KR20060080202A

KR20060080202A - 플라스미드 카피 수가 변화된 광 숙주 범위 ｐＢＢＲ1-기초플라스미드 돌연변이 유도체

Info

Publication number: KR20060080202A
Application number: KR1020067005272A
Authority: KR
Inventors: 키옹 쳉; 루안 타오
Original assignee: 이 아이 듀폰 디 네모아 앤드 캄파니
Priority date: 2003-09-17
Filing date: 2004-09-15
Publication date: 2006-07-07
Also published as: EP1668134A2; US7247467B2; EP1668134A4; US20050130307A1; WO2005028623A2; WO2005028623A3

Abstract

본 발명은 그것이 존재하는 플라스미드에 변화된 플라스미드 카피 수의 표현형을 운반하는 능력을 갖는 돌연변이체 플라스미드 복제 제어 부위를 기술한다. 돌연변이체 복제 제어 부위는 pBBR1 플라스미드 훼밀리로부터 단리된 유사한 부위에 기초한 것이다. 이 복제 제어 부위를 함유하는 플라스미드는 어떠한 공지의 부적합성 그룹에도 속하는 것으로 분류될 수 없고 따라서 단일 숙주에서 광범위한 다른 플라스미드와 공존할 수 있다.

Description

플라스미드 카피 수가 변화된 광 숙주 범위 ｐＢＢＲ1-기초 플라스미드 돌연변이 유도체{BROAD HOST RANGE pBBR1-BASED PLASMID MUTANT DERIVATIVES HAVING ALTERED PLASMID COPY NUMBER}

본 출원은 2003년 9월 17일 출원된, 미국 가출원 제60/503,855호의 이익을 주장한다.

본 발명은 분자생물학 및 클로닝 벡터 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 플라스미드 카피 수가 변화된 pBBR1으로부터 유래된 광 숙주 범위 플라스미드에 관한 것이다.

특정 산물의 고-수준 생산을 위해 적당한 재조합 숙주의 창제는 전형적으로 천연 숙주 기구와 생합성 경로에 대한 중요한 대사 조작을 요구한다. 고-수준 유전자 발현에 대한 요구에 부응하여, 많은 특화된 발현 벡터가 전사, 번역, 단백질 안정성, 산소 제한, 및 숙주 세포로부터의 분비의 측면을 제어하는 많은 상이한 유전적 요소를 조작함으로써 창제되어 왔다. 보다 구체적으로, 최적의 유전자 발현을 위한 시스템을 설계할 때 고려되어야만 하는 분자적 특징은 1.) 관련 전사 프로모터와 터미네이터 서열의 성질; 2.) 리보솜 결합 위치의 강도; 3.) 합성된 외래 단백질의 최종 세포 위치; 4.) 숙주 유기체에서 번역의 효율; 5.) 숙주 세포 내에서 클로닝된 유전자 단백질의 내재적 안정성; 6.) 그 빈도가 숙주 세포의 선호되는 코돈 사용의 빈도에 접근하도록 하는, 클로닝된 유전자 내의 코돈 사용; 및 7.) 클로닝된 유전자의 카피 수 및 유전자가 플라스미드-운반되거나 숙주 세포의 게놈으로 통합되는지 여부를 포함한다.

상기 변형의 각각이 거대한 유용성을 가질지라도, 유전자 발현을 증가시키기 위한 수단으로서 특정 단백질 산물의 생산을 위한 특정 숙주 유기체에서의 각각의 변형을 시험하는 용이성은 널리 변화한다. 예를 들어, 특정 클로닝된 유전자의 코돈 사용의 변형은 관심있는 유전자 전체에 걸친 뉴클레오티드 염기 쌍 변형을 요구하는, 지루한 과정이다. 반대로, 유전자 발현을 증가시키기 위한 가장 쉬운 수단 중 하나는 1.) 각각의 발현 플라스미드 내의 클로닝된 유전자의 카피 수를 증가시키거나; 2.) 발현하고자 하는 유전자가 존재하는 플라스미드의 카피 수를 증가시킴으로써, 플라스미드-운반 클로닝된 유전자(들)의 카피 수를 증가시키는 것을 포함한다. 전자는 특정 발현 플라스미드 내에서 발현하고자 하는 각각의 유전자에 대한 부가적인 클로닝을 요구하고 다중 카피의 동일 유전자는 상동적 재조합으로 인해 불안정할 수 있다. 후자 방법은 관심있는 특정 숙주 유기체에 적당한 플라스미드 카피 수가 변화된 변형된 일 조의 발현 플라스미드의 합성을 요구한다; 그러나, 수많은 상이한 클로닝된 유전자는 유전자 카피 수 대 유전자 발현 수준의 최적 비율을 결정하기 위하여 이 조의 플라스미드 내에서 쉽게 시험될 수 있다.

플라스미드 카피 수에 관하여; 플라스미드는 세포 집단 내에서 주어진 플라 스미드의 카피 수 (N)가 보통 주어진 숙주 내에서 정해진 성장 조건 하에서 좁은 가우스 분포 내에서 유지되도록 그들의 복제를 제어하여야만 하는 것으로 알려져 있다. 이것은, 플라스미드가 그들의 숙주 내에서 안정하게 공존해야 하고 세포에 대한 대사 로드를 최분해해야만 하기 때문에, 요구된다. 구체적으로, 세포 내의 플라스미드 카피의 과잉-축적은 세포 성장을 늦출 수 있고 결국 세포 사멸을 유발할 수 있다. 반대로, 너무 느린 플라스미드 복제 속도는, 플라스미드-결여 세포가 자주 더 신속하게 자라고 집단에서 플라스미드-운반 세포 보다 수적으로 우세하게 할 수 있기 때문에 플라스미드-결핍 세포에 이르게 할 수 있다. 플라스미드 카피 수를 조절하기 위한 수단은 플라스미드 DNA 농도 자체가 새로운 플라스미드 카피가 생성되는 속도를 결정하는, 자동조절 제어 기작의 결과이다. 일반적으로, 플라스미드 복제의 개시는 DNA 복제의 개시를 위해 이용가능한 프라이머의 양을 조절하거나, 필수 복제 단백질의 양을 조절하거나, 필수 복제 단백질의 기능을 조절함으로써 제어될 수 있다. 몇몇 최근 리뷰는 플라스미드 카피 수 제어에 관한 상세내용을 논의하고 있다 (예를 들어, 문헌 ([Helinski, D. R., et al. Replication control and other stable maintenance mechanisms of plasmids. In Escherichia coli and Salmonella, Vol. 2. Neidhardt, F. C., et al. Eds. American Society of Microbiology: Washington, DC, pp. 2295-2324 (1996)]; [Chattoraj, D. K. and Schneider, T. D., Prog Nucleic Acid Res Mol Biol, 57: 145-186 (1997)]; [del Solar, G. & Espinosa, M., Mol Microbiol, 37 (3): 492-500 (2000)]; 및 [Chattoraj, D. K., Mol Microbiol, 37 (3): 467-476 (2000)]) 참조).

특정 발현 벡터를 선택할 때 두번째 고려사항은 벡터 자체의 숙주 범위이다. 구체적으로, 숙주 범위는 플라스미드가 복제할 미생물의 타입을 말한다. 관심있는 각각의 미생물 종에 대해 특이적 벡터를 개발할 수 있다; 또는, 관련이 없는 광 범위한 미생물에서 유지되는 능력을 갖는 이용가능한 광 숙주 범위 레플리콘(replicon)을 이용할 수 있다. 이들 광 숙주 범위 플라스미드는 전형적으로 복제에 요구되고 다중 숙주에서 기능하는 그들 자신의 단백질 모두를 코딩한다. 따라서, 이들 플라스미드는 그들의 숙주 세포에 의존적이지 않다. 반대로, 협 숙주 범위 레플리콘은 복제 또는 분리 능력을 결여할 수 있어 (멀리 관련된 숙주로 도입되거나 그에서 유전자 마커를 발현할 수 없음과 비교되는), 밀접하게 관련된 종에서만 그들의 복제를 일으킨다 (문헌 [Schmidhauser, T. J. and D. R. Helinski., J. Bacteriol., 164: 446-455 (1985)]).

대부분의 광 숙주 범위 플라스미드는 그들의 "부적합성 그룹(incompatibility group)"에 따라, 그들의 내재적 성질에 기초하여 분류된다. 이 분류는 레플리콘의 서열, 기능 및 성질에서의 유사성을 반영한다 (상이한 부적합성 그룹 (예를 들어, "Inc" 그룹)으로부터의 레플리콘은 단일 세포에 동시에 존재할 수 있는 반면, 동일한 타입의 레플리콘은 세포에서 공존할 수 없기 때문에). Inc 그룹 C, N, P, Q 및 W에 속하는 그램-음성 세균의 천연 플라스미드 단리물은 다양한 세균 종에서 복제 및 유지 능력을 나타낸다.

pBBR1 플라스미드는 그램-음성 세균 보데텔라 브론치셉티카 (Bordetella bronchiseptica) S87로부터 단리된 2.6 kB 광 숙주 범위 플라스미드이다 (문헌 [Antoine, R. and C. Locht, Mol. Microbiol., 6 (13): 1785-1799 (1992)]; FR 2,690, 459). pBBR1의 많은 유도체가 다양한 다중 클로닝 위치 (문헌 [Kovach et al., Biotechniques, 16: 800-802 (1994)]), 항생제 내성 마커 (문헌 [Kovach et al., Gene, 166: 175-176 (1995)]), 리포터 유전자 (문헌 [Ramos et al., J Biotechnol, 97: 243-252 (2002)]), 및 조절된 프로모터 (문헌 ([Lefebre and Valvano, Appl Environ Microbiol, 68: 5956-5964 (2002)]; [Sukchawalit et al., FEMS Microbiol Lett, 181: 217-223 (1999)]))를 첨가하도록 제작되었다. 이들 pBBR1-기초 플라스미드 유도체는 1.) 세균을 위한 유전적 시스템의 개발 (문헌 ([Coppi et al., Appl Environ Microbiol, 67: 3180-3187 (2001)]; [Su et al., Microbiology, 147: 581-589 (2001)])); 2.) 새로운 폴리하이드록시 알카노에이트의 합성 (문헌 [Ewering et al., Microbiology, 148: 1397-1406 (2002)]); 3.) 생체변환을 위한 생체촉매의 생산 (문헌 [Overhage et al., Appl Environ Microbiol, 68: 4315-4321 (2002)]); 및 4.) 백신 효능을 증진시키기 위한 보호 항원의 과잉-발현 (문헌 [Vemulapalli et al., Infect Immun, 68: 3286-3289 (2000)])을 포함하는 다양한 용도에 사용되었다.

매우 넓은 숙주 범위 유지를 갖는 발현/클로닝 벡터로서의 유용성을 갖는 pBBR1의 한 특정 유도체는 상업적으로 이용가능한 pBHR1 (모비텍(MoBiTec); 괴팅겐, 독일; 젠뱅크(GenBank)® Y14439)이다. pBBR1과 같이, pBHR1은 보편적인 광 숙주 범위 부적합성 그룹 중 어느 것에도 속하지 않고 상대적으로 높은 카피 수를 갖는다. pBBR1 및 pBHR1 플라스미드 둘 다 두 결정적 오픈 리딩 프레임 (ORF들) 을 갖는다 - rep으로 알려져 있는, 첫번째는 플라스미드의 복제에 관여하고; 두번째 ORF는 mob으로 알려져 있다. 이동화에 관여하는, mob 유전자는 문헌 [Szpirer et al. Molecular Microb. 37 (6): 1283-1292 (2000); J. Bacteriol. 183 (6): 2101-2110 (2001)]에 의해 이 훼밀리의 플라스미드에 대해 널리 특성분석되어 있다. 플라스미드 pBHR1은 또한 단지 5300 bp의 상대적으로 작은 크기를 유지하면서, 부가적으로 두 선별 마커 (즉, 카나마이신과 클로람페니콜)를 갖는다. 이들 성질은 pBHR1이 광범위한 그램-음성 세균에 적당한 매우 유용한 클로닝 벡터가 되게 한다.

pBBR1 및 pBBR1 훼밀리 내의 플라스미드 유도체의 유용성을 증가시키는 하나의 변이는 플라스미드의 카피 수를 증가시키기 위한 수단일 것이다. 구체적으로, 플라스미드 카피 수가 변화된 일 조의 돌연변이체를 창제하는 것이, 이것이 유전자 카피 수와 유전자 발현 간의 관련성을 쉽게 측정할 수 있도록 할 것이므로, 바람직할 것이다. 일반적으로, 세포 당 증가된 플라스미드 카피 수는 숙주 세포 내에서 플라스미드에 의해 발현되는 단백질의 총 수율 (즉, 역가)를 실질적으로 증가시킬 수 있다. 변화된 카피 수의 표현형을 갖는 플라스미드 돌연변이체는 무작위 돌연변이유발 후 목적하는 표현형을 갖는 돌연변이체를 얻기 위한 스크리닝에 의해 생성된다. 이들 돌연변이체를 생성하는 기술이 분자생물학의 당업자에 의해 잘 이해되어 있을지라도, 플라스미드 카피 수가 변화된 pBBR1-기초 플라스미드의 개발에 대한 유용성과 필요가 이전에는 인식되지 않았다.

따라서 해결하고자 하는 문제점은 1.) 다양한 다른 광 숙주 범위 플라스미드 와 공존하고; 2.) 정해진 성장 조건 하에서 주어진 숙주 내에서 복제하는 능력을 가져, 플라스미드 카피 수가 천연 pBBR1-기초 플라스미드에 비해 변화되는 능력을 갖는 광 숙주 범위 발현 플라스미드를 개발하는 것이다.

본 문제점은 증가된 플라스미드 카피 수의 표현형을 운반하는 돌연변이체 복제 제어 부위가 포함된 pBHR1으로부터 유래된 일 조의 단리된 플라스미드를 제공함으로써 해결되었다. 플라스미드의 넓은 숙주 범위, 및 다른 공지의 광 숙주 범위 벡터와의 그들의 적합성은 본 발명의 플라스미드가 다양한 세균 내에서 플라스미드-기초 단백질 발현을 위해 특히 매력적이게 한다.

발명의 요약

본 발명은 그것이 존재하는 플라스미드에 변화된 플라스미드 카피 수를 운반하는 능력을 갖는 돌연변이체 복제 제어 부위를 제공한다. 돌연변이체 복제 제어 부위를 포함하는 플라스미드도 제공된다. 발명의 플라스미드는 단기간 내에 숙주 내에서 이종 유전자의 발현 수준을 효율적으로 변형시키는 방법을 제공한다.

몇몇 돌연변이가 증가된 플라스미드 카피 수의 표현형을 창제하는 플라스미드 pBHR1의 복제 제어 부위 내에서 동정되었다. 복제 제어 부위의 이들 돌연변이는 pBHR1의 복제 제어 부위 (서열 1의 뉴클레오티드 2478-3765 포함)의 뉴클레오티드 서열의 위치 2490, 2496, 2579, 2633, 2634, 2663, 2771, 2805, 2838, 2914, 2935, 3003, 3165, 3262, 3269, 3344, 3347, 3456, 3468, 3570, 3604, 3641, 3729, 3739 및 3747에 위치된 것들을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.

따라서, 발명은

a) pBBR1으로부터 유래된 복제 제어 부위를 포함하는 플라스미드를 제공하고;

b) (a)의 플라스미드를 돌연변이가 플라스미드의 복제 제어 부위로 도입되는 돌연변이유발 과정에 가하고;

c) (b)의 돌연변이체 플라스미드를 적당한 숙주 세포로 형질전환시키고;

d) (c)의 숙주 세포를 배양하고 플라스미드 카피 수를 결정하고;

e) (a)의 플라스미드에 비해 플라스미드 카피 수가 변화된 적어도 하나의 (d)의 플라스미드를 선별하고;

f) (e)의 플라스미드로부터 돌연변이체 복제 제어 부위를 단리하는 것

을 포함하는, 변화된 플라스미드 카피 수를 운반하는 돌연변이체 플라스미드 복제 제어 부위의 생성 및 단리 방법을 제공한다.

또 하나의 태양에서, 플라스미드 카피 수가 결정되는 방법은 유전자 발현을 평가하기 위한 리포터 제작물의 사용; 아가로스 젤 분석에 의한 플라스미드 DNA 농도의 측정; 실시간 PCR; 및 노던 블랏 분석으로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 더욱이, 변화된 플라스미드 카피 수는 단계 (a)의 pBBR1-기초 플라스미드에 비해 증가되거나 감소될 수 있다.

또 하나의 태양에서, 서열 1의 뉴클레오티드 2478-3765에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하고

a) 뉴클레오티드 2490에서 G에서 A로의 돌연변이;

b) 뉴클레오티드 2496에서 C에서 T로의 돌연변이;

c) 뉴클레오티드 2579에서 T에서 C로의 돌연변이;

d) 뉴클레오티드 2633에서 C의 결실에 의한 돌연변이;

e) 뉴클레오티드 2634에서 C의 결실에 의한 돌연변이;

f) 뉴클레오티드 2663에서 T의 C로의 돌연변이;

g) 뉴클레오티드 2771에서 A의 G로의 돌연변이;

h) 뉴클레오티드 2805에서 T의 C로의 돌연변이;

i) 뉴클레오티드 2838에서 C의 A로의 돌연변이;

j) 뉴클레오티드 2914에서 T의 C로의 돌연변이;

k) 뉴클레오티드 2935에서 T의 C로의 돌연변이;

l) 뉴클레오티드 3003에서 C의 T로의 돌연변이;

m) 뉴클레오티드 3165에서 G의 A로의 치환을 위한 돌연변이;

n) 뉴클레오티드 3262에서 T의 G로의 돌연변이;

o) 뉴클레오티드 3269에서 C의 T로의 돌연변이;

p) 뉴클레오티드 3344에서 T의 C로의 돌연변이;

q) 뉴클레오티드 3347에서 C의 T로의 돌연변이;

r) 뉴클레오티드 3456에서 G의 A로의 치환을 위한 돌연변이;

s) 뉴클레오티드 3468에서 T의 C로의 치환을 위한 돌연변이;

t) 뉴클레오티드 3570에서 A의 G로의 치환을 위한 돌연변이;

u) 뉴클레오티드 3604에서 T의 C로의 돌연변이;

v) 뉴클레오티드 3641에서 A의 C로의 돌연변이;

w) 뉴클레오티드 3729에서 A의 G로의 돌연변이;

x) 뉴클레오티드 3739에서 T의 A로의 돌연변이; 및

y) 뉴클레오티드 3747에서 T의 C로의 돌연변이

로 구성된 그룹으로부터 독립적으로 선택되는 적어도 하나의 점 돌연변이를 갖는 돌연변이체 복제 제어 부위가 제공된다.

부가적으로, 추가 태양은 서열 3에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 돌연변이체 복제 유전자 및

a) 뉴클레오티드 117에서 G의 A로의 치환을 위한 돌연변이;

b) 뉴클레오티드 214에서 T의 G로의 돌연변이;

c) 뉴클레오티드 221에서 C의 T로의 돌연변이;

d) 뉴클레오티드 296에서 T의 C로의 돌연변이;

e) 뉴클레오티드 299에서 C의 T로의 돌연변이;

f) 뉴클레오티드 408에서 G의 A로의 치환을 위한 돌연변이;

g) 뉴클레오티드 420에서 T의 C로의 치환을 위한 돌연변이;

h) 뉴클레오티드 522에서 A의 G로의 치환을 위한 돌연변이;

i) 뉴클레오티드 556에서 T의 C로의 돌연변이; 및

j) 뉴클레오티드 593에서 A의 C로의 돌연변이

로 구성된 그룹으로부터 독립적으로 선택되는 적어도 하나의 점 돌연변이를 포함하는 서열 3에 나타낸 돌연변이 복제 유전자를 제공한다.

또 하나의 태양은 발명의 돌연변이체 복제 제어 부위 및/또는 복제 유전자를 포함하는 플라스미드 및 발명의 돌연변이체 복제 제어 부위를 포함하는 그램-음성 숙주 세포에 관한 것이다.

도면의 간단한 설명 및 서열 설명

도 1은 pBHR1-기초 리포터 플라스미드 pDCQ301 및 pDCQ318의 제작을 보여주는 도식도이다.

도 2는 카로티노이드 리포터 플라스미드와 복제 제어 부위가 변형된 돌연변이 유도체를 함유하는 이. 콜라이(E. coli)에서 관찰되는 상대적 β-카로틴 생산의 그래프에 의한 요약을 제공한다.

