化合物，诸如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、蔗糖和麦芽糖；糖醇，诸如甘露醇和山梨糖醇；有机酸，诸如丙酮酸、乳酸、柠檬酸；和氨基酸，诸如谷氨酸、甲硫氨酸和赖氨酸。此外，可以使用天然有机营养源，诸如淀粉水解物、糖蜜、黑带糖蜜、米糠、木薯、甘蔗渣和玉米浆，和特别是碳水化合物，诸如葡萄糖和无菌预处理的糖蜜(即，转化为还原糖的糖蜜)，并且可以使用适量的其他碳源而没有限制。这些碳源可以单独使用或以两种或更多种的组合使用，但不限于此。

至于氮源，可以使用无机氮源，诸如氨、硫酸铵、氯化铵、乙酸铵、磷酸铵、碳酸铵、和硝酸铵；氨基酸，例如谷氨酸、甲硫氨酸和谷氨酰胺；和有机氮源，诸如蛋白胨、NZ-胺、肉提取物、酵母提取物、麦芽提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、鱼或其分解产物、脱脂豆饼或其降解产物等。这些氮源可以单独使用或以其两种或更多种的组合使用，但不限于此。

磷酸盐源的实例可以包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和与其对应的含钠盐。至于无机化合物，可以使用氯化钠、氯化钙、氯化铁、硫酸镁、硫酸铁、硫酸锰、碳酸钙等，并且此外，可以包括氨基酸、维生素和/或合适的前体。这些组成成分或前体可以分批或连续方式添加至培养基中。然而，本公开不限于此。

在本公开的微生物的培养期间，可以通过以适当方式向培养基中添加化合物诸如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸和硫酸来调节培养基的pH。此外，可以添加消泡剂，诸如脂肪酸聚乙二醇酯，以抑制培养期间的泡沫形成。此外，可以向培养基中注入氧气或含氧气体，以维持培养基的有氧状态，或者可以注入氮气、氢气或二氧化碳气体，或者可以不注入气体，以维持培养基的厌氧或非有氧状态，但不限于此。

在本公开的培养中，培养温度可以维持在20℃至45℃，具体地25℃至40℃，并且可以进行培养约10小时至160小时，但不限于此。

通过本公开的培养物产生的嘌呤核苷酸可以释放至培养基中或者可以保留在细胞中而不被释放。

本公开的嘌呤核苷酸生产方法可以进一步包括制备本公开的微生物，制备用于培养微生物的培养基，或这些步骤的组合(无论顺序，以任何顺序)，例如，在培养步骤之前或之后。

本公开的嘌呤核苷酸生产方法可以进一步包括从由培养物得到的培养基(其中已经进行培养的培养基)或微生物中回收嘌呤核苷酸。在培养步骤之后可以进一步包括回收步骤。

回收可以是根据本公开的培养微生物的方法(例如分批、连续或补料分批型培养)，使用本领域已知的适当方法收集期望的嘌呤核苷酸。例如，可以使用离心、过滤、用结晶蛋白沉淀剂处理(盐析)、提取、超声破碎、超滤、透析、各种类型的色谱法，诸如分子筛色谱法(凝胶过滤)、吸附色谱法、离子交换色谱法和亲和色谱法、HPLC和这些方法的组合，并且可以通过使用本领域已知的适当方法从培养基或微生物中回收期望的嘌呤核苷酸。

本公开的嘌呤核苷酸生产方法可以进一步包括纯化步骤。可以通过使用本领域已知的适当方法进行纯化。在一个示例性实施方案中，当本公开的嘌呤核苷酸生产方法包括回收步骤和纯化步骤两者时，回收步骤和纯化步骤可以无论顺序连续或不连续进行，或者可以同时进行或整合为一步，但不限于此。

在一个示例性实施方案中，本公开的GMP生产方法可以进一步包括将XMP转化为GMP。在本公开的GMP生产方法中，可以在培养步骤或回收步骤之后进一步包括转化步骤。可以通过使用本领域已知的适当方法来进行转化步骤。例如，可以使用棒杆菌细菌、大肠杆菌或5'-黄苷酸氨基酶(KR 10-0655902 B1、US 2013-0095529 A1等)进行转化，但不限于此。

在本公开的方法中，所述变体、多核苷酸、载体、菌株、嘌呤核苷酸等如上文其他方面中所述。

本公开的又另一个方面是提供用于产生嘌呤核苷酸的组合物，所述组合物含有本公开的变体、编码所述变体的多核苷酸、包含含有所述多核苷酸的载体或本公开的多核苷酸的微生物；通过培养所述微生物获得的培养基；或其组合物。

本公开的组合物可以进一步含有任何适当的通常用于产生嘌呤核苷酸的组合物中的赋形剂，并且所述赋形剂的实例可以包括防腐剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、缓冲剂、稳定剂或等渗剂，但不限于此。