도 3은 pDCQ318 및 그의 돌연변이 유도체의 복제 제어 부위 내에 창제된 모든 돌연변이 (pDCQ318 및 각각의 돌연변이 유도체에서 뉴클레오티드 위치 3030에서 시토신의 삽입 제외)의 요약이다.

도 4는 실시간 PCR에 의해 결정된, pDCQ318 및 그의 돌연변이 유도체의 상대적 플라스미드 카피 수의 그래프에 의한 요약을 제공한다.

아래 서열 설명 및 여기에 첨부된 서열목록은 37 C.F.R. §1.821-1에 나타낸 특허출원에서 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열 개시를 규제하는 규칙에 부합한다. 서열 설명은 참조에 의해 여기에 도입되는 문헌 [Nucleic Acids Research 13: 3021-3030 (1985)] 및 문헌 [Biochemical Journal 219 (No. 2): 345-373 (1984)]에 기재되어 있는 IUPAC-IYUB 표준에 일치하여 정의된 뉴클레오티드 서열 문자의 1 문자 코드와 아미노산의 3 문자 코드를 포함한다. 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 데이터에 사용된 심볼과 포맷은 37 C.F.R. §1.822에 나타낸 규칙에 부합한다.

서열 1은 광 숙주 범위 플라스미드 pBHR1(젠뱅크® Y14439)의 야생형 서열이다. 본 연구에서 돌연변이유발에 가해지는 복제 제어 부위는 뉴클레오티드 2478-3765에 해당한다; rep 유전자 자체는 뉴클레오티드 3049-3711 사이에 위치되어 있고 Rep 단백질 (서열 2로 제공)을 코딩한다.

서열 3은 발명의 돌연변이체 rep 유전자의 뉴클레오티드 서열이다.

서열 4-21은 표 1에 확인되어 있는 바와 같은, 돌연변이체 복제 제어 부위와 Rep 단백질이다.

복제 제어 부위 서열번호의 요약

복제 제어 부위	복제 제어 부위의 뉴클레오티드 서열번호	Rep 단백질의 아미노산 서열번호
PDCQ318	서열 4	서열 5
PDCQ318M1	서열 6	서열 7
PDCQ318M2	서열 8	서열 9
PDCQ318M3	서열 10	서열 11
PDCQ318M4	서열 12	서열 5
PDCQ318M5	서열 13	서열 14
PDCQ318M7	서열 15	서열 16
PDCQ318M8	서열 17	서열 5
PDCQ318M14	서열 18	서열 19
PDCQ318M32	서열 20	서열 5
PDCQ318M35	서열 21	서열 5

서열 22-25는 각각 리포터 제작물로 사용하기 위한 판토에아 스테와티(Pantoea stewartii) crtEYIB 유전자 클러스터를 증폭하기 위해 사용된 프라이머 pBHRcrt_1F, pBHRcrt_1R, pBHRcrt_2F 및 pBHRcrt_2R이다.

서열 26 및 27은 각각 pDCQ301에서 복제 제어 부위를 증폭하기 위해 사용된 프라이머 301rep_F 및 301rep_R이다.

서열 28 및 29는 각각 오류-유발성(error-prone) PCR 반응을 위해 사용된 프라이머 pBHR1rep_F 및 301rep_R2이다.

서열 30 및 31은 각각 표적 플라스미드 DNA 상의 crtE 유전자의 3' 말단에 있는 65 bp 부위를 증폭시키기 위해 설계된 순방향 및 역방향 프라이머이다.

서열 32 및 33은 각각 이. 콜라이 16S rRNA 유전자의 62 bp 부위를 증폭시키기 위해 설계된 순방향 및 역방향 프라이머이다.

서열 34는 메틸로모나스(Methylomonas) sp. 16a의 16s rRNA 유전자이다.

서열 35는 rep 유전자를 포함하는, pDCQ301의 2152 bp 부분적 뉴클레오티드 서열이다.

서열 36은 pDCQ301의 Rep 단백질이다.

특허 과정의 목적을 위한 미생물 기탁의 국제적 인정에 대한 부타페스트 조약의 조항 하에 아래 생물학적 기탁:

기탁자 식별 참조	국제 기탁 명칭	기탁일
메틸로모나스 16a	ATCC PTA 2402	2000년 8월 22일

여기에 사용된 바, "ATCC"는 U.S.A., VA 20110-2209, 매나싸스, 10801 유니버시티 Blvd., ATCC에 위치한, 어메리칸 타입 컬처 컬렉션을 말한다. "국제 기탁 명칭"은 ATCC로의 기탁 시 배양물에 대한 등록번호이다.

수록된 기탁물은 적어도 삼십 (30) 년간 표시된 국제 기탁기관에 유지될 것이고 그것을 개시한 특허 허여 시 공중에게 이용가능하게 될 것이다. 기탁물의 이용가능성은 정부 행위에 의해 허여되는 특허권의 적용배제로 대상 발명을 실시하기 위한 실시권을 구성하지 않는다.

본 발명은 그것이 존재하는 플라스미드에 변화된 플라스미드 카피 수를 운반하는 돌연변이체 복제 제어 부위 및 그를 포함하는 플라스미드를 제공한다. 그렇게 창제된 돌연변이체 플라스미드의 조는 플라스미드로 클로닝된 이종 단백질의 발현 수준의 용이한 변형을 요구하는 연구를 위해 특히 적당할 것이다.

정의

본 개시내용에서, 많은 용어와 약어가 사용된다. 아래 정의가 제공된다.

"오픈 리딩 프레임"은 ORF로 약칭된다.

"중합효소 연쇄 반응"은 PCR로 약칭된다.

용어 "플라스미드 카피 수"는 세포 내에 포함된 플라스미드 분자의 평균 수를 말한다. 세포에서 플라스미드의 카피 수는 플라스미드 복제의 개시를 조절함으로써 결정된다. 일반적으로, 플라스미드 복제의 개시는 DNA 복제의 개시를 위해 이용가능한 프라이머의 양을 조절하거나, 필수적인 복제 단백질의 양을 조절하거나, 필수적인 복제 단백질의 기능을 조절함으로써 제어될 수 있다.

용어 "변화된 플라스미드 카피 수"는 어세이 방법에 의해 측정될 수 있는, 특정 숙주에서 특정 플라스미드와 관련된 카피 수로서, 그 카피 수가 참조 플라스미드와 관련된 카피 수 보다 크거나 작은 것을 말한다. "증가된 플라스미드 카피 수"는 참조 플라스미드와 관련된 것 보다 더 큰 변화된 플라스미드 카피 수를 말한다. "감소된 플라스미드 카피 수"는 참조 플라스미드와 관련된 것 보다 더 작은 변화된 플라스미드 카피 수이다. 여기에서의 목적을 위해, 돌연변이체 플라스미드의 플라스미드 카피 수는 비-돌연변이유발된 친 플라스미드 (야생형)에 대해 비교된다.

용어 "Rep"은 "rep" 유전자에 의해 코딩되는 복제 단백질을 말한다. 플라스미드의 복제 유전자는 플라스미드의 복제 특성을 담당한다.

용어 "복제 제어 부위"는 rep 유전자 또는 복제를 제어하는 역할을 하고, 플라스미드 카피 수에 영향을 미치는 rep 유전자에 상동성을 갖는 유전자를 함유하는 DNA의 부위를 말한다. 본 발명에서 관심있는 바람직한 복제 제어 부위는 rep 유전자와 유전자 상류의 약 1 kB 이하의 연결 DNA와 유전자의 하류의 약 0.2 kB 이하의 연결 DNA를 포함할 것이다.

전형적으로, 발명의 복제 제어 부위는 pBBR1 (상기 문헌 [Antoine, R. and C. Locht])으로부터 유래된다. 따라서, 용어 "pBBR1으로부터 유래된 복제 제어 부위"는 pBBR1 또는 복제 제어 부위가 pBBR1의 것과 동일한, pBBR1 플라스미드 훼밀리 내의 어느 플라스미드 유도체로부터 단리된 복제 제어 부위를 말한다. pBHR1 (젠뱅크® 등록번호 Y14439; 모비텍(괴팅겐, 독일)을 통해 상업적으로 입수가능)이 pBBR1 훼밀리 내의 플라스미드 유도체의 일례이다. 젠뱅크® 등록번호 Y14439에 의해 정의되는, 야생형 pBHR1에 관하여, 복제 제어 부위는 여기에서 뉴클레오티드 2478-3765 사이에 함유된 그 부분으로 정의될 것이다; rep 유전자 자체는 뉴클레오티드 3049-3711 사이에 위치되어 있다.

용어 "돌연변이체 복제 제어 부위" 또는 "돌연변이체 플라스미드 복제 제어 부위"는 돌연변이체 부위의 뉴클레오티드 서열이 비-돌연변이유발된 (야생형) 서열의 것과 상이하도록 돌연변이유발 과정에 의해 변형된 복제 제어 부위를 말한다. 여기에 기재된 바와 같이, 돌연변이체 복제 제어 부위는 약 1300 bp를 포함하고, pBBR1 및 pBHR1 (젠뱅크® 등록번호 Y14439) 플라스미드로부터 유래되고, pBBR1 및 pBHR1의 야생형 복제 제어 부위에 대해 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 일 태양에서, 본 발명의 돌연변이체 복제 제어 부위는 참조 플라스미드의 복제 제어 부위에 의해 운반되는 플라스미드 카피 수에 대해, 그것이 존재하는 플라스미드에 변화된 플라스미드 카피 수를 운반할 것이다.

용어 "pBBR1"은 보데텔라 브론치셉티카 S87 (상기 문헌 [Antoine, R. and C. Locht])로부터 단리된 잠재(cryptic) 플라스미드를 말할 것이다.

용어 "pBBR1-기초" 또는 "pBBR1 훼밀리 내의 플라스미드 유도체"는 pBBR1의 복제 제어 부위를 포함하는 어느 플라스미드를 말한다.

용어 "pBHR1"은 젠뱅크® 등록번호 Y14439에 나타내어지고, 모비텍을 통해 상업적으로 입수가능한, 광 숙주 범위 플라스미드 pBHR1을 말할 것이다. 플라스미드 pBHR1은 pBBR1 훼밀리 내의 플라스미드 유도체이고 따라서 pBBR1의 것과 동일한 복제 제어 부위를 갖는다.

용어 "돌연변이체 pDCQ318"은 변화된 플라스미드 카피 수의 표현형을 운반하는 돌연변이체 복제 제어 부위를 갖는 pDCQ318의 어느 플라스미드 유도체를 말할 것이다. pDCQ318에 대해 플라스미드 카피 수가 증가된 본 발명의 바람직한 돌연변이체 플라스미드는 pDCQ318M1, pDCQ318M2, pDCQ318M3, pDCQ318M4, pDCQ318M5, pDCQ318M7, pDCQ318M8, pDCQ318M14, pDCQ318M32, 및 pDCQ318M35이다.

여기에 사용된 바, 용어 "돌연변이유발 과정"은 돌연변이가 DNA의 특정 부위 내에서 일어나고 상기 돌연변이가 스크리닝 과정이나 선별 과정을 통해 인식될 수 있도록 다양한 돌연변이유발제에 플라스미드나, 플라스미드를 포함하는 숙주 세포를 가하는 과정을 말한다. 플라스미드 pBBR1 및 그의 유도체의 복제 제어 부위에서 발생하는 돌연변이가 본 발명에서 특히 관심있는 것이다.

플라스미드에 적용되는 바, 용어 "부적합성"은 동일한 숙주 세포 내에서 어느 두 상이한 플라스미드가 공존할 수 없음을 가리킨다. 구체적으로, 동일한 부적합성 그룹 (즉, "Inc 그룹")으로부터의 두 플라스미드는 동일한 세포 내에 유지될 수 없다. 반대로, 상이한 "Inc" 그룹으로부터의 플라스미드는 동일한 숙주 세포 내에 동시에 유지될 수 있다. 특정 Inc 그룹 (예를 들어, Inc 그룹 C, N, P, Q 또는 W) 내의 플라스미드의 분류는 레플리콘의 서열, 기능 및 성질에서의 유사성에 의존한다. Inc 그룹은 그램-음성 세균의 접합성 플라스미드에 대해 가장 널리 정의되어 있다.

용어 "플라스미드", "벡터" 및 "카세트"는 자주 세포의 중심 대사의 일부가 아닌 유전자를 운반하는, 보통 원형의, 이-본쇄 DNA 분자 형태의 염색체 외 요소를 말한다. 그러한 요소는 많은 뉴클레오티드 서열이 독특한 구조로 결합 또는 재조합되어 있는, 어느 출처로부터 유래된, 일- 또는 이본쇄 DNA 또는 RNA의 선형 또는 원형의, 자가 복제 서열, 게놈 통합 서열, 파지 또는 뉴클레오티드 서열일 수 있다. "형질전환 카세트"는 외래 유전자와 외래 유전자에 부가하여 특정 숙주 세포의 형질전환을 용이하게 하는 요소를 함유하는 특정 벡터를 말한다. "발현 카세트"는 외래 유전자와 외래 유전자에 부가하여 외래 숙주에서 그 유전자의 발현 증가를 허용하는 요소를 함유하는 벡터를 말한다.

용어 "C₁ 탄소 기질" 또는 "단일 탄소 기질"은 탄소-탄소 결합을 결여한 어느 탄소-함유 분자를 말한다. 비-제한적 예는 메탄, 메탄올, 포름알데히드, 포름산, 포메이트, 메틸화된 아민 (예를 들어, 모노-, 디-, 및 트리-메틸 아민), 메틸화된 티올, 및 이산화탄소이다.

용어 "C₁ 대사자"는 그의 단일 에너지 및 생체질량 원으로서 단일 탄소 기질을 사용하는 능력을 갖는 미생물을 말한다. C₁ 대사자는 전형적으로 메틸로트로프 및/또는 메타노트로프일 것이다.

용어 "C₁ 대사 세균"은 그의 단일 에너지 및 생체질량 원으로서 단일 탄소 기질을 사용하는 능력을 갖는 세균을 말한다. C₁ 대사자의 서브셋트인, C₁ 대사 세균은 전형적으로 메틸로트로프 및/또는 메타노트로프일 것이다.

용어 "메틸로트로프"는 탄소-탄소 결합을 함유하지 않는 유기 화합물을 산화할 수 있는 유기체를 의미한다. 메틸로트로프가 CH₄를 산화할 수 있는 경우, 메틸로트로프는 또한 메타노트로프이다.

용어 "메타노트로프" 또는 "메타노트로프 세균"은 그의 일차적 탄소 및 에너지원으로서 메탄을 이용할 수 있는 원핵생물을 의미한다. 메탄의 이산화탄소로의 완전한 산화는 호기성 분해 경로에 의해 발생한다. 본 발명에 유용한 메타노트로프의 전형적 예는 메틸로모나스(Methylomonas), 메틸로박터(Methylobacter), 메틸로코커스(Methylococcus), 및 메틸로시너스(Methylosinus)를 포함한다 (그러나 이들로 제한되지 않는다).

용어 "고 성장 메타노트로프 세균 균주"는 높은 성장속도와 대사된 C₁ 기질의 그램 당 세포 질량의 수율로 귀결하는, 기능적 엠브덴-마이어호프(Embden-Meyerof) 탄소 플럭스 경로를 갖는, 유일한 탄소 및 에너지 원으로서 메탄이나 메탄올을 이용하여 성장할 수 있는 세균을 말한다 (WO 02/20728 참조). 여기에 기재된 특정의 "고 성장 메타노트로프 세균 균주"는 상호교환가능하게 사용되는 용어이고 본 발명에서 사용된 메틸로모나스 균주를 말하는 "메틸로모나스 16a", "16a" 또는 "메틸로모나스 sp. 16a"로 언급된다.

용어 "카로티노이드"는 이소프렌으로부터 유래된 공역(conjugated) 폴리엔 탄소 골격을 갖는 탄화수소의 클래스를 말한다. 이 클래스의 분자는 C₃₀ 디아포카르티노이드와 C₄₀ 카로티노이드 및 그들의 산화된 유도체를 포함한다.

"C₄₀ 카로티노이드"는 두 중심 메틸 그룹이 1,6-위치 관계에 있고 남아있는 비말단 메틸 그룹이 1,5-위치 관계에 있도록 이소프레노이드 단위의 배열이 분자의 중심에서 거꾸로 되는 방식으로 결합된 8개의 이소프레노이드 단위로 구성된다. 모든 C₄₀ 카로티노이드는 형식적으로 (ⅰ) 수분해, (ⅱ) 탈수분해, (ⅲ) 폐환화, (ⅳ) 산화, (ⅴ) 에스테르화/글리코실화, 또는 이들 과정의 어느 조합에 의해, 공역 이중결합의 긴 중앙 쇄를 갖는, 어사이클릭 C₄₀H₅₆ 구조 (아래 화학식 Ⅰ)로부터 유래될 수 있다. 이 클래스는 또한 탄소 골격 (화학식 Ⅰ)의 재배열로부터, 또는 이 구조의 일부의 (형식적) 제거에 의해 발생하는 특정 화합물을 포함한다.

용어 "crtEYIB"는 1.) crtE 유전자에 의해 코딩되는 제라닐제라닐 피로포스페이트 신쎄타제(synthetase) 효소 (트랜스-트랜스-파네실 디포스페이트와 이소펜테닐 디포스페이트를 피로포스페이트와 제라닐제라닐 디포스페이트로 전환시키는); 2.) crtY 유전자에 의해 코딩되는 리코펜 사이클라제(cyclase) 효소 (리코펜을 β-카로틴으로 전환시키는); 3.) crtI 유전자에 의해 코딩되는 피토엔 디세튜라제(desaturase) 효소 (피토플루엔, ζ-카로틴 및 뉴로스포렌의 중간체를 통해 피토엔을 리코펜으로 전환시키는); 및 4.) crtB 유전자에 의해 코딩되는 피토엔 신타제(synthase) 효소 (프리피토엔 디포스페이트로부터 피토엔으로의 반응을 촉매하는) 를 코딩하는 유전자를 포함하는 유전자 제작물을 말한다. 함께, 이 조의 효소는 피토엔의 β-카로틴으로의 전환을 촉매한다.

여기에 사용된 바, "단리된 핵산 단편"은 임의로 합성, 비-천연 또는 변화된 뉴클레오티드 염기를 함유하는, 일- 또는 이본쇄 RNA 또는 DNA의 폴리머이다. DNA의 폴리머 형태의 단리된 핵산 단편은 cDNA, 게놈 DNA 또는 합성 DNA의 하나 이상의 조각으로 이루어질 수 있다.

핵산 분자는, 일본쇄 형태의 핵산 분자가 온도와 용액 이온 강도의 적절한 조건 하에서 다른 핵산 분자에 어닐링할 수 있을 때, cDNA, 게놈 DNA, 또는 RNA 분자와 같은 또 하나의 핵산 분자에 "혼성화가능"하다. 혼성화 및 세척 조건은 잘 알려져 있으며 문헌 [Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1989)], 특히 그 중의 11장 및 표 11.1 (참조에 의해 전체적으로 여기에 도입)에 예시되어 있다. 온도와 이온 강도의 조건이 혼성화의 "엄격도"를 결정한다. 엄격도 조건은 보통으로 유사한 단편 (멀리 관련된 유기체로부터의 상동적 서열과 같은)에서, 고도로 유사한 단편 (밀접하게 관련된 유기체로부터의 기능적 효소를 복제하는 유전자와 같은)을 스크리닝하기 위해 조정될 수 있다. 혼성화-후 세척은 엄격도 조건을 결정한다. 한 셋트의 예시적 조건은 15 분간 실온에서 6×SSC, 0.5% SDS로 시작한 후, 30 분간 45 ℃에서 2×SSC로 반복한 후, 30 분간 50 ℃에서 0.2×SSC, 0.5% SDS로 2회 반복하는 일련의 세척을 이용한다. 또 하나의 태양에서, 엄격한 조건은 세척이 0.2×SSC, 0.5% SDS에서의 최종 두 30 분 세척의 온도가 60 ℃로 증가된 것을 제외하고는 위의 것들과 동일한 더 높은 온도를 사용한다. 추가 태양에서, 한 셋트의 고도로 엄격한 조건은 65 ℃에서 0.1×SSC, 0.1% SDS에서의 두 최종 세척으로 이루어져 사용될 수 있다. 부가적인 셋트의 엄격한 조건은 예를 들어, 0.1×SSC, 0.1% SDS, 65 ℃에서의 혼성화와 2×SSC, 0.1% SDS에 이어서 0.1×SSC, 0.1% SDS로의 세척을 포함한다.

혼성화는, 비록 혼성화의 엄격도에 따라, 염기 간의 미스매치가 가능할지라도, 두 핵산이 상보적 서열을 포함하는 것을 요구한다. 핵산을 혼성화하기 위한 적절한 엄격도는 당업계에 잘 알려져 있는 변수, 핵산의 길이와 상보성의 정도에 의존한다. 두 뉴클레오티드 서열 간의 유사성 또는 상동성의 정도가 클수록, 그들 서열을 갖는 핵산의 하이브리드에 대한 T_m 값이 커진다. 핵산 혼성화의 상대적 안정성 (더 높은 T_m에 상응하는)은 아래 순서로 감소한다: RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA. 길이가 100 뉴클레오티드 보다 더 큰 하이브리드를 위해, T_m을 계산하기 위한 등식이 도출되었다 (상기 문헌 [Sambrook et al.], 9.50-9.51 참조). 더 짧은 핵산, 즉 올리고뉴클레오티드와의 혼성화를 위해, 미스매치의 위치는 더 중요해지고, 올리고뉴클레오티드의 길이는 그의 특이성을 결정한다 (상기 문헌 [Sambrook et al.], 11.7-11.8 참조). 일 태양에서 혼성화가능한 핵산의 길이는 적어도 약 10 뉴클레오티드이다. 또 하나의 태양에서, 혼성화가능한 핵산의 최소 길이는 적어도 약 15 뉴클레오티드이고; 또 하나의 태양에서 적어도 약 20 뉴클레오티드이며; 다른 추가 태양에서 길이는 적어도 약 30 뉴클레오티드이다. 더욱이, 당업자는 온도와 세척 용액 염 농도가 프로브의 길이와 같은 인자에 따라 필요한대로 조정될 수 있음을 인식할 것이다.

아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 "실질적 부분"은 당업자에 의한 서열의 수동적 평가, 또는 컴퓨터-자동화된 서열 비교 및 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; 문헌 [Altschul, S. F., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1993)])와 같은 알고리즘을 이용한 동정에 의해, 그 폴리펩티드 또는 유전자를 추정적으로 동정하기 위해 충분한 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 유전자의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 그 부분이다. 일반적으로, 폴리펩티드 또는 핵산 서열을 공지의 단백질 또는 유전자에 상동적인 것으로 추정적으로 동정하기 위해서는 10개 이상의 연속적 아미노산 또는 30개 이상의 뉴클레오티드 서열이 필요하다. 더욱이, 뉴클레오티드 서열에 관하여, 20-30개의 연속적 뉴클레오티드를 포함하는 유전자 특이적 올리고뉴클레오티드 프로브가 서열-의존적 유전자 동정 (예를 들어, 서던 혼성화) 및 단리 (예를 들어, 세균 콜로니 또는 박테리오파지 플라크의 인 사이츄 혼성화) 방법에 사용될 수 있다. 부가적으로, 프라이머를 포함하는 특정 핵산 단편을 얻기 위하여 12-15 염기의 짧은 올리고뉴클레오티드가 PCR에서 증폭 프라이머로 사용될 수 있다. 따라서, 뉴클레오티드 서열의 "실질적 부분"은 서열을 포함하는 핵산 단편을 특이적으로 동정하고/거나 단리하기 위해 충분한 서열을 포함한다. 본 명세서는 하나 이상의 특정 미생물 단백질을 코딩하는 부분적 또는 완전한 아미노산 및 뉴클레오티드 서열을 교시한다. 여기에 보고된 바와 같은 서열의 이익을 갖는, 당업자는 이제 당업자에 알려져 있는 목적을 위해 개시된 서열의 모든 또는 실질적 부분을 이용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 첨부된 서열목록에 보고된 완전한 서열, 및 위에서 정의된 바와 같은 그들 서열의 실질적 부분을 포함한다.

용어 "상보적"은 서로 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들어, DNA에 관하여, 아데닌은 티민과 상보적이고 시토 신은 구아닌과 상보적이다. 따라서, 본 발명은 또한 첨부된 서열목록에 보고된 바와 같은 완전한 서열, 및 그들 실질적으로 유사한 핵산 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함한다.

용어 "퍼센트 동일성"은, 당업계에 알려져 있는 바와 같이, 서열을 비교함으로써 결정되는, 두 개 이상의 폴리펩티드 서열 또는 두 개 이상의 폴리뉴클레오티드 서열 간의 관계이다. 당업계에서, "동일성"은 또한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열 간의, 경우에 따라서, 그러한 서열의 스트링 간의 매치에 의해 결정되는, 서열 관련성의 정도를 의미한다. "동일성" 및 "유사성"은 1.) 문헌 [Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., Ed.) Oxford University: NY (1988)]; 2.) 문헌 [Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., Ed.) Academic: NY (1993)]; 3.) 문헌 [Computer Analysis of Sequence Data, Part Ⅰ (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., Eds.) Humana: NJ (1994)]; 4.) 문헌 [Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., Ed.) Academic (1987)]; 및 5.) 문헌 [Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., Eds.) Stockton: NY (1991)]에 기재된 것들을 포함하지만 이들로 제한되지 않는, 공지의 방법에 의해 쉽게 계산될 수 있다. 동일성을 결정하는 방법은 시험되는 서열 간의 최상의 매치를 제공하기 위하여 설계된다. 동일성 및 유사성을 결정하는 방법은 공중에게 이용가능한 컴퓨터 프로그램에 코드화되어 있다. 서열 정렬과 퍼센트 동일성 계산은 레이저진 바이오인포매틱스 컴퓨팅 스위트(LASERGENE bioinformatics computing suite)의 메가라인(Megalign) 프로그램 (DNA스타 (DNASTAR) Inc., 매디슨, WI)을 이용하여 수행될 수 있다. 서열의 다중 정렬은 디폴트 지수 (갭 페널티=10, 갭 길이 페널티=10)를 갖는 클러스탈(Clustal) 정렬방법 (문헌 [Higgins and Sharp, CABIOS, 5: 151-153 (1989)])을 이용하여 수행된다. 클러스탈 방법을 이용하는 쌍 정렬을 위한 디폴트 지수는 KTUPLE 1, 갭 페널티=3, 윈도우=5 및 다이아고날즈 세이브드=5 이다.

적당한 핵산 단편 (본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드)은 여기에 보고된 아미노산 서열에 적어도 약 70% 동일한, 바람직하게는 적어도 약 75% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 80% 동일한 폴리펩티드를 코딩한다. 바람직한 핵산 단편은 여기에 보고된 아미노산 서열에 약 85% 동일한 아미노산 서열을 코딩한다. 보다 바람직한 핵산 단편은 여기에 보고된 아미노산 서열에 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 코딩한다. 여기에 보고된 아미노산 서열에 적어도 약 95% 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 단편이 가장 바람직하다. 적당한 핵산 단편은 위 상동성 뿐만 아니라 변화된 플라스미드 카피 수의 특성을 갖는다.

"유전자"는 코딩 서열에 앞서고 (5' 비코딩 서열) 뒤따르는 (3' 비코딩 서열) 조절 서열을 포함하는 특정 단백질을 발현하는 핵산 단편, 또는 RNA를 가리킨다. "천연 유전자" (또는 "야생형 유전자")는 그 자신의 조절 서열과 함께 자연에서 발견되는 유전자를 말한다. "키메라 유전자"는 자연에서 함께 발견되지 않는 조절 및 코딩 서열을 포함하는, 천연 유전자가 아닌 어느 유전자를 말한다. 따라서, 키메라 유전자는 상이한 출처로부터 유래된 조절 서열과 코딩 서열, 또는 동일한 출처로부터 유래되었지만, 자연에서 발견되는 것과 상이한 방식으로 배열된 조 절 서열과 코딩 서열을 포함할 수 있다. "내생적 유전자"는 유기체의 게놈에서 그의 자연적 위치에 있는 천연 유전자를 말한다. "외래" 유전자는 숙주 유기체에서 정상적으로 발견되지 않지만, 유전자 도입에 의해 숙주 유기체로 도입된 유전자를 말한다. 외래 유전자는 비-천연 유기체로 삽입된 천연 유전자, 또는 키메라 유전자를 포함한다. "형질전환유전자"는 형질전환 과정에 의해 게놈으로 도입된 유전자이다.

"코딩 서열"은 특정 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 말한다. 용어 "아미노산"은 단백질 또는 폴리펩티드의 기본적 화학 구조 단위를 말한다. 아미노산은 참조에 의해 여기에 도입되는, 문헌 ([Nucleic Acids Research 13: 3021-3030 (1985)] 및 [Biochemical Journal 219 (2): 345-373 (1984)])에 기재된 IUPAC-IYUB 표준에 부합하게, 아미노산에 대한 1-문자 코드 또는 3-문자 코드에 의해 확인된다. 특정 단백질에 대해, DNA 코딩 부위 내의 점 치환 돌연변이와 생성된 아미노산 변화는 아래 표시법 중 하나를 이용하여, 표준 DNA 및/또는 아미노산 서열 (즉, pBHR1의 것)을 참조하여 특정된다. 예를 들어, 복제 제어 부위의 뉴클레오티드 서열에서의 돌연변이를 기술하기 위하여, 돌연변이가 존재하는 특정 염기 위치에 대한 언급과 함께, 야생형 염기 위치에 있는 뉴클레오티드가 먼저, 이어서 언급된 돌연변이에 존재하는 특정 뉴클레오티드 변형이 제시된다. 이 표시법의 일례는 염기쌍 위치 2490에서 야생형 뉴클레오티드가 구아닌이고 그 위치에서 돌연변이체 뉴클레오티드가 아데노신인 경우, "뉴클레오티드 2490에서 G에서 A" 이다. 반대로, Rep 단백질의 코딩 서열의 아미노산 서열에서의 돌연변이를 기술하기 위하여, 3-문 자 약어로 된 야생형 아미노산, 코돈 위치, 및 돌연변이체 아미노산에 대한 3-문자 약어가 제공된다. 이 표시법의 일례는 Rep 단백질의 코돈 100에 있는 야생형 세린의 돌연변이체 단백질에서 류신으로의 돌연변이를 나타내는, "Ser100에서 Leu"이다. 주어진 위치에서 화학적으로 균등한 아미노산의 생산으로 귀결하는 (그러나 코딩되는 단백질의 기능적 성질에 영향을 미치지 않는) 유전자의 변화 가 보편적임이 당업계에 잘 알려져 있다.

"코돈 축퇴"는 코딩되는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 영향을 미치지 않으면서 뉴클레오티드 서열의 변이를 허용하는 유전자 코드에서의 다양성을 가리킨다. 따라서, 본 발명은 서열 5, 7, 9, 11, 14, 16 및 19에 나타낸 바와 같은, Rep 단백질을 코딩하는 아미노산 서열의 모두 또는 실질적 부분을 코딩하는 어느 핵산 단편에 관한 것이다.

당업자는 주어진 아미노산을 특정하기 위한 뉴클레오티드 코돈의 사용에서 특정 숙주 세포에 의해 나타내어지는 "코돈-편향"을 잘 알고 있다. 따라서, 숙주 세포에서 향상된 발현을 위해 유전자를 합성할 때, 그의 코돈 사용 빈도가 숙주 세포의 바람직한 코돈 사용 빈도에 접근하도록 유전자를 설계하는 것이 바람직하다.

"적당한 조절 서열"은 코딩 서열의 상류 (5' 비코딩 서열), 내부, 또는 하류 (3' 비코딩 서열)에 위치하고, 전사, RNA 가공 또는 안정성, 또는 관련 코딩 서열의 번역에 영향을 미치는 뉴클레오티드 서열을 말한다. 조절자 서열은 프로모터, 번역 리더 서열, 폴리아데닐화 인식 서열, RNA 가공 위치, 효과기 결합 위치 및 스템-루프 구조를 포함할 수 있다.

"프로모터"는 코딩 서열이나 기능적 RNA의 발현을 제어할 수 있는 DNA 서열을 말한다. 일반적으로, 코딩 서열은 프로모터 서열에 대해 3'에 위치한다. 프로모터는 그들 전체로 천연 유전자로부터 유래되거나, 자연에서 발견되는 상이한 프로모터로부터 유래된 상이한 요소로 구성되거나, 심지어 합성 DNA 조각을 포함할 수 있다. 상이한 프로모터가 상이한 조직이나 세포 타입에서, 또는 발생의 상이한 단계에서, 또는 상이한 환경적 또는 생리적 조건에 반응하여, 유전자의 발현을 지시할 수 있음이 당업자에 의해 이해된다. 대부분의 세포 타입에서 대부분의 시간에 유전자가 발현되도록 하는 프로모터는 보편적으로 "구성적 프로모터"로 언급된다. 추가로 대부분의 경우 조절 서열의 정확한 경계가 완전히 정의되지 않았으므로, 상이한 길이의 DNA 단편이 동일한 프로모터 활성을 가질 수 있음이 인식된다.

"3' 비코딩 서열"은 코딩 서열의 하류에 위치된 DNA 서열을 말하고 폴리아데닐화 인식 서열 (보통 진핵생물로 한정) 및 mRNA 가공이나 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있는 조절 신호를 코딩하는 기타 서열을 포함한다. 폴리아데닐화 신호는 보통 mRNA 전구체의 3' 말단에 폴리아데닐산 트랙트의 부가에 영향을 미치는 것을 특징으로 한다.

"RNA 전사체"는 DNA 서열의 RNA 중합효소-촉매된 전사로부터 생성되는 산물을 말한다. RNA 전사체가 DNA 서열의 완전한 상보적 카피일 때, 그것은 일차 전사체로 언급되거나 그것은 일차 전사체의 전사-후 가공으로부터 유래된 RNA 서열일 수 있으며 성숙 RNA로 언급된다. "전령 RNA" 또는 "mRNA"는 인트론이 없고 세포에 의해 단백질로 번역될 수 있는 RNA를 말한다. "cDNA"는 mRNA에 상보적이고 그로부 터 유래된 이본쇄 DNA를 말한다. "센스" RNA는 mRNA를 포함하여 세포에 의해 단백질로 번역될 수 있는 RNA 전사체를 말한다. "안티센스 RNA"는 표적 일차 전사체 또는 mRNA의 모두 또는 일부에 상보적이고 표적 유전자의 발현을 차단하는 RNA 전사체를 말한다 (미국특허 제5,107,065호; WO 99/28508). 안티센스 RNA의 상보성은 즉 5' 비코딩 서열, 3' 비코딩 서열, 또는 코딩 서열에 있는 특정 유전자 전사체의 어느 부분과일 수 있다. "기능적 RNA"는 안티센스 RNA, 리보자임 RNA, 또는 번역되지 않지만 세포 과정에 영향을 미치는 기타 RNA를 말한다.

용어 "작동가능하게 연결된"은 하나의 기능이 나머지에 의해 영향을 받도록 하는 단일 핵산 단편 상의 핵산 서열의 결합을 말한다. 예를 들어, 프로모터는 그것이 그 코딩 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있을 (즉, 코딩 서열이 프로모터의 전사 제어 하에 있을) 때 코딩 서열과 작동가능하게 연결된다. 코딩 서열은 센스 또는 안티센스 배향으로 조절 서열과 작동가능하게 연결될 수 있다.

여기에 사용된, 용어 "발현"은 전사와 발명의 핵산 단편으로부터 유래된 센스 (mRNA) 또는 안티센스 RNA의 안정한 축적을 말한다. 발현은 또한 폴리펩티드로의 mRNA의 번역을 말할 수 있다.

"형질전환"은 유전적으로 안정한 유전성으로 귀결하는, 숙주 유기체의 게놈으로의 핵산 단편의 도입을 말한다. 여기에 사용된, 숙주 유기체의 게놈은 염색체 및 염색체 외 유전자 둘 다로 구성된다. 전기천공, 열 쇼크, 접합, 유전자 총 피격(biolistic bombardment) 등을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 미생물 형질전환을 위한 당업자에게 잘 알려져 있는 다양한 방법이 있다. 형질전환된 핵산 단편 을 함유하는 숙주 유기체는 "형질전환(transgenic)", "재조합" 또는 "형질전환된(transformed)" 유기체로 언급된다.

용어 "서열 분석 소프트웨어"는 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 분석을 위해 유용한 어느 컴퓨터 알고리즘 또는 소프트웨어 프로그램을 말한다. "서열 분석 소프트웨어"는 상업적으로 입수가능하거나 독립적으로 개발될 수 있다. 전형적 서열 분석 소프트웨어는 1.) GCG 프로그램 스위트 (위스콘신 팩키지 버전 9.0, 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group) (GCG), 매디슨, WI); 2.) BLASTP, BLASTN, BLASTX (문헌 [Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)]); 3.) DNA스타 (DNA스타, Inc. 매디슨, WI); 및 4.) 스미스-워터만(Smith-Waterman) 알고리즘을 도입한 FASTA 프로그램 (문헌 [W. R. Pearson, Comput. Methods Genome Res., [Proc. Int. Symp.] (1994), Meeting Date 1992, 111-20. Editor(s): Suhai, Sandor. Plenum: New York, NY])을 포함하지만, 이들로 제한되지 않을 것이다. 본 출원의 본문 내에서, 서열 분석 소프트웨어가 분석을 위해 사용되는 경우, 다르게 특정되지 않으면, 분석 결과는 언급된 프로그램의 "디폴트 값"에 기초함이 이해될 것이다. 여기에 사용된 "디폴트 값"은 처음 개시될 때 원래 소프트웨어를 로드한 소프트웨어 제작자에 의한 어느 셋트의 값 또는 지수 셋트를 의미할 것이다.

여기에 사용된 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 당업계에 잘 알려져 있고 문헌 [Sambrook et al.] (상기); 문헌 [Silhavy, T. J., Bennan, M. L. and Enquist, L. W., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1984)]; 및 문헌 [Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, published by Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987)]에 의해 기술되어 있다.

복제 제어 부위의 돌연변이유발

본 발명은 그것이 존재하는 플라스미드에 변화된 플라스미드 카피 수를 운반하도록 돌연변이된 대략 1300 bp의 pBHR1 (pBBR1 플라스미드 훼밀리로부터 유래된 플라스미드)을 포함하는 복제 제어 부위를 제공한다. 발명의 복제 제어 부위는 리포터 제작물을 포함하는 pBHR1으로부터 유래된 플라스미드 (즉, pDCQ318)의 돌연변이유발과 스크리닝을 위한 돌연변이유발된 플라스미드의 적당한 숙주 세포로의 도입 후 단리되었다. 비록 스크리닝이 비-돌연변이유발된 친 플라스미드에 대해 증가된 플라스미드 카피 수를 운반하는 그들 플라스미드와 복제 제어 부위를 동정하기 위해 수행되었을지라도, 이것은 여기에서 발명에 대한 제한으로 해석되어서는 안된다. 구체적으로, 증가 또는 감소된 플라스미드 카피 수를 운반하는 플라스미드 복제 제어 부위가 하기하는 바와 같이, 생성되고 동정될 수 있다.

1.) 오류-유발 PCR (문헌 ([Leung et al., Techniques, 1: 11-15 (1989)]; [Zhou et al., Nucleic Acids Res., 19: 6052-6052 (1991)]; [Spee et al., Nucleic Acids Res., 21: 777-778 (1993)]; [Melnikov et al., Nucleic Acids Research, 27 (4): 1056-1062 (February 15, 1999)])); 2.) 부위 특이적 돌연변이유발 (문헌 [Coombs et al., Proteins, 259-311, 1 plate. Ed.: Angeletti, Ruth Hogue. Academic: San Diego, CA (1998)]); 3.) 생체 내 돌연변이유발; 및 4.) "유전자 셔플링" (참조에 의해 이로써 도입되는, 미국특허 제5,605,793호; 미국특허 제5,811,238호; 미국특허 제5,830,721호; 및 미국특허 제5,837,458호)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 변화된 활성을 갖는 돌연변이된 산물을 생성하기 위하여 야생형 뉴클레오티드 서열을 돌연변이시키기 위한 다양한 방법이 알려져 있다.