在本公开的组合物中，所述变体、多核苷酸、载体、微生物、培养基、嘌呤核苷酸等如上文其他方面中所述。

本发明的又另一个方面是提供用于增加微生物的嘌呤核苷酸-产生能力的方法，所述方法包括修饰所述微生物以表达本公开的变体。

在本申请的方法中，所述变体、多核苷酸、载体、微生物、培养基、嘌呤核苷酸等如上文其他方面中所述。

本公开的又另一个方面提供了本公开的变体用于生产嘌呤核苷酸的用途。

本公开的又另一个方面提供了本公开的变体、编码其的多核苷酸或包含含有其的载体的微生物的用途。

所述变体、多核苷酸、载体、微生物等如上文其他方面中所述。

[用于实施本发明的方式]

在下文中，将参考实施例和测试例详细描述本公开。然而，给出这些实施例和测试例用于具体举例说明本公开，并且本公开的范围不限于此。

实施例1：guaA合酶减少的变体的制备

为了发现用于XMP生产的guaA变体，构建了guaA突变体文库，即编码该变体的基因。

实施例1-1：含有guaA的载体的制备

为了制备guaA突变体文库，首先构建含有guaA的重组载体。使用停滞棒杆菌ATCC6872的染色体作为模板，连同SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的引物，进行PCR，并且通过使用TOPO克隆试剂盒(Invitrogen)将扩增产物克隆至pCR2.1载体中，并且所得载体被命名为pCR-guaA。

表1

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实施例1-2：guaA突变体文库的构建

使用实施例1-1中构建的pCR-guaA载体为模板构建guaA突变体文库。通过使用易错PCR试剂盒(Clontech Diversify®PCR随机诱变试剂盒)制备文库，并且根据制造商的手册使用SEQ ID NO:7和8的引物通过随机诱变获得具有不同序列的guaA突变体PCR产物。使用TOPO克隆试剂盒(Invitrogen)克隆扩增产物，且然后转化至大肠杆菌DH5α中并散布在含有卡那霉素(25mg/L)的LB固体培养基上。收集转化的大肠杆菌菌落以提取质粒，其被命名为pCR-guaA-文库。

表2

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实施例1-3：构建文库的评估和菌株的选择

将实施例1-2中制备的pCR-guaA-文库通过电穿孔转化至停滞棒杆菌ATCC6872野生型菌株中，且然后将该菌株铺展在含有25 mg/L卡那霉素的营养培养基上，以获得5000个其中插入突变体基因的菌株菌落。各自的菌落被命名为C.st ATCC6872_pCR_guaA(mt)1至C.st ATCC6872_pCR_guaA(mt)5000。

- 营养培养基：1%蛋白胨、1%牛肉提取物、0.25%氯化钠、1%酵母提取物、150 mg/L腺嘌呤、150 mg/L鸟嘌呤、2%琼脂、pH 7.2 (基于1L蒸馏水)。

将获得的5,000个菌落中的每一个在压力下进行高压灭菌，接种在100 μL含有卡那霉素(25 mg/L)的种子培养基中，在96深孔板中在30℃、1200rpm下使用微孔板振荡器(TAITEC)振荡培养24小时，且然后用作种子培养物。将320 μL(240 μL主培养基+80 μL单独灭菌培养基)高压灭菌发酵培养基分配至96深孔板中，且然后向其中接种每15μL种子培养物，随后用在与上述相同的条件下振荡培养72小时。

为了分析培养物中产生的XMP的量，在培养完成后将640 μL无菌水分配至培养物中，随后以4000 rpm离心15分钟，且然后将3 μL上清液转移至向其中分配297 μL蒸馏水的96-孔UV板。接着，使用微孔板阅读仪进行振荡30秒，并且使用分光光度计测量25℃和260nm波长下的吸光度。然后，选择显示与野生型菌株相比吸光度增加的10个突变菌株菌落。与对照相比，其他菌落显示相似或降低的吸光度。

通过上述方法反复测量10个选择的菌株的吸光度并研究XMP的产生量，并且选择一种与野生型菌株相比具有显著增强的XMP产生能力的菌株(C.st ATCC6872_pCR_guaA(mt)726)。

为了验证最终选择的菌株的有效性，进行发酵滴度测试。

将停滞棒杆菌ATCC6872野生型菌株和选择的C.st ATCC6872_pCR_guaA(mt)726菌株接种在含有2.5 mL下文的种子培养基的14 mL管中，并在30℃下以170 rpm振荡培养24小时。在含有32 mL以下生产培养基(24 mL主培养基+8 mL单独无菌培养基)的250 mL角挡板烧瓶中，接种0.7 mL种子培养物，并在170 rpm、30℃下振荡培养75小时。

种子培养基、主培养基和单独无菌培养基的组成如下。

<XMP烧瓶种子培养基>

30 g/L葡萄糖、15 g/L蛋白胨、15 g/L酵母提取物、2.5 g/L氯化钠、3 g/L尿素、150 mg/L腺嘌呤、150 mg/L鸟嘌呤，pH 7.0(基于1L蒸馏水)。