오류-유발 PCR은 정해진 뉴클레오티드 서열 내에서 돌연변이를 생성시키기 위해 특히 바람직한 방법이다. 오류-유발 PCR의 주요 장점은 이 방법에 의해 도입된 모든 돌연변이가 복제 제어 부위 내에 있고, 어느 변화도 PCR 조건을 변화시킴으로써 쉽게 제어될 수 있다는 것이다. 대안으로, 생체 내 돌연변이유발이 이. 콜라이 XL1-레드 균주 또는 에피큐리언® 콜라이(Epicurean® coli) XL1-레드 돌연변이 균주 (스트라타진(Stratagene), 라 졸라, CA; 문헌 [Greener and Callahan, Strategies, 7: 32-34 (1994)])와 같은 상업적으로 입수가능한 재료를 이용하여 사용될 수 있다. 이 후자 균주는 야생형의 것 보다 5000-배 높은 돌연변이를 일으키는, 세 일차적 DNA 수복 경로 (즉, mutS, mutD, 및 mutT)가 결핍되어 있다. 생체 내 돌연변이유발은 결찰 효율에 의존하지 않는다 (오류-유발 PCR과 같이); 그러나, 돌연변이는 벡터의 어느 부위에서도 일어날 수 있고 돌연변이 비율은 일반적으로 훨씬 더 낮다.

대안으로, 플라스미드 카피 수가 변화된 돌연변이체 복제 제어 부위를 "유전자 셔플링"의 방법을 이용하여 제작하는 것이 착상된다. 유전자 셔플링 방법은 그의 용이한 실행, 및 높은 돌연변이유발율 및 스크리닝의 용이성으로 인해 특히 매력적이다. 유전자 셔플링의 과정은 둘 다 관심있는 서열에 유사한 (또는 상이한) DNA 부위의 부가적인 집단의 존재 하에 특정 크기의 단편으로의 관심있는 뉴클레오 티드 서열 (예를 들어, 유전자)의 제한 엔도뉴클레아제 절단을 포함한다. 이 풀의 단편은 그런 다음 변성되고 재어닐링되어 돌연변이된 서열을 창제할 것이다. 그런 다음 돌연변이된 서열이 변화된 활성에 대해 스크리닝된다.

복제 제어 부위를 코딩하는 본 발명의 본 미생물 서열은 이 방법에 의해 돌연변이되고 변화된 활성에 대해 스크리닝될 수 있다. 서열은 이본쇄여야 하고 약 50 bp 내지 약 10 kB 범위의 다양한 길이의 것일 수 있다. 서열은 당업계에 잘 알려져 있는 (상기 문헌 [Sambrook et al.]) 제한 엔도뉴클레아제를 이용하여, 약 10 bp 내지 약 1000 bp 범위의 단편으로 무작위로 분해될 수 있다. 본 미생물 서열에 부가하여, 미생물 서열의 모두 또는 일부에 혼성화가능한 단편의 집단이 첨가될 수 있다. 유사하게, 본 서열에 혼성화할 수 없는 단편의 집단 또한 첨가될 수 있다. 전형적으로, 이들 부가적인 단편 집단은 총 핵산에 비해 중량으로 약 10 내지 약 20-배 과량으로 첨가된다. 일반적으로, 이 과정이 뒤따르면, 혼합물 중 상이한 특정 핵산 단편의 수는 약 100 내지 약 1000개일 것이다. 무작위 핵산 단편의 혼합된 집단은 변성화되어 일본쇄 핵산 단편을 형성한 후 재어닐링된다. 다른 일본쇄 핵산 단편과 상동적인 부위를 갖는 그들 일본쇄 핵산 단편만이 재어닐링할 것이다. 무작위 핵산 단편은 가열에 의해 변성화될 수 있다. 당업자는 이본쇄 핵산을 완전히 변성하는데 필요한 조건을 결정할 수 있다. 일 태양에서, 온도는 약 80 ℃ 내지 약 100 ℃이다. 핵산 단편은 냉각에 의해 재어닐링될 수 있다. 또 하나의 태양에서, 온도는 약 20 ℃ 내지 약 75 ℃이다. 재생은 폴리에틸렌 글리콜 ("PEG")이나 염의 첨가에 의해 가속화될 수 있다. 적당한 염 농도는 0 mM 내지 약 200 mM 범위에 있을 수 있다. 어닐링된 핵산 단편은 그런 다음 핵산 중합효소와 dNTP들 (즉, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP)의 존재 하에 인큐베이션된다. 핵산 중합효소는 클레나우(Klenow) 단편, Taq 중합효소, 또는 당업계에 알려진 어느 다른 DNA 중합효소일 수 있다. 중합효소는 어닐링 전, 어닐링과 동시에, 또는 어닐링 후 무작위 핵산 단편에 첨가될 수 있다. 변성, 재생 및 중합효소 존재 하 인큐베이션의 주기는 원하는 횟수를 위해 반복된다. 전형적으로, 주기는 약 2 내지 약 50 회 반복되고, 보다 바람직하게는 순서는 약 10 내지 약 40 회 반복된다. 생성된 핵산은 약 50 bp 내지 약 100 kB 범위의 더 큰 이본쇄 폴리뉴클레오티드이고 표준 클로닝 및 발현 프로토콜 (상기 문헌 [Sambrook et al.])에 의해 변화된 활성에 대해 스크리닝될 수 있다.

기타 주지의 돌연변이유발 처리는 하이드록실아민으로의 시험관 내 처리(예를 들어, 문헌 [G. O. Humpherys et al., Molec. Gen. Genet., 145: 101-108 (1976)]), 조사(radiation), 및 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘 (NTG) 및 아질산과 같은 보통의 돌연변이유발 처리를 위한 사용되는 돌연변이원으로의 플라스미드를 갖는 미생물의 처리를 포함한다. 예를 들어, DNA는 조사나 화학적 돌연변이원과 같은 다양한 물질에 노출된 후 적절한 숙주로 형질전환되고 목적하는 표현형에 대해 스크리닝될 수 있다. 조사를 통해 돌연변이를 창제할 때 자외선 (UV)이나 이온성 조사가 사용될 수 있다. 유전적 돌연변이를 위해 적당한 단 파장 UV 파장은 200 ㎚ 내지 300 ㎚ 범위에 속할 것이고, 254 nm가 바람직하다. 이 파장에 있는 UV 조사는 주로 구아닌 및 시토신으로부터 아데닌 및 티민으로의 핵산 서열 내의 변화를 유발한다. 반대로, 300 ㎚ 내지 400 ㎚ 범위에 있는 광을 이용하는 장 파장 UV 돌연변이 또한 가능하지만 일반적으로 DNA와 상호작용하는 다양한 활성화제 (예를 들어, 소랄렌 염료)와 결합하여 사용되지 않으면 단 파장 UV 광 만큼 효과적이지 않다.

돌연변이유발 과정을 위해 보편적으로 사용되는 화학물질은 비복제 DNA에 영향을 미치는 화학물질 (예를 들어, HNO₂ 및 NH₂OH), 및 복제 DNA에 영향을 미치는 물질 (예를 들어, 프레임쉬프트 돌연변이를 유발하는 것으로 유명한, 아크리딘 염료)을 포함한다. 조사 또는 화학물질을 이용하여 돌연변이체를 창제하는 구체적인 방법은 당업계에 잘 기록되어 있다. 예를 들어, 참조에 의해 여기에 도입되는, 문헌 ([Thomas D. Brock in Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, 2^nd ed. (1989) Sinauer Associates: Sunderland, MA], 또는 [Deshpande, Mukund V., Appl. Biochem. Biotechnol., 36: 227 (1992)])을 참조하라.

플라스미드 카피 수가 변화된 플라스미드의 동정

돌연변이유발이 일어난 후, 플라스미드 카피 수가 변화된 돌연변이체가 1.) 돌연변이체 플라스미드 상에 존재하는 리포터 유전자(들)의 발현 수준의 조사; 2) 아가로스 젤 상에서 DNA 농도 변화의 측정; 3.) 실시간 PCR; 및 4.) 노던 블랏 분석을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 다양한 방법에 의해 선별될 수 있다. 대 집단의 돌연변이체를 신속하게 측정하기 위한 고 처리율 스크리능과 결합하여 이들 선별방법 중 어느 것을 이용하는 장점이 당업자에게 잘 알려져 있고 구체적인 방법 이 잘 기록되어 있다.

변화된 플라스미드 카피 수에 대한 예비적 스크리능은, 돌연변이체 복제 제어 부위가 리포터 유전자(들)를 포함하는 플라스미드 내에 존재하고 플라스미드가 특정 숙주 내에서 발현될 때, 용이하다. 따라서, 돌연변이유발된 복제 제어 부위를 함유하는 세포가 리포터의 과잉-발현 또는 하향-발현을 검출하는 (가시적 수단 또는 기타 기술에 의해 직접 또는 간접적으로) 능력에 기초하여 선별된다. 예를 들어, 리포터 단백질은 단독으로 또는 다른 단백질과의 융합물로서 발현될 수 있다. 또한, 리포터 단백질은 예를 들어 1.) 그의 효소적 활성 (예를 들어, β-갈락토시다제는 기질 X-gal [5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토피라노사이드]을 착색 산물로 전환시킬 수 있다; 루시페라제는 루시페린을 광-발산 산물로 전환시킬 수 있다); 또는 2.) 그의 광-생성 또는 변형 특성 (예를 들어, 애쿼리아 빅토리아(Aequorea victoria)의 녹색 형광 단백질은 청색 광으로 비춰질 때 형광을 나타낸다)에 의해, 검출될 수 있다. 본 출원에서, β-카로틴이, 그것이 그의 흡수 특성에 기초하여 정량 뿐 아니라 직접적 가시화를 위해 적당하므로, 리포터 분자로 사용되었다. 이 분자는 플라스미드 pDCQ318 및 그의 유도체에 존재하는 crtEYIB 유전자의 발현의 결과 합성되었다. 이들 수단을 이용하여, 리포터의 과잉-발현이 복제 제어 부위가 야생형 복제 제어 부위에 대해 증가된 플라스미드 카피 수의 표현형을 운반하고 있는, 돌연변이유발된 복제 제어 부위를 운반하는 플라스미드의 지표였다.

더 많은 정량 수단이 변화된 플라스미드 카피 수를 검출하기 위해 원해지는 경우, 세포에서 플라스미드 DNA를 정량하는 것이 유용하다. 하나의 적당한 방법은 실시간 PCR의 사용이다 (실시간 PCR 적용의 일반적인 재검토를 위해, 문헌 [Ginzinger, D. J., Experimental Hematology, 30: 503-512 (2002)]를 참조하라). 실시간 PCR은 형광 리포터의 검출과 정량에 기초한다. 이 신호는 반응 중 PCR 산물의 양에 직접적으로 비례하여 증가한다. 각 주기에서 형광 발산의 양을 기록함으로써, PCR 산물의 양에서 첫번째 유의한 증가가 표적 주형의 초기 양과 상호관련된 대수 기 동안 PCR 반응을 모니터링하는 것이 가능하다. 앰플리콘의 정량적 검출을 위한 두 일반적인 방법이 있다: (1) 형광 프로브의 사용; 또는 (2) DNA-결합제 (예를 들어, SYBR-그린 Ⅰ 또는 에티디움 브로마이드)의 사용. 상대적 유전자 발현 비교를 위해, 내부 참조 (예를 들어, 염색체에 의해 코딩되는 16S rRNA 유전자)로서 내생적 대조를 사용하여, 각 실시간 PCR 반응에 첨가되는 총 DNA의 양에서의 차이에 대해 정규화하는 것을 허용하는 것이 필요하다. 실시간 PCR을 위한 구체적인 방법은 당업계에 잘 문서화되어 있다. 예를 들어, 문헌 [the Real Time PCR Special Issue (Methods, 25 (4): 383-481 (2001)]을 참조하라.

실시간 PCR 반응에 이어서, 기록된 형광 강도가 1.) 절대적 표준 방법 (시험관 내 번역된 RNA (cRNA)와 같은 기지 량의 표준이 사용되는); 2.) 상대적 표준 방법 (기지 량의 표준 핵산이 각 런의 어세이 설계에 포함되는); 또는 3.) 유전자 발현의 상대적 정량을 위한 비교 C_T 방법 (ΔΔC_T) (표적 서열의 상대 량이 선택된 참조 값 중 어느 것과 비교되고 결과가 참조 값에 상대적으로 주어지는)의 사용에 의 해 주형의 양을 정량하는데 사용된다.

비교 C_T 방법은 먼저 ΔC_T = C_T (표적) - C_T (정규화제)인, 표적과 정규화제의 C_T 값 사이의 차이 (ΔC_T)를 결정하는 것을 요구한다. 이 값은 정량되는 각각의 샘플에 대해 계산되며 한 샘플은 각 비교가 행해지는 참조로서 선택되어야만 한다. 비교 ΔΔC_T 계산은 각 샘플의 ΔC_T와 기준선의 ΔC_T 사이의 차이를 발견한 후, 이들 값을 식 2^-ΔΔCT에 따라 절대 값으로 변환하는 것을 포함한다.

따라서

c) 돌연변이체 플라스미드를 적당한 숙주 세포로 형질전환시키고;

e) (a)의 플라스미드에 비해 플라스미드 카피 수가 변화된 적어도 하나의 (c)의 플라스미드를 선별하고;

f) (d)의 플라스미드로부터 돌연변이체 복제 제어 부위를 단리하는 것

을 포함하는, 변화된 플라스미드 카피 수를 운반하는 플라스미드 복제 제어 부위의 생성 및 단리 방법을 제공하는 것이 발명의 일 측면이다.

플라스미드 카피 수가 예를 들어 리포터 유전자의 발현에 기초하여 플라스미 드 카피 수를 간접적으로 정량하기 위한 리포터 제작물의 사용, 아가로스 젤 상에서 DNA 농도 변화의 측정, 실시간 PCR 및 노던 블랏 분석의 사용에 의해서와 같은, 다양한 수단에 의해 결정될 수 있는 것이 예상된다.

플라스미드 카피 수가 증가된 플라스미드

본 발명의 복제 제어 부위는 돌연변이유발되고, 숙주 세포로 도입되고 숙주에서 증가된 카피 수로 복제하는 플라스미드에 대해 스크리닝되었다 (리포터 제작물의 발현 수준에 따라). 그런 다음 목적하는 플라스미드를 재-단리하고 각각의 복제 제어 부위를 서열결정하였다. 각각의 돌연변이체 플라스미드 복제 제어 부위(서열 6, 8, 10, 12, 13, 15, 17, 18, 20 및 21)가 야생형 pBHR1 복제 제어 부위 (서열 1의 뉴클레오티드 2478-3765)와 비교될 때, 아래 돌연변이가 관찰되었다:

a) 뉴클레오티드 2490에서 G에서 A로의 돌연변이;

b) 뉴클레오티드 2496에서 C에서 T로의 돌연변이;

c) 뉴클레오티드 2579에서 T에서 C로의 돌연변이;

d) 뉴클레오티드 2633에서 C의 결실에 의한 돌연변이;

e) 뉴클레오티드 2634에서 C의 결실에 의한 돌연변이;

f) 뉴클레오티드 2663에서 T의 C로의 돌연변이;

g) 뉴클레오티드 2771에서 A의 G로의 돌연변이;

h) 뉴클레오티드 2805에서 T의 C로의 돌연변이;

i) 뉴클레오티드 2838에서 C의 A로의 돌연변이;

j) 뉴클레오티드 2914에서 T의 C로의 돌연변이;

k) 뉴클레오티드 2935에서 T의 C로의 돌연변이;

l) 뉴클레오티드 3003에서 C의 T로의 돌연변이;

m) 뉴클레오티드 3165에서 G의 A로의 치환을 위한 돌연변이;

n) 뉴클레오티드 3262에서 T의 G로의 돌연변이;

o) 뉴클레오티드 3269에서 C의 T로의 돌연변이;

p) 뉴클레오티드 3344에서 T의 C로의 돌연변이;

q) 뉴클레오티드 3347에서 C의 T로의 돌연변이;

r) 뉴클레오티드 3456에서 G의 A로의 치환을 위한 돌연변이;

s) 뉴클레오티드 3468에서 T의 C로의 치환을 위한 돌연변이;

t) 뉴클레오티드 3570에서 A의 G로의 치환을 위한 돌연변이;

u) 뉴클레오티드 3604에서 T의 C로의 돌연변이;

v) 뉴클레오티드 3641에서 A의 C로의 돌연변이;

w) 뉴클레오티드 3729에서 A의 G로의 돌연변이;

x) 뉴클레오티드 3739에서 T의 A로의 돌연변이; 및

y) 뉴클레오티드 3747에서 T의 C로의 돌연변이.

이들 돌연변이는 돌연변이체 복제 제어 부위가 존재한 플라스미드에 증가된 플라스미드 카피 수를 운반하는 효과를 가졌다. 하나의 다른 돌연변이 (즉, 뉴클레오티드 3030에서 C의 삽입에 의한 돌연변이)가 야생형 pBHR1 복제 제어 부위에 관하여 각각의 돌연변이체 플라스미드 복제 제어 부위에 존재하였다; 그러나, 이 특정 돌연변이는 플라스미드 카피 수에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.

돌연변이체 복제 유전자가 존재하는 플라스미드에 증가된 플라스미드 카피 수를 운반할 대표적 돌연변이체 rep 유전자 (서열 3)는 임의로

a) 뉴클레오티드 117에서 G의 A로의 치환을 위한 돌연변이 (서열 1의 위치 3165에 해당);

b) 뉴클레오티드 214에서 T의 G로의 돌연변이 (서열 1의 위치 3262에 해당);

c) 뉴클레오티드 221에서 C의 T로의 돌연변이 (서열 1의 위치 3269에 해당);

d) 뉴클레오티드 296에서 T의 C로의 돌연변이 (서열 1의 위치 3344에 해당);

e) 뉴클레오티드 299에서 C의 T로의 돌연변이 (서열 1의 위치 3347에 해당);

f) 뉴클레오티드 408에서 G의 A로의 치환을 위한 돌연변이 (서열 1의 위치 3456에 해당);

g) 뉴클레오티드 420에서 T의 C로의 치환을 위한 돌연변이 (서열 1의 위치 3468에 해당);

h) 뉴클레오티드 522에서 A의 G로의 치환을 위한 돌연변이 (서열 1의 위치 3570에 해당);

i) 뉴클레오티드 556에서 T의 C로의 돌연변이 (서열 1의 위치 3604에 해당); 및

j) 뉴클레오티드 593에서 A의 C로의 돌연변이 (서열 1의 위치 3641에 해당)

로 구성된 그룹으로부터 독립적으로 선택되는 적어도 하나의 점 돌연변이를 함유할 수 있다.

이 특정 복제 제어 부위에서 동일하거나 다른 돌연변이를 갖는 다른 서열이 변화된 플라스미드 카피 수의 표현형을 생성할 것이 착상된다. 예를 들어, 본 서열에 높은 정도의 상동성을 갖고 적절한 돌연변이를 갖는 서열 또한 증가된 플라스미드 카피 수를 운반할 것으로 예상될 것이다. 따라서 1.) 플라스미드에 변화된 플라스미드 카피 수를 운반하고; 2.) 아래 조건, 0.1×SSC, 0.1% SDS, 65 ℃ 및 2×SSC, 0.1% SDS에 이어서 0.1×SSC, 0.1% SDS에서 세척, 하에서 발명의 돌연변이체 뉴클레오티드 서열에 혼성화하는 돌연변이체 복제 제어 부위를 제공하여, 플라스미드에 변화된 플라스미드 카피 수를 운반하고 발명의 돌연변이체 복제 제어 부위의 뉴클레오티드 서열에 적어도 90% 동일한 돌연변이체 복제 제어 부위를 제공하는 것이 본 발명의 일 측면이다. 본 발명의 또 하나의 측면은 플라스미드에 변화된 플라스미드 카피 수를 운반하고 발명의 돌연변이체 복제 제어 부위의 뉴클레오티드 서열에 적어도 95% 동일한 돌연변이체 복제 제어 부위를 제공하는 것이다. 부가적인 태양은 플라스미드에 변화된 플라스미드 카피 수를 운반하고 발명의 돌연변이체 복제 제어 부위의 뉴클레오티드 서열에 적어도 98% 동일한 돌연변이체 복제 제어 부위를 제공하는 것이다.

미생물에서 재조합 발현

여기에 기재된 돌연변이체 플라스미드는 이종 숙주 세포, 특히 그램-음성 미생물 숙주의 세포에서 다양한 유전자 및 유전자 산물의 생산을 위해 유용할 수 있다.

본 발명의 돌연변이체 복제 제어 부위에 기초하고 외래 단백질의 고-수준 발현을 지시하는 조절 서열을 함유하는 발현 벡터의 제작방법이 당업자에게 잘 알려 져 있다. 전형적으로 벡터나 카세트는 목적 유전자(들)의 전사와 번역을 지시하는 서열과 선별 마커를 함유한다. 적당한 벡터는 전사 개시 제어를 갖는 유전자의 5' 부위와 전사 종결을 제어하는 DNA 단편의 3' 부위를 포함한다. 그러한 제어 부위가 생산 숙주로 선택된 특정 종의 원래의 유전자로부터 유래될 필요가 없음이 이해되어야 할지라도, 양 제어 부위가 형질전환된 숙주 세포에 상동적인 유전자로부터 유래될 때 가장 바람직하다.