<XMP烧瓶生产培养基(主培养基)>

50 g/L葡萄糖、10 g/L硫酸镁、3 g/L酵母提取物、100 mg/L氯化钙、20 mg/L硫酸铁、10 mg/L硫酸锰、10 mg/L硫酸锌、0.8 mg/L硫酸铜、20 mg/L组氨酸、15 mg/L胱氨酸、15mg/L β-丙氨酸、100 μg/L生物素、5 mg/L硫胺素、50 mg/L腺嘌呤、25 mg/L鸟嘌呤、15 mg/L烟酸，pH 7.0(基于1L蒸馏水)。

<XMP烧瓶生产培养基(单独无菌培养基)>

18 g/L磷酸二氢钾、42 g/L磷酸氢二钾、7 g/L尿素、5 g/L硫酸铵(基于1L蒸馏水)

完成培养后通过使用HPLC的方法测量XMP产生量的结果显示于表3中。

表3

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如表3中所示，与野生型菌株相比，C.st ATCC6872_pCR_guaA(mt)726中产生的XMP的浓度为4.83 g/L。

实施例1-4：通过基因测序鉴定突变

为了鉴定C.st ATCC6872_pCR_guaA(mt)726菌株的guaA变体的序列，使用SEQ IDNO:8和9的引物对C.st ATCC6872_pCR_guaA(mt)726菌株进行PCR并测序。作为与野生型菌株的guaA基因的序列比较的结果，鉴定C.st ATCC6872_pCR_guaA(mt)726菌株以包括其中guaA基因中的位置29处的氨基酸从精氨酸取代为半胱氨酸(位置85处的核苷酸从c取代为t：SEQ ID NO:2)的突变。

鉴定的变体序列显示于表4中。

表4

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在以下实施例中，研究了guaA突变是否对XMP产生具有影响。

实施例2：鉴定guaA变体的效果

实施例2-1：构建用于guaA变体表达的载体

为了研究其中将guaA酶氨基酸序列中的位置29处的精氨酸取代为半胱氨酸的变体(R29C；SEQ ID NO:1)对XMP产生的影响，如下通过使用质粒pDCM2(韩国公开号10-2020-0136813)用于在棒杆菌染色体中进行基因插入和置换构建了用于制备其表达菌株的载体。

通过使用停滞棒杆菌ATCC6872的染色体为模板，连同SEQ ID NO:10和11以及SEQID NO:12和13的引物对进行PCR。Solg™ Pfu-X DNA聚合酶用作聚合酶，并且在以下PCR扩增条件下进行PCR：在95℃变性5分钟，30个循环的在95℃变性30秒、在58℃退火30秒和在72℃聚合60秒，且然后在72℃聚合反应5分钟，以由此获得各PCR产物。将扩增产物与先前通过用SmaI限制酶消化制备的pDCM2载体混合，并通过Gibson组装(DG Gibson等人, NATURE METHODS, Vol. 6 No. 5, MAY 2009, NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix)方法进行克隆以获得重组质粒，其被命名为pDCM2-guaA(R29C)。通过将Gibson组装试剂和每个基因片段以计算的摩尔数混合、随后在50℃下保存1小时来进行克隆。

实施例2-2：guaA变体-表达菌株的制备

将上述实施例中构建的pDCM2-guaA(R29C)载体通过电穿孔转化至停滞棒杆菌ATCC6872菌株中，并且在含有25 mg/L卡那霉素的培养基上选择通过同源序列重组将载体插入染色体的菌株。将选择的主要菌株进行二次交换以选择具有引入靶基因中的突变的菌株。使用SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15的引物对，通过PCR和测序研究最终转化菌株中基因突变的引入，并且证实的菌株被命名为C.st ATCC6872::guaA(R29C)。

实施例2-3：guaA变体-表达菌株的XMP-生产能力的比较

通过实施例1-3中的发酵滴度评估方法，研究实施例2-2中制备的C.stATCC6872::guaA(R29C)菌株和野生型菌株的XMP-生产能力。完成培养后，通过HPLC测量XMP的产生量，并且培养结果显示于表5中。

将测试重复3次，并且分析结果的平均值显示于表5中。

表5

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如表5中所示，在C.st ATCC6872::guaA(R29C)菌株中产生的XMP的浓度为5.21 g/L。

C.st ATCC6872::guaA(R29C)菌株被命名为CN02-2299，其在2021年8月9日根据布达佩斯条约保藏在保藏机构韩国微生物保藏中心(Korea Microorganism ConservationCenter)，并且给予保藏号KCCM13029P。

实施例3：在guaA突变中用其他氨基酸取代氨基酸

实施例3-1：构建用于guaA突变的氨基酸取代和插入的载体

通过上面的实施例鉴定了XMP可以通过guaA(R29C)突变产生。为了研究guaA突变的位置重要性，构建了用于用其他氨基酸取代位置29处的氨基酸的载体，并研究了对XMP-产生能力的影响。通过使用实施例2-1中构建的pDCM2-guaA(R29C)载体为模板进行定点诱变。