목적하는 숙주 세포에서 ORF들의 발현을 주도하는데 유용한 개시 제어 부위 또는 프로모터는 수없이 많고 당업자에게 익숙하다. 예를 들어, 바실러스(Bacillus)에서의 발현을 위해 유용한 amy, apr, npr 프로모터 및 다양한 파지 프로모터 뿐만 아니라 CYC1, HIS3, GAL1, GAL10, ADH1, PGK, PH05, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO, TPI (예를 들어, 사카로마이세스(Saccharomyces)에서의 발현을 위해 유용한); AOX1 (예를 들어, 피치아(Pichia)에서의 발현을 위해 유용한); 및 lac, ara, tet, trp, IP _L , IP _R , T7, tac, 및 trc (예를 들어, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)에서의 발현을 위해 유용한)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 이들 유전자를 주도할 수 있는 사실상 어떠한 프로모터도 본 발명을 위해 적당하다. 부가적으로, 데옥시-자일루로스 포스페이트 신타제 또는 메탄올 데하이드로게나제 오페론 프로모터 (문헌 [Springer et al., FEMS Microbiol Lett, 160: 119-124 (1998)]), 폴리하이드록시알칸산 합성을 위한 프로모터 (문헌 [Foellner et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 40: 284-291 (1993)]), 메틸로트로프에서 천연 플라스미드로부터 동정된 프로모터 (EP 296484), Plac (문헌 [Toyama et al., Microbiology, 143: 595-602 (1997)]; EP 62971), Ptrc (문헌 [Brosius et al., Gene, 27: 161-172 (1984)]), 메틸로모나스에서의 발현을 위해 유용한 nrtA, glnB, moxF, glyoxⅡ, htpG, 및 hps 유전자로부터 단리된 프로모터 (참조에 의해 여기에 도입되는; 미국출원 제10/689200호), 및 항생제 내성과 관련된 프로모터 (예를 들어, 카나마이신 (상기 문헌 [Springer et al.]; 문헌 [Ueda et al. Appl. Environ. Microbiol. 57: 924-926 (1991)]), 테트라사이클린 (미국특허 제4,824,786호), 및 클로람페니콜 내성 유전자 프로모터)가 C₁ 대사자에서의 발현을 위해 적당하다.

발현될 유전자의 상류에 인공적 리보솜 결합 위치 ("RBS")를 포함시키는 것이 RBS가 벡터에 의해 제공되지 않을 때 필요하다. 이것은 단일 프로모터가 제1, 제2, 제3 등의 그룹의 유전자의 발현을 주도하고 있을 때, 발현될 오페론의 제2, 제3 등의 유전자(들)을 위해 빈번하게 요구된다. 특정 숙주 유기체에서 RBS의 바람직한 서열을 결정하는 방법은, 이 합성 위치의 창출을 위한 수단과 같이, 당업자에게 익숙할 것이다.

종결 제어 부위 또한 바람직한 숙주의 원래의 다양한 유전자로부터 유래될 수 있다. 임의로, 종결 위치는 불필요할 수 있다; 그러나, 포함되면 가장 바람직하다.

플라스미드가 유용한 도구가 되기 위하여, 일반적으로 선별 마커를 함유할 것이다. 선별 마커는 당업계에 보편적이고 잘 알려져 있으며 전형적으로 숙주 세 포에 항생제 내성을 운반하는 그들 유전자이다. 본 발명에서 사용하기 위해 적당한 선별 마커는 앰피실린 (Amp) 내성, 카나마이신 (Kan) 내성, 테트라사이클린 내성, 클로람페니콜 내성, 및 스펙티노마이신 내성을 코딩하는 유전자를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 금속 내성, 기질-이용을 코딩하는 그들 유전자, 및 형광 및 생체발광 단백질 (예를 들어, 녹색 형광 단백질, Lux 유전자), 및 lacZ, gfp, cat, galK, inaZ, luc, luxAB, bgaB, nptⅡ, phoA, uidA 및 xylE 또한 유전적 마커로서 적당하다. 기타 적당한 세균 및 효모 마커는 상기 문헌 [Sambrook, J. et al.]에서 발견될 수 있다.

발명의 플라스미드의 한 뜻밖의 측면은 복제 제어 부위가 관용적으로 알려진 플라스미드 (예를 들어, 부적합성 그룹 C, N, P, Q 및 W에 속하는 플라스미드)와 상이하고, 그것이 이들 플라스미드와 부적합성이지 않다는 것이다. 따라서, 이들 플라스미드는 부적합성 그룹 C, N, P, Q 및 W에 속하는 보다 보편적인 플라스미드와 함께 미생물에서 사용될 수 있다. 본 발명의 플라스미드는 모든 그램-음성 세균에서 기능하고 아래 속에서 특히 유용할 것으로 기대된다: 아세토박터(Acetobacter), 아시네토박터(Acinetobacter), 에어로모나스(Aeromonas), 아그로박테리움(Agrobacterium), 알칼리제네스(Alcaligenes), 아나베나(Anabaena), 아조리조비움(Azorizobium), 바토넬라(Bartonella), 보데텔라(Bordetella), 브루셀라(Brucella), 버콜데리아(Burkholderia), 캄필로박터(Campylobacter), 코울로박터(Caulobacter), 크로마티움(Chromatium), 코마모나스(Comamonas), 사이토파가(Cytophaga), 데이노코커스(Deinococcus), 어위니아(Erwinia), 에리쓰로박터 (Erythrobacter), 에스케리키아(Escherichia), 플라보박테리움(Flavobacterium), 하이포마이크로비움(Hyphomicrobium), 크렙시엘라(Klebsiella), 메타노박테리움(Methanobacterium), 메틸박테리움(Methylbacterium), 메틸로바실러스(Methylobacillus), 메틸로박터(Methylobacter), 메틸로박테리움(Methylobacterium), 메틸로코커스(Methylococcus), 메틸로시스티스(Methylocystis), 메틸로마이크로비움(Methylomicrobium), 메틸로모나스(Methylomonas), 메틸로필러스(Methylophilus), 메틸로시너스(Methylosinus), 믹소코커스(Myxococcus), 판토에아(Pantoea), 파라코커스(Paracoccus), 슈도모나스(Pseudomonas), 리조비움(Rhizobium), 로도박터(Rhodobacter), 살모넬라(Salmonella), 쉬겔라(Shigella), 스핑고모나스(Sphingomonas), 비브리오(Vibrio), 아쓰로박터(Arthrobacter), 바실러스(Bacillus), 메타노모나스(Methanomonas), 노카르디아(Nocardia), 로도슈도모나스(Rhodopseudomonas), 잔토박터(Xanthobacter), 브래디리조비움(Bradyrhizobium), 및 브레분디모나스(Brevundimonas).

미생물 숙주로서 C ₁ 대사 세균 및 메틸로모나스 sp. 16a

그들의 유일한 에너지 원으로서 단일 탄소 기질을 이용하는 많은 미생물이 있다. 그러한 미생물은 여기에서 "C₁ 대사자"로 언급된다. 이들 유기체는 유일한 에너지 및 생체질량 원으로 탄소 대 탄소 결합을 결여한 탄소 기질을 이용하는 능력을 특징으로 한다. 이들 탄소 기질은 메탄, 메탄올, 포메이트, 포름알데히드, 포름산, 메틸화된 아민 (예를 들어, 모노-, 디- 및 트리-메틸 아민), 메틸화된 티올, 이산화탄소, 및 어느 탄소-탄소 결합을 결여한 다양한 다른 환원된 탄소 화합물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.

모든 C₁ 대사 미생물은 일반적으로 메틸로트로프로 분류된다. 메틸로트로프는 탄소-탄소 결합을 함유하지 않는 유기 화합물을 산화할 수 있는 어느 유기체로 정의될 수 있다. 그러나, 통성 메틸로트로프, 편성 메틸로트로프, 및 편성 메타노트로프는 메틸로트로프의 모든 다양한 서브셋이다. 구체적으로:

·통성 메틸로트로프는 탄소-탄소 결합을 함유하지 않는 유기 화합물을 산화하는 능력을 갖지만, 또한 에너지 및 생체질량을 위해 당과 복합 탄수화물과 같은 다른 탄소 기질을 사용할 수 있다. 통성 메틸로트로프 세균은 많은 환경에서 발견되지만, 토양, 매립 및 폐기물 처리 위치로부터 가장 보편적으로 단리된다. 많은 통성 메틸로트로프는 프로테오박테리아(Proteobacteria)의 β 및 γ 서브그룹의 구성원이다 (문헌 ([Hanson et al., Microb. Growth C1 Compounds., [Int. Symp.], 7^th (1993), pp 285-302. Murrell, J. Collin and Don P. Kelly, Eds. Intercept: Andover, UK]; [Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 8^th ed., Prentice Hall: UpperSaddle River, NJ (1997)])).

·편성 메틸로트로프는 에너지 생성을 위해 탄소-탄소 결합을 함유하지 않는 유기 화합물의 사용으로 제한된 그들 유기체이다.

·편성 메타노트로프는 메탄을 산화하는 구별되는 능력을 갖는 그들 편성 메 틸로트로프이다.

부가적으로, 단일 탄소 기질을 이용하는 능력은 세균으로 제한되지 않고 효모와 진균으로도 확장된다. 많은 효모 속이 보다 복잡한 물질에 부가하여 에너지 원으로서 단일 탄소 기질을 이용할 수 있다 (즉, 메틸로트로프 효모).

비록 많은 이들 메틸로트로프 유기체가 알려져 있을지라도, 이들 미생물은 거의 물질의 합성을 위한 산업적 과정에 성공적으로 이용되지 못했다. 비록 단일 탄소 기질이 경제적인 에너지 원일지라도, 그들 유전적 기구에 관한 정보의 부족 뿐만 아니라 이들 미생물의 유전자 조작의 어려움은 그들의 사용을 일차적으로 천연 산물의 합성으로 제한하였다.

이들 한계에도 불구하고, 본 발명에 적당한 통성 메틸로트로프 세균은 메틸로필러스(Methylophilus), 메틸로바실러스(Methylobacillus), 메틸로박테리움(Methylobacterium), 하이포마이크로비움(Hyphomicrobium), 잔토박터(Xanthobacter), 바실러스(Bacillus), 파라코커스(Paracoccus), 노카르디아(Nocardia), 아쓰로박터(Arthrobacter), 로도슈도모나스(Rhodopseudomonas), 및 슈도모나스(Pseudomonas): 를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 예시적 메타노트로프는 속 메틸로모나스(Methylomonas), 메틸로박터(Methylobacter), 메틸로코커스(Methylococcus), 메틸로시너스(Methylosinus), 메틸로시스티스(Methylocystis), 메틸로마이크로비움(Methylomicrobium), 및 메타노모나스(Methanomonas)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.

에너지적으로 선호되는 탄소 플럭스 경로를 갖는 고 성장 편성 메타노트로프 인 숙주 유기체가 본 발명에서 특히 관심있다. 일 태양에서, 숙주 유기체는 메틸로모나스 16a (ATCC PTA 2402) (미국특허 제6,689,601호; 참조에 의해 이로써 도입)이다. 다양한 이종 유전자가 이 유기체에서 발현될 수 있음이 입증되어 있다 (WO 02/18617; 이로써 참조에 의해 도입되는, 미국출원 제09/941947호에 대응).

재조합 미생물 숙주에서 플라스미드 발현 산물의 산업적 생산

여기에서의 발명의 플라스미드로부터 발현되는 특정 단백질(들)의 상업적 생산을 원하는 경우, 다양한 배양 방법이 적용될 수 있다. 예를 들어, 재조합 미생물 숙주로부터 발현되는 특정 유전자 산물의 대량 생산이 회분 및 연속 배양 방법 둘 다에 의해 생산될 수 있다.

고전적인 회분 배양 방법은 배지의 조성이 배양 시작 시 설정되고 배양 과정 동안 인공적으로 변화하지 않는 폐쇄 시스템이다. 따라서, 배양 과정의 시작 시 배지는 목적하는 유기체 또는 유기체들로 접종되고 성장 또는 대사 활성이 일어나도록 허용된다 (시스템에 아무 것도 첨가하지 않으면서). 전형적으로, 그러나, "회분" 배양은 탄소 원의 첨가에 관하여 회분식이고 pH와 산소와 같은 인자를 제어하는 시도가 자주 이루어진다. 회분 시스템에서 시스템의 대사물과 생체질량 조성은 배양이 종결되는 시간까지 계속 변화한다. 회분 배양물 내에서 세포는 정지 래그 기를 통해 고 성장 대수 기로 최종적으로 성장속도가 감소되거나 정지되는, 정체 기로 조절된다. 무처리되면, 정체 기에 있는 세포는 결국 사멸할 것이다. 대수 기에 있는 세포는 자주 일부 시스템에서 최종 산물이나 중간체의 생산의 벌크를 담당한다. 정체 또는 대수 기-후 생산이 다른 시스템에서 얻어질 수 있다.

표준 회분 시스템에 대한 변화가 유가(Fed-Batch) 시스템이다. 유가 배양 과정 또한 본 발명에 적당하고 배양이 진행됨에 따라 기질이 증가하여 첨가되는 것을 제외하고는 전형적인 회분 시스템을 포함한다. 유가 시스템은 이화물 억제가 세포의 대사를 저해하는 경향이 있을 때와 배지에 제한된 양의 기질을 갖는 것이 바람직한 경우 유용하다. 유가 시스템에서 실제 기질 농도의 측정은 어렵고 따라서 pH, 용존 산소 및 CO₂와 같은 폐 기체의 분압과 같은 측정가능한 인자의 변화에 기초하여 추정된다. 회분 및 유가 배양 방법은 당업계에 보편적이고 잘 알려져 있다; 예는 문헌 [Brock] (상기) 및 문헌 [Deshpande] (상기)에서 발견될 수 있다.

플라스미드 상에서 발현되는 특정 산물의 상업적 생산은 또한 연속 배양으로 달성될 수 있다. 연속 배양은 한정 배양 배지가 생체반응기로 연속적으로 첨가되고 동량의 조정된 배지가 가공을 위해 동시에 제거되는 개방 시스템이다. 연속 배양은 일반적으로 세포가 일차적으로 대수 기 성장에 있는 일정한 고 액상 밀도로 세포를 유지시킨다. 대안으로, 연속 배양은 탄소와 영양분이 연속적으로 첨가되고 가치있는 산물, 부산물 또는 폐기물이 세포 질량으로부터 연속적으로 제거되는 고정화된 세포로 실행될 수 있다. 세포 고정화는 천연 및/또는 합성 재료로 이루어진 광범위한 고상 지지체를 이용하여 수행될 수 있다.

연속 또는 반-연속 배양은 세포 성장이나 최종 산물 농도에 영향을 미치는 하나의 인자 또는 어느 수의 인자들의 변조를 허용한다. 예를 들어, 하나의 방법은 탄소 원이나 질소 수준과 같은 제한 영양분을 고정된 비율로 유지시키고 모든 다른 지수는 조절되도록 허용할 것이다. 다른 시스템에서, 성장에 영향을 미치는 많은 인자가, 배지 탁도에 의해 측정되는, 세포 농도가 일정하게 유지되면서 연속적으로 변화될 수 있다. 연속 시스템은 정상(steady) 상태 성장 조건을 유지하려고 노력하며 따라서 배지 유출로 인한 세포 유실은 배양물에서 세포 성장 속도에 대해 균형잡혀져야만 한다. 연속 배양 과정을 위한 영양분 및 성장 인자를 변조하는 방법, 및 산물 형성 속도를 최대화하는 기술은 산업 미생물학 분야에 잘 알려져 있고 다양한 방법이 상기 문헌 [Brock]에 의해 상세화되어 있다.

태양의 설명

본 발명의 플라스미드의 구체적 예로서, 플라스미드 카피 수가 증가된 아래 플라스미드가 언급될 수 있다 (각각 아래 실시예에 추가로 설명됨): pDCQ318M1, pDCQ318M2, pDCQ318M3, pDCQ318M4, pDCQ318M5, pDCQ318M7, pDCQ318M8, pDCQ318M14, pDCQ318M32 및 pDCQ318M35. 이들 플라스미드는 복제 제어 부위가 야생형 pBHR1 벡터 (젠뱅크® 등록번호 Y14439)의 서열 1의 뉴클레오티드 2478-3765로 거기에서 정의되는, pBHR1의 야생형 복제 제어 부위에 대해 아래 돌연변이 중 하나 이상을 포함한다:

a) 뉴클레오티드 2490에서 G에서 A로의 돌연변이;

b) 뉴클레오티드 2496에서 C에서 T로의 돌연변이;

c) 뉴클레오티드 2579에서 T에서 C로의 돌연변이;

d) 뉴클레오티드 2633에서 C의 결실에 의한 돌연변이;

e) 뉴클레오티드 2634에서 C의 결실에 의한 돌연변이;

f) 뉴클레오티드 2663에서 T의 C로의 돌연변이;

g) 뉴클레오티드 2771에서 A의 G로의 돌연변이;

h) 뉴클레오티드 2805에서 T의 C로의 돌연변이;

i) 뉴클레오티드 2838에서 C의 A로의 돌연변이;

j) 뉴클레오티드 2914에서 T의 C로의 돌연변이;

k) 뉴클레오티드 2935에서 T의 C로의 돌연변이;

l) 뉴클레오티드 3003에서 C의 T로의 돌연변이;

m) 뉴클레오티드 3165에서 G의 A로의 치환을 위한 돌연변이;

n) 뉴클레오티드 3262에서 T의 G로의 돌연변이;

o) 뉴클레오티드 3269에서 C의 T로의 돌연변이;

p) 뉴클레오티드 3344에서 T의 C로의 돌연변이;

q) 뉴클레오티드 3347에서 C의 T로의 돌연변이;

r) 뉴클레오티드 3456에서 G의 A로의 치환을 위한 돌연변이;

s) 뉴클레오티드 3468에서 T의 C로의 치환을 위한 돌연변이;

t) 뉴클레오티드 3570에서 A의 G로의 치환을 위한 돌연변이;

u) 뉴클레오티드 3604에서 T의 C로의 돌연변이;

v) 뉴클레오티드 3641에서 A의 C로의 돌연변이;

w) 뉴클레오티드 3729에서 A의 G로의 돌연변이;

x) 뉴클레오티드 3739에서 T의 A로의 돌연변이; 및

y) 뉴클레오티드 3747에서 T의 C로의 돌연변이.

참고로, rep 유전자는 서열 1의 뉴클레오티드 3049-3711 사이에서 코딩된다.

여기에 기재된 각각의 플라스미드는 복제 제어 부위 내에 돌연변이를 창출하는 오류-유발 PCR 반응에 따라 단리되었다. 이들 돌연변이체 서열은 그런 다음 pBHR1에 기초하여 리포터 플라스미드의 천연 복제 제어 부위를 대체하는데 사용되었다. 이 리포터 플라스미드는 황색-착색된 카로티노이드 β-카로틴의 합성을 담당하는 효소를 코딩하는, crtEYIB 유전자를 운반하였다. 이 리포터 플라스미드의 사용은 플라스미드 카피 수에서의 변화를 간접적으로 정량하기 위한 수단으로서, 각각의 형질전환체 이. 콜라이 숙주에 의해 생산되는 β-카로틴 양의 용이한 가시적 스크리닝을 허용하였다. β-카로틴을 과잉-생산하는 많은 클론의 동정에 이어서, 잇따른 분석이:

1. 각각의 플라스미드 내의 복제 제어 부위가 오류-유발 PCR에 가해지지 않은 pBHR1의 야생형 복제 제어 부위에 관해 적어도 하나 이상의 돌연변이를 가짐을 확인하였고;

2. 실시간 PCR에 의해, 이들 돌연변이체의 플라스미드 카피 수가 오류-유발 PCR에 가해지지 않은 pBHR1의 야생형 복제 제어 부위를 운반하는 대조 플라스미드의 플라스미드 카피 수에 대해 증가되었음을 확인하였다.

여기에서 동정된 플라스미드는 전체 발현 수준이 플라스미드 카피 수에 따라 변동하므로 특정 숙주 세포 내에서 이종 플라스미드-운반 유전자의 유전자 발현의 수준을 신속하게 최적화하는 수단으로서 유용할 것이다.