具体地，使用以下引物对进行PCR：SEQ ID NO:10和16以及SEQ ID NO:17和13的引物对，SEQ ID NO:10和18以及SEQ ID NO:19和13的引物对，SEQ ID NO:10和20以及SEQ IDNO:21和13，SEQ ID NO:10和22以及SEQ ID NO:23和13的引物对，SEQ ID NO:10和24以及SEQ ID NO:25和13的引物对，SEQ ID NO:10和26以及SEQ ID NO:27和13的引物对，SEQ IDNO:10和28以及SEQ ID NO:29和13的引物对，SEQ ID NO:10和30以及SEQ ID NO:31和13的引物对，SEQ ID NO:10和32以及SEQ ID NO:33和13的引物对，SEQ ID NO:10和34以及SEQID NO:35和13的引物对，SEQ ID NO:10和36以及SEQ ID NO:37和13的引物对，SEQ ID NO:10和38以及SEQ ID NO:39和13的引物对，SEQ ID NO:10和40以及SEQ ID NO: 41和13的引物对，SEQ ID NO:10和42以及SEQ ID NO:43和13的引物对，SEQ ID NO:10和44以及SEQ IDNO:45和13的引物对，SEQ ID NO:10和46以及SEQ ID NO:47和13的引物对，SEQ ID NO:10和48以及SEQ ID NO:49和13的引物对，以及SEQ ID NO:10和50以及SEQ ID NO:51和13的引物对。使用Solg™ Pfu-X DNA聚合酶作为聚合酶，并且在以下PCR扩增条件进行PCR：在95℃变性5分钟，30个循环的在95℃变性30秒、在58℃退火30秒和在72℃聚合60秒，且然后在72℃聚合反应5分钟，以由此获得各PCR产物。将各自扩增产物与先前通过用SmaI限制酶消化制备的pDCM2载体混合，并通过Gibson组装方法克隆以获得重组质粒，并且因此获得的质粒信息显示于表6中。通过将Gibson组装试剂和各自的片段以计算的摩尔数混合、随后在50℃下保存1小时来进行克隆。

表6

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实施例3-2：制备用其他氨基酸取代guaA变体中的突变的菌株和比较XMP-产生能力

将实施例3-1中获得的18种用于突变引入的载体转化至停滞棒杆菌ATCC6872野生型菌株中，并且在含有25 mg/L卡那霉素的培养基上选择通过同源序列重组将载体插入染色体的菌株。对选择的主要菌株进行二次交换以选择具有引入靶基因中的突变的菌株。通过使用SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15的引物对的PCR和测序研究最终转化菌株中基因突变的引入，并且根据插入突变的菌株名称显示于下表7中。

表7

。

对制备的菌株C.st ATCC6872::guaA(R29C)菌株和野生型菌株进行培养，并通过实施例1-3中的发酵滴度评估方法分析XMP浓度。将测试重复3次，并且分析结果的平均值显示于表8中。

表8

。

参考表8，与野生型菌株相比，包括guaA (其中由guaA基因编码的氨基酸序列中的位置29处的氨基酸被除了精氨酸之外的其他氨基酸取代)的菌株被鉴定为产生XMP。即，由guaA基因编码的氨基酸序列中的位置29处的氨基酸对应于XMP生产中的主要突变位置，且更具体地，当由guaA基因编码的氨基酸序列中的位置29处的氨基酸用除了精氨酸以外的其他氨基酸(半胱氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、酪氨酸、色氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苏氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、组氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸和谷氨酸)取代时，可以大大增加含有这种突变的微生物产生的XMP的量。

因此可以看出，具有用其他氨基酸取代guaA中位置29处的氨基酸的变体可以有利地用于产生嘌呤核苷酸。

实施例4：鉴定guaA变体-表达菌株的GMP产生能力

通过以下方法(参见韩国专利号KR10-0655902B1和美国专利公开号US2013-0095529A1)，使用C.st ATCC6872::guaA(R29C)的XMP培养物作为XMP-生产菌株研究GMP的生产。

通过实施例1-3中的发酵滴度评估方法培养C.st ATCC6872::guaA(R29C)菌株。在完成培养后，通过使用HPLC的方法测量XMP产生的量。对于产生的XMP向GMP的转化反应，向角挡板烧瓶中的发酵液中添加以下的转化反应添加剂和大肠杆菌XMP氨基酶，以在40℃下进行转化反应2.5小时。

<转化反应添加剂>

1.8 g/L植酸、4.8 g/L硫酸镁、3mL/L nymeen、2%二甲苯、100 mg/L腺嘌呤、7.7 g/L磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)、2 g/L谷氨酰胺、46 g/L葡萄糖

作为测试的结果，表明GMP生产量相比于XMP消耗量的转化率显示于表9中。

表9

。

如表9中所示，通过由C.st ATCC6872::guaA(R29C)菌株产生的从XMP的转化反应产生3.54 g/L GMP。

因此鉴定到具有用另一种氨基酸取代guaA中位置29处的氨基酸的变体增加了GMP产量，且因此可以看出本公开中提供的变体可以有利地用于生产嘌呤核苷酸。

如上所示，本公开所属领域的技术人员将能够理解，在不背离其技术精神或基本特征的情况下，本公开可以以其他特定形式实施。因此，以上描述的实施方案应被解释为示例性的而不是限制本公开。本公开的范围应理解为，源自权利要求及其等同方案的定义和范围的所有变化或修改都落入本公开的范围内。