일 태양에서, 돌연변이체 복제 제어 부위를 포함하는 본 플라스미드의 플라 스미드 카피 수는 동일한 조건 (즉, 동일한 성장 조건 하에 동일한 숙주) 하에서 어세이될 때 pBBR1의 야생형 복제 제어 부위를 포함하는 플라스미드와 관련된 플라스미드 카피 수에 비해 변화된다. 또 하나의 태양에서, 돌연변이체 복제 제어 부위를 포함하는 본 플라스미드의 플라스미드 카피 수는 pBBR1의 야생형 복제 제어 부위를 포함하는 플라스미드와 관련된 플라스미드 카피 수에 비해 증가된다. 추가 태양에서, 돌연변이체 복제 제어 부위를 포함하는 본 플라스미드의 플라스미드 카피 수는 pBBR1의 야생형 복제 제어 부위를 포함하는 플라스미드와 관련된 플라스미드 카피 수에 비해 적어도 약 2배 증가된다. 다른 추가 태양에서, 돌연변이체 복제 제어 부위를 포함하는 본 플라스미드의 플라스미드 카피 수는 pBBR1의 야생형 복제 제어 부위를 포함하는 플라스미드와 관련된 플라스미드 카피 수에 비해 적어도 약 5배 증가된다.

여기에 기재된 본 연구는 β-카로틴의 생산을 위한 crtEYIB 카로티노이드 클러스터를 이용한다; 단지 상대적 플라스미드 카피 수의 간접 가시적 결정을 위한 편리한 리포터 분자로서. 카로티노이드 화합물의 미생물적 생산에 대해서는 이들 화합물이 화학적으로 제조하기가 매우 어려우므로 일반적인 실용적 유용성이 있다 (문헌 [Nelis and Leenheer, Appl. Bacteriol., 70: 181-191 (1991)]). 자연에서 600개를 넘는 상이한 카로티노이드의 존재에도 불구하고, 산업적으로 단지 소수의 카로티노이드만이 식품 색소, 동물 사료, 약제, 및 화장료를 위해 사용된다. 대부분의 카로티노이드는 강한 색상을 갖고, 천연 색소 또는 착색제로 검토될 수 있다. 더욱이, 많은 카로티노이드는 강력한 항산화 성질을 갖고 따라서 식이에 이들 화합 물의 포함은 건강에 이로운 것으로 생각된다.

미생물 플랫폼에 기초한 카로티노이드 생산을 위한 다양한 방법이 최근에 당업계에 기재되었다 [예를 들어, 리코펜의 생산을 위한 이. 콜라이 및 캔디다 유틸리스(Candia utilis) (문헌 ([Farmer W. R. and J. C. Liao., Biotechnol. Prog., 17: 57-61 (2001)]; [Wang C. et al., Biotechnol Prog., 16: 922-926 (2000)]; [Misawa, N. and H. Shimada., J. Biotechnol., 59: 169-181 (1998)]; [Shimada, H. et al., Appl. Environ. Microbiol., 64: 2676-2680 (1998)])); β-카로틴의 생산을 위한 이. 콜라이, 캔디다 유틸리스 및 파피아 로도지마(Pfaffia rhodozyma) (문헌 ([Albrecht, M. et al., Biotechnol. Lett., 21: 791-795 (1999)]; [Miura, Y. et al., Appl. Environ. Microbiol., 64: 1226-1229 (1998)]); 및 미국특허 제5,691,190호); 제아잔틴의 생산을 위한 이. 콜라이 및 캔디다 유틸리스 (문헌 (상기 [Albrecht, M. et al.]; 상기 [Miura, Y. et al.])); 아스타잔틴의 생산을 위한 이. 콜라이 및 파피아 로도지마 (미국특허 제5,466,599호; 미국특허 제6,015,684호; 미국특허 제5,182,208호; 및 미국특허 제5,972,642호; 미국특허 제5,656,472호, 미국특허 제5,545,816호, 미국특허 제5,530,189호, 미국특허 제5,530,188호, 미국특허 제5,429,939호, 및 미국특허 제6,124,113호도 참조하라)]. 그러나, 카로티노이드를 생산하는 이들 방법은 낮은 수율과 상대적으로 비싼 공급원료에 대한 의존성으로 고생한다. 따라서, 저렴한 공급원료로부터 미생물 숙주에서 높은 수율의 카로티노이드를 생산하는 방법을 알아내는 것이 바람직할 것이다.

최근에, 오돔(Odom) 등은 C₁ 대사 세균 메틸로모나스 sp. 16a가 저급 C₄₀ 카로티노이드 생합성 경로 유전자 (즉, crtM, crtN, crtN2, crtE, crtX, crtY, crtI, crtB, crtZ, crtW, crtO, crtA, crtC, crtD, crtF 및 crtU) 중 하나 이상의 도입에 의해, 다양한 C₄₀ 카로티노이드의 생산을 위해 조작될 수 있음을 입증하였다 (WO 02/18617). 이 유기체는

1. 그것이 탄소 기질로서 메탄올이나 메탄을 효율적으로 이용할 수 있고;

2. 그것이 포름알데히드로부터의 3-탄소 단위로의 탄소의 도입을 위한 다중 경로를 함유하는 점에서 그것은 대사적으로 다재다능하며;

3. 그것은 세균 접합을 통해 에스케리키아 콜라이와 같은 공여 종과 유전자 교환을 할 수 있고;

4. 유기체는 C₃₀ 색소의 생산을 가능하게 하는 선천성 이소프레노이드 경로를 함유

하므로, 카로티노이드의 산업적 규모 생산을 위해 특히 잘 적합화된다.

이 독특한 미생물 숙주에서의 β-카로틴 생산의 이전의 입증에도 불구하고, 특정 카로티노이드 산물의 고-수준 생산을 위해 적당한 재조합 숙주의 창제를 향한 추가 진보는 천연 숙주 기구와 생합성 경로에 대한 중요한 대사 조작을 요구할 것이다. 예를 들어, β-카로틴 생산의 역가를 실질적으로 증가시키는 것이 필요할 것이다. 본 발명은 플라스미드 카피 수를 증가시킴으로써 특정 숙주에서 증가된 유전자 발현의 장점을 신속하게 조사하기 위한 수단으로서, 메틸로모나스 sp. 16a 와 같은 C₁ 대사 세균의 유전자 조작을 표적으로 하는 노력을 위해 특히 유용할 것이다.

본 발명은 아래 실시예에서 추가로 정의된다. 이들 실시예는, 본 발명의 바람직한 태양을 가리키면서, 단지 설명을 위하여 제공된다. 위 논의 및 이들 실시예로부터, 당업자는 본 발명의 필수적 특징을 확인할 수 있고, 그의 정신과 범위를 벗어나지 않으면서, 발명의 다양한 변화와 변형을 만들어 그를 다양한 사용과 조건에 적합화할 수 있다.

일반적 방법

실시예에 사용된 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 당업계에 잘 알려져 있고 문헌 [Sambrook et al.] (상기); 문헌 [Silhavy et al.] (상기); 및 문헌 [Ausubel et al.] (상기)에 의해 기재되어 있다.

세균 배양물의 유지와 성장을 위해 적당한 재료와 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 아래 실시예에서 사용하기 위해 적당한 기술은 문헌 ([Manual of Methods for General Bacteriology (Phillipp Gerhardt, R. G. E. Murray, Ralph N. Costilow, Eugene W. Nester, Willis A. Wood, Noel R. Krieg and G. Briggs Philips, Eds), American Society for Microbiology: Washington, D. C. (1994)]; 또는 [Brock] (상기))에 나타낸 바와 같이 발견될 수 있다.

서열은 벡터와 삽입체-특이적 프라이머의 결합을 이용하는 염료 종결자 기술 (미국특허 제5,366,860호; EP 272,007)을 이용하여 ABI 자동 서열결정기 상에서 생성하였다. 서열 편집과 조립을 서퀀서 프로그램 (진 코즈(Gene Codes) Corp., 앤 하버, MI)에서 수행하였다. 야생형 서열과의 돌연변이체 서열의 정렬을 벡터NTI 스위트 6.0 (인포맥스(InforMax), Inc., 베테스다, MD)에 있는 얼라인X(AlignX) 프로그램을 이용하여 수행하였다.

제한효소 분해, 인산화, 결찰, 및 형질전환을 상기 문헌 [Sambrook, J. et al.]에 기재된 바와 같이 행하였다. 제한효소를 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs) (보스톤, MA), 집코/BRL(GIBCO/BRL) (게이스버그, MD), 또는 프로메가(Promega) (매디슨, WI)로부터 수득하였다. Taq 중합효소를 퍼킨 엘머(Perkin Elmer) (브랜치버그, NJ)로부터 수득하였다. 성장 배지를 집코/BRL (게이스버그, MD)로부터 수득하였다.

약어의 의미는 아래와 같다: "sec"은 초(들)를 의미하고, "min"은 분(들)을 의미하며, "h"는 시간(들)을 의미하고, "d"는 일(들)을 의미하며, "㎕"는 마이크로리터(들)를 의미하고, "㎖"는 밀리리터(들)를 의미하며, "ℓ"는 리터(들)를 의미하고, "μM"은 마이크로몰라를 의미하며, "mM"은 밀리몰라를 의미하고, "M"은 몰라를 의미하며, "mmol"은 밀리몰(들)을 의미하고, "μmole"은 마이크로몰(들)을 의미하며, "g"은 그램(들)을 의미하고, "㎍"은 마이크로그램(들)을 의미하며, "ng"은 나노그램(들)을 의미하고, "U"는 유닛(들)을 의미하며, "bp"는 염기 쌍(들)을 의미하고, "kB"는 킬로염기(들)를 의미한다.

실시예 1

pBHR1 기초한 리포터 플라스미드의 제작

이 실시예는 리포터 제작물로 사용하기 위한 카르티노이드 합성 유전자 클러스터의 클로닝과 pBHR1 벡터 백본으로의 그의 삽입을 설명한다. 두 플라스미드가 이 연구를 위해 제작되었다: pDCQ301 및 pDCQ318. pDCQ301은 pBHR1 벡터의 EcoRＩ 위치로 클로닝된 crtEYIB 유전자 클러스터를 함유한다. pDCQ318은 pDCQ301로부터의 rep 유전자의 하류 부위의 결실을 함유한다.

판토에아 스테와티 crtEYIB 유전자 클러스터의 증폭

카로티노이드 합성 유전자 crtEYIB는 본 출원에서 돌연변이체 스크리닝을 위해 리포터 분자로 사용된, β-카로틴의 합성을 위한 효소를 코딩한다. 판토에아 스테와티 ATCC #8199 (WO 03/016503)는 천연 유전자 클러스터 crtEXYIBZ를 함유한다. β-카로틴 합성을 위해 요구되는 유전자 (즉, crtE 및 crtYIB)가 PCR에 의해 함께 결합되었다. 구체적으로, crtE 유전자와 crtYIB 유전자는 주형으로 염색체 DNA 및 아래 프라이머를 이용하여 각각 증폭되었다:

* 주의: 각각의 프라이머 내의 밑줄친 부분은 EcoRＩ, MfeＩ 또는 KpnＩ을 위한 제한 위치에 해당한다. KpnＩ 위치는 pDCQ318의 제작 (아래 설명될)을 용이하게 하기 위하여 첨가되었다.

PCR 반응을 dNTP들 (각각 200 μM)을 함유하는 제조자에 의해 공급되는 완충액 중 Pfu DNA 중합효소로 수행하였다. 열순환 반응을 위한 지수는 92 ℃ (5 min)에 이어서, 95 ℃ (30 sec), 55 ℃ (30 sec), 및 72 ℃ (5 min)의 30 주기였다. 반응은 72 ℃에서 10 min 간 1 주기로 완결되었다.

두 PCR 산물을 젤 정제하고 프라이머 pBHRcrt_1F 및 pBHRcrt_2R (서열 22 및 25)을 이용하여 잇따른 PCR 반응에 의해 함께 결합시켰다. 열순환 반응을 위한 지수는 92 ℃ (5 min)에 이어서, 95 ℃ (30 sec), 55 ℃ (30 sec), 및 72 ℃ (8 min)의 20 주기였다. 72 ℃에서 10 min 간의 최종 신장 단계가 반응을 완결시켰다. 최종 4511 bp PCR 산물을 pTrcHis2-Topo 벡터 (인비트로젠(Invitrogen), 칼스바드, CA)로 순방향 배향으로 클로닝하여, 플라스미드 pDCQ300을 생성하였다.

리포터 플라스미드 pDCQ301 및 pDCQ318의 제작

crtEYIB 유전자 클러스터를 함유하는 pDCQ300의 ∼4.5 kb EcoRⅠ 단편을 벡터 pBHR1 (모비텍 GmbH, 괴팅겐, 독일)의 독특한 EcoRⅠ 위치로 결찰시켜, 제작물 pDCQ301을 창제하였다. 이 리포터 플라스미드는 pBHR1의 클로람페니콜 내성 유전자 프로모터의 제어 하에 crtEYIB 유전자를 가졌다 (도 1 참조); rep 유전자를 포함하는 pDCQ301의 2152 bp 서열이 서열 35로 제공된다.

pDCQ318로 명명된 두번째 리포터 플라스미드를 pDCQ301로부터 제작하였다. pDCQ318을 잇따른 오류-유발 PCR 돌연변이유발 반응 (실시예 2 참조)에 사용하기 위해 창제하였다. 이 유도체는 pDCQ301에 대해 rep 유전자의 단축된 3' 연결 부위를 가졌다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 대략 860 bp가 rep 유전자의 3' 연결 부위로부터 제거되었다.

구체적으로는, rep 유전자와 그의 5' 및 3' 연결 부위를 프라이머 301rep_F (서열 26) 및 301rep_R (5'-CGGGGTACCGAATTCTACAGCCGATAGTCTGGAACAGC-3'; 서열 27) 및 주형으로서 pDCQ301을 이용하여 PCR 증폭시켰다. 프라이머 301rep_R의 밑줄친 부분은 조작된 KpnＩ 위치에 해당한다.

PCR 반응에 이어서, 1388 bp PCR 산물을 XhoＩ 및 KpnＩ으로 분해시키고, XhoＩ 및 KpnＩ 분해된 pDCQ301로 결찰시켰다. 이것은 pDCQ318의 창제로 귀결하였다. 따라서, 친 플라스미드 pBHR1 및 pDCQ301에 존재하는 원래의 rep 유전자는 pDCQ318에서 더 짧은 3' 연결 부위를 갖는 것으로 대체되었다.

실시예 2

증가된 카로티노이드 생산을 나타내는 플라스미드 pDCQ318의 돌연변이 유도체의 단리

이 실시예는 어떻게 오류-유발 PCR이 돌연변이를 플라스미드 pDCQ318의 복제 제어 부위로 도입하는데 사용되어, 증가된 β-카로틴 생산을 일으키는지를 설명한다. 구체적으로는, 반응 복제 부위를 먼저 pDCQ318로부터 오류-유발 PCR에 의해 증폭하였다. pDCQ318의 원래 복제 제어 부위가 오류-유발 PCR 반응의 산물로 대체되도록, 생성된 PCR 산물을 pDCQ318로부터 유래된 제한 단편에 결찰하였다. 이. 콜라이에서 증가된 카로티노이드 생산을 일으킨 10개의 돌연변이체 플라스미드가 동정되었다.

오류-유발 PCR에 의한 pDCQ318 돌연변이체 플라스미드 라이브러리의 제작

오류-유발 PCR을 수행하여 천연 rep 유전자 (서열 1에 제공된, pBHR1의 뉴클레오티드 3049-3711에 해당)를 함유한 pDCQ318로부터의 1461 bp 단편을 증폭하였다. 각각의 PCR 반응을 MgCl₂ (250 μM), dNTP들 (각각 200 μM), 프라이머 (pBHR1rep_F [서열 28] 및 301rep_R2 [서열 29]), 및 주형으로서 pDCQ318 DNA (10 ng)을 함유하는 제작자에 의해 공급되는 완충액 (진앰프스(GeneAmps)® 10× PCR 완충액 Ⅱ)에서 AmpliTaq DNA 중합효소 (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems), 포스터 시티, CA)로 수행하였다. 부가적으로, 각 반응물은 50 내지 250 μM MnCl₂를 함유하였다. 반응물을 처음에 95 ℃에서 5 min 간 그런 다음 92 ℃에서 1 min, 55 ℃에서 1 min, 및 72 ℃에서 1 min의 35 주기 동안 퍼킨 엘머 GeneAMP 9600에서 인큐베이션하였다. 마지막 주기에, 샘플을 부가적인 10 min 동안 72 ℃에서 인큐베이션하였다.

증폭된 DNA를 제조자의 지시 (자이모 리서치(Zymo Research), 오렌지, CA)에 따라 DNA 클린 & 컨센트레이터(DNA Clean & Concentrator)™ 키트를 이용하여 정제하였다. 50, 75, 100, 125, 150 및 200 μM MnCl₂를 함유한 반응물로부터의 정제된 PCR 산물을 혼합하고 제한 엔도뉴클레아제 KpnＩ 및 XhoＩ으로 분해하였다. 1,300 bp KpnＩ/XhoＩ 제한 단편을 TBE 완충액 중 1% 아가로스에서의 전기영동 후, 적절한 밴드의 절제 및 자이모클린(Zymoclean) 젤 DNA 회수 키트를 제조자의 지시 (자이모 리서치)에 따라 사용하여 절제된 아가로스로부터의 추출에 의해 정제하였다.

정제된 KpnＩ/XhoＩ 분해된 오류-유발 PCR 산물을 KpnＩ/XhoＩ 분해된 pDCQ318에 결찰시켜 T DNA 리가제 (인비트로젠 코포레이션, 칼스바드, CA)를 16 ℃에서 16 h 동안 표준 방법에 따라 이용하여 야생형 복제 제어 부위를 대체하였다. 결찰된 DNA를 바이오래드 유전자 펄서 Ⅱ (바이오래드 래보라토리즈(BioRad Laboratories), 헤르큘레스, CA)를 표준 방법 (전압 1.8 kV, 용량 25 μF 및 200 오옴)에 따라 이용하여 전기적격(electrocompetent) 이. 콜라이 XL1-블루 MRF' 세포 (스트라타진, 라 졸라, CA)로 전기천공하였다. 형질전환된 세포를 50 ㎍/㎖ 카나마이신을 함유하는 LB 아가 상에 도말하고 30 ℃에서 3-4 일간 인큐베이션하였다.

증가된 β-카로틴 생산을 나타낸 돌연변이체 플라스미드의 동정

LB 아가 플레이트 상의 형질전환체를 30 ℃에서 4 일까지 동안 모니터링하였다. 강력한 황색 색상을 나타낸 세 다스(dozen)의 클론을 β-카로틴 정량을 위해 스트리킹하였다. 각 돌연변이체를 24 웰 배양 블록 (퀴아젠(Qiagen) Inc, 발렌시아, CA)의 두 웰로 접종하였다. 각 웰은 50 ㎍/㎖ 카나마이신을 갖는 2.5 ㎖ LB 배지를 함유하였다. 세포를 3 일간 220 rpm에서 진탕하면서 30 ℃에서 성장시켰다. pDCQ301을 함유하는 XL1-블루 MRF' 세포와 pDCQ318을 함유하는 XL1-블루 MRF' 세포를 대조로 사용하였다.

3 일의 성장 후, 각 이. 콜라이 대조 및 돌연변이체 배양물의 세포 밀도를 OD₆₀₀을 측정함으로써 기록하였다. 세포를 4000 g에서 15 min 간 회전 침전시켰다. 카로티노이드를 실온에서 10 min 간 0.5 ㎖ 테트라하이드로퓨란에서 세포 펠렛으로부터 추출하였다. 생산된 β-카로틴의 상대적 양을 OD₄₅₅를 측정함으로써 기록하고 세포 밀도에 의해 정규화하였다. 각 돌연변이체의 OD₄₅₅/OD₆₀₀ 값을 대조의 것과 비교하였다. 10개의 돌연변이체 (즉, pDCQ318M1, pDCQ318M2, pDCQ318M3, pDCQ318M4, pDCQ318M5, pDCQ318M7, pDCQ318M8, pDCQ318M14, pDCQ318M32 및 pDCQ318M35)에서 생산된 β-카로틴의 상대적 양이 도 2에 나타내어져 있다. 이들 10개의 돌연변이체는 약 2.19 내지 2.72 유닛 범위의 생산으로, 시험된 세 다스의 돌연변이체 중에서 β-카로틴 생산에서 가장 높은 증가를 나타내었다. 오류 막대는 1 표준 편차에 해당한다.