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序列表

<110> CJ CheilJedang Corporation

<120> 新型谷氨酰胺-水解GMP合酶变体和用于使用其生产嘌呤核苷酸的方法

<130> OPA21333

<150> KR 10-2021-0125841

<151> 2021-09-23

<160> 51

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 524

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> guaA_R29C

<400> 1

Met Thr Gln Pro Ala Thr Thr Pro Arg Pro Val Leu Val Val Asp Phe

1 5 10 15

Gly Ala Gln Tyr Ala Gln Leu Ile Ala Arg Arg Val Cys Glu Ala Ser

20 25 30

Ile Tyr Ser Glu Val Val Pro His Ser Ala Thr Val Lys Glu Ile Lys

35 40 45

Ala Lys Asn Pro Ala Ala Leu Ile Leu Ser Gly Gly Pro Ser Ser Val

50 55 60

Tyr Ala Asp Gly Ala Pro Gln Leu Lys Pro Glu Leu Leu Glu Leu Gly

65 70 75 80

Val Pro Val Phe Gly Ile Cys Tyr Gly Phe Gln Ala Met Asn His Ala

85 90 95

Leu Gly Gly Asn Val Ala Gln Thr Gly Asp Arg Glu Tyr Gly Arg Thr

100 105 110

Glu Ile Thr His Thr Gly Gly Val Leu His Asp Gly Leu Glu Glu Asn

115 120 125

His Lys Val Trp Met Ser His Gly Asp Ala Val Asp Lys Ala Pro Glu

130 135 140

Gly Phe Thr Val Thr Ala Ser Ser Ala Gly Ala Pro Val Ala Ala Met

145 150 155 160

Glu Cys Val Ala Lys Gln Met Ala Gly Val Gln Tyr His Pro Glu Val

165 170 175

Met His Ser Pro His Gly Gln Glu Val Leu Val Arg Phe Leu Thr Glu

180 185 190

Val Ala Gly Leu Glu Gln Thr Trp Thr Ser Ala Asn Ile Ala Gln Gln

195 200 205

Leu Ile Asp Asp Val Arg Ala Gln Ile Gly Pro Glu Gly Arg Ala Ile

210 215 220

Cys Gly Leu Ser Gly Gly Val Asp Ser Ala Val Ala Ala Ala Leu Val

225 230 235 240

Gln Arg Ala Ile Gly Asp Arg Leu Thr Cys Val Phe Val Asp His Gly

245 250 255

Leu Leu Arg Ala Gly Glu Arg Glu Gln Val Glu Lys Asp Phe Val Ala

260 265 270

Ser Thr Gly Ala Lys Leu Ile Thr Ala His Glu Ala Asp Ala Phe Leu

275 280 285

Ser Lys Leu Ala Gly Val Thr Asp Pro Glu Ala Lys Arg Lys Ala Ile

290 295 300

Gly Ala Glu Phe Ile Arg Ser Phe Glu Arg Ala Val Ala Gln Ala Leu

305 310 315 320

Glu Glu Ser Pro Glu Asp Ser Thr Val Asp Phe Leu Val Gln Gly Thr

325 330 335

Leu Tyr Pro Asp Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Asp Gly Thr Ala Asn