실시예 3

플라스미드 pDCQ318 및 그의 돌연변이 유도체에서 복제 제어 부위의 서열

이 실시예는 β-카로틴을 과잉-생산한 pDCQ318의 10개의 플라스미드 유도체에서 돌연변이체 복제 제어 부위의 서열을 설명한다. 서열 분석은 오류-유발 PCR 돌연변이유발 반응이 pDCQ318에서 rep 유전자 및 그의 연결 서열에 관하여, 각각의 돌연변이체 플라스미드에서 적어도 하나 이상의 돌연변이를 일으켰음을 나타내었다.

돌연변이체 복제 제어 부위의 서열결정

β-카로틴 생산에서 가장 높은 증가를 나타낸 10개의 돌연변이체 (즉, pDCQ318M1, pDCQ318M2, pDCQ318M3, pDCQ318M4, pDCQ318M5, pDCQ318M7, pDCQ318M8, pDCQ318M14, pDCQ318M32 및 pDCQ318M35; 도 2 참조)를 추가 특성분석을 위해 선별하였다. 각각의 돌연변이체를 50 ㎍/㎖ 카나마이신을 갖는 150-㎖ 플라스크 중 10 ㎖ LB 배지로 접종하고 37 ℃에서 17 h 동안 220 rpm에서 배양하였다. 플라스미드 DNA를 퀴아프랩® 스핀 미니프랩 키트(QIAprep® Spin Miniprep Kit) (퀴아젠 Inc, 발렌시아, CA)를 이용하여 1.5 ㎖ 세포로부터 추출하였다.

각 플라스미드의 복제 제어 부위를 301rep_F 프라이머 (서열 26) 및 301rep_R2 프라이머 (서열 29)를 이용하여 서열결정하였다.

서열 분석

KpnＩ 및 XhoＩ 제한 위치 사이의 각각의 조립된 서열의 부분을 벡터NTI 스위트 6.0 (인포맥스, Inc., 베테스다, MD)의 구성원인, 얼라인X를 이용하여 상응하는 pBHR1 서열 (서열 1의 뉴클레오티드 2478-3765)과 정렬하였다. rep 유전자는 서열 1의 뉴클레오티드 3049 내지 3711에 해당한다.

모든 돌연변이 (뉴클레오티드 및 상응하는 아미노산 둘 다)가 표 3에 아래 요약되어 있다; 부가적으로, pDCQ318과 돌연변이체 플라스미드의 차이가 도 3에 요약되어 있다 (비록 pDCQ318 및 각각의 돌연변이 유도체에서 뉴클레오티드 위치 3030에서 시토신의 삽입은 도 3에 나타내어져 있지 않을지라도). 표 3과 도 3 둘 다에서, 돌연변이는 pBHR1에서의 상응하는 염기 쌍 위치를 이용하여 번호매김되어 있다.

pBHR1 (야생형)에 대한, 복제 제어 부위 내에서 생성된 오류-유발 PCR 돌연변이

균주	돌연변이 (뉴클레오티드)	돌연변이 (아미노산)
pBHR1 (서열 1의 뉴클레오티드 2478-3765)	없음	없음
pDCQ318 (친) (서열 4)	3030에서 C 삽입	코딩 부위의 상류
pDCQ318M1 (서열 6)	3030에서 C 삽입 3262에서 T에서 G 3344에서 T에서 C	코딩 부위의 상류 Leu72에서 Val Val99에서 Ala
pDCQ318M2 (서열 8)	3030에서 C 삽입 3347에서 C에서 T	코딩 부위의 상류 Ser100에서 Leu
pDCQ318M3 (서열 10)	뉴클레오티드 2496에서 C에서 T 뉴클레오티드 2634에서 C의 결실 뉴클레오티드 2805에서 T에서 C 3030에서 C 삽입 뉴클레오티드 3269에서 C에서 T 뉴클레오티드 3604에서 T에서 C	코딩 부위의 상류 코딩 부위의 상류 코딩 부위의 상류 코딩 부위의 상류 Thr74에서 Met Trp186에서 Arg
pDCQ318M4 (서열 12)	뉴클레오티드 2663에서 T에서 C 뉴클레오티드 2771에서 A에서 G 뉴클레오티드 3003에서 C에서 T 3030에서 C 삽입	코딩 부위의 상류 코딩 부위의 상류 코딩 부위의 상류 코딩 부위의 상류
pDCQ318M5 (서열 13)	뉴클레오티드 2634에서 C의 결실 3030에서 C 삽입 뉴클레오티드 3165에서 G에서 A 뉴클레오티드 3347에서 C에서 T	코딩 부위의 상류 코딩 부위의 상류 침묵 Ser100에서 Leu
pDCQ318M7 (서열 15)	뉴클레오티드 2633에서 C의 결실 뉴클레오티드 2634에서 C의 결실 3030에서 C 삽입 뉴클레오티드 3347에서 C에서 T 뉴클레오티드 3729에서 A에서 G	코딩 부위의 상류 코딩 부위의 상류 코딩 부위의 상류 Ser100에서 Leu 코딩 부위의 하류
pDCQ318M8 (서열 17)	뉴클레오티드 3003에서 C에서 T 3030에서 C 삽입	코딩 부위의 상류 코딩 부위의 상류
pDCQ318M14 (서열 18)	뉴클레오티드 2914에서 T에서 C 뉴클레오티드 2935에서 T에서 C 3030에서 C 삽입 뉴클레오티드 3347에서 C에서 T 뉴클레오티드 3570에서 A에서 G 뉴클레오티드 3641에서 A에서 C	코딩 부위의 상류 코딩 부위의 상류 코딩 부위의 상류 Ser100에서 Leu 침묵 Asp198에서 Ala

pDCQ318M32 (서열 20)	뉴클레오티드 2490에서 G에서 A 뉴클레오티드 2579에서 T에서 C 뉴클레오티드 2634에서 C의 결실 뉴클레오티드 2838에서 C에서 A 뉴클레오티드 3003에서 C에서 T 3030에서 C 삽입 뉴클레오티드 3456에서 G에서 A 뉴클레오티드 3739에서 T에서 A	코딩 부위의 상류 코딩 부위의 상류 코딩 부위의 상류 코딩 부위의 상류 코딩 부위의 상류 코딩 부위의 상류 침묵 코딩 부위의 하류
pDCQ318M35 (서열 21)	뉴클레오티드 3003에서 C에서 T 3030에서 C 삽입 뉴클레오티드 3165에서 G에서 A 뉴클레오티드 3468에서 T에서 C 뉴클레오티드 3747에서 T에서 C	코딩 부위의 상류 코딩 부위의 상류 침묵 침묵 코딩 부위의 하류

* 굵은 문자로 나타낸 돌연변이는 친 플라스미드, pDCQ318로부터 물려받은 돌연변이이다.

pDCQ318 (서열 4)은 pBHR1과 비교할 때 뉴클레오티드 3030에 단일 염기 쌍 삽입을 가졌다. rep 유전자의 개시 코돈의 19 bp 상류인, 이 C3030 삽입은 pDCQ318의 제작 동안 PCR에 의해 생성되었다. 그러나, pDCQ318로부터의 β-카로틴 합성의 양은 야생형 rep 부위를 함유하는 pDCQ301로부터의 것과 유사하였다 (도 2 참조). 따라서, 이 돌연변이는 pDCQ318M1, pDCQ318M2, pDCQ318M3, pDCQ318M4, pDCQ318M5, pDCQ318M7, pDCQ318M8, pDCQ318M14, pDCQ318M32 및 pDCQ318M35에서 관찰된 증가된 카로티노이드 생산을 담당하지 않았다. 위, 표 3에 나타낸 바와 같이, 모든 pDCQ318 돌연변이체는 pDCQ318로부터 C3030 삽입 돌연변이를 물려받았다.

실시예 4

플라스미드 pDCQ318 및 돌연변이 유도체에서 상대적 카피 수의 결정

이 실시예는 이. 콜라이에서 pDCQ318 및 β-카로틴을 과잉-생산하는 각각의 10개의 돌연변이 유도체의 상대적 플라스미드 카피 수를 결정하기 위한 실시간 PCR의 사용을 설명한다. 실시간 PCR 결과는 돌연변이체 복제 제어 부위를 갖는 돌연변이체 플라스미드의 카피 수가 친 플라스미드 pDCQ318 및 pDCQ301에 비해, 3-7 배 증가하였음을 가리켰다.

구체적으로, 각각의 돌연변이체 플라스미드 (즉, pDCQ318M1, pDCQ318M2, pDCQ318M3, pDCQ318M4, pDCQ318M5, pDCQ318M7, pDCQ318M8, pDCQ318M14, pDCQ318M32 및 pDCQ318M35)를 함유하는 이. 콜라이 균주의 조 용해물 샘플을 카피 수 결정을 위해 제조하였다. 조 용해물을 제조하기 위하여, 각 돌연변이체를 50 ㎍/㎖을 갖는 150-㎖ 플라스크 중 10 ㎖ LB 배지로 접종하고 37 ℃에서 17 h 동안 220 rpm에서 배양하였다. 1 ㎖ 배양물로부터의 각 돌연변이체에 대한 세포 펠렛을 1 ㎖ dH₂0로 재현탁하였다. 대략 0.25 ㎖의 0.1 mm 지르코니아(ZirConia) 실리카 비드 (바이오스펙 프로덕츠(Biospec Products), Inc., 바틀스빌, OK)를 세포 현탁액에 가하고 혼합물을 비드비터(BeadBeater) (바이오스펙 프로덕츠, Inc.)에서 2 min 간 휘저어 세포를 용해시켰다. 조 용해물을 그런 다음 마이크로-원심분리기에서 12,000 g에서 10 min 간 회전시켰다. 각각의 돌연변이체 배양물로부터의 100 ㎕ 상등액의 수적을 99 ℃에서 10 min 간 가열하여 DNase 활성을 불활성화시켰다. 7개의 1:10 연속 희석물을 이어서 각각의 조 DNA 샘플에 대해 제조하였다. DNA를 함유하지 않는 샘플을 또한 음성 대조로 포함시켰다.

PCR 프라이머를 어플라이드 바이오시스템즈 (포스터 시티, CA)로부터의 프라이머 익스프레스 v 2.0 소프트웨어에서 디폴트 셋팅을 이용하여 설계하였다. 순방향 (서열 30) 및 역방향 프라이머 (서열 31)를 표적 플라스미드 DNA 상의 crtE 유전자의 3' 말단에 있는 65 bp 부위를 증폭시키기 위하여 설계하였다. 이. 콜라이 16S rRNA 유전자의 62 bp 부위를 또한 순방향 (서열 32) 및 역방향 프라이머 (서열 33)를 이용하여 대조 DNA로서 증폭하였다.

실시간 PCR을 ABI 7900 서열 검출 시스템 장치 상에서 제조자의 지시에 따라 어플라이드 바이오시스템즈 (ABI) SYBR 그린 표지 방법을 이용하여 수행하였다. 각각의 PCR 반응물 (20 ㎕)을 아래 시약을 이용하여 셋 업하였다: 10 ㎕ ABI 2×SYBR 그린 주 혼합물, 0.2 ㎕의 각각의 순방향 및 역방향 프라이머 (100 μM), 8.6 ㎕ 물 및 1 ㎕의 희석된 DNA 샘플. 사용된 열순환 조건은 아래와 같았다: 95 ℃에서 10 min에 이어서 95 ℃, 15 sec 및 60 ℃, 1 min의 40 주기. 모든 반응을 삼중으로 운전하였다.

플라스미드 카피 수의 상대적 정량을 참조 샘플로서 pDCQ318을 이용하여 계산하였다. 16S rRNA를 사용하여 각 반응물에 첨가된 총 DNA의 양에서의 차이에 대해 각 샘플의 정량을 정규화하였다. 정규화된 양은 ΔCt로 언급된다. 각 pDCQ318 돌연변이체에 대해 정규화된 값을 pDCG318 참조의 정규화된 값과 비교하였다. 이 양은 ΔΔCt로 언급된다. ΔΔCt 값을 그런 다음 식 2^-ΔΔCt를 이용하여 절대 값으로 전환하였다. 이들 값은 pDCQ318 친플라스미드에 비교하여, pDCQ318 돌연변이체 플라스미드의 카피 수에서 배 증가를 가리킨다.

각 돌연변이체 (즉, pDCQ318M1, pDCQ318M2, pDCQ318M3, pDCQ318M4, pDCQ318M5, pDCQ318M7, pDCQ318M8, pDCQ318M14, pDCQ318M32 및 pDCQ318M35)에 대한 플라스미드 카피 수의 상대적 정량의 결과가 1 표준 편차 오류 막대와 함께, 도 4에 나타내어져 있다. 각 샘플에 있는 16S rRNA 유전자 및 표적 유전자의 PCR 효율은 100%에 가까웠다. 이것은 플라스미드 DNA의 상대적 카피 수의 정량을 위한 ΔΔCt 방법을 사용을 검증하였다.

플라스미드 pDCQ318의 카피 수는 pDCQ301의 것에 대해 변하지 않았다. 따라서, pDCQ318에서 뉴클레오티드 3030에서 시토신 염기의 삽입은 플라스미드 카피 수에 영향을 미치지 않는 무작위 돌연변이인 것 같았다. 반대로, 돌연변이체 플라스미드의 카피 수는 친 플라스미드 pDCQ318 및 pDCQ301의 것에 비해 3-7 배 증가하였다. 카피 수에서 관찰된 증가는 거의 오류-유발 PCR 돌연변이유발 반응에 의해 생성된, 표 3 및 도 3에 나타낸 부가적인 돌연변이에 기인하는 것 같았다. pDCQ318로부터 물려받은 C3030 삽입은, 그들이 이. 콜라이에서 발현될 때, 돌연변이체 플라스미드에서 증가된 카피 수의 표현형에 기여하지 않는 것 같았다.

실시예 5

메틸로모나스 sp. 16a에서의 pDCQ318 및 돌연변이체 플라스미드의 분석

아래 실시예는 β-카로틴 합성의 역가를 증가시키기 위하여 메틸로모나스 16a (ATCC PTA 2402) 및 대표적 돌연변이체 플라스미드 (실시예 3으로부터)를 도입하는데 사용된 기술을 설명한다. 메틸로모나스 16a에서 돌연변이체 플라스미드의 상대적 카피 수를 또한 결정하였다.

플라스미드 pDCQ318 및 돌연변이 유도체 pDCQ318M2 (단일 뉴클레오티드 돌연변이 포함)를 삼-친 접합 교배에 의해 메틸로모나스 16a로 도입하였다. pRK2013을 함유하는 이. 콜라이 헬퍼 균주 (ATCC No. 37159)와 플라스미드 (즉, pDCQ318 또는 pDCQ318M2)를 함유하는 이. 콜라이 XL1 블루 MRF' 공여자 균주를 각각 카나마이신 (50 ㎍/㎖)을 함유하는 LB 배지에서 밤새 성장시키고, LB에서 3회 세척하고, 원래 배양 부피의 대략 60-배 농도를 나타내는 부피의 LB에 재현탁하였다.

메틸로모나스 16a 수혜자를 WO 02/18617에 기재된 일반적인 조건을 이용하여 성장시켰다. 간략하게, 이것은 일정하게 진탕하면서 30 ℃에서 적어도 8:1의 기체/액체 비율 (즉, 160 ㎖ 총 부피 중 20 ㎖의 질산염 액체 "BTZ-3" 배지)을 이용하여 혈청으로 막은 휘톤 병 (휘톤 사이언티픽(Wheaton Scientific), 휘톤 IL)에서 메틸로모나스 16a를 성장시키는 것을 포함한다.

메틸로모나스 16A를 위한 질산염 배지

여기에서 "한정 배지" 또는 "BTZ-3" 배지로도 언급되는, 질산염 배지는 아래(표 4 및 5) 표시된 바와 같이 용액 1과 혼합된 다양한 염으로 이루어지거나 특정된 경우 질산염이 15 mM 염화암모늄으로 대체된다. 용액 1은 미량 무기질의 100-배 농축된 저장 용액을 위한 조성물을 제공한다.

용액 1^*

	MW	농도 (mM)	ℓ 당 g
니트릴로아세트산	191.1	66.9	12.8
CuCl₂×2H₂O	170.48	0.15	0.0254
FeCl₂×4H₂O	198.81	1.5	0.3
MnCl₂×4H₂O	197.91	0.5	0.1
CoCl₂×6H₂O	237.9	1.31	0.312
ZnCl₂	136.29	0.73	0.1
H₃BO₃	61.83	0.16	0.01
Na₂MoO₄×2H₂O	241.95	0.04	0.01
NiCl₂×6H₂O	237.7	0.77	0.184

* 900 ㎖의 H₂O에 위 지정된 그램 량을 혼합하고, pH=7로 조정하고, 1 ℓ의 최종 부피로 H₂O를 가하라. 냉장 상태로 유지하라.

질산염 액체 배지 (BTZ-3)^**

	MW	농도 (mM)	ℓ 당 g
NaNO₃	84.99	10	0.85
KH₂PO₄	136.09	3.67	0.5
Na₂SO₄	142.04	3.52	0.5
MgCl₂×6H₂O	203.3	0.98	0.2
CaCl₂×2H₂O	147.02	0.68	0.1
1 M HEPES (pH 7)	238.3 50 ㎖
용액 1	10 ㎖

** 900 ㎖ H₂O에 용해시키고, pH=7로 조정하고, 1 ℓ를 제공하도록 H₂O를 가하라.

아가 플레이트에 대해: 1 ℓ의 배지에 15 g의 아가로스를 가하고, 오토클레이브하고, 50 ℃로 방냉하고, 플레이트를 부어라.

배양을 위한 표준 기체 상은 공기 중 25% 메탄을 함유한다. 이들 조건을 이용하여, 수혜자를 BTZ-3 배지에서 48 h 동안 배양하고, BTZ-3으로 3회 세척하고, 원래 배양물 부피의 150-배 농도를 나타내는 부피의 BTZ-3에 재현탁하였다.

공여자, 헬퍼 및 수혜자 세포 페이스트를 그런 다음 0.5% (w/v) 효모 추출물을 함유하는 BTZ-3 아가 플레이트의 표면 상에, 각각, 1:1:2의 비율로 배합하였다. 플레이트를 25% 메탄에서 30 ℃에서 16-72 시간 동안 유지시켜 접합이 일어나도록 한 후, 세포 페이스트를 모으고 BTZ-3에 재현탁하였다. 희석물을 카나마이신 (50 ㎍/㎖)을 함유하는 BTZ-3 아가 상에 플레이팅하고 1 주까지 동안 25% 메탄에서 30 ℃에서 인큐베이션하였다. 트랜스접합체를 단리를 위해 카나마이신 (50 ㎍/㎖)을 함유하는 BTZ-3 아가 상으로 스트리킹하였다.

카로티노이드 양을 결정하기 위해, 트랜스접합체를 카나마이신 (50 ㎍/㎖)을 함유하는 20 ㎖ BTZ-3에서 배양하고 1 주까지 동안 유일한 탄소 원으로서 25% 메탄에서 30 ℃에서 인큐베이션하였다. 세포 밀도를 OD₆₀₀에 의해 측정하고 β-카로틴 함량을 OD₄₅₅에 의해 측정하였다. β-카로틴의 상대적 양을 OD₄₅₅/OD₆₀₀으로 정량하였다. pDCQ318M2를 함유하는 세포는 대조의 것에 비해 β-카로틴 합성의 대략 40% 증가를 나타내었다.

조 추출물을 또한 다양한 플라스미드를 함유하는 메틸로모나스 16a로부터 실시예 4에 기재된 바와 같이 제조하였다. 추출물을 메틸로모나스 16a에서 돌연변이체 플라스미드의 상대적 카피 수 증가를 결정하기 위하여 실시간 PCR 분석을 위해 사용하였다. 메틸로모나스 16S rRNA 유전자 서열 (서열 34)을 정규화를 위해 사용하였다. 결과는 돌연변이체 플라스미드 pDCQ318M2의 카피 수가 C₁ 대사 숙주 메틸로모나스 16a에서 대조 플라스미드의 것 보다 2배 초과 (2.38배)임을 보여주었다.