340 345 350

Ile Lys Ser His His Asn Val Gly Gly Leu Pro Asp Asp Val Glu Phe

355 360 365

Glu Leu Val Glu Pro Leu Arg Leu Leu Phe Lys Asp Glu Val Arg Ala

370 375 380

Val Gly Arg Glu Leu Gly Leu Pro Glu Glu Ile Val Ala Arg Gln Pro

385 390 395 400

Phe Pro Gly Pro Gly Leu Gly Ile Arg Ile Ile Gly Glu Val Thr Glu

405 410 415

Glu Arg Leu Glu Ile Leu Arg Gln Ala Asp Leu Ile Ala Arg Thr Glu

420 425 430

Leu Thr Asn Ala Gly Leu Asp Gly Asp Ile Trp Gln Cys Pro Val Val

435 440 445

Leu Leu Ala Asp Val Arg Ser Val Gly Val Gln Gly Asp Gly Arg Thr

450 455 460

Tyr Gly His Pro Ile Val Leu Arg Pro Val Ser Ser Glu Asp Ala Met

465 470 475 480

Thr Ala Asp Trp Thr Arg Val Pro Tyr Asp Val Leu Glu Lys Ile Ser

485 490 495

Thr Arg Ile Thr Asn Glu Val Asn Asp Val Asn Arg Val Val Val Asp

500 505 510

Ile Thr Ser Lys Pro Pro Gly Thr Ile Glu Trp Glu

515 520

<210> 2

<211> 1575

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> guaA_c85t

<400> 2

gtgactcaac ctgcaacaac tccgcgccca gtcctcgtgg tggatttcgg tgcccaatac 60

gcacagctga ttgctcgtcg cgtatgtgag gcatcgattt actccgaggt agtcccacat 120

tccgccaccg ttaaagagat taaagctaaa aaccctgcag ctttgatttt gtccggtggc 180

ccgtcctctg tttatgccga tggcgccccg caattaaagc ctgaactgct cgagcttggt 240

gtgccagtct ttggcatctg ctacggcttc caagccatga accatgcttt gggtggcaac 300

gttgcgcaaa ccggtgaccg tgaatacggc cgcaccgaaa tcacccatac cggtggtgtg 360

ctgcacgacg gcttagaaga aaaccacaag gtctggatgt cccacggtga tgctgtggat 420

aaggcacctg agggctttac cgtgaccgca tcgtcggctg gtgcgccggt tgcagcgatg 480

gaatgcgtgg ccaagcaaat ggctggtgtg caataccacc ccgaggttat gcattcccca 540

cacggacagg aagtactcgt tcgcttcctc accgaggtag cagggctaga gcagacctgg 600

acctcggcaa atattgcgca gcagcttatc gatgatgtcc gcgcgcaaat cggccctgaa 660

ggccgcgcta tttgtggcct gtcgggcggc gtggactccg cagtcgctgc agcgctcgtg 720

cagcgcgcca ttggcgaccg tttgacctgt gtgttcgtgg accacggtct gctgcgcgcc 780

ggtgagcgtg agcaggtaga aaaggacttc gtggcttcga ctggtgcgaa gctgattacc 840

gcgcatgaag ctgatgcttt cttgtctaag ctcgccggtg ttaccgatcc tgaggctaag 900

cgcaaggcta tcggcgcgga attcatccgt tcctttgagc gtgctgtggc acaggctttg 960

gaagaatctc ctgaagactc cacagtggac ttcctggtcc agggcacctt gtatccggat 1020

gtggttgaat ccggcggcgg tgacggcacc gcaaatatca agtcccacca caatgttggc 1080

ggcctgccag acgatgtcga attcgaactc gtcgagccac tacgcctgct gtttaaggac 1140

gaagtccgtg ccgtcggccg cgagctcggc ctgcctgagg aaatcgttgc ccgccagcca 1200

ttccctggcc ctggcctagg catccgcatc atcggtgaag tcaccgagga gcgtctagaa 1260

atcctgcgtc aagcagacct gattgcgcgt accgagctga ccaacgctgg cctcgacggt 1320

gatatctggc agtgcccagt cgtactgctt gccgatgtcc gctccgtcgg agtccaaggc 1380

gacggccgca cctacggcca cccaatcgtg ctgcgcccag tgtcatccga ggatgccatg 1440

accgccgact ggacccgcgt tccttacgac gtcctagaga aaatctccac ccgcattacc 1500

aacgaagtca acgacgtcaa ccgcgtggtc gtcgacatca cctccaagcc accgggaacc 1560

atcgagtggg agtaa 1575

<210> 3

<211> 524

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 停滞棒杆菌

<400> 3

Met Thr Gln Pro Ala Thr Thr Pro Arg Pro Val Leu Val Val Asp Phe

1 5 10 15

Gly Ala Gln Tyr Ala Gln Leu Ile Ala Arg Arg Val Arg Glu Ala Ser

20 25 30

Ile Tyr Ser Glu Val Val Pro His Ser Ala Thr Val Lys Glu Ile Lys

35 40 45

Ala Lys Asn Pro Ala Ala Leu Ile Leu Ser Gly Gly Pro Ser Ser Val

50 55 60

Tyr Ala Asp Gly Ala Pro Gln Leu Lys Pro Glu Leu Leu Glu Leu Gly

65 70 75 80

Val Pro Val Phe Gly Ile Cys Tyr Gly Phe Gln Ala Met Asn His Ala

85 90 95

Leu Gly Gly Asn Val Ala Gln Thr Gly Asp Arg Glu Tyr Gly Arg Thr

100 105 110

Glu Ile Thr His Thr Gly Gly Val Leu His Asp Gly Leu Glu Glu Asn

115 120 125

His Lys Val Trp Met Ser His Gly Asp Ala Val Asp Lys Ala Pro Glu

130 135 140

Gly Phe Thr Val Thr Ala Ser Ser Ala Gly Ala Pro Val Ala Ala Met

145 150 155 160

Glu Cys Val Ala Lys Gln Met Ala Gly Val Gln Tyr His Pro Glu Val

165 170 175

Met His Ser Pro His Gly Gln Glu Val Leu Val Arg Phe Leu Thr Glu

180 185 190

Val Ala Gly Leu Glu Gln Thr Trp Thr Ser Ala Asn Ile Ala Gln Gln

195 200 205

Leu Ile Asp Asp Val Arg Ala Gln Ile Gly Pro Glu Gly Arg Ala Ile

210 215 220

Cys Gly Leu Ser Gly Gly Val Asp Ser Ala Val Ala Ala Ala Leu Val

225 230 235 240

Gln Arg Ala Ile Gly Asp Arg Leu Thr Cys Val Phe Val Asp His Gly

245 250 255

Leu Leu Arg Ala Gly Glu Arg Glu Gln Val Glu Lys Asp Phe Val Ala

260 265 270

Ser Thr Gly Ala Lys Leu Ile Thr Ala His Glu Ala Asp Ala Phe Leu

275 280 285

Ser Lys Leu Ala Gly Val Thr Asp Pro Glu Ala Lys Arg Lys Ala Ile

290 295 300

Gly Ala Glu Phe Ile Arg Ser Phe Glu Arg Ala Val Ala Gln Ala Leu

305 310 315 320

Glu Glu Ser Pro Glu Asp Ser Thr Val Asp Phe Leu Val Gln Gly Thr

325 330 335

Leu Tyr Pro Asp Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Asp Gly Thr Ala Asn

340 345 350

Ile Lys Ser His His Asn Val Gly Gly Leu Pro Asp Asp Val Glu Phe

355 360 365

Glu Leu Val Glu Pro Leu Arg Leu Leu Phe Lys Asp Glu Val Arg Ala

370 375 380

Val Gly Arg Glu Leu Gly Leu Pro Glu Glu Ile Val Ala Arg Gln Pro

385 390 395 400

Phe Pro Gly Pro Gly Leu Gly Ile Arg Ile Ile Gly Glu Val Thr Glu

405 410 415

Glu Arg Leu Glu Ile Leu Arg Gln Ala Asp Leu Ile Ala Arg Thr Glu

420 425 430

Leu Thr Asn Ala Gly Leu Asp Gly Asp Ile Trp Gln Cys Pro Val Val

435 440 445

Leu Leu Ala Asp Val Arg Ser Val Gly Val Gln Gly Asp Gly Arg Thr

450 455 460

Tyr Gly His Pro Ile Val Leu Arg Pro Val Ser Ser Glu Asp Ala Met

465 470 475 480

Thr Ala Asp Trp Thr Arg Val Pro Tyr Asp Val Leu Glu Lys Ile Ser

485 490 495

Thr Arg Ile Thr Asn Glu Val Asn Asp Val Asn Arg Val Val Val Asp

500 505 510

Ile Thr Ser Lys Pro Pro Gly Thr Ile Glu Trp Glu

515 520

<210> 4

<211> 1575

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 停滞棒杆菌

<400> 4

gtgactcaac ctgcaacaac tccgcgccca gtcctcgtgg tggatttcgg tgcccaatac 60

gcacagctga ttgctcgtcg cgtacgtgag gcatcgattt actccgaggt agtcccacat 120

tccgccaccg ttaaagagat taaagctaaa aaccctgcag ctttgatttt gtccggtggc 180

ccgtcctctg tttatgccga tggcgccccg caattaaagc ctgaactgct cgagcttggt 240

gtgccagtct ttggcatctg ctacggcttc caagccatga accatgcttt gggtggcaac 300

gttgcgcaaa ccggtgaccg tgaatacggc cgcaccgaaa tcacccatac cggtggtgtg 360

ctgcacgacg gcttagaaga aaaccacaag gtctggatgt cccacggtga tgctgtggat 420

aaggcacctg agggctttac cgtgaccgca tcgtcggctg gtgcgccggt tgcagcgatg 480

gaatgcgtgg ccaagcaaat ggctggtgtg caataccacc ccgaggttat gcattcccca 540

cacggacagg aagtactcgt tcgcttcctc accgaggtag cagggctaga gcagacctgg 600

acctcggcaa atattgcgca gcagcttatc gatgatgtcc gcgcgcaaat cggccctgaa 660

ggccgcgcta tttgtggcct gtcgggcggc gtggactccg cagtcgctgc agcgctcgtg 720

cagcgcgcca ttggcgaccg tttgacctgt gtgttcgtgg accacggtct gctgcgcgcc 780

ggtgagcgtg agcaggtaga aaaggacttc gtggcttcga ctggtgcgaa gctgattacc 840

gcgcatgaag ctgatgcttt cttgtctaag ctcgccggtg ttaccgatcc tgaggctaag 900

cgcaaggcta tcggcgcgga attcatccgt tcctttgagc gtgctgtggc acaggctttg 960

gaagaatctc ctgaagactc cacagtggac ttcctggtcc agggcacctt gtatccggat 1020

gtggttgaat ccggcggcgg tgacggcacc gcaaatatca agtcccacca caatgttggc 1080

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ttccctggcc ctggcctagg catccgcatc atcggtgaag tcaccgagga gcgtctagaa 1260