SEQUENCE LISTING <110> E.I. du Pont de Nemours and Company, Inc. <120> BROAD HOST RANGE pBBR1-BASED PLASMID MUTANT DERIVATIVES HAVING ALTERED PLASMID COPY NUMBER <130> CL2388 PCT <150> US 60/503,855 <151> 2003-09-17 <160> 36 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 5300 <212> DNA <213> Escherichia coli (GenBank Accession No. Y14439) <220> <221> misc_feature <222> (2478)..(3765) <223> replication control region <220> <221> CDS <222> (3049)..(3711) <223> rep gene <400> 1 ctcgggccgt ctcttgggct tgatcggcct tcttgcgcat ctcacgcgct cctgcggcgg 60 cctgtagggc aggctcatac ccctgccgaa ccgcttttgt cagccggtcg gccacggctt 120 ccggcgtctc aacgcgcttt gagattccca gcttttcggc caatccctgc ggtgcatagg 180 cgcgtggctc gaccgcttgc gggctgatgg tgacgtggcc cactggtggc cgctccaggg 240 cctcgtagaa cgcctgaatg cgcgtgtgac gtgccttgct gccctcgatg ccccgttgca 300 gccctagatc ggccacagcg gccgcaaacg tggtctggtc gcgggtcatc tgcgctttgt 360 tgccgatgaa ctccttggcc gacagcctgc cgtcctgcgt cagcggcacc acgaacgcgg 420 tcatgtgcgg gctggtttcg tcacggtgga 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Escherichia coli (GenBank Accession No. Y14439) <400> 2 Met Ala Thr Gln Ser Arg Glu Ile Gly Ile Gln Ala Lys Asn Lys Pro 1 5 10 15 Gly His Trp Val Gln Thr Glu Arg Lys Ala His Glu Ala Trp Ala Gly 20 25 30 Leu Ile Ala Arg Lys Pro Thr Ala Ala Met Leu Leu His His Leu Val 35 40 45 Ala Gln Met Gly His Gln Asn Ala Val Val Val Ser Gln Lys Thr Leu 50 55 60 Ser Lys Leu Ile Gly Arg Ser Leu Arg Thr Val Gln Tyr Ala Val Lys 65 70 75 80 Asp Leu Val Ala Glu Arg Trp Ile Ser Val Val Lys Leu Asn Gly Pro 85 90 95 Gly Thr Val Ser Ala Tyr Val Val Asn Asp Arg Val Ala Trp Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Asp Gln Leu Arg Leu Ser Val Phe Ser Ala Ala Val Val Val 115 120 125 Asp His Asp Asp Gln Asp Glu Ser Leu Leu Gly His Gly Asp Leu Arg 130 135 140 Arg Ile Pro Thr Leu Tyr Pro Gly Glu Gln Gln Leu Pro Thr Gly Pro 145 150 155 160 Gly Glu Glu Pro Pro Ser Gln Pro Gly Ile Pro Gly Met Glu Pro Asp 165 170 175 Leu Pro Ala Leu Thr Glu Thr Glu Glu Trp Glu Arg Arg Gly Gln Gln 180 185 190 Arg Leu Pro Met Pro Asp Glu Pro Cys Phe 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gcgtaggcgg 540 ttttttaagt cagatgtgaa agccctgggc ttaacctggg aactgcattt gatactgggg 600 aactagagtt gagtagagga gagtggaatt tcaggtgtag cggtgaaatg cgtagagatc 660 tgaaggaaca ccagtggcga aggcggctct ctggactcaa actgacgctg aggtacgaaa 720 gcgtgggtag caaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgtcaacta 780 accgttgggt tcttaaagaa cttagtggtg gagctaacgt attaagttga ccgcctgggg 840 agtacggccg caaggctaaa actcaaatga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc 900 atgtggttta attcgatgca acgcgaagaa ccttacctac ccttgacatc ctcggaactt 960 gtcagagatg acttggtgcc ttcgggaacc gagagacagg tgctgcatgg ctgtcgtcag 1020 ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gtaacgagcg caacccttat ccttagttgc 1080 cagcgcgtca tggcgggaac tctagggaga ctgccggtga taaaccggag gaaggtgggg 1140 acgacgtcaa gtcatcatgg cccttatggg tagggctaca cacgtgctac aatggtcggt 1200 acagagggtt gcgaactcgc gagagccagc caatcccaaa aagccgatcc tagtccggat 1260 tgcagtctgc aactcgactt gcatgaagtc ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagaatgc 1320 cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccatgg gagtgggttg 1380 caaaagaagt aggtagttta accttcggga gggcgcttac cactttgtg 1429 <210> 35 <211> 2152 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pDCQ301 replication control region <400> 35 ctcgagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac cccttgtatt actgtttatg 60 taagcagaca gttttattgt tcatgatgat atatttttat cttgtgcaat gtaacatcag 120 agattttgag acacaacgtg gctttccccc ccccccctgc aggtcccgag cctcacggcg 180 gcgagtgcgg gggttccaag ggggcagcgc caccttgggc aaggccgaag gccgcgcagt 240 cgatcaacaa gccccggagg ggccactttt tgccggaggg ggagccgcgc cgaaggcgtg 300 ggggaacccc gcaggggtgc ccttctttgg gcaccaaaga actagatata gggcgaaatg 360 cgaaagactt aaaaatcaac aacttaaaaa aggggggtac gcaacagctc attgcggcac 420 cccccgcaat agctcattgc gtaggttaaa gaaaatctgt aattgactgc cacttttacg 480 caacgcataa ttgttgtcgc gctgccgaaa agttgcagct gattgcgcat ggtgccgcaa 540 ccgtgcggca ccctaccgca tggagataag catggccacg cagtccagag aaatcggcat 600 tcaagccaag aacaagcccg gtcactgggt gcaaacggaa cgcaaagcgc atgaggcgtg 660 ggccgggctt attgcgagga aacccacggc ggcaatgctg ctgcatcacc tcgtggcgca 720 gatgggccac cagaacgccg tggtggtcag ccagaagaca ctttccaagc tcatcggacg 780 ttctttgcgg acggtccaat acgcagtcaa ggacttggtg gccgagcgct ggatctccgt 840 cgtgaagctc aacggccccg gcaccgtgtc ggcctacgtg gtcaatgacc gcgtggcgtg 900 gggccagccc cgcgaccagt tgcgcctgtc ggtgttcagt gccgccgtgg tggttgatca 960 cgacgaccag gacgaatcgc tgttggggca tggcgacctg cgccgcatcc cgaccctgta 1020 tccgggcgag cagcaactac cgaccggccc cggcgaggag ccgcccagcc agcccggcat 1080 tccgggcatg gaaccagacc tgccagcctt gaccgaaacg gaggaatggg aacggcgcgg 1140 gcagcagcgc ctgccgatgc ccgatgagcc gtgttttctg gacgatggcg agccgttgga 1200 gccgccgaca cgggtcacgc tgccgcgccg gtagcacttg ggttgcgcag caacccgtaa 1260 gtgcgctgtt ccagactatc ggctgtagcc gcctcgccgc cctatacctt gtctgcctcc 1320 ccgcgttgcg tcgcggtgca tggagccggg ccacctcgac ctgaatggaa gccggcggca 1380 cctcgctaac ggattcaccg tttttatcag gctctgggag gcagaataaa tgatcatatc 1440 gtcaattatt acctccacgg ggagagcctg agcaaactgg cctcaggcat ttgagaagca 1500 cacggtcaca ctgcttccgg tagtcaataa accggtaaac cagcaataga cataagcggc 1560 tatttaacga ccctgccctg aaccgacgac cgggtcgaat ttgctttcga atttctgcca 1620 ttcatccgct tattatactt attcaggcgt agcaccaggc gtttaagggc accaataact 1680 gccttaaaaa aattacgccc cgccctgcca ctcatcgcag tactgttgta attcattaag 1740 cattctgccg acatggaagc catcacagac ggcatgatga acctgaatcg ccagcggcat 1800 cagcaccttg tcgccttgcg tataatattt gcccatggtg aaaacggggg cgaagaagtt 1860 gtccatattg gccacgttta aatcaaaact ggtgaaactc acccagggat tggctgagac 1920 gaaaaacata ttctcaataa accctttagg gaaataggcc aggttttcac cgtaacacgc 1980 cacatcttgc gaatatatgt gtagaaactg ccggaaatcg tcgtggtatt cactccagag 2040 cgatgaaaac gtttcagttt gctcatggaa aacggtgtaa caagggtgaa cactatccca 2100 tatcaccagc tcaccgtctt tcattgccat acggaattcg cccttaggta cc 2152 <210> 36 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rep protein <400> 36 Met Ala Thr Gln Ser Arg Glu Ile Gly Ile Gln Ala Lys Asn Lys Pro 1 5 10 15 Gly His Trp Val Gln Thr Glu Arg Lys Ala His Glu Ala Trp Ala Gly 20 25 30 Leu Ile Ala Arg Lys Pro Thr Ala Ala Met Leu Leu His His Leu Val 35 40 45 Ala Gln Met Gly His Gln Asn Ala Val Val Val Ser Gln Lys Thr Leu 50 55 60 Ser Lys Leu Ile Gly Arg Ser Leu Arg Thr Val Gln Tyr Ala Val Lys 65 70 75 80 Asp Leu Val Ala Glu Arg Trp Ile Ser Val Val Lys Leu Asn Gly Pro 85 90 95 Gly Thr Val Ser Ala Tyr Val Val Asn Asp Arg Val Ala Trp Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Asp Gln Leu Arg Leu Ser Val Phe Ser Ala Ala Val Val Val 115 120 125 Asp His Asp Asp Gln Asp Glu Ser Leu Leu Gly His Gly Asp Leu Arg 130 135 140 Arg Ile Pro Thr Leu Tyr Pro Gly Glu Gln Gln Leu Pro Thr Gly Pro 145 150 155 160 Gly Glu Glu Pro Pro Ser Gln Pro Gly Ile Pro Gly Met Glu Pro Asp 165 170 175 Leu Pro Ala Leu Thr Glu Thr Glu Glu Trp Glu Arg Arg Gly Gln Gln 180 185 190 Arg Leu Pro Met Pro Asp Glu Pro Cys Phe Leu Asp Asp Gly Glu Pro 195 200 205 Leu Glu Pro Pro Thr Arg Val Thr Leu Pro Arg Arg 210 215 220

Claims

a) pBBR1으로부터 유래된 복제 제어 부위를 포함하는 플라스미드를 제공하는 단계;

b) (a)의 플라스미드를 돌연변이가 플라스미드의 복제 제어 부위로 도입되는 돌연변이유발 과정에 가하는 단계;

c) (b)의 돌연변이체 플라스미드를 적당한 숙주 세포로 형질전환시키는 단계;

d) (c)의 숙주 세포를 배양하고 플라스미드 카피 수를 결정하는 단계;

e) (a)의 플라스미드에 비해 플라스미드 카피 수가 변화된 적어도 하나의 (d)의 플라스미드를 선별하는 단계;

f) (e)의 플라스미드로부터 돌연변이체 복제 제어 부위를 단리하는 단계

를 포함하는, 변화된 플라스미드 카피 수를 운반하는 돌연변이체 플라스미드 복제 제어 부위의 생성 및 단리 방법.
제1항에 있어서, 플라스미드 카피 수가

a) 리포터 제작물의 사용;

b) 아가로스 젤 분석;

c) 실시간 PCR; 및

d) 노던 블랏 분석

으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법에 의해 결정되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 변화된 플라스미드 카피 수가 단계 (a)의 플라스미드에 비해 증가되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 변화된 플라스미드 카피 수가 단계 (a)의 플라스미드에 비해 감소되는 것인 방법.
제1항의 방법에 의해 제조된 플라스미드 복제 제어 부위.
제5항의 플라스미드 복제 제어 부위를 포함하는 플라스미드.
서열 1의 뉴클레오티드 2478-3765에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖고

a) 뉴클레오티드 2490에서 G에서 A로의 돌연변이;

b) 뉴클레오티드 2496에서 C에서 T로의 돌연변이;

c) 뉴클레오티드 2579에서 T에서 C로의 돌연변이;

d) 뉴클레오티드 2633에서 C의 결실에 의한 돌연변이;

e) 뉴클레오티드 2634에서 C의 결실에 의한 돌연변이;

f) 뉴클레오티드 2663에서 T의 C로의 돌연변이;

g) 뉴클레오티드 2771에서 A의 G로의 돌연변이;

h) 뉴클레오티드 2805에서 T의 C로의 돌연변이;

i) 뉴클레오티드 2838에서 C의 A로의 돌연변이;

j) 뉴클레오티드 2914에서 T의 C로의 돌연변이;

k) 뉴클레오티드 2935에서 T의 C로의 돌연변이;

l) 뉴클레오티드 3003에서 C의 T로의 돌연변이;

m) 뉴클레오티드 3165에서 G의 A로의 치환을 위한 돌연변이;

n) 뉴클레오티드 3262에서 T의 G로의 돌연변이;

o) 뉴클레오티드 3269에서 C의 T로의 돌연변이;

p) 뉴클레오티드 3344에서 T의 C로의 돌연변이;

q) 뉴클레오티드 3347에서 C의 T로의 돌연변이;

r) 뉴클레오티드 3456에서 G의 A로의 치환을 위한 돌연변이;

s) 뉴클레오티드 3468에서 T의 C로의 치환을 위한 돌연변이;

t) 뉴클레오티드 3570에서 A의 G로의 치환을 위한 돌연변이;

u) 뉴클레오티드 3604에서 T의 C로의 돌연변이;

v) 뉴클레오티드 3641에서 A의 C로의 돌연변이;

w) 뉴클레오티드 3729에서 A의 G로의 돌연변이;

x) 뉴클레오티드 3739에서 T의 A로의 돌연변이; 및

y) 뉴클레오티드 3747에서 T의 C로의 돌연변이

로 구성된 그룹으로부터 독립적으로 선택되는 적어도 하나의 점 돌연변이를 갖는 돌연변이체 복제 제어 부위.
(ⅰ) 증가된 플라스미드 카피 수를 플라스미드로 운반하고;

(ⅱ) 아래 조건: 0.1×SSC, 0.1% SDS, 65 ℃ 및 2×SSC, 0.1% SDS에 이어서 0.1×SSC, 0.1% SDS로의 세척 하에서 제7항의 뉴클레오티드 서열에 혼성화하는

돌연변이체 복제 제어 부위.
(ⅰ) 증가된 플라스미드 카피 수를 플라스미드로 운반하고;

(ⅱ) 제7항의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90% 동일한

돌연변이체 복제 제어 부위.
서열 3에 나타낸 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 갖는 돌연변이체 복제 유전자.
k) 뉴클레오티드 117에서 G의 A로의 치환을 위한 돌연변이;

l) 뉴클레오티드 214에서 T의 G로의 돌연변이;

m) 뉴클레오티드 221에서 C의 T로의 돌연변이;

n) 뉴클레오티드 296에서 T의 C로의 돌연변이;

o) 뉴클레오티드 299에서 C의 T로의 돌연변이;

p) 뉴클레오티드 408에서 G의 A로의 치환을 위한 돌연변이;

q) 뉴클레오티드 420에서 T의 C로의 치환을 위한 돌연변이;

r) 뉴클레오티드 522에서 A의 G로의 치환을 위한 돌연변이;

s) 뉴클레오티드 556에서 T의 C로의 돌연변이; 및

t) 뉴클레오티드 593에서 A의 C로의 돌연변이

로 구성된 그룹으로부터 독립적으로 선택되는 적어도 하나의 점 돌연변이를 포함하는 서열 3에 나타낸 바와 같은 돌연변이 복제 유전자.
제7항에 있어서, 서열 6, 8, 10, 12, 13, 15, 17, 18, 20 및 21로 구성된 그룹으로부터 선택되는 돌연변이체 복제 제어 부위.
제7항, 제9항 또는 제12항 중 어느 한 항의 돌연변이체 복제 제어 부위를 포함하는 플라스미드.
제10항 또는 제11항의 돌연변이체 복제 유전자를 포함하는 플라스미드.
제13항에 있어서, 플라스미드가 그램-음성 세균에서 복제되는 것인 플라스미드.
제15항에 있어서, 그램-음성 세균이 아세토박터(Acetobacter), 아시네토박터(Acinetobacter), 에어로모나스(Aeromonas), 아그로박테리움(Agrobacterium), 알칼리제네스(Alcaligenes), 아나베나(Anabaena), 아조리조비움(Azorizobium), 바토넬 라(Bartonella), 보데텔라(Bordetella), 브루셀라(Brucella), 버콜데리아(Burkholderia), 캄필로박터(Campylobacter), 코울로박터(Caulobacter), 크로마티움(Chromatium), 코마모나스(Comamonas), 사이토파가(Cytophaga), 데이노코커스(Deinococcus), 어위니아(Erwinia), 에리쓰로박터(Erythrobacter), 에스케리키아(Escherichia), 플라보박테리움(Flavobacterium), 하이포마이크로비움(Hyphomicrobium), 크렙시엘라(Klebsiella), 메타노박테리움(Methanobacterium), 메틸박테리움(Methylbacterium), 메틸로바실러스(Methylobacillus), 메틸로박터(Methylobacter), 메틸로박테리움(Methylobacterium), 메틸로코커스(Methylococcus), 메틸로시스티스(Methylocystis), 메틸로마이크로비움(Methylomicrobium), 메틸로모나스(Methylomonas), 메틸로필러스(Methylophilus), 메틸로시너스(Methylosinus), 믹소코커스(Myxococcus), 판토에아(Pantoea), 파라코커스(Paracoccus), 슈도모나스(Pseudomonas), 리조비움(Rhizobium), 로도박터(Rhodobacter), 살모넬라(Salmonella), 쉬겔라(Shigella), 스핑고모나스(Sphingomonas), 비브리오(Vibrio), 아쓰로박터(Arthrobacter), 바실러스(Bacillus), 메타노모나스(Methanomonas), 노카르디아(Nocardia), 로도슈도모나스(Rhodopseudomonas), 잔토박터(Xanthobacter), 브래디리조비움(Bradyrhizobium), 및 브레분디모나스(Brevundimonas)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 플라스미드.
제7항, 제8항, 제9항 또는 제12항 중 어느 한 항에 따른 돌연변이체 복제 제 어 부위를 포함하는 그램-음성 숙주 세포.
제17항에 있어서, 아세토박터, 아시네토박터, 에어로모나스, 아그로박테리움, 알칼리제네스, 아나베나, 아조리조비움, 바토넬라, 보데텔라, 브루셀라, 버콜데리아, 캄필로박터, 코울로박터, 크로마티움, 코마모나스, 사이토파가, 데이노코커스, 어위니아, 에리쓰로박터, 에스케리키아, 플라보박테리움, 하이포마이크로비움, 크렙시엘라, 메타노박테리움, 메틸박테리움, 메틸로바실러스, 메틸로박터, 메틸로박테리움, 메틸로코커스, 메틸로시스티스, 메틸로마이크로비움, 메틸로모나스, 메틸로필러스, 메틸로시너스, 믹소코커스, 판토에아, 파라코커스, 슈도모나스, 리조비움, 로도박터, 살모넬라, 쉬겔라, 스핑고모나스, 비브리오, 아쓰로박터, 바실러스, 메타노모나스, 노카르디아, 로도슈도모나스, 잔토박터, 브래디리조비움, 및 브레분디모나스로 구성된 그룹으로부터 선택되는 숙주 세포.
유기체에서 제7항, 제8항, 제9항 또는 제12항 중 어느 한 항의 돌연변이체 복제 제어 부위를 포함하는 플라스미드 상의 적어도 하나의 유전자를 발현시켜, 상기 유전자 발현이 유기체에서 pBBR1의 복제 제어 부위를 포함하는 플라스미드 상의 적어도 하나의 유전자의 발현에 비해 유기체에서 변화되도록 하는 것을 포함하는 유기체에서 유전자 발현을 조절하는 방법.
제19항에 있어서, 상기 유전자 발현이 증가되는 것인 방법.
제20항에 있어서,

a) 적어도 하나의 유전자가 crtM, crtN, crtN2, crtE, crtX, crtY, crtI, crtB, crtZ, crtW, crtO, crtA, crtC, crtD, crtF 및 crtU 로 구성된 그룹으로부터 선택되고;

b) 유기체가 C1 대사 세균인

방법.
제21항에 있어서, C1 대사 세균이 메틸로모나스, 메틸로박터, 메틸로코커스, 메틸로시너스, 메틸로시스티스, 메틸로마이크로비움, 및 메타노모나스로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
제22항에 있어서, C1 대사 숙주 세포가 ATCC 명칭 PTA 2402를 갖는 메틸로모나스 16a로 알려져 있는, 고 성장 메타노트로프 세균 균주인 방법.