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gacggccgca cctacggcca cccaatcgtg ctgcgcccag tgtcatccga ggatgccatg 1440

accgccgact ggacccgcgt tccttacgac gtcctagaga aaatctccac ccgcattacc 1500

aacgaagtca acgacgtcaa ccgcgtggtc gtcgacatca cctccaagcc accgggaacc 1560

atcgagtggg agtaa 1575

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 5

gcgatgtgat tgccggtg 18

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 6

gctctaggaa gtcagcag 18

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 7

tgcccaatac gcacagctg 19

<210> 8

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 8

ggctggggct ttgtcc 16

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 9

ggcttagcaa gacctggc 18

<210> 10

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 10

gtgaattcga gctcggtacc cgcaccgcag ttagccc 37

<210> 11

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 11

taaatcgatg cctcacatac gcgacgagca atc 33

<210> 12

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 12

gattgctcgt cgcgtatgtg aggcatcgat tta 33

<210> 13

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 13

ggtcgactct agaggatccc ccgaggtcca ggtctgctc 39

<210> 14

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 14

ggaatccgaa gcggagc 17

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 15

caggccacaa atagcgcg 18

<210> 16

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 16

taaatcgatg cctcgcctac gcgacgagca atc 33

<210> 17

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 17

gattgctcgt cgcgtaggcg aggcatcgat tta 33

<210> 18

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 18

taaatcgatg cctcgaatac gcgacgagca atc 33

<210> 19

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 19

gattgctcgt cgcgtattcg aggcatcgat tta 33

<210> 20

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 20

taaatcgatg cctcggatac gcgacgagca atc 33

<210> 21

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 21

gattgctcgt cgcgtatccg aggcatcgat tta 33

<210> 22

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 22

taaatcgatg cctcgtatac gcgacgagca atc 33

<210> 23

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 23

gattgctcgt cgcgtatacg aggcatcgat tta 33

<210> 24

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 24

taaatcgatg cctcccatac gcgacgagca atc 33

<210> 25

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 25

gattgctcgt cgcgtatggg aggcatcgat tta 33

<210> 26

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 26

taaatcgatg cctcgattac gcgacgagca atc 33

<210> 27

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 27

gattgctcgt cgcgtaatcg aggcatcgat tta 33

<210> 28

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 28

taaatcgatg cctccactac gcgacgagca atc 33

<210> 29

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 29

gattgctcgt cgcgtagtgg aggcatcgat tta 33

<210> 30

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 30

taaatcgatg cctctggtac gcgacgagca atc 33

<210> 31

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 31

gattgctcgt cgcgtaccag aggcatcgat tta 33

<210> 32

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 32

taaatcgatg cctcggttac gcgacgagca atc 33

<210> 33

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 33

gattgctcgt cgcgtaaccg aggcatcgat tta 33

<210> 34

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 34

taaatcgatg cctctgctac gcgacgagca atc 33

<210> 35

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 35

gattgctcgt cgcgtagcag aggcatcgat tta 33

<210> 36

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 36

taaatcgatg cctcatctac gcgacgagca atc 33

<210> 37

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 37

gattgctcgt cgcgtagatg aggcatcgat tta 33

<210> 38

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 38

taaatcgatg cctcgtttac gcgacgagca atc 33

<210> 39

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 39

gattgctcgt cgcgtaaacg aggcatcgat tta 33

<210> 40

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 40

taaatcgatg cctcgtgtac gcgacgagca atc 33

<210> 41

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 41

gattgctcgt cgcgtacacg aggcatcgat tta 33

<210> 42

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 42

taaatcgatg cctccagtac gcgacgagca atc 33

<210> 43

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 43

gattgctcgt cgcgtactgg aggcatcgat tta 33

<210> 44

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 44

taaatcgatg cctccattac gcgacgagca atc 33

<210> 45

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 45

gattgctcgt cgcgtaatgg aggcatcgat tta 33

<210> 46

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 46

taaatcgatg cctcctgtac gcgacgagca atc 33

<210> 47

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 47

gattgctcgt cgcgtacagg aggcatcgat tta 33

<210> 48

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 48

taaatcgatg cctcctttac gcgacgagca atc 33

<210> 49

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 49

gattgctcgt cgcgtaaagg aggcatcgat tta 33

<210> 50

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 50

taaatcgatg cctcttctac gcgacgagca atc 33

<210> 51

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 51

gattgctcgt cgcgtagaag aggcatcgat tta 33

Claims

1.谷氨酰胺-水解GMP合酶变体，其中对应于SEQ ID NO:3中的位置29处的氨基酸被另一种氨基酸取代。

2.权利要求1的谷氨酰胺-水解GMP合酶变体，其中所述其他氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸和组氨酸。

3.编码权利要求1的变体的多核苷酸。

4.微生物，其包含其中对应于SEQ ID NO:3中位置29处的氨基酸被另一种氨基酸取代的谷氨酰胺-水解GMP合酶变体，或编码所述变体的多核苷酸。

5.权利要求4的微生物，其中所述微生物是停滞棒杆菌(Corynebacterium stationis)。

6.用于产生嘌呤核苷酸的方法，所述方法包括培养权利要求4或5的微生物。

7.权利要求6的方法，其进一步包括从培养基或所述微生物回收嘌呤核苷酸。

8.用于产生嘌呤核苷酸的组合物，所述组合物包含以下中的至少一种：谷氨酰胺-水解GMP合酶变体，其中对应于SEQ ID NO:3中的位置29处的氨基酸被另一种氨基酸取代；包含所述变体的微生物；和其中已经培养所述微生物的培养基。

9.用于增加微生物的嘌呤核苷酸产生能力的方法，所述方法包括修饰所述微生物以表达权利要求1的变体。